CN101215321B - 超滤法提取ⅱ型真菌疏水蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种适合在大规模工业生产上应用的超滤法提取II型疏水蛋白的方法。本发明方法是超滤法，在超滤过程中使用的是膜孔径为3000-10000的中空纤维超滤膜。超滤运行的工艺条件为：运行压力0.02-0.09MPa；运行温度为20-45℃；运行pH为3-11；每超滤2小时需要反洗。本发明经过超滤可得到II型疏水蛋白含量在20％-30％的蛋白浓缩液，疏水蛋白回收率在70％-90％之间。本方法可除去蛋白粗提液中大部分色素、无机盐以及其它小分子物质，操作简单，分离效率高，运行成本低。

Description

超滤法提取Ⅱ型真菌疏水蛋白的方法

【技术领域】：本发明属于生物材料技术领域，特别涉及一种II型疏水蛋白的纯化方法，即用超滤法纯化II型疏水蛋白。该疏水蛋白可以应用到生物传感器、细胞固定化、化妆品、医药卫生和乳化等的众多领域。

【背景技术】：疏水蛋白(hydrophobin)是高等丝状真菌在特定发育阶段大量分泌的一类具有特殊性质的小型结构蛋白，它们能够在不同界面处自组装成为一种两亲性薄膜。这种特性在很多方面都得到了应用，涉及到生物传感器、细胞固定化、化妆品、医药卫生和乳化等的众多领域。

由于疏水蛋白的特殊性质，疏水蛋白的纯化与一般蛋白相比，难度比较大。根据疏水性图谱及装配成的两性蛋白膜的溶解性等特征，疏水蛋白可以分为两类：I型和II型，并且因为两者的性质差别很大，因而提取方法差别也很大。据已公开的文献来看，疏水蛋白的主要纯化方法如下：

(1)三氟乙酸法：如SC3、SC4、EAS、HYPA等I型疏水蛋白就是利用此法提取纯化。这种方法利用了I型疏水蛋白在界面形成的聚合物(包括菌丝和孢子的表面)不能在热SDS溶液中解聚和溶解，而只能在强酸如过氧甲酸(PFA)和三氟乙酸(TFA)中解聚成单体(早期用PFA，后期都用TFA)的特性。

(2)唯一的一种温和条件下提取I型疏水蛋白的方法：1998年Lora JM等发现裂褶菌分泌SC3的同时分泌高分子量的多糖裂褶菌素，裂褶菌素在水溶液能稳定SC3，以此发明了用疏水层析法从发酵清液中分离I型疏水蛋白的方法。除此之外，对I型疏水蛋白还没有提出TFA(或PFA)解聚以外的分离纯化方法。

(3)II型疏水蛋白纯化法：因为II型疏水蛋白能被1％～2％SDS溶液和60％乙醇溶液解聚和溶解，所以如CU、CFTH1以及融合蛋白EGIcore-HFBI等一般都不用PFA或TFA解聚，而用近几年发展起来SDS抽提法、双水相系统ATPS分离法和各种层析法分离纯化。但SDS抽提法和双水相系统ATPS分离法需要使用大量的无机或有机试剂，分离后产生的废液还需额外处理，并且最后所得II型蛋白溶液含有大量盐类和色素，还需要下一步工艺来去除它们；各种层析方法虽然能有效的解决最终II型疏水蛋白溶液中含有盐类和色素的问题，但实际应用中能处理蛋白粗样品的规模太小，并且各种层析所用填料价格昂贵，不适合于大规模使用。

超滤(UF)以压力为推动力，利用中空纤维超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程，其切割分子量(CWCO)10³至10⁶，孔径1100nm。1965年，首先由美国亚米康公司开发成功中空纤维式超滤器，并投放市场。超滤应用范围很广，除在水处理工程中，用于除菌、胶体和大分子有机物等外，还可以用于许多特殊溶液的分离、精制，如血液净化、蛋白质精制、大分子有机物与盐的分离和脱水等。超滤作为一种较为快速简便的方法，具有对产物破坏少的优点。中空纤维超滤膜由于孔径小，过滤时不易产生浓差极化，并具有可同时脱盐和浓缩等优点，故被国内外一些研究者相继采用，用于蛋白质的浓缩和沉淀剂去除。

