CN114269943A - 用于核酸的大小选择性富集的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于从生物流体混合物中分离和浓缩选定靶大小(例如,以小于1000个碱基对的增量)的核酸的方法,该方法包括将该生物流体混合物与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一双水相系统(ATPS)合并,使得小于所希望的靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液中并且污染物分配到该第一相溶液中,提取第二相溶液并将其与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合,使得这些靶核酸片段分配到该第三相溶液并在其中浓缩,以及从该第三相溶液中回收这些浓缩的靶核酸片段。还提供了组合物和试剂盒,用于如上所述分离和浓缩选定靶大小的核酸。
Description
技术领域
本发明涉及在连续水相系统中分离、浓缩和/或纯化核酸片段。特别地,本发明提供了用于从生物材料中分离、浓缩和/或纯化核酸片段的样品制备方法、组合物和试剂盒组分。
背景技术
从复杂基质如血液、组织、尿液和法医样品以及细菌和哺乳动物细胞培养基中分离和纯化核酸(如DNA和RNA)的方法在遗传研究、核酸探针诊断、法医DNA测试和其他需要扩增、加工或分析核酸的领域中是重要的。纯化的核酸必须具有高质量并达到足够的量,使得它们可用于各种下游应用,这些下游应用包括检测、测序、临床诊断等。由于在鉴定核酸的复杂环境(包括尿液、血液、血浆、血清、唾液和其他生物流体)中存在大量污染性细胞物质(例如蛋白质和碳水化合物),因此获得纯化的核酸是一项复杂的任务。目前从生物样品中提取和纯化核酸的方法通常是耗时的、繁琐的、昂贵的,涉及使用危险的有机溶剂,并且通常仅适于捕获某些大小(例如1000bp)以上的核酸。
对于在诸如尿液和血液的生物流体中以非常低的浓度存在的靶分析物,需要获得大体积的生物流体以便获得足够量的靶分析物用于随后通过分子技术进行检测。检测具有极低浓度的分析物的存在是一项重大挑战。分析物可以是疾病的生物标志物,如无细胞DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)或存在于样品如患者的唾液、血液、尿液和其他体液中的蛋白质。如果分析物浓度太低,许多现有的诊断或检测方法可能错误地报告分析物不存在。例如,如果靶分析物具有超出测定检测极限的极低量,如聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)的诊断黄金标准可能产生假阴性结果。
当生物标志物以少量存在时,精确的检测依赖于可以从背景中浓缩核酸的分离方法。根据分离方法,这种挑战可能会因核酸片段大小的变化和测试抑制剂的影响而变得复杂。多种方法已经用于纯化核酸。这些方法包括沉淀、超滤(Hirasaki等人,J.Membr.Sci.[膜科学杂志],106:123-129(1995))以及使用阴离子交换柱的吸附。包括市售方法的其他测试方法具有较低的DNA提取产量并且不能提取长度小于200bp的小DNA片段(Fong等人,Clinical Chemistry[临床化学]55(3),587-589,2009)。Ribeiro等人(Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程]2002年5月20日;78(4):376-84)描述了具有PEG作为聚合物组分和磷酸氢二钾(K2HPO4)作为盐组分的双水相系统(ATPS)。报道了从大肠杆菌DH5a中分离出质粒pCF1-CFTR。为此,首先通过碱裂解(含有NaOH和SDS的裂解缓冲液)分解细胞,然后用3M乙酸钠中和裂解物。随后通过离心批料除去细胞碎片、蛋白质和基因组DNA(gDNA)。将澄清的裂解物用于上述双水相系统中。然而,该方法的缺点是在设备和时间方面非常昂贵。上述文章的全部内容通过引用并入本文。商用台式固相试剂盒,例如由和提供的那些试剂盒,允许相对快速地提取和纯化核酸,但需要台式实验室设备,这意味着提取和纯化在很大程度上限于具有基本设置和电源的实验室。
因此,非常需要一种简化的方法和装置,以精确、更高信噪比用于下游应用,与各种工业、临床和研究用途(例如即时测试)相容的廉价方式实现较高浓度和较多数量的小靶片段大小的核酸分子。
发明内容
为了克服现有技术的上述限制,披露了新的方法、组合物和试剂盒,其用于在不需要复杂设备的情况下,在使用连续双水相系统(sequential aqueous two-phase systems(ATPS))的廉价、快速和完全液体方法中对分析物进行大小选择性富集、分离和分析。这些方法和组合物可实现以下多项任务,包括细胞裂解、除去非靶向生物分子和/或浓缩靶向分析物。在一些实施例中,分析物是小于选定大小的核酸片段,例如包含少于1000个碱基对(例如少于10,000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、或50bp)的核酸。在一些实施例中,分析物是单链核酸,而在其他实施例中,分析物是双链核酸。可以通过ATPS相形成和分级组分的适当选择和特定排序,以及离心、混合和孵育步骤来选择靶大小截止值。在一些实施例中,核酸片段可以在最有利于分析的范围内在小于1000bp的情况下以50bp靶大小截止精度,并且更优选以25bp精度,分离和浓缩。
本发明提供了一种改进的方法,用于从生物样品中纯化核酸,然后从核酸中除去ATPS组分,否则ATPS组分将干扰下游应用如疾病检测、扩增和基因分型。示例性生物样品可以包括血液、血浆、唾液、尿液、细胞、外来体、蛋白质、cfDNA、RNA和循环肿瘤细胞。发明人出乎意料地发现,所披露的稳定的、可重复的方法实现了核酸纯化而几乎没有核酸损失(即,非常高的回收率),并且通过提取独特ATPS的一个相,将其与具有与第一ATPS的相形成组分不同的化学性质的相形成组分混合,可以形成第二ATPS,其中靶核酸将分配到第二ATPS中与它们在第一ATPS中分配的相相反的相中。
在一些实施例中提供了一种披露的方法,用于从包含核酸和污染物的流体生物混合物中分离和浓缩所希望靶大小的核酸。生物混合物可以与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一ATPS合并,使得通过分配到所述第二相溶液来分离小于靶大小的靶核酸片段而污染物分配到第一相溶液。然后可以提取第二相溶液并与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合,使得通过分配到第三相溶液中来浓缩靶核酸片段。然后浓缩的靶核酸片段可以以多种方式从第三相溶液中回收。
在一些实施例中,第一和第二相形成聚合物或表面活性剂组分可包含一种或多种聚合物、一种或多种表面活性剂以及其组合。可以使用的可能的聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇(PEG)(例如疏水改性的聚亚烷基二醇)、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物(例如疏水改性的聚(氧化烯)共聚物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性(silicone-modified)的聚醚和聚N异丙基丙烯酰胺及其共聚物。在另一个实施例中,第一相形成聚合物包含聚乙二醇、聚丙二醇或右旋糖酐(dextran)。可以使用的可能的表面活性剂包括但不限于Triton-X,Triton-114,Igepal CA-630和Nonidet P-40,阴离子表面活性剂,例如羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油脂、硫酸化酯、硫酸化链烷醇酰胺、烷基酚,乙氧基化和硫酸化非离子表面活性剂,例如乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨糖醇酯、脂肪酸的乙二醇酯、羧酸酰胺、单烷醇胺缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺,阳离子表面活性剂,例如季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环胺、n,n,n',n'四取代的乙二胺、2-烷基1-羟乙基2-咪唑啉,和两性表面活性剂,例如n-椰油3-氨基丙酸/钠盐、n-牛油3-亚氨基二丙酸二钠盐、n-羧甲基n-二甲基n-9十八烯基氢氧化铵、n-椰油基酰氨乙基n-羟乙基甘氨酸和钠盐。
在一些实施例中,第一聚合物或表面活性剂组分具有比第二聚合物或表面活性剂组分更高的分子量。
