CN101502722A - 萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，由离子液体和无机盐形成的双水相体系实现了食品中残留抗生素的高效萃取。通过特定的吡啶类离子液体和特定的无机盐，按照1－20％(w/v)离子液体和40％－56％(w/v)无机盐组合后，使得离子液体双水相体系对食品中抗生素的萃取率≥90％，显著提高食品中抗生素残留检测的灵敏度和可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及一种离子液体双水相，尤其涉及一种离子液体—无机盐双水相体系，更具体的涉及一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系及其在抗生素残留检测中的应用。
背景技术
随着养殖业规模化的发展，兽药被广泛应用于养殖业中，用于预防和治疗动物疾病，与此同时也出现了滥用的趋向。在禁用兽药的检测技术方面，我国目前只有盐酸克伦特罗(GC-MS法)和己烯雌酚(HPLC-UV检测)的国家标准；农业部公布了10类药物的检测方法，其中只有硝基咪唑(液相色谱法)和氯霉素(液相色谱法)类物质属于禁用药物；进出口商品检验行业发布的包括己烯雌酚、雌二醇、雌三醇、丙酸睾酮、呋喃唑酮等16种禁用药物的气相色谱、放射免疫、酶联免疫、液相色谱等方法。这些方法中除了有国家标准的盐酸克伦特罗GC-MS检测法能够符合欧盟等国家对兽药残留检测的要求外，其他方法的灵敏度、选择性、特异性等都无法满足欧盟等国家对兽药残留检测的要求，这就造成了我国许多食品在国内检测是符合要求的，而出口到其他国家却被认为不符合要求，造成了巨大的经济损失。对食品中有残留限量检测要求的药物，我国目前已经有近50中方法，其中包括磺胺、四环素、青霉素、恶喹酸、氟甲喹、恩诺沙星、环丙沙星等药物的液相色谱分析方法。最近还公布了蜂蜜中15种磺胺类药物的液相色谱—质谱—质谱的检测方法，这些方法中的大部分存在灵敏度较差，样品前处理方法简单，样品基质干扰较大等问题。
上世纪90年代末，出于对环境污染问题的重视，随着绿色化学的兴起，人们掀起了对离子液体(Ionic Liquid)的理论和应用研究的热潮。目前研究的离子液体，基本上由含氮有机杂环阳离子和无机阴离子构成(如BF4 -、PF6 -等)，它们突出的优点是(A)液体状态温度范围广；(B)蒸汽压低，不易挥发；(C)对有机物、无机物都有良好的溶解性，使许多化学反应得以在均相中完成，且反应器体积大为减小；(D)密度大，与许多溶剂不互溶，当用另一溶剂萃取产物时，通过重力作用，就可实现溶剂和产物、催化剂和产物的分离，从而保证溶剂和催化剂的高效使用；(E)具有较大的可调控性，离子液体的溶解性、液体状态范围等物化性能，取决于阴、阳离子的配伍和离子液体—催化剂的物料配比，因而可根据需要，定向设计离子液体体系；(F)离子液体作为电解质具有较大的电化学窗口、良好的导电性、热稳定性和极好的抗氧化性。
随着研究的不断深入，离子液体已经在诸如聚合反应、选择性烷基化和胺化反应、酰基化反应、酯化反应、化学键的重排反应、室温和常压下的催化加氢反应、烯烃的环氧化反应、电化学合成、支链脂肪酸的制备等方面得到应用，并显示出反应速率快、转化率高、反应的选择性高、催化体系可循环重复使用等优点。此外，离子液体还应用于溶剂萃取、物质的分离和纯化、废旧高分子化合物的回收、燃料电池和太阳能电池、工业废气中二氧化碳的提取、地质样品的溶解、核燃料和核废料的分离与处理等方面。
夏寒松等人(化工学报，2006，57，2149—2151)分别对离子液体双水相成相规律中涉及的，如：辅助盐类型、液体离子阴离子类型和离子液体侧链进行了研究。结果得出减小离子液体头部极性、增长疏水侧链及采用疏水性阴离子都有利于双水相的形成离子液体阴离子对双水相形成有明显影响。将离子液体固定不变，如[C8min]Cl中加入不同的无机盐，所得相图簇间每条曲线的位置相差并不大。研究者认为无机盐可能起着非特征性的盐析作用，以渗透压作用推动双水相的形成。
研究人员通过亲水性离子液体[C4min]Cl—K2HPO4双水相体系实现了从人尿中萃取分离睾酮和表睾酮(He Chiyang，et al.J Chromatogr A，2005，1082，143—149)。刘庆芬等人(科学通报，2005，50(8)，756—759)以亲水性离子液体四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑([Bmim]BF4)和NaH2PO4·2H2O水溶液形成的双水相体系为对象，研究了NaH2PO4浓度、青霉素浓度以及[Bmim]BF4的浓度对双水相的形成和萃取率的影响，发现萃取率受成相盐浓度、初始青霉素浓度以及离子液体浓度的影响。对于不同的化合物，其双水相高效萃取体系(萃取率≥90％)的具体组成亦有不同。
