CN108218995A - 一种多肽作为b细胞表位或肽半抗原的免疫刺激物构成多肽免疫原及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含T辅助细胞表位(Th表位)的多肽可作为B细胞表位或肽半抗原的免疫刺激物构成多肽免疫原及其用途。将B细胞表位或肽半抗原通过连接肽和多肽共价连接，形成多肽免疫原，经小鼠多次筛选分析，获得含该多肽的多肽免疫原，能显著增强B细胞表位或肽半抗原的免疫原性，产生与目标抗原蛋白特异结合的抗体，显著增强偏向Th2的免疫调节，改善病症。同时本发明提供的多肽及含该多肽的免疫原及衍生物和类似物也可以用于重组微生物和能转基因的动物或植物及细胞，使它们作为生产工厂，能生产疫苗或制作口服疫苗或生产特异抗体及衍生物和改造物，用于防治Th1占优势的疾病包括但不限于糖尿病及并发症、类风湿性关节炎等和用于开发检测试剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种含T辅助细胞表位(Th表位)的多肽及其应用，尤其是此多肽用于和B细胞表位或肽半抗原---一种目标抗原蛋白的目标抗原位点共价连接成为新型多肽免疫原，可以作为B细胞表位或肽半抗原的免疫刺激物，增强目标抗原位点(B细胞表位或肽半抗原)的免疫原性并可用于制备特异的与含B细胞表位或肽免疫原的目标抗原蛋白结合的抗体，含有该多肽的新型多肽免疫原及偶联蛋白和融合蛋白以及基于其生产的特异抗体以及含有该多肽的衍生物和类似物及其基础上产生的特异抗体和抗体衍生物和类似物的药物及制剂，在预防和治疗Th1占优势诱导的疾病等方面具有重要应用价值，特异抗体及其衍生物和类似物可检测相关目标抗原蛋白，开发为检测试剂。本发明涉及免疫学、药学及医学相关领域。
背景技术
人类和动物同样存在两个辅助性T淋巴细胞亚群，Th1细胞主要产生Th1类细胞因子IL-2、TNF-β和IFN-γ；Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。正常情况下，辅助性T淋巴细胞亚群Th1/Th2细胞处于平衡状态，但机体发生功能异常时，常表现出平衡偏向其中一方，此即为″Th1/Th2平衡漂移″。习惯上把Th1及其细胞因子占优势的状态称为Th1状态，Th2及其细胞因子占优势的状态称为Th2状态。Th1/Th2平衡影响细胞因子网络的平衡，与许多疾病的发生、发展、治疗、转归有密切的关系，不同的自身免疫性疾病中，Th1/Th2平衡失调的表现各不相同。类风湿性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化及慢性甲状腺炎等疾病中，Th1或Th1分泌的细胞因子占优势，Th1诱导发病，加重病情；Th2则能减轻病症，甚至阻止发病，这与Th1/Th2的炎性及抗炎性反应有关。基于Th1/Th2漂移状态与各种疾病的关系，越来越多的研究正倾向于发现、开发能逆转或稳定Th1/Th2状态的药物和方法。
表位是蛋白质抗原性的基础，蛋白质抗原通过表位体现其免疫特性，就某一蛋白质而言，它含有多种表位如B细胞表位又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，T辅助细胞(Th)表位等等，还有抑制性表位，毒性表位，交叉反应性表位等等。选择合适的表位并且通过合适的方法与其他肽或者蛋白质等等连接以及用什么佐剂及剂型，如何免疫等等才能得到理想的多肽和蛋白疫苗，产生特异的高效价(高滴度)抗体是有巨大的挑战性的。小鼠体内Th1会产生IgG2a亚型抗体，Th2型则会产生IgG1和IgG2b亚型抗体，Th2亚型抗体可以增加Th2型细胞因子的产生并能治疗Th1偏高疾病，缓解病症。
当前判断疾病免疫发病机制中Th1或Th2细胞效应为主导的方法，主要是依据炎症组织局部细胞因子的表达，也可根据外周血清中抗体反应亚类的变化进行判断。在动物模型的研究中，根据干扰Th1或Th2细胞效应的各种环节后Th1或Th2细胞效应的变化来判断的与Th1偏高相关的人类感染疾病及自免疫性疾病有1型糖尿病及并发症，肾脏病，肾炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，多发性硬化，自身免疫性甲状腺炎，接触性皮炎，结节性红斑，习惯性流产等等。
B细胞表位或肽半抗原的确定对多肽疫苗的合成、诊断试剂的制备、单克隆抗体的筛选等研究工作具有重要意义，但是B细胞表位或肽半抗原促使机体产生高滴度抗体的前提是要具有强免疫原性，通常为了增加B细胞表位或肽半抗原的免疫原性，通过将B细胞表位或肽半抗原偶联到载体蛋白质上增加Th 应答，该方法存在一些不利之处。多肽免疫原诱导特异的抗体应答，必需包括B细胞表位(或肽半抗原)和Th细胞表位，这已经很清楚。选择合适的T辅助细胞(Th)表位及其与B细胞表位或肽半抗原的合适的连接来显著提高B细胞表位或肽半抗原的免疫原性是一个难题。
P277肽是HSP60的437～460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前以进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化；将P277分成P1肽段(437～450)和P2肽段(448～460)两部分，已经证实P1多肽具有一定的促动脉粥样硬化作用，而P2多肽是P277对T1DM起主要作用的Th2表位肽。
胰岛细胞特异抗原-胰岛素瘤相关蛋白(Insulinoma associated protein-2，IA-2)被认为是启动自身免疫性糖尿病即1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)的主要靶抗原之一，主要在脑部，胰腺，胰岛瘤，神经内分泌细胞中表达。IA-2的近膜区JM2的626～630位的线形序列是一个B细胞表位(626FEYQD630)，命名其为IA2(5)。以IA-2或者其中的B细胞表位免疫模型动物是1型糖尿病防治的一个策略。
发明内容
发明目的：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种含T辅助细胞表位(Th表位)的多肽作为B细胞表位或合成肽半抗原的免疫刺激物及将其用于制备疫苗和抗体及开发药物和检测试剂，制备疫苗和抗体及衍生物和改造物可用于治疗Th1偏高疾病包括1型糖尿病及其并发症、动脉粥样硬化、心血管病、类风湿性关节炎、老年痴呆等疾病及检测相关特异目标抗原。
本发明的目的之二在于提供该多肽制备的技术方案。
本发明涉及一种多肽，其特征在于该多肽含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1和氨基酸序列2，所述氨基酸序列1是胰岛素瘤相关蛋白IA-2的B细胞表位IA2(5)，氨基酸序列分别见SEQ ID NO.1；所述氨基酸序列2是P277的C端的Th2细胞表位P2，氨基酸序列分别见SEQ ID NO.2。
在于提供该多肽的制备方法，其特征在于其氨基酸序列的确定按照如下步骤实现：
