CN103265636B - 一种具有降血糖作用的新型肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有降血糖作用的新型肽。运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具对糖尿病并发症相关蛋白的B细胞抗原表位进行分析，筛选的B表位氨基酸序列为：RLEPYKKKNPS，选用胰岛细胞特异抗原-胰岛素相关蛋白(IA-2)近膜区JM2的一个线形B表位的截短片段，其氨基酸序列为：FEYQD，将FEYQD插入P2肽段的N端，形成新型肽I5P，再将B表位RLEPYKKKNPS以Gly与I5P的C端相连，制成新型肽O-IA-2(5)-P2，其氨基酸序列为：RLEPYKKKNPSGFEYQDIPALDSLTPANED。该新型肽和氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED的IA-2-P2肽，它们通过皮下注射途径能显著降低STZ糖尿病模型鼠的血糖值，显著增加STZ糖尿病模型鼠的存活率。同时本发明提供的新型肽也可以用于重组微生物和转基因动物或植物，使它们作为生产工厂，能够生产该新型肽或制作口服疫苗，能够用于糖尿病及其相关疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型肽及其应用，尤其是具有降血糖作用的新型肽及其应用，以及含有该新型肽及其主要组成片段的衍生物和类似物的药物制剂，本发明涉及药学及医学相关领域。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。糖尿病带来的危害，几乎都来自它的并发症。例如糖尿病酮症酸中毒、糖尿病肾病、高血压、糖尿病眼病、糖尿病足等已成为导致糖尿病致死、致残的主要原因。其中糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，在糖尿病患者的死亡原因中占有较大比例。
胰岛素绝对缺乏为1型糖尿病，胰岛素相对缺乏为2型糖尿病。1型糖尿病又名胰岛素依赖型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种代谢异常综合征。由于机体自身反应性免疫应答攻击胰岛β细胞，使其遭破坏、功能缺失，从而导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病。由于β细胞具有产生胰岛素和调节血糖的功能，β细胞群的毁坏最终导致了血糖的失调和高糖血症的发生。T1DM是由T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，自身免疫性疾病(autoimmune disease)是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态。通过一定的免疫途径来诱导机体对致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效预防自身免疫性疾病的发生。
P277肽是HSP60的437～460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前以进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化；并将P277分成P1肽段(437～450)和P2肽段(448～460)两部分，发现P1多肽具有一定的促动脉粥样硬化作用，而P2多肽却没有。经过改构，选用胰岛细胞特异抗原-胰岛素相关蛋白(IA-2)近膜区JM2的两个线形B表位：IA-2的626～630位(626FEYQD630)和IA-2的621～628位(621HGDTTFEY628)，即用621HGDTTFEYQD630替换P277的347～446位肽段，合成多肽IA-2-P2，实验证明IA-2-P2能有效的降低NOD小鼠糖尿病的发病率，增加小鼠的存活率。
B细胞表位(B cell epitope)是抗原分子被抗体或B细胞抗原受体(Bcell receptor，BCR)特异性识别并互相结合的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)。免疫细胞通常难以借助其表面受体识别抗原分子，实际上其识别的只是抗原分子上的一个特定表位，因而表位是蛋白质抗原性的基础，抗体的特异性是针对表位的。B细胞表位的确定对多肽疫苗的合成、诊断试剂的制备、单克隆抗体的筛选等研究工作具有重要意义。B细胞表位分为连续型和非连续型。B细胞表位预测软件：DNAStar、PREDITOP、ADEPT、PEOPLEOMIGA、UWGCG、ANTHEPROT等。B细胞表位预测数据库和预测工具有ABCpred、AgAbDb、AntiJen、Bcipep、Bepipred、CEP等。B细胞表位预测方法有基于氨基酸序列预测还有基于结构预测，其中基于序列预测主要有ABCpred、Bepipred等。已经证实P277中的P2肽段在治疗1型糖尿病中起到关键性作用，我们运用B细胞表位预测软件以及在线预测工具，对糖尿病并发症相关蛋白进行B细胞抗原表位分析，选择一个线形B表位RLEPYKKKNPS，选用胰岛细胞特异抗原-胰岛素相关蛋白(IA-2)近膜区JM2的一个线形B表位IA-2的626～630位(626FEYQD630)，将FEYQD插入P2肽段的N端，形成新型肽I5P，再将B表位RLEPYKKKNPS以Gly与I5P的C端相连，制成的新型肽O-IA-2(5)-P2能有效降低血糖及预防和治疗糖尿病。