抗生素根据其结构可以分为β内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素(如：链霉素、卡那霉素；庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星；新霉素；大观霉素)、四环素类抗生素(如：四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、美他霉素、米诺环素)、氯霉素、大环内酯类抗生素(如：红霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素)、林可霉素和克林霉素、利福霉素类抗生素(如：利福平、利福喷汀、利福布汀)、万古霉素和去甲万古霉素、磷霉素、甲硝唑和替硝唑、喹诺酮类抗生素(如：诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星等)、磺胺类、呋喃类(如：呋喃唑酮和呋喃西林)和抗真菌药(如：两性霉素B、、酮康唑、咪康唑、灰黄霉素、特比萘芬)等几个大类。
β内酰胺类抗生素又分为青霉素类(如：青霉素G、青霉素V、普鲁卡因青霉素；氯唑西林、苯唑西林；氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、美洛西林和阿洛西林)、头孢菌素类(如：头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢羟氨苄；头孢克洛、头孢呋辛；头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮；头孢吡肟、头孢克定、头孢吡罗)、碳青霉烯类(如：亚胺培南/西司他丁、帕尼培南/倍他米隆)和β内酰胺类/β内酰胺酶抑制剂(如：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦)
中国发明专利ZL98104898.6公开了一种双水相萃取法提取红霉素的方法。将3000—1000u/ml红霉素发酵液加入分子量为1000—8000的环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物和K2HPO4·3H2O的双水相系统中萃取，之后使用醋酸丁酯进行反萃取。该方法主要用于工业生产红霉素的分离纯化。
中国发明专利申请200410069042.7公开了一种离子液体双水相中抗生素类药物制备分离一体化的新方法。其通过青霉素发酵液在亲水性离子液体(四氟硼酸1-丁基-3-甲基眯唑([bmim]BF4)和盐酸1-丁基-3-甲基眯唑([bmim]Cl))溶液中酸化后形成的无机盐将亲水性离子液体从水溶液中析出后，实现对水溶液中青霉素的萃取分离。但是该申请并没有对所用的离子液体和无机盐的具体用量及其比例关系进行说明或公开。
中国发明专利申请200510086617.0公开了一种离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6—氨基青霉素烷酸的方法。其分离过程为，将质量百分含量为10—50％亲水性离子液体和质量百分含量为10—30％无机盐加入质量百分含量为0.5—8％的青霉素发酵液中，搅拌混合后静置，青霉素进入亲水离子液体相当中。然后再通过疏水性离子液体将青霉素从亲水性离子液体中分离出来。该方法的目的在于通过亲水性离子液体与无机盐形成的双水相系统分离发酵制得的青霉素，其第一步亲水性离子液体的对青霉素的萃取率并不清楚。
中国发明专利申请200610134738.2公开了一种离子液体—无机盐—水双水相体系，通过含有重量百分比10—18％的无机盐、60—71％的水和14—26％的离子液体体系用于回收离子液体，回收率可以达到60—90％。
中国发明专利申请200710056179.2公开了一种双水相萃取富集水中芳香类化合物的方法，其使用质量百分含量为4.8—36.5％咪唑类离子液体和质量百分含量为15.3—31.6％无机盐加入浓度为5—500μg/ml的芳香类化合物(苯酚、硝基苯、对硝基苯酚或苯胺)溶液中，搅拌混合后静置分离。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，以离子液体和无机盐形成的双水相体系萃取残留在食品中的抗生素。
本发明的另一个目的在于提供一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，以吡啶类离子液体和无机盐形成的双水相体系实现残留在食品中抗生素的高效萃取。通过特定的吡啶类离子液体和特定的无机盐，按照特定的比例组合后，使得离子液体双水相体系对食品中抗生素的萃取率≥90％，显著提高食品中抗生素残留检测的灵敏度和可靠性。
本发明的再一个目的在于提供一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，该体系应用于食品中抗生素残留的检测。
本发明的又一个目的在于提供一种应用离子液体双水相体系对食品中抗生素残留进行检测的方法，包括离子液体—无机盐形成双水相体系、振荡充分混合后静置和HPLC检测等步骤。
本发明所述的离子液体双水相体系包括无机盐和离子液体。
无机盐(或称辅助盐)类型对双水相影响较弱(化工学报，2006，57，2149—2151)，可以选择的无机盐有磷酸盐或碳酸盐。磷酸盐选自于K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4之一种或任意几种的组合。