将IA2(5)肽段FEYQD的C端和Th2表位P2肽段的N端直接或通过柔性肽或连接肽段的连接形成该多肽，命名为IA2(5)-P2，IA-2(5)-P2-1，IA-2(5)-P2-2，IA-2(5)-P2-3等。进一步，将该多肽IA2(5)-P2或IA-2(5)-P2-1，IA2(5)-P2-2或IA-2(5)-P2-3等再和B细胞表位或合成肽半抗原(以B表示)的C端通过柔性肽或连接肽共价连接，形成新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA2(5)-P2-2，B-IA2(5)-P2-3等，该多肽可以显著增强B细胞表位或合成肽免疫原的免疫原性。
进一步，也可以是IA2(5)肽段FEYQD的C端和B细胞表位或肽半抗原通过柔性肽或连接肽共价连接后，再和Th2表位P2肽段的N端通过柔性肽或连接肽段的连接形成新型多肽免疫原IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1，IA2(5)-B-P2-2，IA2(5)-B-P2-3等，也可以显著增强B细胞表位或合成肽免疫原B的免疫原性。
进一步，在于提供能将线形B细胞表位IA2(5)与P2肽段连接起来形成新型多肽的柔性肽或连接肽段的氨基酸序列，或者是IA2(5)肽段FEYQD的C端和B细胞表位或肽半抗原B共价连接再和Th2表位P2肽段的N端连接起来的柔性肽或连接肽段的氨基酸序列。
进一步，所述柔性肽或连接肽接头为Xaa1Xaa2Xaa3------Xaan，Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5、Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4、Xaa1Xaa2Xaa3、Xaa1Xaa2、Xaa、GGGGG、GGGG、GGG、GGS、GG、G、K、KK或其他短肽。Xaa1Xaa2Xaa3------Xaan，Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5和Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4所述氨基酸序列见SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。Xaan为任一种氨基酸残基，n为1，2，3---任何阿拉伯数字。
本发明的目的之三在于提供和该多肽能通过柔性肽或连接肽段连接的目标抗原的B细胞表位或合成半抗原，该多肽能作为B细胞表位或合成肽半抗原(B)的免疫刺激物，增强免疫原性。
进一步，制备方法是将该多肽IA2(5)-P2，IA-2(5)-P2-1，IA-2(5)-P2-2，IA-2(5)-P2-3的N端通过柔性肽或连接肽和目标抗原的B细胞表位或合成肽免疫原(B)的C端共价连接，形成新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA-2(5)-P2-1，B-IA-2(5)-P2-2，B-IA-2(5)-P2-3等。用该新型多肽免疫原多次小剂量免疫动物后可以产生高水平的能和B细胞表位或合成肽免疫原特异结合的Th2型抗体。
进一步，所述柔性肽或连接肽接头为Xaa1Xaa2Xaa3，GGG、GGS、GG、G、K、KK或其他短肽。Xaa1，Xaa2，Xaa3各为任一种氨基酸残基。
本发明的目的之四在于提供的该多肽及含该多肽的新型多肽免疫原也可以用于重组微生物和能转基因的动物或植物及细胞，使它们作为生产工厂，能够生产含该多肽的新型多肽免疫原及其融合蛋白和偶联蛋白或制作口服疫苗或生产特异抗体及其衍生物和类似物，减低目标抗原蛋白的含量和/或活性，显著调节Th1/Th2平衡失调，由Th1偏向Th2转移，显著改善疾病的发病症状。
本发明的目的之五在于提供包含免疫学有效量的所述包含该多肽的新型多肽免疫原及其偶联蛋白、融合蛋白的抗原肽和蛋白的组合物和串联物。
进一步，还包含药学上可接受的载体或者药学上可接受的辅料。所述的新型多肽免疫原和多肽疫苗与药物活性物质或药物载体制成组合物后的应用。
所述的药学上可接受的药物活性物质，包括但不限于：胰岛素、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平等等。
进一步，药学上可接受的载体，包括但不限于：热休克蛋白HSP60/65、门冬酰胺酶、门冬酰胺酶-TTP、门冬酰胺酶-TTP-CETPC，Fc，牛血清白蛋白(BSA)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，聚乙二醇等。
进一步，所述药学上可接受的辅料：为填充剂、稀释剂、赋形剂、佐剂等。例如包括但不限于：弗氏佐剂、铝佐剂、乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水，甘露醇加Lipofundin力保肪宁等。
所述的辅料为填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水等。
本发明的有益效果在于：
含有该多肽的新型多肽免疫原免疫动物可以显著改善目标抗原位点的B细胞表位或合成半抗原的免疫原性并显著提高Th2亚型抗体的量，含有该多肽的新型多肽免疫原用于制备特异的与含B细胞表位或肽半抗原的目标抗原蛋白结合的抗体，可以减低目标蛋白的含量和/或活性，显著调节Th1/Th2平衡失调，由Th1偏向Th2转移，显著改善疾病的发病症状。以及含有该多肽及其衍生物和类似物和偶联蛋白和融合蛋白及其免疫产生的特异抗体和抗体衍生物和类似物的药物制剂，以及提供的该多肽及含此多肽的新型多肽免疫原用于重组微生物和转基因动物或植物，使它们作为生产工厂，生产含此多肽的新型多肽免疫原和融合蛋白和偶联蛋白或制作口服疫苗或生产特异抗体及其衍生物和类似物的药物制剂，在预防和治疗Th1占优势诱导的疾病风湿病，多发硬化症、糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、高血脂、高尿酸、老年痴呆、眼病、足病、心血管等方面具有重要应用价值，产生的特异抗体及其衍生物和类似物或改造物可供防治相关疾病或检测相关目标抗原蛋白，开发为药物或检测试剂。
进一步，当B细胞表位或合成半抗原选择为人二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase 4，DPP4)的优势B细胞抗原表位或合成肽半抗原，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原D41-IP，D41-2-IP和D41-3-IP或将其连接于IA2(5)与P2中间，形成IA2(5)-D41-P2-1等肽免疫原，在免疫正常小鼠后能产生高水平抗体，但是不引起低血糖，具有安全性；在免疫糖尿病模型小鼠后能产生特异性的与DPP4结合的抗体(属于Th2亚型)，升高Th2类细胞因子，调节Th1/Th2平衡，升高GLP-1量，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低血糖，能为治疗与DPP4异常、血糖异常、血糖代谢紊乱及Th1/Th2失衡引起的糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、老年痴呆、眼病、足病、心血管等疾病提供新途径；含DPP4优势B细胞抗原表位的新型多肽疫苗可以开发防治糖尿病，包括1型糖尿病，2型糖尿病，妊娠期糖尿病等类型糖尿病。也可以用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用。
