CN101050460B - 用于利用氢键在固相支持物的亲水表面上纯化核酸的方法和设备 - Google Patents

用于利用氢键在固相支持物的亲水表面上纯化核酸的方法和设备 Download PDF

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Abstract

提供了纯化核酸的方法，该方法包括：使含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液在表面上具有亲水性功能基团的固相支持物上接触，来将所述核酸结合到所述固相支持物上。由于可以按照原状使用固相支持物而不需任何表面处理，制造设备非常容易，核酸可以在宽的pH范围内与固相支持物结合而不需特定的添加剂，从而该设备可以用于芯片实验室。

Description

用于利用氢键在固相支持物的亲水表面上纯化核酸的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于利用氢键在固相支持物的亲水表面上纯化核酸的方法和设备。
背景技术
使用具有结合DNA倾向的材料进行从细胞分离DNA的方法。用于分离DNA的材料的实例包括二氧化硅(silica)、玻璃纤维、阴离子交换树脂和磁珠(Rudi，K.等，Biotechniqures 22，506-511(1997)；和Deggerdal，A.等，Biotechniqures 22，554-557(1997))。为了避免人工操作和消除操作员误差，已经开发了自动化的机器用于高通量的DNA提取。
高纯度双链质粒DNA、单链噬菌体DNA、染色体DNA和琼脂糖凝胶纯化的DNA片段的产生在分子生物学中是非常重要的。纯化DNA的理想步骤应是简单和快速的，并包括对样品的少量附加操作。使用这种方法获得的DNA可以用于进行直接转化、限制性内切酶分析、连接或测序。在DNA样品的自动化产生中这种方法是非常吸引人的，在研究和诊断实验室中是非常有利的。
通常，利用固相来纯化核酸的方法是已知的。例如，美国专利No.5,234,809公开了利用固相来纯化核酸的方法，核酸被结合到所述固相上，该方法包括：将起始材料、离液(chaotropic)材料和结合固相的核酸混合；从液体中分离结合了核酸的所述固相，和洗涤所述固相核酸复合物。然而，这种方法是费时和复杂的，因而不适合于芯片实验室(Lab-On-a-Chip，LOC)。该方法还存在的问题在于要使用离液材料。
美国专利No.6,291,166公开了利用固相基质来获得(archiving)核酸的方法。该方法有益在于，由于核酸不可逆地与固相基质结合，对核酸固相基质复合物的延迟的分析或重复的分析是可能的。然而，依据这种方法，具有带正电表面的氧化铝需要通过添加碱性材料，例如NaOH使其成为亲水性的，核酸不可逆地与亲水性氧化铝结合，因而不能从氧化铝上分离。
美国专利No.6,383,783公开了从样品分离核酸的方法，该方法包括：将含有目标核酸的样品施加到疏水性有机聚合物固相上以将目标核酸连接到固相上；以及向所述固相添加非离子表面活性剂并除去连接的目标核酸。这个术语在说明书的这一节中的描述不是通用的，因为在美国专利No.6,383,783中公开的发明使用了亲水的固相，但是本发明使用了具有亲水表面的固相和kosmotropic盐。
本发明的发明人根据如上所述的先有技术研究了纯化核酸的方法，证实了当将kosmotropic盐添加到在表面上具有亲水性功能基团的固相支持物上时，核酸可以连接到其上而与pH值无关。
发明内容
本发明提供了使用具有亲水表面的固相支持物来纯化核酸的方法，该方法包括：使含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液在表面具有亲水性功能基团的固相支持物上接触，来将所述核酸结合到所述固相支持物上。
本发明还提供了用于纯化核酸的设备，该设备包括：表面具有亲水性功能基团的固相支持物；通过微通道与所述固相支持物互连并向所述固相支持物提供kosmotropic盐的kosmotropic盐溶液存储部分。
本发明还提供了包括用于纯化核酸的设备的芯片实验室。
附图说明
通过参考附图详细地描述本发明的示范性的实施方案，本发明的上述及其他特征和优点将更为显而易见，在附图中：
图1是显示在存在kosmotropic盐的情况下核酸与固相支持物的亲水表面结合的示意图；
图2是显示根据pH值结合到二氧化硅基底的E.coli gDNA的结合效率的图；
图3是显示根据pH值以及kosmotropic盐和离液盐的浓度的E.coligDNA结合效率的图；
图4是显示根据基底表面的种类的E.coli gDNA结合效率的图；以及
图5是显示使用kosmotropic盐E.coli gDNA的结合和洗脱效率的图。
具体实施方式