在一些实施例中,在分离核酸(NA)的ATPS的第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度(molar concentration)大于在第三相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分、在第四相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分以及在浓缩NA的ATPS中的第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的摩尔浓度。
在一些实施例中,在分离NA的ATPS的第一相溶液中的的第一聚合物或表面活性剂组分质量浓度(mass concentration)大于在第三相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分、在第四相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分以及在浓缩NA的ATPS中的第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的质量浓度。在一个实施例中,第一相溶液的第一聚合物或表面活性剂组分浓度为水溶液总重量的按重量计约0.01%至约90%(w/w)。在各种实施例中,第一相溶液选自约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w的聚合物或表面活性剂溶液。在一些实施例中,第一相溶液选自约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、和约50%w/w的聚合物或表面活性剂溶液。
在一些实施例中,分离ATPS中的第二相溶液包括至少一种如上所述的相形成溶解表面活性剂或聚合物组分,和/或溶解盐如磷酸二钾、磷酸二氢钾及其组合。在一些实施例中,盐包括但不限于亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵以及含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐。在另一个实施例中,盐可以包括NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠及其组合。也可以使用其他盐,例如乙酸铵。在另一个实施例中,盐可选自镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐和铝盐。在一些实施例中,盐可选自溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐和磷酸盐。在一些实施例中,盐包括磷酸钾。在一些实施例中,盐包括硫酸铵。在一个实施例中,总盐浓度在约0.01%至约90%的范围内。本领域技术人员将理解,形成ATPS所需的盐的量将受聚合物或表面活性剂的分子量、浓度和物理状态的影响。在各种实施例中,盐溶液为约0.001%至90%w/w。在各种实施例中,盐溶液为约0.01%w/w、约0.05%w/w、约0.1%w/w、约0.15%w/w、约0.2%w/w、约0.25%w/w、约0.3%w/w、约0.35%w/w、约0.4%w/w、约0.45%w/w、约0.5%w/w、约0.55%w/w、约0.6%w/w、约0.65%w/w、约0.7%w/w、约0.75%w/w、约0.8%w/w、约0.85%w/w、约0.9%w/w、约0.95%w/w、或约1%w/w。在一些实施例中,盐溶液为约1%w/w、约2%w/w、约3%w/w、约4%w/w、约5%w/w、约6%w/w、约7%w/w、约8%w/w、约9%w/w、约10%w/w、约11%w/w、约12%w/w、约13%w/w、约14%w/w、约15%w/w、约16%w/w、约17%w/w、约18%w/w、约19%w/w、约20%w/w、约21%w/w、约22%w/w、约23%w/w、约24%w/w、约25%w/w、约26%w/w、约27%w/w、约28%w/w、约29%w/w、约30%w/w、约31%w/w、约32%w/w、约33%w/w、约34%w/w、约35%w/w、约36%w/w、约37%w/w、约38%w/w、约39%w/w、约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、和约50%w/w。在一个实施例中,盐的浓度为约2%至40%w/w。在一个实施例中,盐的浓度为约3%至30%w/w。在一个实施例中,盐的浓度为约5%至20%w/w。
在一些实施例中,浓缩ATPS中的第四相溶液包括至少一种如上所述的相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分及其组合。
在一些实施例中,与浓缩ATPS的第四相溶液相比,分离ATPS的第二相溶液对靶核酸片段施加较弱的排除体积相互作用(excluded volume interaction)。在一些实施例中,与浓缩ATPS的第三相溶液相比,分离ATPS的第一相溶液对靶核酸片段施加较强的排除体积相互作用。
在一些实施例中,与浓缩ATPS的第四相溶液相比,分离ATPS的第二相溶液施加较有利于靶核酸片段分配到所述第二相中的亲水和疏水相互作用。更具体地,与当DNA分子从第三相溶液移动到第四相溶液时相比,当靶DNA分子从第一相溶液移动到第二相溶液时自由能发生有利的变化。在一些实施例中,与浓缩ATPS的第三相溶液相比,分离ATPS的第一相溶液施加较不利于靶核酸片段分配到所述第一相溶液中的亲水和疏水相互作用。
在一些实施例中,与浓缩ATPS的第四相溶液相比,分离ATPS的第二相溶液施加较有利于靶核酸片段分配到所述第二相中的静电相互作用(electrostatic interaction)。更具体地,与当DNA分子从第三相溶液移动到第四相溶液时相比,当靶DNA分子从第一相溶液移动到第二相溶液时自由能发生有利的变化。在一些实施例中,与浓缩ATPS的第四相溶液相比,分离ATPS的第一相溶液施加较不利于靶核酸片段分配到所述第一相溶液中的静电相互作用。
在一个具体实施例中,在第二ATPS中回收浓缩的靶核酸片段可以包括将第三相溶液与第四相溶液分离,并将第三相溶液与至少一种选自聚合物、表面活性剂、盐及其组合的大小分级组分混合,以形成由浓缩的靶核酸组成的上清液和沉淀的大于靶截止大小的核酸沉淀物。然后可以将上清液与沉淀的大于靶截止大小的核酸沉淀物分离,并且可以将小于所选截止大小的靶核酸片段从上清液中沉淀。
在一些实施例中,大小分级组分可包含分子量大于分离ATPS的第一聚合物或表面活性剂组分的聚合物或表面活性剂组分,其中所述第一聚合物或表面活性剂组分的分子量大于浓缩ATPS的第二聚合物或表面活性剂组分。
在一些实施例中,上清液中的至少一种大小分级组分的摩尔浓度可以小于第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度,并且第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度大于第三相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度。
在一些实施例中,上清液中的至少一种大小分级组分的质量浓度小于第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度,并且第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度大于第三相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分的质量浓度。
在一些实施例中,至少一种大小分级组分可以包含一种或多种例如如上所述的盐、聚合物和/或表面活性剂,或其组合。
在另一个主要实施例中,披露了一种组合物,用于从包含核酸和污染物的流体(例如生物的)混合物中分离和浓缩选定的小靶大小的核酸。该组合物可以包括用于由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成分离NA的ATPS的组分,使得当与流体混合物混合时,小于靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液并且污染物分配到第一相溶液,和用于由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成浓缩NA的ATPS的组分,使得当与第二相溶液混合时,靶核酸片段分配到第三相溶液并在其中浓缩。该组合物还可以包括用于从第三相溶液中浓缩靶核酸片段的材料。
在又另一个实施例中,披露了试剂盒,用于从包含核酸和污染物的流体混合物中分离和浓缩靶大小的核酸。试剂盒可包括组合物实施例中描述的组合物组分,但另外包括用于储存、包装和/或反应的注射器或移液管可及容器以及任选地用于操作水溶液的设备。这样的容器和设备可以包括柱、试管、毛细管、塑料试管、falcon管、培养管、孔板、移液管和/或比色皿。