进一步，当B细胞表位或合成半抗原选择为人黄嘌呤氧化还原酶(xanhtineoxidoreductase，XOD)的优势B细胞抗原表位或合成肽半抗原，将其与该多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原O-IA2(5)-P2，O-IA2(5)-P2-1，O2-IA2(5)-P2-2等多肽免疫原，或将其连接于IA2(5)与P2中间，形成IA2(5)-O-P2，在免疫小鼠后能产生特异性的与黄嘌呤氧化酶结合的抗体(属于Th2亚型)，升高Th2类细胞因子，调节Th1/Th2平衡，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低血糖，降低黄嘌呤氧化酶活性，增显著增强抗氧化能力。可以开发治疗糖尿病并发症的疫苗和抗体。以新型多肽免疫原免疫动物，再通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体属于Th2亚型，给药治疗高尿酸模型鼠，不降低动物血糖，可以特异性的与黄嘌呤氧化酶结合，升高Th2类细胞因子，调节Th1/Th2平衡，降低黄嘌呤氧化酶活性、降低血清尿酸和肌酐量，增加尿酸和肌酐排泄，保护肾脏。可以开发用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用。
进一步，当B细胞表位或合成半抗原选择为人HMG-CoA还原酶(是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶)的优势B细胞抗原表位或合成肽半抗原，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原HIP1和H24IP1等肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与HMG-CoA还原酶结合的抗体(属于Th2亚型)，降低HMG-CoA还原酶酶活，降低血脂，降低尿酸，升高SOD等等，可以开发用于制备Th2抗体供治疗疾病或检测用。
进一步，当B细胞表位或合成半抗原选择为人尿酸转运蛋白1(URAT1)的优势B细胞抗原表位，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原UIP-1，在免疫小鼠后能产生特异性的与URAT1结合的抗体(属于Th2亚型)，增加尿酸排泄，降低血清尿酸和肌酐，保护肾脏。可以开发用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用，具有重要理论价值和广阔应用前景，有重要社会和经济效益。
当选择人Th1占优势的Th1/Th2失衡相关疾病的目标抗原蛋白如类风湿性关节炎，老年痴呆的优势B细胞抗原表位或合成肽半抗原，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与含B细胞抗原表位的关键抗原蛋白结合的抗体(属于Th2亚型)，改善疾病症状。可以开发用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用。当选择其他Th2相关疾病的目标抗原蛋白，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与含B细胞抗原表位的关键抗原蛋白结合的抗体，可供开发检测试剂。
当选择其他的目标抗原蛋白的优势B细胞抗原表位或合成肽半抗原，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与含B细胞抗原表位的关键抗原蛋白结合的抗体(属于Th2亚型)，可以开发用于制备Th2抗体供检测用。具有重要理论价值和广阔应用前景，有重要社会和经济效益。
附图说明
为了使本发明目的，技术方案和优点清楚，结合附图对本发明进行进一步详细描述，其中：
图1为本发明含该多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA-2(5)-P2-2，IA2(5)-B-P2-1等(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1)的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2-1、IA2(5)-O-P2、H24IP1、HIP1和UIP-1)免疫C57BL/6J雄鼠后血清产生的特异性抗体的ELISA检测结果；
图2为本发明含该多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA-2(5)-P2-2，IA2(5)-B-P2-1等(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1)的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1)免疫C57BL/6J雄鼠后血清产生的特异性抗体亚型的ELISA检测结果；
图3为含该多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶)的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1)免疫C57BL/6J雄鼠后的细胞因子检测结果；
图4为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶)的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1)免疫C57BL/6J雄鼠后血清产生的特异性抗体分别与人DPP4(图4A，Lane 1：marker；Lane2：DPP4；Lane 3：D41-BSA；Lane 4：BSA；Lane 5：L-ASP无关蛋白质)和人黄嘌呤氧化酶(图4B，1：marker；Lane 2：BSA；Lane 3：人黄嘌呤氧化酶)和牛黄嘌呤氧化酶片段(图4C，1：marker；Lane 2：牛黄嘌呤氧化酶片段；Lane 3：BSA；Lane4：L-ASP无关蛋白质)特异结合的Western Blot实验结果图；
图5为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶)的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2、O-IA2(5)-P2-1、IA2(5)-O-P2、HIP1和H24IP1)免疫C57BL/6J雄鼠后分别抑制人DPP4(图5A)、嘌呤氧化酶(图5B)及HMG-CoA还原酶酶活性(图5C)的结果图；
图6为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA-2(5)-P2-2，IA2(5)-B-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1和UIP-1(图6A)，HIP1和H24IP1(图6B) 免疫C57BL/6J雄鼠后降血糖结果图；