离子液体由阳离子和阴离子组成。根据阳离子分类，离子液体选自于烷基季铵离子，记为[NR4]+、烷基季膦离子，记为[PR4]+、烷基取代的咪唑离子(如：1-丁基-3-甲基咪唑离子(1-butyl-3-methylimidazolium)，记为[bmim]+；1-乙基-3-甲基咪唑离子(1-ethyl-3-methylimidazolium)，记为[emim]+)或烷基取代的吡啶离子，记为[Rpy]+(如：N-丁基吡啶(N-butylpyridinium)，记为[Bupy]+)。
根据负离子分类，离子液体选自于含AlCl3的卤化盐(其中Cl也可用Br代替)，如：[bmim]Cl—AlCl3，当AlCl3的摩尔分数x＝0.5时称为中性，x<0.5时称为碱性的，x>0.5时称为酸性的。或以[emim]BF4为基础的离子液体，负离子多用BF4 -、PF6 -，也有CF3COO-、C3H7COO-、CF3SO3 -、C4F9SO3 -、(CF3SO2)2N-、(C2F5SO2)2N-、(CF3SO2)3C-、SbF6 -和AsF6 -等。与第一类不同的是其组成固定，而且大多数对水和空气是稳定的。
一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于烷基取代的吡啶离子(记为[RPy]+)、烷基取代的2-甲基吡啶离子(记为[R，2-MPy]+)、烷基取代的4-甲基吡啶离子(记为[R，4-MPy]+)或烷基取代的咪唑离子；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+、[R，4-MPy]+、1-丁基-3-甲基咪唑离子(记为[bmim]+)或1-乙基-3-甲基咪唑离子(记为[emim]+)；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C10的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C6的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体组成，所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C3的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
离子液体双水相体系包括40％—56％(w/v)的无机盐、1％—20％(w/v)的离子液体和待测样品溶液，待测样品溶液可以为水。
一种离子液体双水相体系，40％—56％(w/v)的无机盐、1％—15％(w/v)的离子液体和待测样品溶液组成，待测样品溶液可以为水。
另一种离子液体双水相体系，40％—56％(w/v)的无机盐、2％—10％(w/v)的离子液体和待测样品溶液组成，待测样品溶液可以为水。
另一种离子液体双水相体系，40％—56％(w/v)的无机盐、4％—9％(w/v)的离子液体和待测样品溶液组成，待测样品溶液可以为水。
另一种离子液体双水相体系，质量分数为40％—56％(w/v)的无机盐、质量分数分别为4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)或9％(w/v)的离子液体和待测样品溶液组成，待测样品溶液可以为水。
本发明所述的离子液体双水相体系用于残留在食品中抗生素的高效萃取。离子液体双水相体系由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、1％—20％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+、烷基取代的咪唑离子；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
所述的另一种离子液体双水相体系用于食品中抗生素残留量在1—1000μg/kg的高效萃取。离子液体双水相体系由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、1％—20％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+、[R，4-MPy]+或烷基取代的咪唑离子；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
所述的另一种离子液体双水相体系用于食品中抗生素残留量在10—500μg/kg的高效萃取。离子液体双水相体系由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、1％—20％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+、[R，4-MPy]+、[bmim]+或[emim]+；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
所述的另一种离子液体双水相体系用于食品中抗生素残留量在10—200μg/kg的高效萃取。离子液体双水相体系由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、1％—20％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
