CN102633873B

CN102633873B - 一种肽及其应用、制备方法

Info

Publication number: CN102633873B
Application number: CN 201210141345
Authority: CN
Inventors: 刘景晶; 马艳君; 吴洁; 李泰明; 曹荣月; 金亮; 董元楷; 侯景; 黄文睿
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102633873A

Abstract

本发明提供了一种能用于预防和治疗糖尿病的肽。针对抗原多肽的弱免疫原性，将源于人HSP60的一段抗原表位多肽(IPALDSLTPANED)插入胰岛素相关蛋白2(insulinoma associated protein2)的近膜区线形B表位序列(HGDTTFEYQD)的下游，形成一种肽。该肽通过注射途径能显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能起到防治I型糖尿病的作用。同时本发明提供的肽也可用于转基因动物或植物和重组微生物，使它们作为生产该肽的工厂或制作口服疫苗，用于糖尿病及其相关疾病的预防和治疗。

Description

一种肽及其应用、制备方法

技术领域

本发明涉及药学及医学相关领域，特别涉及糖尿病的诊断、预防和治疗；更具体地说，本发明涉及一类肽、其制备方法和用途，以及含有该肽及其衍生物和类似物的药物制剂，能用于诊断、预防和治疗人糖尿病。

背景技术

糖尿病(Diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现。糖尿病是现代疾病中的第二杀手，其对人体的危害仅次于癌症。糖尿病带来的危害，几乎都来自它的并发症。糖尿病与心血管疾病有密切联系已成为不争的事实。临床观察表明，糖尿病的主要致死因素是心血管并发症，糖尿病人因心肌梗死而死亡者，可占糖尿病死亡人数的75％～80％。同样，在冠心病人群中，高血糖人群占总人群的2/3。糖尿病与冠心病、高血压等心血管病有许多相互关联的易感基因。糖尿病病人几乎具有所有与心血管疾病相关的危险因素，如高血糖、血脂紊乱、高血压、高血黏度、高血凝状态、高胰岛素血症、血管内皮功能失调、低度系统性炎症等。糖尿病不仅糖代谢异常，而且是一种糖脂病，即血糖血脂紊乱性疾病。

胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是由于胰岛β细胞破坏或功能缺失导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病，患者血糖水平持续升高，出现糖尿病。IDDM属于自身免疫性疾病。自身免疫性疾病(Autoimmune disease)是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态。通过一定的免疫途径来诱导机体对致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效预防自身免疫性疾病的发生。

热休克蛋白HSP60/65是一种高度保守的热激蛋白，也是重要的胰岛素依赖型糖尿病相关蛋白，在糖尿病患者和自发性糖尿病模型鼠(NOD小鼠)体内都能检测到抗HSP60抗体。在糖尿病患者体内检测到的抗HSP60抗体滴度与疾病严重程度正相关。人源HSP60和结核分枝杆菌HSP65大约具有50％的同源性。当病原体侵入时，机体的免疫系统针对病原体产生抵抗性的免疫应答，这时针对菌源HSP65的免疫反应赋予机体抗感染的能力，但同时由于人源HSP60和微生物源HSP65分子的高度同源性，免疫系统在识别菌源HSP65的同时也可能针对自身的HSP60产生应答，这种交叉免疫反应使得HSP65/60分子成为了一种危险的自身抗原。

P277肽是HSP60的一段含有24个氨基酸的功能性肽段，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在IDDM中发挥作用的特异片段，用该表位肽段能发展抗糖尿病治疗性疫苗，用人工合成的P277多肽通过皮下注射免疫NOD小鼠，能减少自发性糖尿病的发生率，明显延缓I型糖尿病的病情发展，保护胰岛β细胞不受免疫破坏。已经证实P277分子的C端P2(IPALDSLTPANED)肽段已包涵了整个文献报道的与自身免疫性糖尿病相关的T表位，是P277分子中治疗IDDM的关键性肽段，我们将胰岛细胞特异抗原一胰岛素相关蛋白2(IA-2)的B表位序列插入在P2的N端，制成的肽IA-2-P2能有效预防和治疗糖尿病。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是提供一种新型多肽疫苗，能有效预防和治疗糖尿病。

技术方案：

一种肽，其特征在于其氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED，含有上述氨基酸序列、通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。

一种肽在制备预防或治疗I型糖尿病药物中的应用。

所述的肽与药物载体或药物活性物质组合制成组合物在制备预防或治疗I型糖尿病药物中的应用。

所述的药物载体为热休克蛋白HSP60/65；所述的药物活性物质为胰岛素、磺脲类、双胍类；其中磺脲类药物包括格列苯脲、格列齐特、米克胰、格列博脲、克糖利、格列喹酮、糖适平、糖肾平、美吡达；所述的双胍类包括苯乙双胍、二甲双胍、丁二胍。