图7为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1免疫C57BL/6J雄鼠后血清ELISA检测GLP-1和胰岛素结果；
图8为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA-2(5)-P2-1、UIP-1、HIP1、H24IP1)免疫C57BL/6J雄鼠后血脂，尿酸和肌酐的检测结果；
图9为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1(B分别为黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原O-IA2(5)-P2-1、UIP-1、HIP1、H24IP1)免疫C57BL/6J雄鼠后抗氧化应激的检测结果；
图10为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2-1分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1)免疫C57BL/6J雄鼠后胰腺免疫组化的检测结果；溶剂(见图10A)、IA2(5)-P2-1(见图10B)、D41-IP(见图10C)、O-IA2(5)-P2-1(见图10D)、HIP1(见图10E)，UIP-1(图10F)。
具体实施方式
实施例1：一种含T辅助细胞表位(Th表位)的多肽IA2(5)-P2、IA-2(5)-P2-1、IA-2(5)-P2-2和IA-2(5)-B-P2-1等的制备和合成。
选用IA-2的一个线形B细胞表位IA2(5)肽段，氨基酸序列1见SEQ ID NO.1，P277的C端的Th2表位P2肽段，氨基酸序列2见SEQ ID NO.2，运用分析软件及多次大量STZ糖尿病模型鼠实验的筛选分析鉴定修改，确定将两个表位直接或以柔性肽相连，将IA2(5)肽段FEYQD的C端和Th2表位P2肽段的N端直接或通过柔性肽或连接肽段的连接形成IA2(5)-P2、IA-2(5)-P2-1IA-2(5)-P2-2等，柔性肽连接肽氨基酸序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。IA2(5)-P2、IA-2(5)-P2-1IA-2(5)-P2-2氨基酸序列分别见SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；或将IA2(5)肽段FEYQD的C端和B细胞表位或肽半抗原通过柔性肽或连接肽共价连接后，再和Th2表位P2肽段的N端通过柔性肽或连接肽段的连接形成新型多肽免疫原IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1等，IA2(5)-D41-P2，IA2(5)-D41-P2-1和IA2(5)-O-P2的氨基酸序列分别见SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。肽采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。
实施例2：B细胞表位或合成肽半抗原B的制备和合成。
运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具，以单参数为基础，结合二级结构预测及空间结构特点，分别从一个目标抗原蛋白质(如：DPP4或XOD或HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1)的100多个表位中选出多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原B，通过与IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-B-P2-1、等以柔性肽连接，经过免疫动物实验筛选任何再改造再筛选的过程，获得免疫原性高的B细胞抗原表位或合成肽半抗原B。肽均采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。
实施例2-1当B为人二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)的优势B细胞抗原表位，制备方法是从其100多个表位中选出D41，D42，D43，D44-----等等多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原B，通过与IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2等的N端以柔性肽连接形成肽免疫原，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的B细胞抗原表位或肽半抗原D41，D42，D43等等。D41是DPP4的一段特异性多肽VFLENSTFDE，共10个氨基酸残基，氨基酸序列见SEQ ID NO.11。
实施例2-2当B为人黄嘌呤氧化还原酶(xanhtine oxidoreductase，XOD)的优势B细胞抗原表位，从其100多个表位中选出O1，02，03-----等等多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原B，通过与IA-2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2的N端以柔性肽连接形成肽免疫原，经过免疫动物实验筛选任何再改造再筛选的过程，获得免疫原性高的B细胞抗原表位或肽半抗原O，O1等等。0是黄嘌呤氧化还原酶的一段特异性多肽RLEPYKKKNPS，共11个氨基酸残基，氨基酸序列分别见SEQ ID NO.12。
实施例2-3当B为人HMG-CoA还原酶(是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶，从其100多个表位中选出H1，H2，H3-----等等多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原B，通过与IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2的N端以柔性肽连接形成肽免疫原，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的B细胞抗原表位或肽半抗原H，H1等。H和H1是黄嘌呤氧化还原酶的一段特异性多肽，氨基酸序列见SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
实施例2-4当B为人尿酸转运蛋白1(URAT1)的优势B细胞抗原表位，从其100多个表位中选出U1，U2，U3-----等等多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原X，通过与IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2等等以柔性肽连接，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的B细胞抗原表位或肽半抗原U1，U2，其采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。