在参考附图考虑以下详细描述和所附权利要求时,这些和其他特征和特性、以及相关部件的操作方法和功能以及制造的经济性将变得更加明显,所有这些形成本说明书的一部分,其中相同的附图标记表示各图中的对应部分。然而,应当清楚地理解,这些附图仅仅是出于图解和说明的目的,而不旨在限定权利要求的界限。如在本说明书和权利要求中所使用的,除非文中另外明确指明,否则单数形式的“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
附图说明
图1说明了用于从流体(例如生物的)混合物中分离和浓缩小片段大小的核酸的工作流程的实施例。
图2显示了通过本发明的一个实施例分配的核酸的凝胶电泳图像。
图3A和图3B显示了在根据本发明的分离和浓缩步骤的实施例中回收的核酸的百分比。
图4显示了根据本发明的几个实施例的大小分级成沉淀物和上清液的核酸的凝胶电泳图像。
图5显示了根据本发明的几个实施例通过选定的片段大小而分级成沉淀物和上清液的核酸的凝胶电泳图像。
图6显示了本发明实施例和Qiagen试剂盒之间的比较性的DNA回收。
图7显示了根据本发明的示例性实施例的顶部相和底部相的凝胶电泳图像。
图8显示了根据本发明的示例性实施例的三个样品的DNA回收和蛋白质回收。
图9显示了根据本发明的示例性实施例的去除的液体、最终提取物和T富集相的凝胶电泳图像。
图10显示了根据本发明的几个实施例的沉淀物和上清液的凝胶电泳图像。
具体实施方式
除非另外指出,否则本文使用的术语,包括技术和科学术语,具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义,并且省略了可能模糊本发明主旨的公知功能和构成的详细描述。
如本文所用,“水性(aqueous)”是指溶剂/溶质体系的特征性质,其中溶剂化物质主要具有亲水性特征。水性溶剂/溶质体系的实例包括那些以水或含水的组分为主要溶剂的体系。在实施例中描述其用途的聚合物和/或表面活性剂组分是“水性的”,其含义是当与溶剂(例如水)组合时它们形成水相。此外,如技术人员所理解的,在本发明上下文中,术语液体“混合物(mixture)”仅指本文定义的组分的组合。
如本文所用,双水相系统(aqueous two-phase system)(ATPS)意指可通过分配实现分析物的分离或浓缩的液-液分离系统,其中两相、部分、区域、组分等与它们所暴露并任选溶解的至少一种分析物不同地相互作用。当两种不混溶相形成组分(例如盐和聚合物)或具有一定浓度的两种不相容聚合物(例如PEG和右旋糖酐)在水溶液中混合时,形成ATPS。ATPS方法相对便宜且可规模化,因为它们采用两相分配来将分析物(例如核酸)与污染物分离。
如本文所用,术语“分离(isolated)”是指将核酸从其原始环境中移出并因此从其原始环境中改变。提供了分离的核酸,其通常具有比来源样品中存在的组分的量更少的非核酸组分(例如,蛋白质、脂质)。包含分离的样品核酸的组合物可以是基本上分离的(例如,约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%不含非核酸组分)。
如本文所用,“浓缩(concentrated)”是指所述分析物与其中悬浮有分析物的溶液的质量比大于所述分析物在其浓缩前溶液中的质量比。例如,它可以略高,或更优选高至少两倍、十倍或一百倍。
如本文所用,‘聚合物(polymer)’包括但不限于均聚物、共聚物、三元共聚物、无规共聚物和嵌段共聚物。嵌段共聚物包括但不限于嵌段聚合物、接枝聚合物、树枝状聚合物和星形聚合物。如本文所用,共聚物是指衍生自两种单体物质的聚合物;类似地,三元共聚物是指衍生自三种单体物质的聚合物。聚合物还包括各种形态,包括但不限于线性聚合物、支化聚合物、无规聚合物、交联聚合物和树枝状聚合物体系。例如,聚丙烯酰胺聚合物是指包括聚丙烯酰胺的任何聚合物,例如聚丙烯酰胺的均聚物、共聚物、三元共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或三元共聚物。聚丙烯酰胺可以是聚丙烯酰胺的线性聚合物、支化聚合物、无规聚合物、交联聚合物或树枝状聚合物。
样品制备
参考图1,示例性方法实施例可以包括任选的第一步骤10:通过在合适的容器14中混合生物样品和裂解缓冲液来制备流体混合物12,并在合适的温度(例如,在15℃至40℃的范围内)下孵育足够的时间(例如,优选地在1至60分钟的范围内)以从生物样品中的细胞、外来体、蛋白质和/或其他材料中释放核酸16。优选地,裂解缓冲液的pH范围可以是4-11,优选地7-10,最优选地8-9。裂解缓冲液中物质的浓度取决于待裂解的生物材料的量和提供所述生物材料的方式。原则上,技术人员已知的任何分离方法都可适用于从生物样品中释放核酸。可以考虑的裂解方法特别是通过热作用的裂解、通过机械力作用的裂解、通过酶(例如蛋白激酶K)的裂解、或通过使细胞与含有洗涤剂或离液化合物的裂解缓冲液接触、或通过低渗溶液的裂解。适当的情况下,上述措施也可以组合,例如通过在含有洗涤剂或离液化合物的裂解缓冲液中机械破坏细胞,或例如通过使用含有蛋白激酶K和离液化合物的裂解缓冲液。
分析物的分离
在分离步骤18中,可以将分离组分17加入混合物12中,形成双水相系统ATPS 19,进行或不进行离心,以便将靶核酸片段26与污染物20分离。分离组分17可以包括溶解在第一相溶液22和第二相溶液24中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分,使得小于选定的靶截止大小的靶核酸片段26分配到第二相溶液24(例如,富含盐的下部相)中,而蛋白质和其他污染物20分配到第一相溶液22(例如,富含聚合物的上部相)中。
可以使用多种类型的ATPS 19,包括聚合物-盐系统、聚合物-聚合物系统、聚合物-表面活性剂系统和胶束或反胶束系统。相分离分配可受以下因素影响,例如分离组分17的适当选择和具体排序、pH、分子量、相对浓度以及离心、混合和孵育步骤。
分离组分17可包括有助于形成第一相溶液22和第二相溶液24的聚合物或表面活性剂组分。合适的聚合物可以包括聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖、聚亚烷基二醇(例如疏水改性的聚亚烷基二醇)、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物(例如疏水改性的聚(氧化烯)共聚物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性的聚醚和聚N异丙基丙烯酰胺及其共聚物。合适的表面活性剂包括但不限于Triton-X,Triton-114,IgepalCA-630和Nonidet P-40,阴离子表面活性剂,例如羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油脂、硫酸化酯、硫酸化链烷醇酰胺、烷基酚,乙氧基化和硫酸化非离子表面活性剂,例如乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨糖醇酯、脂肪酸的乙二醇酯、羧酸酰胺、单烷醇胺缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺,阳离子表面活性剂,例如季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环胺、n,n,n',n'四取代的乙二胺、2-烷基1-羟乙基2-咪唑啉,和两性表面活性剂,例如n-椰油3-氨基丙酸/钠盐、n-牛油3-亚氨基二丙酸二钠盐、n-羧甲基n-二甲基n-9十八烯基氢氧化铵、n-椰油基酰氨乙基n-羟乙基甘氨酸和钠盐。
在ATPS 19的聚合物-盐实施例中,第二相溶液24可以包括包含溶解盐的分离组分。合适的盐包括但不限于亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵,含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵,及其组合。
在一些实施例中,形成包含分离组分17的第一相溶液24,该分离组分17包含平均分子量为200至10000Da(例如,200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、50000或100000Da)的聚合物。
分析物的浓缩
希望减少含有核酸片段26的工作溶液的处理体积。在ATPS中,这可以通过减小顶部相的体积来实现。在浓缩步骤30的一些实施例中,可以从容器14中提取含有靶核酸片段26的第二相溶液24并在第二容器32中与浓缩组分31混合,进行或不进行离心,以形成第二ATPS 34。在其他实施例中,可以提取核酸贫乏的第一相溶液22,并且容器14可以用于进行浓缩步骤30。浓缩组分31可以包含溶解于第三相溶液36(例如,顶部相)和第四相溶液38(例如,底部相)中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分,使得靶核酸片段26分配到第三相溶液36(例如,富含聚合物的上部相)中并在其中浓缩,而盐和其他污染物分配到第四相溶液38(例如,富含盐的底部相)中。
