CN103191581B - 一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法，属于环境分析技术领域。该方法将温敏性聚合物EOPO与盐两相混合，它利用了表面活性剂在温度改变的情况下与水相亲和度改变的性质，结合无机盐形成双水相体系进行萃取分离的一种新的分离技术。这种新型的分离体系集双水相萃取优点，同时由于温敏性聚合物的温度分离性质，实现了二次萃取，使得萃取效率比一次萃取更高，同时相组分的回收利用，降低了实验成本。

Description

一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法

技术领域

本发明属于环境分析技术领域，涉及一种分离/富集食品中痕量环丙沙星(CIP)的新方法，特指以环氧乙烷与环氧丙烷的无规共聚物（EOPO）为萃取剂，以无机盐磷酸氢二钾(K₂HPO₄)作为分相的盐析剂，形成双水相体系（ATPS）分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法。

背景技术

环丙沙星是全合成的第三代哇诺酮类抗菌药, 具有抗菌谱广, 内在活性高, 穿透力强, 与其他抗菌药不易产生交叉耐药等特点, 因而临床上已广泛应用于各种全身感染。同时，从细菌核深处破坏了细菌的代谢和增殖，能迅速把细菌杀死，杀菌效果稳定，也广泛用于水产养殖中疾病的治疗，成为水产养殖中最重要的抗感染药物之一。但是，由于环丙沙星广泛的使用，在水产动物体内的残留增强了致病菌的耐药性，直接威胁公共卫生安全和生物安全、污染了自然环境，对人可以引起皮肤过敏、心动过速、胃肠道反应、光敏性皮肤病等副作用。美国等国家将其列入禁止在食品动物使用的兽药及其化合物清单。为了消费者健康，必须监控各种水产品药物残留，为此需要可靠的分析方法来监测这些药物残留。

样品分析最重要的环节是样品的前处理，它对分析方法的可靠性、准确性有重要影响。由于环境样品具有被测物浓度低、组分复杂、干扰物多，故一般都要经过前处理才能进行分析测定。目前，环丙沙星类抗生素残留的前处理方法主要为液-液萃取法、固相萃取法、基质固相分散萃取法、固相微萃取法、超临界萃取法、加压溶剂萃取法、超声波提取法和双水相萃取法。其中最常用的是固相萃取法，但是固相萃取使用有机溶剂，对环境污染较大，并且解吸附过程操作非常耗时。因此，需要建立一种高效、无毒、无污染的绿色分离/富集方法。

双水相体系是一类新型萃取分离体系，它是由两种聚合物或一种聚合物和一种盐的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系，具有无毒、无污染、萃取条件温和、样品易分离、操作简单等优点。与传统的双水相萃取体系相比，功能性聚合物-盐双水相体系使用的温敏性聚合物成本低且易于温度分离回收，分相时间短，萃取组分可以循环利用，达到绿色化学的目的。

1955年由Albertson首先利用双水相技术来分离生物分子，在随后的几十年中，这项技术有了长足的发展。近几年来，双水相技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了显著的成绩。由于其操作条件温和、有机溶剂用量少、可调节因素多及易于工业化放大和操作等，广泛用于物质的提取和分离富集。

发明内容

本发明建立了一种全新的样品前处理体系—温敏性聚合物/盐双水相体系 (ATPS)。该方法将温敏性聚合物EOPO与盐两相混合，它利用了表面活性剂在温度改变的情况下与水相亲和度改变的性质，结合无机盐形成双水相体系进行萃取分离的一种新的分离技术。这种新型的分离体系集双水相萃取优点，同时由于温敏性聚合物的温度分离性质，实现了二次萃取，使得萃取效率比一次萃取更高，同时相组分的回收利用，降低了实验成本。

本发明采用的技术方案是：

功能性聚合物盐双水相体系分离/富集食品中环丙沙星(CIP)，是以低成本的温敏性表面活性剂EOPO作为萃取溶剂，以磷酸氢二钾(K₂HPO₄)作为盐析剂对环丙沙星进行分离/富集的方法。