实施例2-5当B为Th1占优势的Th1/Th2失衡相关疾病的关键抗原蛋白的优势B细胞抗原表位，从其100多个表位中选出B1，B2，B3-----等等多个优势B细胞抗原表位或合成肽肽半抗原B，通过与IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2等以柔性肽连接形成肽免疫原，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的B细胞抗原表位或肽半抗原B1，B2，其采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。
实施例3：新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2、B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2(B为B细胞表位或合成肽半抗原)的制备和合成。
运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具，以多个单参数为基础，结合二级结构预测及空间结构特点，从一个目标抗原蛋白质(如：DPP4或XOD或HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1等等)的100多个表位中选出多个优势B细胞抗原表位或肽半抗原B，将B的C端和IA2(5)-P2-1的N端连接，构成B-IA2(5)-P2、B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1等新型多肽免疫原，经过软件分析和动物实验多次筛选和改造，获得免疫原性高的含发明的多肽IA2(5)-P2、IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2、B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1)的优势B细胞表位或合成肽半抗原时分别构成新型多肽疫苗D41-IP(氨基酸序列见SEQ ID NO.15)、D41-2-IP(氨基酸序列见SEQ IDNO.16)、O-IA2(5)-P2(氨基酸序列见SEQ ID NO.17)、O-IA2(5)-P2-1(氨基酸序列见SEQ IDNO.18)、IA2(5)-O-P2-1、HIP1(氨基酸序列见SEQ ID NO.19)、H24IP1(氨基酸序列见SEQ IDNO.20)和UIP-1。
上述叙述的新型多肽均采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。分析用肽采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞95％，再和蛋白质偶联。
实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。所用试剂盒均按照制造产品厂商所建议的条件进行。
实施例4：含本发明多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1的优势B细胞表位或肽半抗原)D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1)的免疫原性和药效学评价。
实施例4-1、含本发明多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1)免疫STZ诱导的糖尿病模型鼠的免疫原性和药效学评价。
实施例4-1-1.STZ诱导的糖尿病模型鼠的的建立
采用小剂量连续多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠糖尿病(DM)模型。4周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自扬州大学比较医学中心)用0.1M pH4.4柠檬酸盐缓冲液配置STZ浓度为7.5mg/ml，按50mg/kg剂量腹腔注射，每日1次，连续注射5次，于造模后第3、7、14天测定血糖值，以空腹血糖连续两次≥11.1mmol/L为成模标准。
实施例4-1-2.造模成功后动物免疫的治疗实验
几十只糖尿病模型小鼠随机分成3组，每组10只，分别为：placebo组(溶剂对照组，阴性对照组)、IA-2(5)-P2、IA-2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2对照组、D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1给药组。给药组药物浓度均为1mg/ml，给药量为100μg/只/次，即100μl药液；阴性对照组：100μl油剂/只/次。药物配置方法按1mg+40mg甘露醇溶于1ml20％Lipofundin的比例临时配置油剂。在模型成功(以血糖≥11.1mmol/L为准)后第2周开始进行动物免疫。每周给药1次，连续5次，再分别于7、9、11周免疫三次，共计8次。
实施例4-1-3.含本发明多肽的新型多肽免疫原D41-IP、D4-2-IP、O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1分别免疫C57BL/6J雄鼠后血清产生的特异性抗体的ELISA和抗体效价检测：
包被稀释液(0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)稀释X-BSA，以BSA作为对照组，分别配成终浓度为0.5mg/mL的溶液，96孔酶标板中每孔加入0.1mL，4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加入5％脱脂奶粉(pH7.4PBS配制)封闭液，4℃满孔封闭过夜；弃去封闭液，每孔加入1∶100，5％脱脂奶粉稀释的抗原肽免疫的小鼠血清0.1mL，37℃孵育1h；弃去血清，每孔用PBST(含0.5％吐温-20的PBS溶液)和蒸馏水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次；洗涤后，每孔加入5％脱脂奶粉稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG二抗0.1mL，稀释倍数1∶5000，(效价测定时分别稀释1∶100，1∶1000，1∶5000，1∶10000，1∶15000)37℃孵育1h；弃去二抗液，每孔用PBST和蒸馏水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次；洗涤后，每孔加入0.1mL TMB显色液，37℃反应30min后，加入2mol/L的H2SO40.1mL终止反应；双蒸水调零，酶标仪450nm波长下测定各孔的OD值。结果如图1所示，实验结果表明，含本发明多肽的新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1分别免疫糖尿病小鼠后血清中产生针对B的特异性抗体量显著增加，与溶剂组和IA2(5)-P2-1、IA2(5)-P2-2组相比具有统计学差异(P＜0.001\P＜0.01\P＜0.05)。效价检测显示：D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1的血清抗体效价均在8000到10000之间，故可以用于制备抗体，开发治疗药物和检测试剂。