抗生素选自于β内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、氯霉素、大环内酯类抗生素、林可霉素和克林霉素、利福霉素类抗生素、万古霉素和去甲万古霉素、磷霉素、甲硝唑和替硝唑、喹诺酮类抗生素、磺胺类、呋喃类和抗真菌药之一种或其中任意几种以任意比例的组合。
一种抗生素具体为氯霉素。
另一种抗生素具体为喹诺酮类抗生素，其是具有1取代1，4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸结构，有抗菌活性的全化学合成的一类化合物，含有氟原子的结构也称为氟喹诺酮。喹诺酮类抗生素选自于萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星和奥比沙星之一种或其中任意几种以任意比例的组合。
另一种抗生素具体为氯霉素与萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星和奥比沙星之一种或其中任意几种以任意比例的组合。
进一步地，用于食品中抗生素残留量在1—1000μg/kg的高效萃取的离子液体双水相体系，其离子液体选自于1％—15％(w/v)，其阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+、烷基取代的咪唑离子；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
上述离子液体双水相体系还适用于抗生素残留量在10—500μg/kg的高效萃取，最适宜抗生素残留量在10—200μg/kg的高效萃取。
一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、2％—10％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+、[R，4-MPy]+、[bmim]+或[emim]+，其中R为C1—C10的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、4％—9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C10的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、4％—9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C6的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、4％—9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C3的直链烷基；阴离子选自于Cl-、Br-或I-。
另一种离子液体双水相萃取体系具体为，由40％—56％(w/v)的K2HPO4、分别为4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)或9％(w/v)的离子液体和含抗生素待测样品溶液组成。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C3的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
应用上述离子液体双水相萃取体系对食品中抗生素残留进行检测的方法，加入吡啶类离子液体和无机磷酸盐使之形成双水相体系、振荡充分混合后静置和HPLC-UV检测。
一种抗生素残留检测方法为，向抗生素残留量为10—200μg/kg的待检禽蛋样品溶液中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，定容，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，向氯霉素残留量为10—200μg/kg的待检禽蛋样品溶液中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，向抗生素残留量为10—200μg/kg的待检动物乳液样品溶液中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，向喹诺酮类抗生素残留量为10—200μg/kg的待检动物乳液样品溶液中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
应用上述离子液体双水相体系对食品中抗生素残留进行检测的方法，现将待检测样品进行前处理，再加入吡啶类离子液体和无机磷酸盐使之形成双水相体系、振荡充分混合后静置和HPLC-UV检测。
一种抗生素残留检测方法为，先将含抗生素样品进行前处理：将pH为7.0—7.4，含有0.33％(v/v)甲醇，NaCl浓度为40g/L的磷酸盐缓冲溶液溶解禽蛋破碎液中的可溶性物质，振荡离心后取上层清液。其余部分重复上述步骤2次以上，合并上清液，去甲醇，第一次定容至5ml。