本发明具体步骤：一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法，按照下述步骤进行：

（1）在磨口离心管中，首先加入分相盐溶液，再加入100ng/mL环丙沙星标准溶液，最后加入质量浓度为80%的EOPO溶液，其中试液体积V_{环丙沙星标准溶液}：V_{分相盐溶液}:V_eopo:V_总体积=（0.5：6.5：3:10）；其中V_总体积即双水相体系总体积，分相盐溶液为质量浓度为55%K₂HPO₄；

（2） 加入固体盐调节溶液的离子强度，加入固体盐使分相盐溶液的浓度范围为20%-60%（w/w）；振荡使其充分溶解；其中所述的固体盐为（NH₄）₂SO₄、NaH₂PO₄、KCl、Na₂SO₄、K₂HPO₄或K₂CO₃；优选K₂HPO₄，K₂HPO₄的浓度为55%（w/w）；

（3）用高效液相检测法在波长274nm处分析测定CIP含量，反相色谱柱XDB-C18， 250 mm×4.6 mm，5 μm，no.G1314B，25 ℃。流动相比例为甲醇和水（pH=3.0）27:73 流速为1.0 mL·min^-1。

（4） 优选出萃取的最佳条件，EOPO (80%,w/w) 3mL , K₂HPO₄(55%,w/w)7mL, pH=11。

（5） 在优化的实验条件下结合高效液相法对食品中痕量环丙沙星的分离/富集分析。

本方法与一次双水相萃取技术相比具有富集倍数大，选择性好、无毒、分离效果好、成本低，且具有设备简单、灵敏度高、测量快速、提取物后处理简便、相组分可以回收及循环利用等特点。

附图说明

图1 分相盐的选择；

图2 K₂HPO₄浓度对CIP一次萃取率的影响；

图3 pH对CIP一次萃取率的影响；

图4 加入蒸馏水的量对CIP二次萃取率的影响；

图5萃取空白样品HPLC-UV色谱图。（mAu表示色谱峰的强度）；

图6一次萃取牛奶样品HPLC-UV色谱图；

图7二次萃取牛奶样品HPLC-UV色谱图；

图8一次萃取鸡蛋样品HPLC-UV色谱图；

图9二次萃取鸡蛋样品HPLC-UV色谱图；

图10一次萃取虾样品HPLC-UV色谱图；

图11二次萃取虾样品HPLC-UV色谱图。

具体实施方式

分相盐的选择

选择一种合适的分相是双水相体系的一个重要因素。功能性聚合物双水相，以温敏性聚合物EOPO为萃取剂，就要求一种既能与之形成双水相体系，也要对目标抗生素有很高萃取率的盐。实验中讨论了酸性盐（（NH₄）₂SO₄、NaH₂PO₄）、中性盐（KCl、Na₂SO₄）及碱性盐（K₂HPO₄、K₂CO₃）与EOPO形成双水相对CIP萃取率的影响。

固定上相EOPO体积加入量为3mL，六种分相盐浓度均接近饱和浓度（7mL）分别与之形成双水相对目标物进行萃取实验，实验结果如图1所示。从图中可以看出，在这三种不同类型的盐中，两种碱性盐的萃取率明显高于中性盐，最低的是酸性盐，我们最终选择K₂HPO₄作为双水相萃取的分相盐。

1)   K₂HPO₄浓度对CIP一次萃取率的影响

从图2中可以看出，当K₂HPO₄的浓度小于20%（w/w）时，双水相体系无法形成，所以在这部分我们选择讨论K₂HPO₄的浓度范围为20%-60%（w/w）。结果如图2，当在20%-55%（w/w）随着K₂HPO₄浓度增加，CIP萃取率不断增大，在K₂HPO₄浓度为55%（w/w）时CIP萃取率达到最大值82.14%；随后CIP萃取率随K₂HPO₄浓度增加而降低。我们选择K₂HPO₄的浓度为55%（w/w）进行后续实验。