现在将参考附图更充分地描述本发明，在附图中显示了本发明的示范性的实施方案。
本发明提供了使用表面具有亲水性功能基团的固相支持物来纯化核酸的方法，该方法包括：使含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液在所述固相支持物上接触，来将所述核酸结合到所述固相支持物上。
在根据本发明的方法中，使用kosmotropic盐溶液，使核酸结合到具有亲水性功能基团的固相支持物表面上而与pH值无关，和向其中添加低盐溶液来洗脱核酸。在分离核酸的常规方法中要使用离液盐、要调整pH值、要修饰固相支持物表面、或要添加额外的特定添加剂例如聚乙二醇(PEG)。在根据本发明的实施方案的方法中，对固相支持物的表面条件限制很小，核酸可以在宽的pH范围下与固相支持物结合而不需特定的添加剂。
根据本发明的实施方案，使用kosmotropic盐来将核酸结合到固相支持物上。对于离液盐来说，固相支持物表面是脱水的，核酸通过氢键直接结合到固相支持物上，因而固相支持物的pH值是重要的。然而，对于kosmotropic盐来说，固相支持物表面是水化的，从而在其上形成稳定的水层。认为核酸在水化的固相支持物表面上被水化，这基于亲水性的相互作用的盐析效应。图1是显示在存在kosmotropic盐的情况下核酸与固相支持物的亲水表面结合的示意图。参考图1，由于kosmotropic盐的盐析效应，水在二氧化硅基底(图1的左侧)上形成氢键，形成的水层(图1的中间部分)再次与核酸(图1的右侧)形成氢键，从而核酸通过稳定的水层结合到固相支持物上。
因此，核酸与固相支持物结合不需要核酸结合一般所需的酸性条件，固相支持物表面不必限于二氧化硅。
固相支持物上亲水性功能基团的实例包括羟基、胺基(amine group)、羧基、多羧基等等，但不限于此。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，该方法还包括在核酸结合之后洗涤未结合到固相支持物上的样品。在这个过程中，核酸结合到固相支持物上，未结合到固相支持物上的样品被洗掉，从而核酸可以被纯化为更纯的形式。在核酸与固相支持物结合中使用的溶液可以用作洗涤液。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，该方法还包括通过添加水或核酸洗脱缓冲溶液来洗脱结合到固相支持物的核酸。可以使用结合到固相支持物上的核酸本身，但对于更有效地使用所述结合的核酸，例如扩增或检测分离的核酸，需要洗脱结合到固相支持物上的核酸。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，kosmotropic盐可以是硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)、醋酸盐(CH3COO-)等等，但不限于此。kosmotropic盐诱导蛋白的结晶，作为疏水性粒子的盐析离子起作用，根据霍夫曼迈斯特序列(Hofmeister series)形成水结构。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液可以具有3-10的pH值。当含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液的pH值超过这个范围时，DNA可能物理地或化学地变性，因而可能影响随后的处理。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，kosmotropic盐的浓度可以是100-2,000mM。当kosmotropic盐的浓度低于100mM时，结合到固相支持物上的核酸的结合效率降低。当kosmotropic盐的浓度大于2,000mM时，难以制备所述溶液。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，所述固相支持物可以是载玻片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜、金属板等等，但不限于此。所述固相支持物可以是表面上具有亲水性功能基团的任何材料，但它应当是不溶于水的。当所述固相支持物可溶于水时，在纯化核酸之后难以从固相支持物上分离核酸溶液。此外，使用具有大的表面积的固相支持物是可取的，因为在其表面上可以包括更多的亲水性功能基团。因此，在平面状的固相支持物例如玻片或薄片的情况下，对平面状固相支持物的表面进行处理以具有柱状结构来增加它的表面积。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，核酸洗脱缓冲液可以是磷酸盐、Tris、HEPES、CHES、硼酸盐缓冲液等，但不限于此。