但是到目前为止，市场上还没有一种成型的疏水蛋白产品，主要是因为现有的疏水蛋白的纯化方法过程复杂，成本过高，不适合在大规模工业生产上应用。

【发明内容】：本发明目的是解决现有技术存在的不足，提供一种适合在大规模工业生产上应用的超滤法提取I I型疏水蛋白的方法。以便去除II型疏水蛋白粗提液中的大部分色素，无机盐以及其它小分子物质，得到高纯度的疏水蛋白。

本发明提供的超滤法提取II型真菌疏水蛋白的方法，包括以下步骤：

第一、用SDS法从真菌菌丝表面抽提II型真菌疏水蛋白，经离心或板框过滤得到蛋白粗提液；

第二、用KCl对蛋白粗提液进行处理，经离心，板框或微滤以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中70％-80％左右的SDS；

第三、超滤，将KCl处理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通过膜孔径为6000的中空纤维超滤膜，经过超滤得到II型真菌疏水蛋白浓缩液；超滤结束后对超滤膜进行反洗，待用。

对上述第三步得到II型真菌疏水蛋白浓缩液，可以进行常规喷雾干燥，得到含量在20％-30％的II型真菌疏水蛋白干粉。

其中，超滤过程中所用的中空纤维超滤膜材质为聚砜；中空纤维超滤膜为管式膜。

超滤运行工艺条件为：运行压力0.06MPa；运行温度为40℃；运行PH为8；每超滤2小时需要反洗。

所述的反洗是在超滤过程中用去离子水反冲膜，以部分恢复膜通量；或在超滤结束时用水反洗膜以提高II型真菌疏水蛋白收率，然后用碱性溶液洗膜以完全恢复膜通量。

本发明针对不同规模的II型疏水蛋白粗提液，选择材质、大小合适的超滤柱，通过超滤压力、时间、温度、PH等超滤条件的优化，得到最佳的超滤条件。在超滤过程中，用SDS-PAGE、高效液相色谱、葡聚糖凝胶G-25层析、Western Blotting及吖啶橙法等技术对蛋白粗提液中的疏水蛋白、无机盐和SDS进行定性和定量。

本发明的优点和积极效果：

本发明与传统的II型疏水蛋白纯化方法，如双水相系统分离法和各种层析法相比，超滤法纯化II型疏水蛋白更加方便，效率更高，所用成本更少，更适合于工业上大规模的纯化。本方法的实施为加快疏水蛋白应用的产业化打下了坚实的基础。

【附图说明】：

图1是瑞氏木酶疏水蛋白HFBI标准品电泳图。

图2是不同超滤时间下膜通量曲线图。

图3是不同超滤压力下膜通量曲线图。

图4是不同超滤温度下膜通量曲线图。

图5是不同超滤PH下膜通量曲线图。

图6是超滤后瑞氏木酶疏水蛋白HFBI电泳图和Western Blotting图。

图7是超滤后瑞氏木酶疏水蛋白HFBI与标准品的HPLC对比图。

图8是超滤后瑞氏木酶疏水蛋白HFBI的Sephadex G25层析图。

图9是超滤后检测SDS所用标准曲线。

图10是超滤后瑞氏木酶疏水蛋白HFBI的定量标准曲线。

【具体实施方式】：

实施例1：

以目前国际上研究最多的II型疏水蛋白HFBI为例，选择以聚砜为材质的中空纤维膜(不易结合蛋白质)，完整的实现了超滤纯化HFBI的整个过程。

本发明方法包括以下步骤：

第一、用SDS法从真菌菌丝表面抽提II型真菌疏水蛋白，经离心或板框过滤得到蛋白粗提液；

第二、用KCl对蛋白粗提液进行处理，经离心，板框或微滤以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中80％左右的SDS；