发明内容
发明目的：
本发明的目的是提供一种具有降血糖效果的新型肽O-IA-2(5)-P2和I5P，肽IA-2-P2。
技术方案：
一种新型肽O-IA-2(5)-P2，由30个氨基酸组成，其特征在于是一种多表位组合物，其氨基酸序列为：RLEPYKKKNPSGFEYQDIPALDSLTPANED，其主要组成片段为新型肽I5P，其氨基酸序列为：FEYQDIPALDSLTPANED。通过氨基酸修饰或是氨基酸置换得到的氨基酸序列，含有上述氨基酸的序列。IA-2-P2氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED。
所述的新型肽和IA-2-P2疫苗在降血糖产品上的应用，所述的新型肽在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。
所述的新型肽与药物活性物质或药物载体制成组合物后，在预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。
所述的药物活性物质为胰岛素、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平。
所述的药物载体为热休克蛋白HSP60/65；
一种新型肽疫苗的制备方法，其特征在于其氨基酸序列的确定按照如下步骤实现：
运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具筛选出糖尿病并发症相关蛋白B细胞抗原表位，其氨基酸序列为：RLEPYKKKNPS，选用胰岛细胞特异抗原-胰岛素相关蛋白(IA-2)近膜区JM2的一个线形B表位，其氨基酸序列为：FEYQD，将FEYQD插入P2肽段的N端，形成新型肽I5P，再将B表位RLEPYKKKNPS以Gly与I5P的C端相连，制成一种新型肽O-IA-2(5)-P2，其氨基酸序列为：RLEPYKKKNPSGFEYQDIPALDSLTPANED。
有益效果：
P277肽437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460是HSP60一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前以进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化，并将P277分成P1肽段(437～450)和P2肽段(448～460)两部分，发现P1多肽具有一定的促动脉粥样硬化作用，而P2多肽却没有。
本发明的优点在于用糖尿病肾病相关蛋白黄嘌呤氧化还原酶(xanhtine oxidoreductase，XOR)B细胞抗原表位替换了P277中有促动脉粥样硬化作用的P1肽段(437～450)，并与截短的IA-2以Gly相连，并插入到P2肽段的上游N端，获得一种能够有效预防和治疗糖尿病的新型肽O-IA-2(5)-P2。
实验结果证明新型肽能显著降低糖尿病小鼠的血糖值。其主要组成片段为新型肽I5P，其氨基酸序列为：FEYQDIPALDSLTPANED。发现IA-2-P2有新的作用即能显著降低糖尿病小鼠的血糖值。
附图说明
图1固相合成本发明多肽O-IA-2(5)-P2(内含I5P)的流程图
图2ESI-MS测定本发明新型肽O-IA-2(5)-P2的分子量
图3新型肽和IA-2-P2对STZ造模成功后的糖尿病小鼠治疗实验中的血糖值的影响
图4新型肽和IA-2-P2对糖尿病小鼠生存率的统计
图5新型肽和IA-2-P2对STZ造模后隔天给药的小鼠的血糖值的影响
具体实施方式
实施例1：新型多肽O-IA-2(5)-P2(内含I5P序列)的制备过程
合成一种新型肽其氨基酸序列为：RLEPYKKKNPSGFEYQDIPALDSLTPANED(命名为O-IA-2(5)-P2)，见SEQ NO.1)，其具体合成过程见图1；I5P(FEYQDIPALDSLTPANED，见SEQ NO.2)；IA-2-P2(HGDTTFEYDQDIPALDSLTPANED，见SEQNO.3)P277(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED见SEQ NO.4)上述肽类均由吉尔生化上海有限公司采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。
O-IA-2(5)-P2(内含I5P序列)具体合成过程如下：
1.选择树脂
多肽合成按照序列反向合成，多肽是从C端向N端开始连接，首先Fmoc-Asp(Otbu)-OH Wang Resin；
2.去除Fmoc
将去保护液(20％六氢吡啶和80％DMF)加入反应器，用氮气吹30min左右，然后抽掉，用DMF清洗5-6遍，然后检测树脂颜色(一般呈蓝色或棕色)。在接下一个氨基酸前要去掉上一个氨基酸氨基上的保护基团。
3.氨基酸的缩合
去保护后把准备好的原料和固体缩合剂(tbtu、hobt)加入反应器，然后加入DMF并通入氮气。在氨基酸和缩合剂完全溶解后加入相应的液体激活剂(DIEA)进行反应。原料与固体激活剂投料量一般都是三倍。反应一定的时间后，取少量树脂检测，当树脂呈无色透明时，表明反应完全。
4.切割
将合成好的多肽加入到切割液中，搅拌器搅拌2-3h之后滤出切割液，在其中加入乙醚，多肽即能析出。滤纸过滤得到多肽，然后用乙醚洗4-5遍得到粗品肽。
5.多肽纯化