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，核酸洗脱缓冲液可以具有5-10的pH值。当核酸洗脱缓冲液的pH值低于pH 5时，结合到固相支持物上的核酸的洗脱效率降低。当核酸洗脱缓冲液的pH值大于pH 10时，可能影响随后的处理。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，核酸洗脱缓冲液的浓度可以小于或等于100mM。当核酸洗脱缓冲液的浓度大于100mM时，结合到固相支持物上的核酸的洗脱效率降低，并也可能影响随后的过程。如果核酸洗脱缓冲液是水，核酸洗脱缓冲液的浓度是0mM。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，核酸与固相支持物的结合或核酸从固相支持物上的洗脱可以在静止或流动状态下进行。核酸和固相支持物的接触可以在静止状态和在流动状态下进行。也就是说，当含有核酸的溶液流入流动控制系统中时，固相支持物与核酸接触。在流动控制系统中，固相支持物可以是平面状的。然而，为了使更多的核酸与固相支持物接触，固相支持物可以具有大量的柱状结构。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，含有核酸的样品可以是血液、血清、尿、唾液、眼睛晶状体液、脑脊液、奶、腹水、滑液、腹膜腔液、羊水、组织、发酵液、细胞培养液、核酸扩增反应产物、核酸合成产物等等，但不限于此。根据本发明的实施方案含有核酸的样品可以来自哺乳动物、植物、细菌或酵母。样品可以是单个细胞形式或组织形式，细胞或组织可以来自体外培养。
使用根据本发明的当前实施方案的方法纯化的核酸可以具有任何分子量，具有单链形式、双链形式、环形、质粒形式，等等。例如，核酸，如小的寡核苷酸或长度约10-50核苷酸的核酸分子、长度约1,000-10,000核苷酸的较长的分子、具有甚至约50kb-500kb更大分子量的核酸，可以使用根据本发明的当前实施方案的方法来分离。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，该方法还包括在从固相支持物上洗脱核酸之后检测洗脱的核酸。可以通过电泳、测序等来检测洗脱的核酸。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，该方法还包括在从固相支持物上洗脱核酸之后扩增洗脱的核酸。当由于非常小数量的洗脱核酸而不能直接检测核酸时，通过使用PCR方法扩增洗脱的核酸可以容易地检测核酸。
在根据本发明的当前实施方案的方法中，扩增核酸可以不除去核酸洗脱缓冲液而进行。核酸洗脱缓冲液具有与核酸扩增中使用的缓冲液几乎相同的组成，因而在核酸洗脱缓冲液中洗脱的核酸可以立即扩增而不用除去核酸洗脱缓冲液。
本发明还提供了用于纯化核酸的设备，包括：表面上具有亲水性功能基团的固相支持物；和通过微通道与所述固相支持物互连并向所述固相支持物提供kosmotropic盐的kosmotropic盐溶液存储部分。
根据本发明的当前实施方案用于纯化核酸的设备基本上包括kosmotropic盐溶液存储部分和表面上具有亲水性功能基团的固相支持物。kosmotropic盐溶液存储部分是向固相支持物提供kosmotropic盐，并通过微通道与固相支持物互连的部分。当含有要分离的核酸的样品被导入到设备中时，kosmotropic盐溶液存储部分中的kosmotropic盐被提供给固相支持物，含有核酸的样品和kosmotropic盐在固相支持物中混合，然后核酸通过kosmotropic盐的盐析效应与固相支持物结合。为了洗脱结合的核酸，根据本发明的当前实施方案用于纯化核酸的设备还包括通过微通道与固相支持物互连并向固相支持物提供核酸洗脱缓冲液的核酸洗脱缓冲液存储部分。
在根据本发明的当前实施方案的设备中，固相支持物可以具有平面状结构、柱状结构、珠状结构或筛状结构，但不限于此。
在根据本发明的当前实施方案的设备中，所述固相支持物可以是载玻片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜、金属板等等，但不限于此。所述固相支持物可以是表面上具有亲水性功能基团的任何材料，但应当是不溶于水的。当所述固相支持物可溶于水时，在纯化核酸之后难以从固相支持物上分离核酸溶液。此外，使用具有大的表面积的固相支持物是可取的，因为在其表面上可以包含更多的亲水性功能基团。因此，对于平面状的固相支持物例如玻片或薄片来说，对平面状固相支持物的表面进行处理以具有柱状构造来增加它的表面积。
在根据本发明的当前实施方案的设备中，保存在kosmotropic盐溶液存储部分中并通过微通道导入到固相支持物的kosmotropic盐可以是硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)、醋酸盐(CH3COO-)等等，但不限于此。