一种肽在制备预防或治疗I型糖尿病药物中的应用。

一种肽的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

将源于人HSP60的一段抗原表位多肽IPALDSLTPANED插入胰岛素相关蛋白2的表位序列HGDTTFEYQD的下游，形成一种肽，其氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED。

有益效果：

P277是人热休克蛋白HSP60中437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460的一段多肽，由24个氨基酸组成。P277的后12个氨基酸的片段(449～460)含有关键的T表位，NOD小鼠体内分离的脾细胞以及体外建立的自身免疫性糖尿病HSP65/60反应性T细胞系都对这个片段有强烈的应答，其应答程度与全P277分子相当。这提示P277中与预防自身免疫性糖尿病相关的T表位很可能位于后半段，该片段起到了预防糖尿病的主要作用。

HSP60尽管也是胰岛细胞产生的糖尿病相关抗原，但在血管内皮细胞以及机体的许多细胞中都有表达，不是胰岛细胞特异的。胰岛素相关蛋白2(IA-2)相应的自身抗体是胰岛素依赖型糖尿病的特异性血清标志物，对新发病的胰岛素依赖型糖尿病患者的敏感性超过80％。IA-2抗原是胰岛细胞特异抗原但不是β细胞特异抗原，选择IA-2抗原B表位主要还在于要评估选择胰岛细胞特异抗原B表位是否也能在糖尿病疫苗中起到辅助作用。本发明中选用IA-2近膜区JM2的两个线形B表位：IA-2的626～630位(626FEYQD630)和IA-2的621～628位(621HGDTTFEY628)，即用621HGDTTFEYQD630替换P277的347～446位肽段。

本发明的优点在于用更加安全的胰岛素相关蛋白2的B辅助表位替换了P277肽中347～446位肽段，构建了一种更加有效预防糖尿病的新型疫苗肽。实验结果证明新疫苗肽IA-2-P2能够有效地降低NOD小鼠糖尿病的发病率、延缓糖尿病的发病进程、有效控制已发病NOD小鼠的血糖并降低胰岛炎级别、维持NOD小鼠的体重稳定、明显延长NOD小鼠的生存率等。IA-2-P2肽抗IDDM的效果与P277相当，而且IA-2-P2肽比P277能明显延长NOD小鼠的生存率。

附图说明

图1对NOD小鼠糖尿病累积发病率的影响；

图2为NOD小鼠的生存率统计；

图3为对NOD小鼠胰岛形态的影响，其中A：control组；B：placebo组；C：P277组；D：P2组；E：IA-2-P2组；

图4为固相合成本发明多肽的流程图。

具体实施方式

实施例1：肽的制备过程

合成一种肽其氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED(命名为IA-2-P2，见SEQ NO.1)，其具体流程图见图4；P277(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，见SEQ NO.2)；P2(P277中的T表位序列，IPALDSLTPANED，见SEQ NO.3)，上述肽类均由吉尔生化上海有限公司采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。

其具体制备方法如下：

1.树脂的选择

多肽是从C端向N端开始连接，所以多肽合成是按序列反向合成。首先选择Fmoc-Asp(Otbu)-OH Wang Resin；

2.Fmoc的去除

每接下一个氨酸之前先要去除上一个氨基酸氨基上的保护基团。把配好的去保护液(20％六氢吡啶和80％DMF)加入反应器，用氮气吹30min左右，然后抽掉，再用DMF清洗5-6遍，并检测树脂颜色(一般呈蓝色或棕色)。

3.氨基酸缩合

去保护后把称取的原料和固体缩合剂(tbtu、hobt)加入反应器，加入DMF通入氮气，待氨基酸和缩合剂溶解完全后加入相应的液体激活剂(DIEA)进行下反应！原料和固体激活剂一般都是三倍投料。反应相应的时间后，取少量树脂检测(树脂无色透明表明反应完全)！

4.切割

把合成好的多肽加入切割液中，用搅拌器搅拌2-3小时后滤出切割液，加入乙醚中多肽即会析出。用滤纸过滤出多肽，再用乙醚洗4-5遍得到粗品肽。

5.纯化

把切割好的粗品肽抽干后拿给纯化。根据需要得出相应纯度的精品。

实施例2：肽IA-2-P2的药效学评价

1、动物免疫

60只4周龄雌性非肥胖型糖尿病(NOD/Lt)小鼠(购自上海斯莱克实验动物中心(Slaccas Experimental Animal)，许可证号：SCXK2003-0003。)随机分成5组，每组12只，分别为：control组(空白对照组)、placebo组(溶剂对照组，阴性对照组)、P277组(阳性对照组)、P2组(阳性对照组)、IA-2-P2组。给药前按1mg多肽+40mg甘露醇溶于1ml20％Lipofundin的比例临时配置油剂。在第4、7、10周龄时分别皮下注射给药，共3次。给药组药物浓度均为1mg/ml，给药量为80μg/只/次，即80μl药液；阴性对照组：80μl油剂/只/次。