实施例4-1-4.为本发明含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1分别免疫C57BL/6J雄鼠后产生的特异性抗体亚型的ELISA检测：
购自酶免生物，按照试剂盒说明书操作，每孔加入50ul标准品，或者5倍稀释的血清。每孔加入100ul酶标二抗，保鲜膜缠绕后37℃孵育60min。washsolution满孔洗板5次。每孔加入50ul底物A和50ul底物B，轻轻混匀，37℃避光孵育15min。每孔加入50ul终止液(2MH2SO4)(颜色由蓝变黄)。15min内在450nm波长处测定OD值。以标准品的OD值为横坐标，浓度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品浓度。结果如图2所示，实验结果表明，多肽免疫原(包括D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1)分别免疫糖尿病小鼠后血清中针对B的特异性Th2抗体IgG1和IgG2b量显著增加，D41-IP与溶剂组和IA2(5)-P2组相比IgG1和IgG2b量显著增加，具有统计学差异(P＜0.01)。O-IA2(5)-P2-1和UIP-1与IA2(5)-P2组相比IgG1和IgG2b量显著增加(P＜0.05)。故可以用于制备Th2抗体，治疗Th1偏高疾病。
实施例4-1-5.为含本发明多肽的的多肽免疫原D41-IP和O-IA2(5)-P2-1在免疫治疗STZ诱导的糖尿病C57BL/6J雄鼠模型后细胞因子检测：
细胞因子测定根据试剂盒说明书进行。简要实验步骤为1、标准品和样品的稀释与加样。在96孔板上准确加入标准品50μl，或者5倍稀释的血清。2、温育，用封板膜封板后置于37℃温育30分钟。3、洗涤，弃去液体后甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。4、每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。5、温育，操作同2。6、洗涤，操作同3。7、显色，每孔加入50μl底物A和50μl底物B，轻轻混匀，37℃避光孵育15min。8、终止，每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)(颜色由蓝变黄)。9、测定，空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。实验结果见图3，结果表明，D41-IP、O-IA2(5)-P2-1免疫C57BL/6J小鼠后，IL-10(图3)水平显著升高，IFN-γ(图3)水平显著降低，与溶剂组相比具有统计学意义(P＜0.01)说明Th2介导的免疫应答升高，Th1介导的免疫应答下降。这证明D41-IP、O-IA2(5)-P2-1可以调节糖尿病小鼠体内Th1/Th2失衡，更多的干预免疫平衡向Th2转化。D41-IP、O-IA2(5)-P2-1的免疫可用于治疗由体内Th1/Th2失衡引起的疾病，如1型糖尿病及其并发症，炎症反应等其他Th1/Th2失衡相关的疾病。
实施例4-1-5.含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1分别免疫C57BL/6J雄鼠后血清产生的特异性抗体分别与人DPP4和黄嘌呤氧化酶特异结合的WesternBlot实验：
依据Western Blot标准操作规程，将DPP4转移到PVDF膜上，转移条件为100V，5h；转移后的PVDF膜至于25mL封闭缓冲液中室温下摇动1h。15mL TBST洗3次(5min/次)；然后将PVDF膜浸泡于1∶10稀释的抗原肽免疫小鼠血清中，室温孵育1-2h或4℃过夜，缓慢摇动，15mL TBST洗3次(5min/次)。再加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。PBST洗膜3次，每次10min。加入DAB显色液进行显色。充分显色后将膜转移至去离子水中终止显色反应。结果如图4所示，结果如图4所示，结果表明：D41-IP(见图4A)、O-IA2(5)-P2-1(见图4B)分别免疫小鼠后产生的血清中抗体能与含B的目标蛋白质抗原人DPP4、人黄嘌呤氧化酶特异结合，而不和无关蛋白质结合，O-IA2(5)-P2-1(见图4C)免疫小鼠后产生的血清还能和牛的黄嘌呤氧化酶片段结合，因此，多肽免疫原免疫动物产生的抗体可以开发供检测目标抗原及其片段用。
实施例4-1-6.含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1、HIP1和H24IP1分别免疫C57BL/6J雄鼠后的血清抑制体外DPP4和黄嘌呤氧化酶活性及血清HMG-CoA还原酶活性测定：
实施例4-1-6-1.多肽免疫原免疫C57BL/6J雄鼠后的血清抑制体外酶活性的抑制率测定按照江南大学苗雷文献方法测定，总反应体系100ul，将血清，缓冲液，酶于37摄氏度下分别孵育30分钟；设4组，按照酶，缓冲液，底物的顺序加入96孔板，37℃恒温培养箱反应60min，测定405nm处的吸光度。比较各组OD405的值，计算抑制率。结果如图5A所示，结果表明：与溶剂和IA-2(5)-P2-1比较，D41-IP免疫小鼠后产生的血清能显著抑制体外DPP4的活性(P＜0.001)。
4-1-6-2.O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1免疫C57BL/6J雄鼠后的血清抑制体外黄嘌呤氧化酶活性的抑制率测定按照文献方法测定，总反应体系2.45ml。血清取10ul加40ul缓冲液稀释到50ul。不加抑制剂的两管(OD2，OD4)按表格试剂加完之后，立马测量吸光度。加抑制剂的两管(OD1，OD3)，先加缓冲液，再加抑制剂，再加酶，37℃孵育20分钟后，加入底物后混匀，60秒后测定294nm处的吸光度。比较各组OD294的值，计算抑制率。结果如图5B所示，结果表明：与溶剂比较，O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1免疫小鼠后产生的血清能小显著抑制体外黄嘌呤氧化酶的活性(P＜0.01)
实施例4-1-6-2.HIP1免疫C57BL/6J雄鼠后的血清HMG-CoA还原酶活性测定试剂盒购自上海宝曼公司，测定方法按照说明书进行。结果如图5C所示，结果表明：与溶剂和IA-2(5)-P2-1比较，HIP1免疫小鼠后产生的血清中HMG-CoA还原酶活性显著降低(P＜0.01)，H24IP1免疫小鼠后产生的血清中HMG-CoA还原酶活性显著降低(P＜0.05).