在根据本发明的当前实施方案的设备中，该设备还包括在从固相支持物上洗脱核酸之后可以扩增或检测洗脱的核酸的核酸扩增部分或检测部分。在核酸扩增部分中，当由于非常小量的洗脱核酸而不能直接检测核酸时，可以使用PCR装置扩增洗脱的核酸。在核酸检测部分中，可以使用电泳装置、测序装置等来察看是否存在洗脱的核酸。
根据本发明的另一个实施方案，提供了包括用于纯化核酸的设备的芯片实验室。在根据本发明的实施方案用于纯化核酸的设备中，可以通过使用已知的微流体技术和MEMS装置的芯片上处理(process-on-a-chip)来实现每种功能元件，并可以进一步由芯片实验室实现。
在下文中，参考以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅是为说明性的目的，而不是用来限制本发明的范围。
比较实施例1：使用Qiagen DNA纯化系统根据pH值的核酸结合效率
测定了使用Qiagen DNA纯化系统根据pH值的核酸结合效率。使用包含E.coli BL21 gDNA 4688ng的E.coli溶胞产物作为包含核酸的样品，使用具有二氧化硅表面作为基底表面的Qiagen试剂盒(Cat.#51306)，在pH 4、7和10测量了核酸的结合效率。
图2是显示根据pH值结合到二氧化硅基底的E.coli gDNA的结合效率的图。在图2中可以看出，在pH 4时核酸结合效率最高，在pH 10时核酸结合效率最低。因此，可以看出，当pH值升高时核酸的结合效率显著地降低。这是因为当溶液的pH值升高时，基底表面上的负电荷增加，在增加的负电荷和具有负电荷的DNA之间的静电排斥力升高，从而DNA结合效率降低。
因此，在没有使用kosmotropic盐的Qiagen DNA纯化系统中在低pH值下核酸结合是可能的，但在高pH值核酸结合效率显著降低，因而可以看出当分离核酸时核酸高度地受pH值的影响。
实施例1：
使用根据本发明实施方案的方法的核酸结合效率
测定了使用根据本发明实施方案的方法的核酸结合效率。按照与比较性实施例1中相同的方法进行实验，只是使用SO4 2-作为kosmotropic盐，使用SCN-作为离液盐，分别使用0、10、1,000和2,000mM的SO4 2-和SCN-，在pH 4、6.5-7.5和10进行核酸结合。
图3是显示根据pH值以及kosmotropic盐或离液盐的浓度的E.coligDNA结合效率的图。在图3中，左侧图片代表使用SO4 2-作为kosmotropic盐测量E.coligDNA的结合效率的结果，右侧图片代表使用SCN-作为离液盐测量E.coli gDNA的结合效率的结果。在图3中可以看出，一般地，在pH 4时核酸结合效率最高，在pH 10时核酸结合效率最低，并可以看出盐浓度升高时核酸结合效率升高。然而，不同于比较实施例1，在使用kosmotropic盐的情况下，当SO4 2-的浓度升高时，即使在pH 10核酸的结合效率也升高。因此，看出当SO4 2-的浓度是2000mM时，核酸的结合效率在pH 4和pH 10有少许差异。然而，当以低浓度使用离液盐时，核酸的结合效率与以低浓度使用kosmotropic盐时的类似。另一方面，当盐浓度是2,000mM时，当pH值升高时核酸的结合效率降低，不同于kosmotropic盐。
以上描述的结果基于水的水化效应，以及kosmotropic盐水化基底表面，从而它增强了水网络，当DNA通过氢键结合到表面时，二氧化硅表面上水层的强大网络起到了关键作用。
因此，当根据本发明的实施方案使用kosmotropic盐将核酸结合到表面时，通过添加适量的kosmotropic盐可以有效地结合核酸而与pH值无关。
实施例2：
根据基底表面类型的核酸结合效率
测定了根据不同基底表面类型的核酸结合效率。基底是玻璃珠、具有多羧基末端的玻璃珠或具有羧基末端的玻璃珠。按照与比较性实施例1中相同的方法进行实验，只是使用1M硫酸钠(pH 4，pH 7)作为kosmotropic盐，和使用E.coli gDNA 1515ng作为核酸。
图4是显示根据基底表面的种类的E.coli gDNA结合效率的图。在附图4中，DDW代表的结果是指不存在kosmotropic盐的情况下使用蒸馏水时的结果，pH 4.0和pH 7.0的结果是指添加1M硫酸钠作为kosmotropic盐时的结果。在图4中可以看出，当不添加kosmotropic盐时核酸的结合效率非常低，当添加kosmotropic盐时核酸的结合效率显著地提高。此外，pH 4.0和pH 7.0的核酸结合效率显示了根据基底表面类型的微小变化。
因此，当添加kosmotropic盐同时将核酸结合到基底时，核酸有效地与基底结合而与pH值或基底表面类型无关。
实施例3：
使用根据本发明的实施方案的方法的核酸的洗脱效率