在一些实施例中,与从容器14提取的浓缩前水性底部相体积相比,核酸片段26可以浓缩至水溶液体积的1/10。在一些实施例中,分析物核酸相对于其在形成ATPS 34之前的浓度被浓缩至少10倍(例如,至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000倍或更多倍)。在一些实施例中,可以使用促进分离两相的步骤,例如通过向ATPS 34施加力(例如重力或离心)。
在一些实施例中,第三相溶液36和第四相溶液38具有不同的体积,并且核酸片段26优先地分配到具有较小体积的相中。在一些实施例中,第四相溶液38的体积为ATPS 34的第三相溶液36的体积的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或100倍或更多倍。
在一些实施例中,在第一相溶液22中的第一聚合物或表面活性剂组分17的摩尔浓度可大于在第三相溶液36中的第二聚合物或表面活性剂组分31、在第四相溶液38中的第二聚合物或表面活性剂组分和在第二ATPS 34中的第二聚合物或表面活性剂组分31中的至少一种的摩尔浓度。
在一些实施例中,在第一相溶液22中的第一聚合物或表面活性剂组分17的质量浓度大于在第三相溶液36中、在第四相溶液38中和在整个第二ATPS 34中的至少一种的第二聚合物或一种或多种表面活性剂组分31的质量浓度。
在一些实施例中,构成第四相溶液38的第二聚合物或一种或多种表面活性剂组分31包括一种或多种如上所述的相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分及其组合。
在一些实施例中,与第四相溶液38相比,第二相溶液24对靶核酸片段26施加较弱的排除体积相互作用并施加较有利的静电相互作用。
在一些实施例中,与第三相溶液36相比,第一相溶液22对靶核酸片段26施加较强的排除体积相互作用,以及与第四相溶液38相比,施加较不利的静电相互作用。
在一些实施例中,与第四相溶液38所施加的相比,第二相溶液22施加较有利于靶核酸片段26分配到所述第二相22中的亲水/疏水相互作用。在一些实施例中,与第三相溶液36所施加的相比,第一相溶液22施加较不利于靶核酸片段26分配到所述第一相溶液22中的亲水/疏水相互作用。靶核酸26在刚混合之后和达到平衡之前的各相中的化学势的关系是这样的:μ1 DNA/μ2 DNA>μ3 DNA/μ4 DNA。
分析物的回收
在回收步骤40中,可以从第三相溶液36中回收浓缩的靶核酸片段26。图1说明了用于回收片段26的一种任选方法(步骤40a至40c),其中第三相溶液36可以在步骤40a中与大小分级组分42合并,进行或不进行离心,以沉淀不希望的核酸(即,大于靶片段大小的核酸)。在步骤40b中,可以转移包含靶片段26的上清液44并与沉淀组分46合并,进行或不进行离心,以从溶液中分离靶核酸片段26并使其脱盐,作为在容器48底部形成的沉淀物50。在步骤40c中,可除去上清液44,并可重悬包含靶核酸片段26的沉淀物50。
在一些实施例中,大小分级组分42可包括一种或多种盐、聚合物和/或表面活性剂及其组合。合适的聚合物可以包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、右旋糖酐、聚亚烷基二醇(例如疏水改性的聚亚烷基二醇)、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物(例如疏水改性的聚(氧化烯)共聚物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性的聚醚和聚N异丙基丙烯酰胺及其共聚物。
合适的表面活性剂可以包括但不限于Triton-X,Triton-114,Igepal CA-630和Nonidet P-40,阴离子表面活性剂,例如羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油脂、硫酸化酯、硫酸化链烷醇酰胺、烷基酚,乙氧基化和硫酸化非离子表面活性剂,例如乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨糖醇酯、脂肪酸的乙二醇酯、羧酸酰胺、单烷醇胺缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺,阳离子表面活性剂,例如季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环胺、n,n,n',n'四取代的乙二胺、2-烷基1-羟乙基2-咪唑啉,和两性表面活性剂,例如n-椰油3-氨基丙酸/钠盐、n-牛油3-亚氨基二丙酸二钠盐、n-羧甲基n-二甲基n-9十八烯基氢氧化铵、n-椰油基酰氨乙基n-羟乙基甘氨酸。
合适的盐可以包括但不限于亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵和含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵,及其组合。
在一些实施例中,上清液中的一种或多种大小分级组分42的摩尔浓度小于第一相溶液22中的第一聚合物或表面活性剂组分17的摩尔浓度,后者的摩尔浓度又大于第三相溶液36中的第二聚合物或表面活性剂组分31的摩尔浓度。
在一些实施例中,上清液44中的至少一种大小分级组分42的质量浓度小于第一相溶液22中的第一聚合物或表面活性剂组分17的质量浓度,后者的质量浓度又大于第三相溶液36中的第二聚合物或表面活性剂组分31的质量浓度。
合适的沉淀组分46可以包括本领域已知的那些,例如异丙醇、一种或多种聚阳离子聚合物盐、一种或多种压实剂和/或二醇。
实例
将参考以下实例更详细地描述本发明。本领域技术人员将容易理解,所提供的实例仅用于说明的目的,并不意味着限制本发明的范围,本发明的范围由随后的权利要求限定。以下和本申请中其他地方给出的所有参考文献通过引用包括在本文中。
实例一-核酸的分离
进行一组实验以观察使用不同浓度的不同大小的聚合物的组合对通过如上所述在分离聚合物-盐ATPS的顶部相和底部相之间的分配来从污染物中纯化核酸的影响。当生物样品被裂解时,释放蛋白质、RNA、基因组DNA、细胞和细胞碎片。裂解样品的离心可以除去其中一些污染物,但仍有许多残留。出于一些分离步骤实验的目的,在室温(15-30℃)和在7至11之间变化的pH下,将1mL的10%(w/v)BSA溶液和从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)或新英格兰生物实验室(New England BioLabs)获得的不同类型的DNA梯的制剂与相形成分离组分在离心管中混合,并以不同的持续时间和速度进行离心。
将从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得的分子量在400与1200之间的二醇聚合物(在30wt%水溶液中)于水中在40uL至80uL的范围内以相对比例与在30wt%水溶液中制备的67μL的相形成盐合并以形成分离ATPS。
在琼脂糖凝胶上定性分析来自ATPS的顶部相和底部相(图2)。琼脂糖凝胶在来自miniPCR的blueGel电泳系统单元中运行。将含有0.01%(v/v)GelGreen核酸染料(Biotium公司)的1%(w/v)琼脂糖(飞世尔生物试剂公司(Fisher BioReagents))凝胶在48V下运行40分钟。然后在UV光下分析凝胶并拍照。从琼脂糖凝胶电泳可以看出,大尺寸的DNA片段高度分配到富含盐的底部相。凝胶图像和表格说明了改变不同大小的聚合物分离组分的百分比对核酸分配到富含聚合物的顶部相中,而较大的不希望的DNA片段分配到富含盐的底部相中的影响。
制备聚合物、分子量范围为400至35000的聚丙二醇、分子量范围为200至35000的聚乙二醇、分子量范围为8000至240000的聚(丙烯酸)钠、分子量范围为6000至65000的右旋糖酐、盐(相形成和非相形成)、0.1M至5M氯化钠溶液、硫酸钠溶液、硫酸铵溶液、30wt%至65wt%磷酸氢二钾、20wt%至50wt%磷酸二氢钾和表面活性剂(Triton X-100、Triton X-114)和条件(例如pH、温度)的多种组合,并通过涡旋混合随后以各种旋转时间和速度离心来筛选它们分离成热力学稳定的分离ATPS的能力,从而优化产量、稳定性、分配、与后续方法步骤和下游PCR的相容性。在优选的实施例中,在包含聚合物和盐的ATPS中可实现更高的核酸回收,尽管其他相形成分离组分也是合适的。聚合物的分子量的范围为200至240000,浓度为0.1至40,盐的浓度为0.1至40。观察到通常7至8的pH和20℃至30℃的温度导致更稳定的ATPS和相对更高的核酸回收。还通过添加共溶质来调节各相之间的密度阶梯。
实例二-使用连续ATPS选择性分离和浓缩短链核酸片段