将粗品肽抽干后纯化，得到HPLC纯度＞90％的纯品。
ESI-MS检测合成肽分子量，结果见图2.新型肽O-IA-2(5)-P2分子量为3436.81。
实施例2：新型肽和IA-2-P2的药效学评价
1、糖尿病模型鼠的建立
采用小剂量连续多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠糖尿病(DM)模型。4周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXR(苏)2012-0004。)用0.1M pH4.4柠檬酸盐缓冲液配置STZ浓度为7.5mg/m1，按50mg/kg剂量腹腔注射，每日1次，连续注射5次，于造模后第3、7、14天测定血糖值，以空腹血糖连续两次≥11.1mmol/L为成模标准。
2、造模成功后的动物免疫治疗实验
60只糖尿病模型小鼠随机分成5组，每组12只，分别为：placebo组(溶剂对照组，阴性对照组)、P277组(阳性对照组)、I5P组、IA-2-P2、O-IA-2(5)-P2组。给药组药物浓度均为1mg/ml，给药量为100μg/只/次，即100μl药液；阴性对照组：100μl油剂/只/次。药物配置方法按1mg+40mg甘露醇溶于1ml20％Lipofundin的比例临时配置油剂。在模型成功(以血糖≥11.1mmol/L为准)后第2周开始进行动物免疫。
3.对糖尿病小鼠血糖的影响
在模型成功(以血糖≥11.1mmol/L为准)后第2周第一次免疫，之后每周给药1次，共四次，再分别于第7免疫一次。每次免疫前将糖尿病小鼠断尾取血，取血时用血糖监测仪检测小鼠血糖水平。结果如图3所示，从给药开始到第7周，O-IA-2(5)-P2的血糖值明显低于阴性对照组(placebo)和I5P组以及IA-2-P2组，并且O-IA(5)-P2与I5P组相比，有统计学差异，p＜0.05；与IA-2-P2组相比，有统计学差异，p＜0.05；与P277组相比，有统计学差异，p＜0.05；与Placebo组相比，有统计学差异，p＜0.05。
4.生存率统计
在模型成功(以血糖≥11.1mmol/L为准)后第2周进行第一次免疫，之后每周给药1次，再分别于第7和12周各免疫一次。统计各组小鼠在5个月观测期间的生存率。结果如图4所示，O-IA-2(5)-P2的死亡率仅有25％，与阴性对照组(placebo)(83％)和I5P组(75％)以及IA-2-P2组(33％)相比，能明显增加糖尿病小鼠的生存率。其中，O-IA-2(5)-P2与IA-2-P2组比，有统计学差异，p＜0.05；与I5P组相比，有统计学差异，p＜0.05；与P277组比较，有统计学差异，p＜0.05；与placebo组相比，有统计学差异，p＜0.05。
5.STZ造模后隔天动物免疫的防治实验
采用小剂量连续多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠糖尿病(DM)模型。4周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXR(苏)2012-0004。)用0.1M pH4.4柠檬酸盐缓冲液配置STZ浓度为4.0mg/ml，按40mg/kg剂量腹腔注射，每日1次，连续注射5次，于造模后第2天，将60只糖尿病模型小鼠随机分成5组，每组12只，分别为：placebo组(溶剂对照组，阴性对照组)、P277组(阳性对照组)、I5P组、IA-2-P2、O-IA-2(5)-P2组。给药组药物浓度均为1mg/ml，给药量为100μg/只/次，即100μl药液；阴性对照组：100μl油剂/只/次。药物配置方法按1mg+40mg甘露醇溶于1ml20％Lipofundin的比例临时配置油剂。造模后隔天进行第一次免疫，从第一次免疫开始于第3，5，7周再分别免疫一次，共计免疫四次。
每次免疫前将糖尿病小鼠断尾取血，取血时用血糖监测仪检测小鼠血糖水平。结果如图5所示，所有小鼠于造模后第15天血糖值均高于11.1mmol/L，于第50天的血糖值结果显示，Placebo组降血糖率为-0.57％，P277组降血糖率为13.24％，I5P组降血糖率为18.23％，IA-2-P2组降血糖率为5.42％，O-IA-2(5)-P2组降血糖率为33.05％，四次免疫后O-IA-2(5)-P2组的降血糖效果明显高于其他肽组。
Claims (8)
1.肽O-IA-2(5)-P2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1中所示序列，其主要组成片段氨基酸序列为肽RLEPYKKKNPS和SEQ ID NO：2中所示肽I5P。
2.根据权利要求1所述肽在制备降血糖产品上的应用。
3.根据权利要求1所述肽在制备治疗1型糖尿病药物中的应用。
4.根据权利要求1所述肽与药物活性物质或药物载体制成的组合物。
5.根据权利要求4所述的药物活性物质为胰岛素、双胍类、磺脲类，其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍，磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平。
6.根据权利要求4所述的药物载体为热休克蛋白HSP60/65。
7.根据权利要求4制成的组合物在制备降血糖产品上的应用。
8.根据权利要求4制成的组合物在治疗1型糖尿病药物中的应用。
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