使用根据本发明的实施方案的方法测定了结合到基底上的核酸的洗脱效率。按照与比较性实施例1中相同的方法进行实验，只是使用具有柱状结构的二氧化硅芯片(silica chip)作为基底，使用2M硫酸钠(pH 4)作为kosmotropic盐，使用E.coli gDNA 1377ng作为核酸，以及使用10mMTris-HCl(pH 9)作为核酸洗脱缓冲液。核酸洗脱缓冲液具有与普通的PCR缓冲液类似的组成。使用Qiagen溶液作为对照组比较了核酸的结合效率和洗脱效率。
图5是显示使用kosmotropic盐E.coli gDNA的结合效率和洗脱效率的图。在图5中，A是指使用SO4 2-作为kosmotropic盐时，B是指使用Qiagen溶液作为对照组时。在图5中可以看出，在pH4，在kosmotropic盐和Qiagen溶液中核酸的结合效率都非常高。然而，对于洗脱效率来说，与使用Qiagen溶液的情况相比，根据本发明的实施方案使用kosmotropic盐的情况下DNA回收产量更高。
因此，当使用kosmotropic盐纯化核酸时，核酸的结合效率和洗脱效率非常高，从而根据本发明的实施方案的方法可以有效地用于核酸纯化。
根据本发明，由于可以按照原状使用固相支持物而不需任何表面处理，制造用于在固相支持物的亲水表面上纯化核酸的设备非常容易，核酸可以在宽的pH范围内与固相支持物结合而不需特定的添加剂，从而该设备可以用于芯片实验室。
虽然已经参考其示范性的实施方案具体地显示和描述了本发明，本领域的普通技术熟练人员应理解的是，在其中可以进行形式和细节方面的各种变化而不背离以下的权利要求中所限定的本发明的精神和范围。

Claims (19)

1.使用表面上具有亲水性功能基团的固相支持物纯化核酸的方法，该方法包括：
在所述固相支持物上使含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液接触，以将所述核酸结合到所述固相支持物上，其中该亲水性功能基团选自胺基、羧基和多羧基。
2.权利要求1的方法，还包括通过添加水或核酸洗脱缓冲液来洗脱结合到所述固相支持物上的核酸。
3.权利要求1的方法，其中所述kosmotropic盐选自硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)和醋酸盐(CH3COO-)。
4.权利要求1的方法，其中含有核酸的样品和含有kosmotropic盐的溶液具有3到10的pH值。
5.权利要求1或权利要求4的方法，其中所述kosmotropic盐的浓度是100～2000mM。
6.权利要求1的方法，其中所述固相支持物选自载玻片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜和金属板。
7.权利要求2的方法，其中所述核酸洗脱缓冲液选自磷酸盐、Tris、HEPES、CHES和硼酸盐。
8.权利要求2的方法，其中所述核酸洗脱缓冲液具有5-10的pH值。
9.权利要求2的方法，其中所述核酸洗脱缓冲液的浓度小于或等于100mM。
10.权利要求1的方法，其中所述含有核酸的样品选自血液、血清、尿、唾液、眼睛晶状体液、脑脊液、奶、腹水、滑液、腹膜腔液、羊水、组织、发酵液、细胞培养液、核酸扩增反应产物和核酸合成产物。
11.权利要求2的方法，还包括在从固相支持物上洗脱核酸之后检测或扩增洗脱的核酸。
12.权利要求11的方法，其中扩增核酸在不除去核酸洗脱缓冲液下进行。
13.用于纯化核酸的设备，所述设备包括：表面上具有亲水性功能基团的固相支持物；通过微通道与所述固相支持物互连并向所述固相支持物提供kosmotropic盐的kosmotropic盐溶液存储部分，其中该亲水性功能基团选自胺基、羧基和多羧基。
14.权利要求13的设备，还包括通过微通道与所述固相支持物互连并向所述固相支持物提供核酸洗脱缓冲液的核酸洗脱缓冲液存储部分。
15.权利要求13的设备，其中所述固相支持物具有平面状结构、柱状结构、珠状结构或筛状结构。
16.权利要求13的设备，其中所述固相支持物选自载玻片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜和金属板。
17.权利要求13的设备，其中所述kosmotropic盐选自硫酸盐(SO4 2-)、磷酸盐(HPO4 2-)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、甲酸盐(HCOO-)和醋酸盐(CH3COO-)。
18.权利要求13的设备，还包括核酸扩增部分或核酸检测部分。
19.包含权利要求13的用于纯化核酸的设备的芯片实验室。
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