实施例4-1-7.含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、O-IA-2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1分别免疫C57BL/6J雄鼠后降血糖实验：
在模型成功(以血糖≥11.1mmol/L为准)后每周给药1次，连续5次，再分别于7、9、11周免疫三次，共计8次。每次免疫前将糖尿病小鼠断尾取血，取血时用血糖监测仪检测小鼠血糖水平。结果如图6所示，实验结果表明，多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP和O-IA2(5)-P2-1(图6A)、HIP1和UIP-1(图6B)免疫糖尿病小鼠后可显著性降低小鼠血糖，D41-IP与溶剂组和IA-2(5)-P2组相比具有统计学差异(P＜0.001)。D41-2-IP，O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1与溶剂组相比具有统计学差异(P＜0.01)。可以开发用于治疗糖尿病。
实施例4-1-8.含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP、O-IA2(5)-P2-1分别免疫C57BL/6J雄鼠后血清ELISA检测GLP-1或胰岛素水平：
小鼠血清中GLP-1水平的测定按照试剂盒说明进行(酶免生物科技有限公司)。按照试剂盒说明在450nm波长处测定OD值。D41-IP、O-IA2(5)-P2-1分别免疫C57BL/6J雄鼠7次后，测定血清中GLP-1水平。实验结果如图7所示。结果表明，D41-IP免疫后，小鼠体内GLP-1水平显著升高，和溶剂组和IA-2(5)-P2-1相比具有统计学差异(P＜0.01)。O-IA-2(5)-P2-1免疫后，小鼠体内胰岛素水平显著升高，和溶剂组相比具有统计学差异(P＜0.05)。可以开发治疗糖尿病。
实施例4-1-9.含新型多肽的新型多肽免疫原O-IA-2(5)-P2-1、HIP1和H24IP1、UIP-1免疫C57BL/6J雄鼠后血脂、尿酸、肌酐和抗氧化应激指标的检测；
小鼠血清血脂，尿酸和抗氧化应激的检测试剂有建成公司提供，按照试剂盒说明进行检测和计算。实验结果如图8和图9所示，结果表明，O-IA-2(5)-P2-1、HIP1和H24IP1、UIP-1免疫小鼠后，小鼠血清尿酸和肌酐显著降低，抗氧化作用显著增强，具有统计学差异(P＜0.05/P＜0.05)。HIP1免疫小鼠后，小鼠血清血脂显著降低，具有统计学差异(P＜0.05/P＜0.05)。故也可以缓解糖尿病并发症。
实施例4-1-10.含新型多肽的新型多肽免疫原D41-IP，O-IA2(5)-P2-1、HIP1和UIP-1免疫治疗C57BL/6J雄鼠后胰腺的胰岛素免疫组化鉴定；
动物实验结束时，取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS(磷酸盐缓冲液)洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块固定和包埋，切片，切片上滴加胰岛素抗体处理，滴加生物素化第二抗体(IgG)处理，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟；，DAB显色，洗涤，中性树脂封片，显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性和阴性组织进行200×的显微照相。实验结果如图10所示，实验结果表明，D41-IP(图10C)，O-IA2(5)-P2-1(图10D)、HIP1(图10E)和UIP-1(图10F)免疫小鼠后，与溶剂(图10A)和IA-2(5)-P2-1(图10B)对照相比，小鼠胰岛炎得到显著改善，胰岛分泌胰岛素量明显增加。可以开发保护胰岛药物。
实施例4-2、含本发明多肽的新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1、B-IA2(5)-P2-2、IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1(B分别为人DPP4、黄嘌呤氧化酶、HMG-CoA还原酶和尿酸转运蛋白1的优势B细胞表位或肽半抗原时分别构成新型多肽免疫原D41-IP、D41-2-IP、O-IA2(5)-P2、IA2(5)-O-P2、O-IA2(5)-P2-1、H24IP、HIP1和UIP-1)免疫NOD1型糖尿病模型鼠的免疫原性和药效学评价。
按照STZ模型鼠同样给药方法免疫NOD小鼠，结果显示，多肽免疫原能有效控制糖尿病血糖，糖耐量，胰岛炎等发病症状，作用和机理同STZ模型鼠。
结论：本发明的含T辅助细胞表位(Th表位)的新型多肽的N端和B细胞表位或肽半抗原---一种目标抗原蛋白的目标抗原位点B的C端共价连接，形成为新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA2(5)-P2-2，IA2(5)-B-P2-1等可以显著改善目标抗原位点(B细胞表位或肽半抗原)的免疫原性并用于制备特异的与含B细胞表位或肽免疫原的目标抗原蛋白结合的Th2亚型抗体，含有该新型多肽的新型多肽免疫原和基于其生产的Th2亚型特异抗体以及含有该新型多肽及其衍生物和类似物及其产生的特异抗体和抗体衍生物和类似物的药物制剂，在预防和治疗Th1占优势诱导的疾病等方面具有重要应用价值，Th2亚型特异抗体及其衍生物和类似物可检测相关目标抗原蛋白，开发为检测试剂。当B为DPP4的优势B细胞表位时，产生特异的高效价的能和DPP4结合的Th2抗体，抑制DPP4活性，升高GLP-1、保护β细胞，增加胰岛素分泌，显著降血糖，降低尿酸和肌酐，可用于DPP4异常、血糖异常、血糖代谢紊乱及Th1/Th2失衡引起的糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、老年痴呆、眼病、足病、心血管等疾病治疗上的应用。此外，制备的抗体可开发供治疗和检测用。当B为人黄嘌呤氧化还原酶(xanhtine oxidoreductase，XOR)的优势B细胞抗原表位，将其C端与IA2(5)-P2-1相连接的新型多肽免疫原在免疫小鼠后能产生特异性的与黄嘌呤氧化酶结合的抗体(属于Th2亚型)，升高Th2类细胞因子，调节Th1/Th2平衡，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低血糖，降低黄嘌呤氧化酶活性，增显著增强抗氧化能力。可以开发治疗糖尿病并发症的疫苗和抗体。以新型多肽疫免疫原免疫动物，通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体属于Th2亚型，给药治疗高尿酸模型鼠，不降低动物血糖，可以特异性的与黄嘌呤氧化酶结合，升高Th2类细胞因子，调节Th1/Th2平衡，抑制黄嘌呤氧化酶活性、增加胰岛素分泌，降低血清尿酸和肌酐量，增强抗氧化作用，保护肾脏。可以开发用于制备Th2抗体供治疗疾病或检测用。当B为人HMG-CoA还原酶(是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶，抑制HMG-CoA还原酶能阻碍内源性胆固醇合成)，的优势B细胞抗原表位或肽半抗原，将其C端与IA-2(5)-P2-1相连接的新型多肽免疫原HIP1和H24IP1在免疫小鼠后能产生特异性的与HMG-CoA还原酶结合的抗体(属于Th2亚型)，降低HMG-CoA还原酶酶活，降低血脂，增加胰岛素分泌，降低血糖，增强抗氧化作用，可以开发用于制备Th2抗体供治疗疾病或检测用。