再向含抗生素待测样品中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，第二次定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，先将含氯霉素食品样品进行前处理：将pH为7.0—7.4，含有0.33％(v/v)甲醇，NaCl浓度为40g/L的磷酸盐缓冲溶液溶解禽蛋破碎液中的可溶性物质，振荡离心后取上层清液。其余部分重复上述步骤2次以上，合并上清液，去甲醇，第一次定容至5ml。
再向含氯霉素待测样品中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，第二次定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，先将含抗生素样品进行前处理：将40g/L的NaCl溶液加入待测动物乳液样品，再加入固体磷酸或磷酸盐，使得溶液pH为7.0—7.4，振荡离心后取上清液。沉淀部分重复上述步骤2次以上，合并上清液，第一次定容至5ml。
再向含抗生素待测样品中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，第二次定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
另一种抗生素残留检测方法为，先将含喹诺酮类抗生素食品样品进行前处理：将40g/L的NaCl溶液加入待测动物乳液样品，再加入固体磷酸或磷酸盐，使得溶液pH为7.0—7.4，振荡离心后取上清液。沉淀部分重复上述步骤2次以上，合并上清液，第一次定容至5ml。
再向含喹诺酮类抗生素待测样品中加入40％—56％(w/v)的K2HPO4、4％—9％(w/v)的离子液体，第二次定容至5ml，振荡充分混合后静置，取水相溶液HPLC-UV检测。所述离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+或[R，4-MPy]+，其中R为C1—C4的直链烷基；阴离子选自于Br-，Br-可为Cl-或I-所代替。
本发明所述的术语与其一般概念相同。
所述的“烷基取代的吡啶离子(记为[RPy]+)”指吡啶基N原子被烷基取代的吡啶离子。
所述的“烷基取代的2-甲基吡啶离子(记为[R，2-MPy]+)”指甲基2位取代且吡啶基N原子被烷基取代的吡啶离子。
所述的“烷基取代的4-甲基吡啶离子(记为[R，4-MPy]+)”指甲基4位取代且吡啶基N原子被烷基取代的吡啶离子。
所述的“C1—C10烷基”、“C1—C6烷基”和“C1—C4烷基”包括直链烷基和支链烷基，数字表示烷基的碳原子数。
所述的抗生素残留量单位“μg/kg”指每公斤未经前处理的待测食品中的抗生素残留量。
所述的“40％—56％(w/v)无机盐”、“40％—56％(w/v)无机磷酸盐”和“40％—56％(w/v)K2HPO4”指无机盐在离子液体双水相萃取体系的终浓度。
所述的“1％—20％(w/v)的离子液体”、“1％—15％(w/v)的离子液体”、“2％—10％(w/v)的离子液体”、“4％—9％(w/v)的离子液体”和“4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)或9％(w/v)的离子液体”指离子液体在离子液体双水相萃取体系的终浓度。
所述的“食品”指可为人或畜食用的物质，如：糖类、脂肪、蛋白质或多肽、氨基酸、维生素、微量元素及其混合物或加工产物。上述物质及其混合物或加工物可以是液体、固体、固-液混合物或糊状物。上述物质可以是自然界已存在的(如：各类微量元素)或是通过自然界的微生物、植物、动物或人代谢产生的物质(如：糖类、脂肪、蛋白质或多肽、氨基酸或维生素)。这类代谢产物通常是混合物，如乳液是蛋白质、脂肪和糖类物质的混合物。上述物质及其混合物或加工物还可以是通过人们劳动所制得的各类产品。
所述的“禽蛋破碎液”指禽蛋清和禽蛋黄经匀浆后的液体。
所述的“动物乳液”指哺乳动物乳液，如：人乳液、牛乳液、羊乳液和马乳液等。
所述的“待测样品溶液”指经过前处理的食品样品溶液或未经过前处理的食品样品溶液。
所述的“含抗生素待测样品溶液”指经过前处理的样品溶液。
所述的“第二次定容”指先将无机盐和离子液体加入将待测样品溶液后，再加水至目标体积；或先将无机盐和离子液体体积扣除后，配制待测样品溶液，然后加入无机盐和离子液体至目标体积。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明以吡啶类离子液体和无机盐形成的双水相体系实现残留在食品中抗生素的高效萃取。通过1—20％(w/v)吡啶类离子液体和40％—56％(w/v)无机盐配比与待测样品溶液形成的离子液体双水相体系，实现了对食品中残留抗生素的高效萃取，萃取率≥90％，同时显著提高食品中抗生素残留检测的灵敏度和可靠性。
本发明将1—20％(w/v)吡啶类离子液体和40％—56％(w/v)无机盐配比与待测样品溶液形成的离子液体双水相体系应用于食品中残留抗生素的检测，使得抗生素的富集倍数大大提高，从而显著提高了检测灵敏度。