将来自赛默飞世尔科技公司的500ng GeneRuler Low Range DNA梯掺入到500μL89mg/mL BSA(西格玛奥德里奇公司)溶液中,平衡至RT(24℃)后,然后在试管中与分离组分溶液混合,所述分离组分溶液由22.5%(v/v)二醇聚合物200MW和18%(v/v)相形成盐组成,pH为约7至9。在充分涡旋之后,将试管在7000rcf下旋转120秒以形成第一、分离ATPS。污染物分配到富含聚合物的顶部相中,而一定大小范围的大多数核酸分配到富含盐的底部相中,顶部相:底部相的体积比为5:1。在测试的配制品中,测量了在底部相中回收的核酸的百分比,并且发现在优选的实施例中回收的核酸的百分比高于92%(运行2,图3A)。
为了将核酸片段浓缩成更小的体积,从分离ATPS容器中提取富含核酸的底部相,并与相形成浓缩组分的各种组合混合,这些相形成浓缩组分包括终浓度为9.5%(v/v)的二醇聚合物600MW(西格玛奥德里奇公司)和终浓度为25.8%(v/v)的相形成盐,并且内容物的pH为约7-9。在充分涡旋之后,将试管在7000rcf下旋转120秒以形成第二、浓缩ATPS。增加相形成盐的浓度导致较大的底部相,而核酸分配到较小的顶部相,这主要通过改变二醇聚合物含量来自由调节以最大化核酸浓度或分配。
通过微量移液管将来自第一ATPS的底部相转移到含有上述第二ATPS的微量离心管中。污染物分配到富含盐的底部相中,而一定大小范围的核酸分配到富含聚合物的顶部相中并在其中浓缩,富含聚合物的顶部相的体积为富含盐的底部相体积的1/3至1/20。在不同的运行中,测量在顶部相中回收的核酸的百分比,并且发现在优选的实施例中回收的核酸的百分比超过90%,更优选地接近100%(图3B)。
实例三-经分离和浓缩核酸的回收
进行了多个筛选实验以开发用于从溶液中(例如经分离和浓缩的如上所述的浓缩ATPS的顶部相中)回收所希望的片段大小的核酸的合适参数。在一些实施例中,使用大小分级和盐沉淀方法,其中将纯化的、浓缩的核酸溶液(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州(MA),大小从25bp至20kbp)首先通过涡旋与各种浓度(范围为1%-12%)的具有MW 15000的二醇聚合物和浓度范围为0.1M至1.8M的一种或多种非相形成盐混合,然后在10krcf下于室温离心15分钟。聚合物/盐浓缩导致超过所希望的截止大小(其可自由调节超过100bp)的核酸在混合容器的底部,微量离心管的底部尖端沉淀成沉淀物,同时形成包括小于所选大小的核酸片段的上清液。然后通过微量移液管转移上清液(其最终体积取决于配制品),并与包括聚乙烯亚胺、精胺、quatroquat、NaI、精胺-HCl、三价亚精胺和盐的沉淀组分混合,以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物。
发现截止大小可以通过许多因素精确调节,包括终浓度为1%-12%(v/v)的具有2k至20k的不同MW的二醇聚合物、浓度为0.1M至1.8M的非相形成盐、0℃至30℃的孵育温度、5至20分钟的孵育时间、10krcf 15分钟至20krcf 1分钟的组合下的离心时间和速度。研究了不同的共沉淀剂,发现几种共沉淀剂有助于去除大尺寸的DNA条带以及稳定所选定的截止值。
在一个示例性实施例中,制备并分析样品1-9以通过几个核酸回收实验评价改变聚合物/盐DNA沉淀系统中不同参数的影响。将制备的掺有血浆的核酸混合物样品溶液(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp)与第一ATPS组分在试管中混合,并在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个第一底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。然后,将来自第二ATPS的具有反应体积(uL)的每个第二顶部相分别转移到新试管中。将含有二醇聚合物P10、盐S17和添加剂EDTA的分级组分添加到来自第二ATPS的第二顶部相以形成分级混合物。在充分涡旋之后,将试管在室温下孵育10分钟(或样品9为30分钟)并且在约16,000rcf下旋转10分钟。对于每个样品,获得沉淀物“P”和上清液“S”。将上清液“S”转移到新试管中并与所述沉淀组分和盐混合以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于合适的缓冲液中进行分析。将获得的沉淀物“P”重悬于缓冲液中进行分析。表1-3显示了该示例性实施例中的核酸回收实验中所采用的第一ATPS组分和第二ATPS组分以及实验条件的细节。
第一ATPS组分 | 体积(uL) |
样品 | 1000 |
65%(w/w)非相盐 | 241.6 |
MW 600的100%二醇聚合物 | 196.2 |
表1.核酸回收实验中示例性第一ATPS组分的组成。
第二ATPS组分 | 体积(uL) |
来自第一ATPS的底部相 | 约800uL |
65%(w/w)非相盐 | 178.6 |
MW 200的100%二醇聚合物 | 60 |
表2.核酸回收实验中示例性第二ATPS组分的组成。
表3.核酸回收实验中使用的详细实验条件。
图4显示了几个核酸回收实验的沉淀物和上清液凝胶图像结果。“L”表示直接加载到凝胶中用于参考的DNA梯(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp),“P”表示在沉淀物中回收的DNA,“S”表示在最后步骤中获得的上清液中回收的DNA。其证明了改变几种沉淀组分(聚合物、盐、共沉淀剂)如何影响大小截止值。结果显示,分级组分中聚合物浓度从26.0%降低到14.3%将使大小截止值从优选较小和500bp(样品1)变为无截止值,即所有大小的DNA片段将保留在上清液中(样品2),而分级组分中聚合物浓度从26.0%增加到40.1%将使大小截止值从优选较小和500bp(样品1)变为200bp,即仅约200bp或更小的DNA片段将保留在上清液中(样品3)。结果显示,分级组分中盐浓度从0.5%降低到0.26%将对沉淀物中的DNA沉淀产生不利影响,并且所有大小的DNA片段将保留在上清液中(样品4)。分级组分中盐浓度从0.5%增加到0.9%也将对沉淀物中的DNA沉淀产生不利影响(样品5),但大于500bp的DNA片段将不会保留在上清液中。样品6(具有降低的EDTA浓度)和样品7(具有增加的EDTA浓度)中的结果表明,EDTA浓度的变化不会导致大小截止值的变化。结果进一步显示,掺入的总DNA量从500ng减少到100ng(样品8)显著降低最终产量(即,DNA条带强度较轻)但不影响大小截止值。较长的孵育时间(从10分钟增加到30分钟)不会增加最终产量(样品9)。通常,改变所使用的一种或多种聚合物的浓度将使大小截止值从500bp变为200bp或从500bp变为无截止值,如凝胶图像所示,而改变所使用的盐的浓度将影响沉淀能力,随着盐浓度增加去除大尺寸的DNA片段。尝试了双沉淀法并发现产生一致的结果,但靶大小核酸片段的产量降低。还发现较低的初始核酸浓度显著地降低了所得核酸产物的产量和纯度,但未降低大小截止值。该观察可通过调节所添加的各组分的浓度来解决(图5)。
在一个示例性实施例中,制备并分析样品1-5以评价回收系统实验的稳健性。表1-2显示了第一ATPS组分和第二ATPS组分的细节,并且表4显示了该示例性实施例中的核酸回收实验中使用的实验条件。
表4.在回收系统的稳健能力实验中使用的详细实验条件。
图5说明了凝胶图像,其证明了回收系统实施例的稳健能力,通过设计参数的调整,在100bp和300bp之间以50bp的增量相对容易地微调核酸片段大小截止值。将总量100ng的NEB 1kb梯和Thermo GRL预掺入血浆样品中,并使样品运行本发明。
在示例性实施例中,“cfDNA”表示示例性靶DNA大小为150-200bp,例如约170bp。样品1-2中的结果显示,大部分cfDNA将沉淀到沉淀物中,而在样品3-5中,cfDNA将保留在上清液中。通过仅改变聚合物/非相形成盐沉淀步骤中组分的浓度,其中二醇聚合物15000在1%-12%(v/v),非相形成盐浓度在0.1M至1.8M,可实现所提及的希望截止值范围。选择该范围仅用于示例性目的及其与cfDNA分析中遇到的小尺寸的关系。
实例四-与Qiagen QIAamp MinElute ccfDNA微型试剂盒的比较
在该示例性实施例中,使用相同DNA样品比较ATPS系统与市售试剂盒。将ThermoGR1kb+和GRL(马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp)掺入到血浆中以形成用于测试的1kb梯样品混合物。使用相同量的1kb梯样品混合物进行测试。对于使用Qiagen QIAamp MinEluteccfDNA微型试剂盒(Qiagen试剂盒)的样品,根据制造商的说明书制备核酸。对于使用ATPS系统的样品,将所制备的核酸混合物溶液与第一ATPS组分在试管中混合并且在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的第一底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。然后,将来自第二ATPS的具有反应体积(uL)的每个第二顶部相分别转移到新试管中。将含有二醇聚合物P10、盐S17和添加剂EDTA的分级组分添加到来自第二ATPS的第二顶部相以形成分级混合物。在充分涡旋之后,将试管在室温下孵育10分钟(或样品9为30分钟)并且在约16,000rcf下旋转10分钟。对于每个样品,获得沉淀物“P”和上清液“S”。将上清液“S”转移到新试管中并与沉淀组分混合。然后将试管在20krcf下离心2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于合适的缓冲液中进行分析。将获得的沉淀物“P”重悬于缓冲液中进行分析。表1-2显示了第一ATPS组分和第二ATPS组分的细节,并且表5显示了该示例性实施例中的核酸回收实验中使用的实验条件。通过qPCR(罗氏公司(Roche))分析从ATPS系统和用于比较的商业试剂盒回收的DNA样品。
