CN103060212A - 一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，有效解决单产低、甲醇转化率不高的技术难题，将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株接种至YPD试管斜面培养基上，培养得斜面种子，斜面种子接入到YPD液体培养基的中，培养得摇瓶种子；将摇瓶种子接种到另取的YPD液体培养基中，培养一级种子；将一级种子接种到BSM液体培养基中，培养得二级种子；将二级种子接种到发酵培养基中开始发酵，得发酵液；发酵液导入到发酵液储罐中，静置，沉降，然后离心得菌泥，加清水，搅拌均匀，喷雾干燥，本发明所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达55%以上，氨基酸总量达50%以上，发酵菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。

Description

一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法。 

背景技术

当前，世界各国都十分重视开辟蛋白质资源和研究其应用技术，并已取得了很大进展，其中工业化最快的是单细胞蛋白生产，被认为是解决人类蛋白质资源匮乏最有效途径之一。 

单细胞蛋白（Single cell protein，SCP）又称微生物蛋白，指的是从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。单细胞蛋白可用制糖、造纸、淀粉、木材加工等产生的废液来发酵生产，但受原料限制而产量太少。在单细胞蛋白中，能够进行工业化大量生产的是甲醇蛋白，它是以工业甲醇为原料进行微生物发酵而得到的第二代单细胞蛋白。与天然植物蛋白相比，它含有更丰富的氨基酸、矿物质和维生素，可以部分代替鱼粉、大豆、肉类及脱脂奶粉等喂养家禽。 

从上世纪60年代起，世界就有不少国家开始进行甲醇蛋白的研究与开发生产，至70年代后期，从事该项研究工作的单位达到近千家。1980年，英国帝国化学公司（I. C. I）建立了年产10万吨甲醇蛋白的生产装置。美国的菲利浦石油公司（Phillips）改进了发酵罐结构，在1983年开发出了生产甲醇蛋白的新工艺，获得了更高浓度的甲醇蛋白，并在中间试验基础上建成了年产2000吨的工业示范装置。随后，法国的石油研究院与泰克尼伯公司（IFP-Technip），瑞典的奥普劳特（Norprotein）公司，德国的赫斯特-伍德（Hoechest-Uhde）公司等也相继建立了实验装置。国内从上世纪70年代开始，有包括山西生物研究所、北京营养源研究所等10余家单位从事甲醇蛋白的研究工作，其中山西生物研究所于90年代完成了中试工作。但从世界范围来看，由于甲醇蛋白生产过程中水、电、气消耗较大，不能实现高密度发酵，生产成本较高，而使得众多厂家未投入实际生产。 

近年来，全球气候与地质灾害频发，发展中国家的工业化进程加快，致使大量耕地被占用，全球性的粮食危机已开始显现，全球粮食储备水平不足年消费量的15%，以大豆与玉米为主要原料的饲料行业受到严重冲击，人与动物争夺口粮的严峻现实迫使人们寻求新的蛋白质资源来代替谷物蛋白。 

单细胞蛋白具有丰富的氨基酸、矿物质及维生素，可制作食品添加剂供人类直接食用。酵母浓缩蛋白具有明显的香味，可用于食品增鲜剂。它还可以用作饲料蛋白，大规模替代谷物蛋白而减少粮食的用量。 

但目前在我国对于单细胞甲醇蛋白饲料的开发还刚刚起步，只停留在研究阶段，对于如何将单细胞甲醇蛋白进行工业化生产，至今还未见有报导。 

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，可有效解决单细胞甲醇蛋白工业化生产过程中出现的单产低、甲醇转化率不高的技术难题。 

本发明解决的技术方案是，包括如下步骤： 

1）、分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342，保藏日期为：2012年9月12日；

将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，即得斜面种子，所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%葡萄糖、2%琼脂（北京奥博星化学试剂有限公司产品，公知技术，以下同）和余量的水混合在一起组成；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以YPD液体培养基体积1%～5%的接种量接入到YPD液体培养基的中，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子，所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