当B为人尿酸转运蛋白1(URAT1)，的优势B细胞抗原表位，将其C端与IA-2(5)-P2-1相连接的新型多肽免疫原UIP-1在免疫小鼠后能产生特异性的与URAT1结合的抗体(属于Th2亚型)，增加胰岛素分泌降低血清尿酸和肌酐，保护肾脏。可以开发用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用。当选择人Th1占优势的Th1/Th2失衡相关疾病的关键抗原蛋白如类风湿性关节炎，老年痴呆的优势B细胞抗原表位，将其与新型多肽通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与含B细胞抗原表位的关键抗原蛋白结合的抗体(属于Th2亚型)，改善疾病症状。可以开发用于制备Th2抗体供治疗相关疾病或检测用。当选择其他Th2占优势的Th1/Th2失衡相关疾病的目标抗原蛋白，将其与新型多肽的N端通过柔性肽或连接肽相连接形成新型多肽免疫原，在免疫小鼠后能产生特异性的与含B细胞抗原表位的关键抗原蛋白结合的抗体，可供开发检测试剂，具有重要理论价值和广阔应用前景，有重要社会和经济效益。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种多肽，其特征在于该多肽含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1和氨基酸序列2，氨基酸序列1和氨基酸序列2通过柔性肽或连接肽段的连接形成该种多肽，所述氨基酸序列1是胰岛素瘤相关蛋白IA-2的B细胞表位IA2(5)，所示氨基酸序列组成见SEQ IDNo.1；所述氨基酸序列2是P277的C端的Th2细胞表位P2，所示氨基酸序列组成见SEQ IDNo.2。
2.根据权利要求1所述的多肽，当IA2(5)的C端和P2肽段的N端直接或通过柔性肽或连接肽段的连接形成一种多肽，IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1，IA2(5)-P2-2，所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7。
3.根据权利要求1所述的多肽，当IA2(5)的C端和目标抗原的B细胞表位或肽半抗原的N端通过Gly，GlyGly，GlyGlyGly或其他小于3个氨基酸残基的连接肽连接后，再和Th2表位P2肽段的N端通过柔性肽或连接肽段的连接形成新型多肽免疫原IA2(5)-B-P2，IA2(5)-B-P2-1等。当其中B是二肽基肽酶4的B细胞表位D41并以Gly连接IA2(5)，再以柔性肽或连接肽段连接P2时，多肽免疫原所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.8和SEQ ID No.9，当B是黄嘌呤氧化酶的B细胞表位0时，多肽免疫原所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.10。
4.根据权利要求1-3所述的柔性肽和连接肽接头为Xaa1Xaa2Xaa3------Xaan，Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5、Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4、Xaa1Xaa2Xaa3、Xaa1Xaa2、Xaa、GGGGG、GGGG、GGG、GGS、GG、G、K、KK或其他短肽。Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5和Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4所述氨基酸序列见SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4。Xaan为任一种氨基酸残基，n为1，2，3---任何阿拉伯数字。
5.根据权利要求1-2所述的多肽，目标抗原的B细胞表位或肽半抗原通过Gly、GlyGly、GlyGlyGly或其他小于3个氨基酸残基的连接肽和多肽IA2(5)-P2，IA2(5)-P2-1，IA2(5)-P2-2共价连接，形成新型多肽免疫原B-IA2(5)-P2，B-IA2(5)-P2-1，B-IA2(5)-P2-2，当B是二肽基肽酶4的B细胞表位D41(氨基酸序列组成见SEQ ID No.11)并以Gly连接多肽时，形成的多肽免疫原所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.15和SEQ ID No.16，当B是黄嘌呤氧化酶的B细胞表位0(氨基酸序列组成见SEQ ID No.12)并以Gly连接多肽时，形成的多肽免疫原所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.17和SEQ ID No.18，当B是HMG-CoA还原酶的B细胞表位H和H1(氨基酸序列组成见SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)并以Gly连接多肽时，形成的多肽免疫原所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.19和SEQ ID No.20。
6.根据权利要求3和5所述的含B细胞表位或肽半抗原的目标抗原，包括但是不限于Th1偏高疾病的相关的目标抗原。
7.根据权利要求1-6所述的多肽和多肽免疫原及衍生物及其偶联蛋白和融合蛋白也可以用于重组微生物和能转基因的动物或植物及其细胞，使它们作为生产工厂，能够生产含此B细胞表位及含有此表位的多肽免疫原和偶联蛋白抗原及其融合蛋白或制作口服疫苗或生产特异的Th2抗体及其衍生物和类似物及药物。
8.包含免疫学有效量的权利要求1-7中所述的含此多肽的多肽免疫原及其偶联蛋白和融合蛋白的组合物或串联物。其特征在于：还包含药学上可接受的载体和药学上可接受的辅料。包含此多肽和多肽免疫原及其偶联蛋白和融合蛋白及由此抗原肽改构得到的抗原肽为有效成分的制剂，多肽及免疫原与药学上可以接受的载体连接的偶联蛋白或融合蛋白为有效成分的制剂的注射剂、缓释剂、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液。
9.根据权利要求1-8所述的该多肽和多肽免疫原以及其改构得到的免疫原及其免疫原组合物串联物等用于显著增强B细胞表位或肽半抗原的免疫原性，抑制目标抗原的活性，此抗体是Th2亚型。其特征在于：可用于治疗Th1偏高相关疾病。用于制备能和目标抗原特异性结合的抗体抑制剂及基于其用各种方法改造的抗体和衍生物及类似物。
10.根据权利要求1-9所述的含该多肽的免疫原和基于其生产的抗体及衍生物和改造物，可用于目标抗原异常、血糖和尿酸异常、氧化应激异常、血糖代谢紊乱及Th1偏高引起的疾病包括但不限于糖尿病及其并发症，肾病、高血脂、高尿酸血症、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、老年痴呆、眼病、足病、心血管等相关疾病的预防和治疗，及用于检测相关特异目标抗原或片段，开发检测试剂。
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