表5.ATPS系统中使用的详细实验条件。
如图6所示,当使用本发明时,通过连续ATPS方法从血浆样品中提取接近100%(通过qPCR(罗氏公司)分析)的核酸,130bp掺入的寡核苷酸,而Qiagen试剂盒提取约50%的此类核酸。因此,与QIAamp MinElute ccfDNA微型试剂盒相比,本发明显示出改进的性能。
实例五-使用二醇聚合物/聚(丙烯酸)钠和二醇聚合物/Triton ATPS系统选择性分离和浓缩靶核酸片段
在该示例性实施例中,制备并分析样品以通过几个核酸回收实验评价示例性ATPS系统。将制备的掺入有血浆的核酸混合物样品溶液(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp)与第一ATPS组分(二醇聚合物/聚(丙烯酸)钠)在试管中混合,并在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个底部相转移到含有第二ATPS组分(浓度为0、10%、20%和30%的二醇聚合物/盐/Triton)的新试管中。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。将顶部(T)和底部(B)相转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合。然后将试管在20krcf下离心2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于合适的缓冲液中进行分析。表6-7显示了该示例性实施例中的第一ATPS组分和第二ATPS组分的细节。
第一ATPS组分 | 体积(uL) |
样品 | 1000 |
20%非相盐 | 10 |
30%二醇聚合物MW10,000/10%聚(丙烯酸)钠 | 400 |
表6.核酸回收实验中示例性第一ATPS组分的组成。
第二ATPS组分 | 体积(uL) |
来自第一ATPS的底部相 | 约800uL |
20%非相盐 | 10 |
22%二醇聚合物MW4,000/Triton MW 625 | 300 |
表7.核酸回收实验中示例性第二ATPS组分的组成。
图7显示核酸回收实验的顶部(T)和底部(B)相凝胶图像结果。其证明了改变几种沉淀组分(聚合物、盐、共沉淀剂)如何影响大小截止值。结果显示,大多数蛋白质和污染物将分配到第一ATPS系统(二醇聚合物/盐/聚(丙烯酸)钠)中的第一底部相中,并且大多数核酸将保留在第一顶部相中。图7显示第二ATPS系统中二醇聚合物/盐/Triton浓度的增加将使核酸大小截止值选择从无截止值变为约300bp以保留在第二顶部(T)相中,并且较大的不希望的DNA将分配到第二底部(B)相中。通常,改变所用的二醇聚合物/Triton的浓度将改变第二顶部相中所希望的核酸大小截止值,如凝胶图像所示。
实例六-使用具有不同盐浓度的ATPS系统选择性分离和浓缩靶核酸片段
在该示例性实施例中,制备和分析样品以通过几个DNA和蛋白质回收实验评估不同浓度的硫酸钠。制备掺入有89.3mg/ml蛋白质的核酸混合物样品溶液(500ng/uL),并与具有不同浓度的硫酸钠的第一ATPS组分在试管中混合,并在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。将顶部(T)和底部(B)相转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合。然后将试管在20krcf下离心2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于合适的缓冲液中进行分析。测定顶部相和底部相中的DNA回收%和蛋白质回收%。表8显示了该示例性实施例中的实验细节。
表8.核酸和蛋白质回收实验中实验细节的组成。“顶部1”表示样品1的顶部相;“底部1”表示样品1的底部相;“顶部2”表示样品2的顶部相;“底部2”表示样品2的底部相;“顶部3”表示样品3的顶部相;“底部3”表示样品3的底部相。
图8显示了核酸和蛋白质回收实验的DNA和蛋白质回收结果。结果显示,硫酸钠盐浓度从0.1%增加到0.8%将导致在底部相中从约60%至85%(样品2和3)的更高DNA回收率。
实例七-使用多个Triton ATPS系统选择性分离和浓缩靶核酸片段
在该示例性实施例中,制备和分析样品以通过几个DNA和蛋白质回收实验评估不同浓度的硫酸钠。制备掺有血浆蛋白200ul的核酸混合物样品溶液(总共1000ng),并与第一ATPS组分在试管中混合以形成第一ATPS系统(水/Triton ATPS系统),并在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个底部相转移到含有沉淀组分的新试管中。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以在盐沉淀系统中形成核酸沉淀物。除去含有污染物的上清液。然后,向沉淀物中添加第二ATPS组分。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二分离ATPS(二醇聚合物/盐ATPS系统)。将含有较小尺寸核酸的第二上部相转移到新试管中并与第三ATPS组分混合以形成第三ATPS系统(二醇聚合物/Triton系统)。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以在上部白色悬浮液中形成第三ATPS(二醇聚合物/Triton ATPS系统)。然后,添加水以重悬白色悬浮液,以形成具有上部Triton贫乏相和下部Triton富集相的水/Triton系统。样品1和2中使用的最终提取体积分别为25ul和20ul。上部Triton贫乏相是含有干净的靶核酸的最终产物。通过凝胶电泳分析除去的液体、最终提取物(即Triton贫乏相)和Triton富集相。图9显示了除去的液体、最终提取物和T富集相凝胶图像结果。“L”表示直接加载到凝胶中用于参考的DNA梯(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp),结果显示靶核酸存在于所有级分中,这表明在一系列提取步骤中损失了一些靶核酸。结果还显示最终提取物含有大量的靶核酸。靶75bp条带保留在最终提取物中,并除去掺入的蛋白质。最终提取物中靶核酸的质量和数量均足以进行凝胶电泳分析。总之,多个Triton ATPS系统可有效地分离、纯化和浓缩靶核酸以用于下游应用。
实例八-使用具有不同分子量的聚合物回收经分离和浓缩的核酸
在该示例性实施例中,制备并分析样品以评价改变第二ATPS系统中聚合物的不同分子量对核酸回收的影响。将制备的掺入有血浆的约50ng样品溶液的核酸混合物与相同的第一ATPS组分在试管中混合,并在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个第一底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中,该第二ATPS组分含有低分子量或中等分子量聚合物。所有样品中第二ATPS组分中的聚合物和盐分别保持在7%和35%的相同浓度。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。然后,将来自第二ATPS的具有反应体积(uL)的每个第二顶部相分别转移到新试管中。将上清液转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于15ul合适的缓冲液中进行分析。通过Qubit荧光定量(英杰公司(Invitrogen))测定最终项目的核酸产量,并由产量计算回收率。表9显示了该示例性实施例中的实验细节以及DNA产量和回收率结果。在该示例性实施例中,从“低”到“中”的分子量差异在100-1000Da之内。
表9.使用具有不同MW的聚合物的实验细节以及DNA产量和回收率结果。“N/A”表示未记录转移体积。*注意平均回收率的计算排除了54.67%的异常值。
表9显示,聚合物分子量从“低”增加到“中”将导致更差的回收率,这表明具有特定分子量的聚合物可以在核酸回收中产生出色的性能。