本发明先依次以磷酸盐溶液、NaCl溶液净化和提取样品的前处理方式，再通过1—20％(w/v)吡啶类离子液体和40％—56％(w/v)无机盐配比与待测样品溶液形成的离子液体双水相体系富集后，再由HPLC检测。使得待测样品在净化、提取步骤中省去大量有机溶剂，节约且不影响离子液体双水相体系的形成，富集倍数大，灵敏度高，实用性强。
附图说明
图1表示含恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹混标50μg/kg的牛奶样品未经萃取的液相色谱图；
图2表示含恶喹酸、萘啶酸、氟甲喹混标50μg/kg的牛奶样品经[EPy]Br-K2HPO4萃取后的液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案，本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未经注明，均购自西格玛—奥德里奇(Sigma—Aldrich)公司。
实施例1 离子液体的合成
依次加0.1mol吡啶、0.1mol溴乙烷和15mL环己烷于50mL两口烧瓶中，在30～40℃下搅拌回流反应超过24hr。将所得产品再用无水乙醇和乙酸乙酯多次重结晶，得到白色晶体，即为烷基取代的吡啶离子([RPy]+)，产品纯度大于98％。产品经FT-IR、1H-NMR和13C-NMR表征。
依据上述相同的制备方法，使用原料2-甲基吡啶或4-甲基吡啶代替吡啶即可制得烷基取代的2-甲基吡啶离子([R，2-MPy]+)或烷基取代的4-甲基吡啶离子([R，4-MPy]+)。
实施例2 鸡蛋中氯霉素的检测
鸡蛋样品前处理：
准确称取鸡蛋破碎液5g于25ml离心管中，加入0.05μg氯霉素(氯霉素含量为10μg/kg鸡蛋破碎液)，再加入pH7.0，NaCl浓度为40g/L磷酸盐缓冲液混合提取溶液3ml，其中含有甲醇100μl。旋涡振荡混匀后以10,000r/min的速度离心，离心后上层清液转入另一离心管中，下层再加入上述混合提取溶液3ml重复以上操作后，合并上清液，热风吹去甲醇，静置。加入3ml正己烷振荡离心，重复操作2～3次，弃去上层，用超纯水定容至5ml，制得鸡蛋标准样液，氯霉素含量为10μg/kg的鸡蛋破碎样液。
加入离子液体和无机盐：
取10μg/kg鸡蛋样液2ml于5ml比色管中，于比色管中加入0.4g离子液体溴化乙基吡啶([EPy]Br)和2.8g K2HPO4，定容至5ml，振荡，静置，即成相，取上层离子液体水相过0.45μm滤膜后进行液相色谱分析。
HPLC-UV检测：
Agilent液相色谱仪，Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5.0μm)；流动相以水—甲醇(70/30，v/v)等度洗脱；流速1.0mL/min；UV检测器，VWD＝278nm；进样量20μL；柱温25℃。氯霉素在此色谱条件下的保留时间为15min。
实施例3 鸡蛋中氯霉素的检测
根据实施例2相同的方法制得氯霉素含量分别为20μg/kg、40μg/kg和200μg/kg的待测鸡蛋样液，并适用实施例2相同的离子液体—无机盐和检测方法进行检测。
通过分析计算(即以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标的标准曲线上，依据实测峰面积确定相应的样品浓度)，四种浓度分析检测结果见表1。
表1 鸡蛋样品中氯霉素测定结果
离子液体溴化乙基吡啶([EPy]Br)和K2HPO4对鸡蛋破碎液中的氯霉素的萃取率大于90％。
实施例4 牛奶中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的检测
牛奶样品前处理：
取2.0g牛奶于10ml刻度离心管中，再加浓度分别为1μg/ml恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的混标溶液100μl，然后加40g/L氯化钠溶液4ml于离心管中，再加磷酸2滴(滴管加入)，混匀，4,000r/min离心10min，上层清液转入10ml离心管中，下层加入40g/L氯化钠溶液2ml，重复以上操作，合并上清液，即得含恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹总量为50μg/kg牛奶加标样液。
加入离子液体和无机盐：
将50μg/kg牛奶加标样液移入10mL比色管中，加入5.6gK2HPO4和0.8g/ml[EPy]Br溶液1ml，振荡，静置后取上层过0.45μm滤膜，待测。
HPLC-UV检测：
Agilent液相色谱仪，Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5.0μm)；流动相：乙腈—水(0.1％(v/v)磷酸)梯度洗脱，见表2，UV检测器，VWD＝310nm，进样量20μL；柱温30℃。恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹在此色谱条件下的保留时间分别为16.3min、25.7min和28.9min。
表2 梯度洗脱表
将含恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹混标50μg/kg的牛奶样品未经萃取的样品采用上述HPLC-UV方法检测，得到的液相色谱图见图1。