第三、超滤，将KCl处理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通过膜孔径为3000-10000的中空纤维超滤膜，经过超滤得到II型真菌疏水蛋白浓缩液；超滤结束后对超滤膜进行反洗，待用。

对上步得到的II型真菌疏水蛋白浓缩液，进行常规喷雾干燥，得到含量在20％-30％的II型真菌疏水蛋白干粉。

本实施例所用的中空纤维超滤膜材质为聚砜(效果好于其它材质)，超滤膜孔径为6000。

超滤运行工艺条件为：运行压力0.02-0.09MPa；运行温度为20-45℃；运行PH为3-11；每超滤2小时需要反洗。最佳操作压力为0.06Mpa；最佳运行温度为40℃；最佳运行PH为8；最佳反洗时间为2小时。

下面结合附图对本实施例的方法做进一步的阐明。

图1说明：通过瑞氏木酶疏水蛋白HFBI标准品电泳图可以看出，疏水蛋白的分子量在7.5KDa。如果膜的切割分子量太小，则在单位时间内单位面积透过膜的通量太小，不能得到实际应用，如果膜的切割分子量过大，则膜对截留物质的截流率太低。考虑到疏水蛋白的分子量在7.5KDa，并且要过膜去除的色素、盐类以及SDS都是小分子物质，综合以上考虑，选择6000作为膜的切割分子量(实验中发现使用切割分子量为3000-10000的超滤膜都有效果，6000为最佳)。

图2说明：从图中可以看出，随着时间的推移，膜通量开始衰减，但衰减速度逐渐减慢。这主要是由于蛋白质浓差极化形成凝胶层及膜压密所致。系统运行2小时之后膜通量为起始通量的64％左右，这种状态一直可持续到第六小时，波动非常小，这主要是由于膜表面形成了稳定的凝胶层所致。但系统不能长时间在较低通量运行，因为低通量不仅效率比较低，而且长时间的压密对以后的膜清洗带来困难。所以运行2小时后要对柱子进行反洗。

图3说明：从图中可以看出，在操作压差较小时，渗透通量与压差呈线性关系，压差越大，渗透通量越大；但是当压差超过0.05MPa后，渗透通量的增长幅度明显减小，最后逐渐趋于稳定，与压差无关，此时的渗透通量为“临界渗透通量”，压差为“临界压差”。这是因为料液在压力较小时，膜渗透通量小，被透过液带到膜表面的溶质量也较少，膜表面及膜孔内只形成了少量的凝胶层和污染，由于压力将物料中压向凝胶层内的溶质和由于物料切线流动和扩散带走的溶质基本保持平衡，增大压力产生的压差会使通量增大；而在压力达到一定程度后，超滤的初始通量很大，大量的溶质被透过液带到膜表面并聚集形成浓度极化层，浓差极化严重，这时增大压力产生的压差会很快被加厚和压实的凝胶层所抵消，所以通量不再随着压力变化，如果继续增加压力，反而可能将一些与膜孔大小相近的分子压进膜内，增加膜污染的危险，更严重的还会将膜压实，造成膜不可逆的损坏。在本试验中，与“临界压差”接近的0.06MPa为最佳超滤压力。

图4说明：从图中可以看出，随着温度的升高，膜通量也相应的变大，温度与膜通量成正相关。这可能有两方面的原因，一方面是随着温度的升高，降低了蛋白粗提液的粘度，膜面上的大分子物质向两侧溶液中扩散速度有所增加，从而减轻了浓差极化和凝胶层的产生，通量增加；另一方面是随着温度的升高，加快了中空纤维超滤膜的聚合物链节的微观布朗运动使得单位时间单位体积形成小孔的可能性增加，同时也增加了渗透组分的活动与扩散，结果使膜的渗透性增强，通量增加。值得注意的是，过高的温度会使蛋白质变性，且易于形成凝胶层，还会导致中空纤维超滤膜的过快老化，所以超滤时的温度不能过高。在本试验中，40℃为最佳的超滤温度。