实例九-在第二ATPS中使用不同顶部相体积回收经分离和浓缩的核酸
在该示例性实施例中,制备并分析样品以评价改变第二ATPS系统中顶部相的体积对核酸回收的影响。制备一种核酸混合物并且将其等分到含有相同的第一ATPS组分的试管中并且在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。然后将来自第一ATPS的每个第一底部相汇集在一起并等分到含有第二ATPS组分的新试管中,第二ATPS组分中含有根据表10的不同体积的聚合物(PM2)和盐(SM2)。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。然后,测定来自第二ATPS的每个第二顶部相的体积。将每个第二顶部相分别转移到新试管中。将上清液转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于合适的缓冲液中进行分析。对每个样品评价和测定形成干净沉淀物的能力、由A260/A280比率表示的核酸纯度、最终产物浓度和总产量。表10显示了该示例性实施例中的实验细节和结果。
表10.在第二ATPS中使用不同体积的顶部相的实验细节和结果。“N/A”表示不适用,因为DNA沉淀物未能形成。形成干净沉淀物的结果表示为“是”;形成不良、松散和/或脏沉淀物的结果表示为“可接受”;不形成沉淀物的结果表示为“否”。
虽然具有较大的顶部相体积是有利的,因为它倾向于使转移或提取期间核酸的损失最小化,但是表10显示较大的顶部相体积实际上仅产生可接受的(样品2和3)或甚至不产生DNA沉淀物(样品4、6、8-10)。具有较低浓度的盐的样品(样品2)产生不良、不稳定的沉淀物。较大的盐体积(样品5-10)产生更稳定的沉淀物和合理的产量。为了实现顶部相体积的增加,聚合物浓度需要相应地增加。发现当聚合物浓度增加至大于8.7%时,顶部相体积将大于200μL。表10中的数据显示,大于220μL的顶部相体积将导致核酸提取过程失败。即使核酸沉淀成功,也产生不干净的沉淀物(奇怪或垃圾沉淀物),结果也反映在DNA的纯度(A260/A280)中。总之,发现第二ATPS中的聚合物浓度和盐浓度分别小于8.7%和1%并且顶部相的最终体积小于200uL将显著提高ATPS系统的所得核酸产物的产量和纯度。
实例十-在第一和第二ATPS系统中使用不同分子量的聚合物回收经分离和浓缩的核酸
在该示例性实施例中,制备并分析样品以评价在第一和第二ATPS系统中使用不同分子量的聚合物对核酸回收的影响。制备核酸混合物样品溶液,并将其等分到含有不同聚合物分子量(根据表11)的第一ATPS组分的试管中并且在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。将来自第一ATPS的每个第一底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中,这些第二ATPS组分具有不同的聚合物分子量(根据表11)。在充分涡旋后,将各试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。将每个第二顶部相分别转移到新试管中。将上清液转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于具有相同体积的合适的缓冲液中进行分析。通过分光光度计(Nanodrop)测定每个样品的核酸纯度(由A260/A280比率表示)和DNA浓度。表11显示了该示例性实施例中的实验细节和结果。在该示例性实施例中,从“低”到“高”的分子量差异在200-2000Da范围内。
表11.在第一ATPS和第二ATPS中使用不同聚合物分子量的实验细节和结果。在样品3和4中没有获得DNA,因为在第一ATPS中没有形成相。
表11显示,当在第二ATPS中使用高分子量聚合物代替较低分子量聚合物时,DNA浓度将从约24ng/ul显著降低至约17ng/ul(样品1和2)。还显示,如果在第一ATPS中使用低分子量聚合物,则在第一ATPS中甚至不会形成相,因此不会获得核酸。结果显示,第一和第二ATPS系统中聚合物分子量的选择除了影响靶大小截止值选择外,还显著影响核酸回收。具有比第二聚合物组分更高的分子量的第一聚合物组分将显著提高ATPS系统的所得核酸产物的产量和纯度。
实例十一-在分级组分中使用不同分子量和浓度的聚合物回收经分离和浓缩的核酸
在该示例性实施例中,制备并分析样品以评价在分级组分中使用不同分子量和不同浓度的聚合物对核酸回收的影响。制备约200ng/mL的DNA梯(Thermo GR1kb+和GRL,马萨诸塞州,大小从25bp至20kbp)样品混合物溶液的核酸混合物,并将其等分到含有相同的第一ATPS组分的试管中并且在约37℃下孵育约15分钟。在充分涡旋后,将试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第一、分离ATPS。将来自第一ATPS的每个第一底部相转移到含有第二ATPS组分的新试管中,这些第二ATPS组分具有不同的聚合物分子量(根据表11)。在充分涡旋后,将各试管在7000rcf下离心约1分钟以形成第二、浓缩ATPS。将每个第二顶部相分别转移到新试管中。然后,将来自第二ATPS的每个第二顶部相分别转移到新试管中。将含有不同分子量或不同浓度的聚合物的分级组分(请参考表12)分别添加到来自第二ATPS的第二顶部相以形成分级混合物。在充分涡旋后,将各试管在室温下孵育10分钟(或样品9为30分钟)并在约16,000rcf下旋转10分钟。对于每个样品,获得沉淀物“P”和上清液“S”。将上清液“S”转移到新试管中并与沉淀组分和盐混合以将pH中和至约8-10。然后将试管在20krcf下旋转2分钟以分离靶核酸片段并使其脱盐成为沉淀物,将其进一步重悬于10uL合适的缓冲液(1X加载染料)中进行分析。将获得的沉淀物“P”以相同的方式重悬进行分析。表11显示了该示例性实施例中的实验细节和结果。在该示例性实施例中,从“低”到“高”的分子量差异在200-2000Da范围内。
图10显示了示例性实施例中核酸回收实验的沉淀物“P”和上清液“S”凝胶图像结果。从“低”到“中”的分子量差异在100-1000Da范围内,而从“中”到“高”的分子量差异在100-1000Da范围内。“P”表示在沉淀物中回收的DNA,“S”表示在最后步骤中获得的上清液中回收的DNA。虚线表示约1500bp的分子大小。结果显示,如果在分级组分中使用高MW聚合物(样品1和2),将实现小于约1500bp的截止大小。如果聚合物的分子量从高分子量变为中等分子量或甚至低分子量,则不能获得小于约1500bp的截止大小,并且具有所有片段大小的大多数核酸倾向于保留在上清液中(样品3-6)。结果进一步显示,使用两倍或四倍浓度的聚合物将不能获得令人满意的截止大小同时具有合理的产量,因为具有所有片段大小的大多数核酸将保留在沉淀物中(样品7-10)。总之,具有特定浓度的高分子量聚合物将获得令人满意的大小截止值和核酸回收结果。
因此全面地描述了本发明的示例性实施例。尽管该描述涉及特定实施例,但是本领域技术人员将清楚,本发明可以利用这些具体细节的变型来实践。因此,本发明不应被解释为限于本文所阐述的实施例。
Claims (24)
1.一种用于从包含核酸和污染物的流体混合物中分离和浓缩靶大小的核酸的方法,所述方法包括:
将所述流体混合物与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一双水相系统(ATPS)合并,使得小于靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液而污染物分配到所述第一相溶液;
提取所述第二相溶液并将其与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合,使得所述靶核酸片段分配到所述第三相溶液并在其中浓缩;以及
从所述第三相溶液中回收所述浓缩的靶核酸片段。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一聚合物或表面活性剂组分具有比所述第二聚合物或表面活性剂组分更高的分子量。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度大于在所述第三相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分、在所述第四相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分以及在所述第二ATPS中的所述第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的摩尔浓度。