2)   pH对CIP一次萃取率的影响

pH对CIP一次萃取率的影响结果见图3。 pH是影响萃取率的重要因素，由于选择碱性盐作为分相盐，pH环境就应该处于碱性范围内，试验中我们讨论的pH范围为8.0-11.0，随着pH值的增加，CIP的萃取率先下降在升高；当pH值为11.0时，CIP的萃取率达到最大（97.66%）；由于碱性的增加使得环丙沙星的盐酸盐被中和为中性盐，在下相接近饱和的盐溶液环境里被排斥的几率变大，萃取率就会随之变大，综上考虑，我们选择pH为11.0进行后续实验。

3)   加入蒸馏水的量对CIP二次萃取率的影响

加入蒸馏水的量对CIP二次萃取率的影响如图4所示。在进行第二次温度分离实验，必须加入蒸馏水使之与EOPO在温度诱导下形成新的两相体系，试验中讨论了1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL四个不同量对二次萃取率的影响，从图4得出，萃取率先上升在下降，在蒸馏水加入量为2.0时，二次萃取率达到最大（85.62%）。故本实验中选择加入蒸馏水的量为2.0mL。

4)   萃取实际样品HPLC-UV色谱图

(A)未加标的蒸馏水（图5）；(B1)加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的牛奶样品的一次萃取（图6）；(B2) 加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的牛奶样品的二次萃取（图7）；(C1) 加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的鸡蛋样品的一次萃取（图8）；(C2) 加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的鸡蛋样品的二次萃取（图9）；(D1) 加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的虾肉样品的一次萃取（图10）；(D2) 加标100 ng·g^-1CIP标准工作液的虾肉样品的二次萃取（图11）。

 表1

     EOPO的回收及循环使用的数据及CIP在每一步里的收率。

在上述最优化的实验条件下，本实验对三个实际样品(牛奶，鸡蛋，虾肉)进行了分析，经检测发现三个实际样品中都未检测出CIP。表1表示实际样品的加标回收率，可以看出一次回收率为83.1~97.66%，二次收率在83.8~86.8%，相对标准偏差为0.3~0.7%，表明此方法回收率是非常令人满意的。

表2实际样品中CIP的分析结果(注：ND 表示为未检出)

Claims (3)

1.一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）在磨口离心管中，首先加入分相盐溶液，再加入100ng/mL环丙沙星标准溶液，最后加入质量浓度为80%的EOPO溶液，其中试液体积V_{环丙沙星标准溶液}：V_{分相盐溶液}:V_eopo:V_总体积=0.5：6.5：3:10；其中V_总体积即双水相体系总体积，分相盐溶液为质量浓度为55%K₂HPO₄；

（2） 加入固体盐调节溶液的离子强度，加入固体盐使分相盐溶液的质量浓度范围为55%-60%；振荡使其充分溶解；其中所述的固体盐为（NH₄）₂SO₄、NaH₂PO₄、KCl、Na₂SO₄、K₂HPO₄或K₂CO₃；

（3）用高效液相检测法在波长274nm处分析测定CIP含量，反相色谱柱XDB-C18， 250 mm×4.6 mm，5 μm，no.G1314B，25 ℃；流动相比例为体积比为27:73的甲醇和水，流速为1.0 mL·min^-1 ，pH=3.0。

2.根据权利要求1所述的一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法，其特征在于所述的加入质量浓度为80%的EOPO溶液3mL , 分相盐溶液为质量浓度为55%K₂HPO₄ 7mL, pH=11。

3.根据权利要求1所述的一种分离/富集食品中痕量环丙沙星的方法，其特征在于所述的固体盐为K₂HPO₄，K₂HPO₄溶液的质量浓度为55%。