图5说明：疏水蛋白作为-种两亲性蛋白质，很容易在疏水的聚砜中空纤维超滤膜上自组装成蛋白膜。为了尽量减少成膜的可能性，就要使疏水蛋白远离等电点，这样可以使蛋白单体带上相同的电荷，相互排斥，不易于成膜；另外由于远离等电点，疏水蛋白的溶解度增加，不易于聚集在中空纤维超滤膜的表面，形成紧密的吸附层；再者由于蛋白带电，就与水的亲和力增加，相应的中空纤维超滤膜上的吸附量就减少，膜的通量就较高。HFBI疏水蛋白的等电点在6左右，在图中可以看出，当PH为6时，蛋白粗提液的通量是最低的，因为处于等电点的蛋白质间的斥力是最小的，很容易在膜表面沉积，在等电点附近的PH时，可以看出蛋白粗提液的通量提高的不是很明显。考虑到PH的调节对通量的影响不是很大，且如果调节PH，还要增加一道工序，所以本试验选取蛋白粗提液的初始PH＝8为超滤PH值。

图6说明：疏水蛋白超滤水溶液经连续真空冷冻干燥四十个小时之后，得到蛋白干粉。取适量蛋白干粉进行ricine-SDS-PAGE电泳及Western Blotting。结果如图所示，可以清楚的看到在7.5KDa处有一条蛋白带，进行Western Blotting检测，确定其是HFBI。

图7说明：实验中使用C18层析柱，柱直径4.6mm，柱长25cm，柱体积4.15ml。洗脱液A液为20％乙腈，0.1％三氟乙酸；B液为80％，0.1％三氟乙酸。进样20μl，流速为1ml/min。首先将HFBI纯品进行液相色谱分析，所做液相色谱为梯度洗脱。从图中可以看到HFBI的出峰位置在30％进程左右。随后将经过中空纤维膜超滤的样品进行HPLC分析，梯度洗脱，A液和B液成分同上。可以看到，HFBI的出峰位置也在30％进程左右，同纯品出峰位置一致。

图8说明：用Sephadex G25柱对疏水蛋白HFBI进行检测，目的是为了验证样品中色素和盐类是否已经大部分被除去。结果如图所示。横坐标为时间(分钟)，纵坐标为紫外和离子吸收。蛋白峰只有一个，离子吸收一直没有什么变化。可见，用中空纤维膜超滤除去样品中色素和盐类的效果非常好。很适合在工业上大规模生产，可以大幅度降低成本。

图9说明：将不同浓度的SDS标准溶液，通过吖啶橙法测定其在499nm下的OD值。每种浓度检测5次，并求得平均值，将各数据处理后绘制标准曲线。对经过中空纤维膜超滤的蛋白干粉进行SDS含量检测，代入公式求得SDS浓度值为0.02‰，说明经过KCl沉淀和中空纤维膜超滤，绝大部分SDS已被除去，效果比较理想。

图10说明：先进行Tricine-SDS-PAGE电泳，第1-第5泳道为中空纤维膜超滤所得疏水蛋白HFBI，从左向右各泳道的上样量分别为7.5μg，10μg，12.5μg，15μg，20μg，第六泳道为HFBI标准品，上样量为2.5μg。然后用凝胶成像仪扫描，扫描结果用软件BandScan进行定量分析。根据所得数值，以样品HFBI的质量和光吸收值为坐标轴得到样品的标准曲线。

Claims (1)

1.一种提取II型真菌疏水蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

第一、用SDS法从真菌菌丝表面抽提II型真菌疏水蛋白，经离心或板框过滤得到蛋白粗提液；

第二、用KCl对蛋白粗提液进行处理，经离心，板框或微滤以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中70％-80％的SDS；

第三、超滤，将KCl处理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通过膜孔径为6000的中空纤维超滤膜，经过超滤得到II型真菌疏水蛋白浓缩液；超滤结束后，每超滤2小时对超滤膜进行反洗，待用；

其中，所述的中空纤维超滤膜是由聚砜制成的管式膜；超滤运行工艺条件为：运行压力0.06MPa；运行温度为40℃；运行PH为8。

Images