4.根据权利要求1所述的方法,其中在所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度大于在所述第三相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分、在所述第四相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分以及在所述第二ATPS中的所述第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的质量浓度。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二相溶液包含至少一种相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分,其选自由以下组成的组:磷酸二钾、磷酸二氢钾、亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵,含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵,及其组合。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述第四相溶液包含至少一种相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分,其选自由以下组成的组:磷酸二钾、磷酸二氢钾、亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵,含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵,及其组合。
7.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比,所述第一ATPS的第二相溶液对所述靶核酸片段施加较弱的排除体积相互作用。
8.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第三相溶液相比,所述第一ATPS的第一相溶液对所述靶核酸片段施加较强的排除体积相互作用。
9.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比,所述第一ATPS的第二相溶液施加较有利于所述靶核酸片段分配到所述第二相中的亲水/疏水相互作用。
10.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第三相溶液相比,所述第一ATPS的第一相溶液施加较不利于所述靶核酸片段分配到所述第一相溶液中的亲水/疏水相互作用。
11.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比,所述第一ATPS的第二相溶液施加较有利于所述靶核酸片段分配到所述第二相中的静电相互作用。
12.根据权利要求1所述的方法,其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比,所述第一ATPS的第一相溶液施加较不利于所述靶核酸片段分配到所述第一相溶液中的静电相互作用。
13.根据权利要求1所述的方法,其中回收所述浓缩的靶核酸片段包括:
将所述第三相溶液与所述第四相溶液分离;
将所述第三相溶液与溶解在水溶液中的至少一种选自聚合物、表面活性剂、盐及其组合的大小分级组分混合,以形成由浓缩的靶核酸组成的上清液和沉淀的大于靶大小的核酸沉淀物;以及
将所述上清液与沉淀的大于靶大小的核酸沉淀物分离,并且将所述靶核酸片段从所述上清液中沉淀。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述至少一种大小分级组分包含分子量大于所述第一聚合物或表面活性剂组分的聚合物或表面活性剂组分,并且所述第一聚合物或表面活性剂组分的分子量大于所述第二聚合物或表面活性剂组分。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述上清液中的至少一种大小分级组分的摩尔浓度小于所述第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度,并且所述第一相溶液中的第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度大于所述第三相溶液中的第二聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述上清液中的所述至少一种大小分级组分的质量浓度小于所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度,并且所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度大于所述第三相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分的质量浓度。
17.根据权利要求13所述的方法,其中所述至少一种大小分级组分选自由以下组成的组:盐、聚合物、表面活性剂、或其组合。
18.根据权利要求13所述的方法,其中所述第一、第二和第三聚合物或表面活性剂组分的分子量为200至10000。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述流体混合物包括血液、血浆、细胞、外来体、蛋白质、无细胞DNA、RNA和循环肿瘤DNA中的至少一种。
20.根据权利要求1所述的方法,其中选择的核酸靶大小在100bp至小于10,000bp的范围内。
21.根据权利要求1所述的方法,其中选择的核酸靶大小在50bp至小于1000bp的范围内。
22.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一和第二相形成聚合物或表面活性剂组分包含至少一种选自由以下组成的组的组分:盐、聚合物、表面活性剂或其组合。
23.一种用于从包含核酸和污染物的流体混合物中分离和浓缩靶大小的核酸的组合物,其包含:
用于由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成第一双水相系统(ATPS)的组分,使得当与所述流体混合物混合时,小于靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液并且污染物分配到所述第一相溶液;
用于由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成第二ATPS的组分,使得当与所述第二相溶液混合时,所述靶核酸片段分配到所述第三相溶液并在其中浓缩;以及
用于从所述第三相溶液中浓缩靶核酸片段的材料。
24.一种用于从包含核酸和污染物的流体混合物中分离和浓缩靶大小的核酸的试剂盒,其包含:
负载在容器中的用于由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成第一双水相系统(ATPS)的组分,使得当与所述流体混合物混合时,小于靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液并且污染物分配到所述第一相溶液;
负载在容器中的用于由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成第二ATPS的组分,使得当与所述第二相溶液混合时,所述靶核酸片段分配到所述第三相溶液并在其中浓缩;以及
负载在容器中的用于从所述第三相溶液中浓缩靶核酸片段的材料。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2019055926A2 (en) * | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Yin To Chiu | METHOD FOR USING A TWO-PHASE AQUEOUS SYSTEM FOR ISOLATING, PURIFYING AND / OR CONCENTRATING SHORT NUCLEIC ACID FRAGMENTS |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MUJAHID IQBAL等: "Aqueous two-phase system (ATPS): an overview and advances in its applications", BIOL PROCED ONLINE ., pages 1 - 18 * |
T. MATOS等: "Isolation of PCR DNA fragments using aqueous two-phase systems", SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY, 16 November 2013 (2013-11-16), pages 144, XP028818053, DOI: 10.1016/j.seppur.2013.11.014 * |
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