将含恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹混标50μg/kg的牛奶样品经[EPy]Br—K2HPO4双水相萃取的样品采用上述HPLC-UV方法检测，得到的液相色谱图见图2。图中数字“1”、“2”和“3”分别表示“恶喹酸”、“萘啶酸”和“氟甲喹”。
比较图1和图2可得，[EPy]Br-K2HPO4双水相萃取使得抗生素的富集倍数大大提高，从而显著提高了检测灵敏度。
实施例5 牛奶中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的检测
根据实施例4相同的方法制得恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹含量为100μg/kg的待测牛奶样液，并适用实施例4相同离子液体—无机盐和检测方法进行检测。
通过分析计算(即以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标的标准曲线上，依据实测峰面积确定相应的样品浓度)，两种浓度分析检测结果见表3。
表3[EPy]Br-K2HPO4对牛奶样品中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的测定结果
实施例6 牛奶中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的检测
根据实施例4相同的方法分别制得恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹含量为50μg/kg和100μg/kg的待测牛奶样液，使用0.4g离子液体溴化二甲基乙基吡啶([E，2-MPy]Br)和2.8g K2HPO4，定容至5ml，振荡，静置，即成相，取上层离子液体水相过0.45μm滤膜后并适用实施例4相同的检测方法进行检测。
通过实施例5相同的分析计算方法，两种浓度分析检测结果见表4。
表4[E，2-MPy]Br-K2HPO4对样品中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的测定结果
实施例7 牛奶中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的检测
根据实施例4相同的方法分别制得恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹含量为50μg/kg和100μg/kg的待测牛奶样液，使用0.4g离子液体溴化二甲基乙基吡啶([N-E，4-MPy]Br)和2.8g K2HPO4，定容至5ml，振荡，静置，即成相，取上层离子液体水相过0.45μm滤膜后并适用实施例4相同的检测方法进行检测。
通过实施例5相同的分析计算方法，两种浓度分析检测结果见表5。
表5[N-E，4-MPy]Br-K2HPO4对样品中恶喹酸、萘啶酸和氟甲喹的测定结果
Claims (10)
1、一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，包括40％—56％(w/v)的无机磷酸盐、1％—20％(w/v)的离子液体和待测样品溶液。
2、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的离子液体为2％—10％(w/v)。
3、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的离子液体的阳离子选自于[RPy]+、[R，2-MPy]+、[R，4-MPy]+、[bmim]+或[emim]+；阴离子选自于Cl-、Br-、I-、BF4 -或PF6 -。
4、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的无机磷酸盐为K2HPO4。
5、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的离子液体的阳离子上的取代基为C1—C6的烷基。
6、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的离子液体的阳离子上的取代基为C1—C4的直链烷基。
7、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的待测样品溶液，其抗生素残留量为1—1000μg/kg。
8、根据权利要求1所述的离子液体双水相体系，其特征在于所述的待测样品溶液，其抗生素残留量为10—200μg/kg。
9、根据权利要求1所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，其特征在于所述的抗生素为氯霉素或奎诺酮类抗生素或其中任意两种抗生素的组合。
10、根据权利要求1—9之一所述的萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，在食品抗生素残留检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090812 |