2、对NOD小鼠糖尿病累积发病率的影响

每次免疫前从NOD小鼠眼眶静脉丛取血一次，最后一次免疫结束后10天取血一次，此后每月小鼠眼底丛静脉丛取血一次，取血时用血糖检测仪(怡成5D-1型)检测NOD小鼠血糖水平。两次连续测定血糖浓度＞11.1mmol/l视为发生糖尿病。结果如图1所示，在4周龄开始免疫前至10周龄免疫结束后，各组小鼠都是健康且未发病的。从12周龄起，空白对照组(control组)和阴性对照组(placebo组)的NOD小鼠即陆续发病；从16周龄起发病率明显上升，在24～40周龄内，累积有大约80％的NOD小鼠发病；control组和placebo组的NOD小鼠糖尿病的发病率没有统计学差异，p＞0.05。

阳性对照组P277组和P2组的NOD小鼠糖尿病发病率在20～32周内一直维持在低水平(不到30％)；观测期结束时的终末累积发病率分别为33.3％和41.7％，与control组和placebo组的终末累积发病率相比均有统计学差异，p＜0.05。IA-2-P2组NOD小鼠的发病率始终保持在较低水平，在32周龄时发病率最高约为41.7％，随后发病率迅速下降到25％左右，在观测末期稍有上升，最终累积发病率为33.3％，与control组和placebo组相比均有统计学差异，p＜0.05，而与阳性对照P277组和P2组相比没有统计学差异，p＞0.05。结果表明，经IA-2-P2免疫可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率，p＜0.05。

3、生存率统计

动态检测所有组别NOD小鼠在观测期内生存率的变化。记录NOD小鼠死亡时间。结果如图2所示，control组和placebo的NOD小鼠死亡的高峰期紧随其糖尿病发病的高峰期，即这两组NOD小鼠发病不久后即迅速死亡；早在11周，placebo组即开始有NOD小鼠陆续死亡；截至28周，control组和placebo组的NOD小鼠已有50％死亡。在观测期结束时，各组NOD小鼠的生存率分别如下：control组和placebo组：50％；P2组：为67.7％；IA-2-P2组：83.3％。其中，IA-2-P2组在接近观测末期之前NOD小鼠的生存率高达91.7％，仅在24和37周有两只NOD小鼠死亡。结果表明，IA-2-P2免疫后，与control组和placebo组相比，能明显延长NOD小鼠的生存率，p＜0.01，且效果优于P277阳性对照组，p＜0.05。

4、对NOD小鼠胰岛形态的影响

胰腺由外分泌部腺泡细胞和内分泌部胰岛组成。腺泡细胞呈锥体形，顶部胞质内含嗜酸性染色的酶原颗粒，核位于细胞基部，核仁明显。胰岛分布于腺泡之间，HE染色细胞着色浅、排列呈团索状。如图3所示，control组和placebo组胰岛周围或内部明显可见炎细胞浸润，淋巴细胞浸润自胰岛近血管侧向远血管侧发展，随后全胰岛均被淋巴细胞浸润，形成全胰岛炎，并进一步纤维化萎缩变小。每个低剂量低倍镜下平均胰岛数量为0个，胰岛炎细胞高度浸润，胰岛病变越重。其它各给药组胰腺外分泌部胰岛组织学形态未见明显异常；内分泌部胰岛数量明显较control组和placebo组增多，炎细胞浸润程度减轻，其中，IA-2-P2组内分泌部胰岛数量增加最多，且未发生胰岛炎(0级)的胰岛细胞也最多，胰岛轮廓整齐，胰岛内细胞排列整齐，胞浆饱满，细胞界限清晰。Control和placebo组切片胰岛数目较少，胰岛形态大多不规则，细胞排列紊乱。P277和P2等阳性组均有不同程度的改观。

以上结果表明：各组新疫苗肽免疫后，NOD小鼠的胰岛损伤均有不同程度的减轻，提示给药后可减轻NOD小鼠的胰岛损伤性病变。其中，IA-2-P2组内分泌部胰岛数量增加最多，且未发生胰岛炎(0级)的胰岛细胞也最多。

Claims

1.一种肽，其特征在于其氨基酸序列为：HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED。

2.根据权利要求1所述的一种肽在制备预防或治疗I型糖尿病药物中的应用。