2）、一级种子培养：

A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行降温，当YPD液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

二级种子培养在5m³发酵罐中进行，二级种子培养基采用BSM液体培养基，步骤如下：5m³发酵罐中装BSM液体培养基体积为3m³；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15L/m³，二水硫酸钙0.4Kg/m³，硫酸钾8Kg/m³，七水硫酸镁6Kg/m³，甘油36Kg/m³和微量元素溶液3L/m³加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15L，二水硫酸钙0.4Kg，硫酸钾8Kg，七水硫酸镁6Kg，甘油36Kg和微量元素溶液3L加水至1m³；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同），硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同），氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；

用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将培养好的一级种子30L接种到3m³的BSM液体培养基中，接种量为1%，接种前应检查一级种子质量，镜检种子菌体整齐，健壮，出芽数在2～3个，无杂菌污染，接种时二级种子罐（二级种子罐即5m³发酵罐）罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐（一级种子罐即50L罐）罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度30～32℃，通风比1：1~1.5vvm（vvm表示通风量为发酵液体积的1～1.5倍/分钟），罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养24~30h，得二级种子；

4）、发酵罐甲醇蛋白生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子的BSM液体培养基相同的培养基，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3～4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m³发酵罐内的发酵培养基降温到30℃～35℃；用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m³发酵罐内pH值为5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养16~20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到36～40，湿重达到100～120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达350～400g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉；

所述的重量体积是指固体用g计，液体用mL计（以下同）。

本发明采用的毕赤氏酵母菌株HGD-01菌株，可以甲醇及氨水作为培养基主要碳源及氮源进行单细胞蛋白生产，所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达55%以上，氨基酸总量达50%以上，发酵菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。 

具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 

一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，包括如下步骤： 

1）、摇瓶种子培养：

在超净工作台（仪器型号SW-CJ-1FD）上将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24小时后，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子；

2）、一级种子培养：

A、在50L发酵罐中先加水10L，再投入300克酵母提取物、600克胰蛋白胨、600克葡萄糖，搅拌溶解，然后再加水至30L得YPD液体培养基，打开罐体蒸汽阀进口，通蒸汽进发酵罐夹套层，将YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，同时，对发酵罐的空气过滤器和取样口灭菌10min，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，同时使冷却水进入罐体夹套对培养基降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL（可培养4瓶，每瓶250mL）从50L发酵罐接种口倒入，接种前检查种子质量，要求无杂菌污染，菌体生长良好，出芽整齐，接种后，控制发酵罐温度30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

将3m³BSM液体培养基装入5m³发酵罐中，用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将30L一级种子通过压力管道接种到5m³发酵罐内pH值为4.8～5.0的BSM液体培养基中，接种前检查种子质量，镜检菌体整齐，健壮，出芽数在2～3个，无杂菌污染，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养30h，得二级种子；

4）、50m³发酵罐中甲醇蛋白的发酵生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子所用BSM液体培养基相同配方，首先将30m³发酵培养基投入到配料罐内，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到125℃，进入层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，当进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，打开50m³发酵罐内盘管冷却管进水阀门，对发酵培养基降温；待发酵培养基温度降到30℃时，用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将3m³二级种子接种到50m³发酵罐内的pH值为5.0的30m³发酵培养基中开始发酵，发酵温度30℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到40，湿重达到120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧上升高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72小时后，取样测定菌体湿重达392g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到两个25m³的发酵液储罐中，静置沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，离心获得菌泥，收集到发酵液储存罐中，向发酵液储存罐中加入2m³清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，进料流量为1吨/小时，进行喷雾干燥，收集蛋白干粉（即单细胞甲醇蛋白），称重，25公斤/袋，包装。

本发明主要采用甲醇及氨水作为碳源和氮源，以BSM液体培养基作为发酵培养基，以巴斯德毕赤酵母HGD-01作为生产菌株，发酵72-84小时，发酵液先经沉降、再离心，离心后的菌泥进行喷雾干燥，即得单细胞甲醇蛋白粉，50吨发酵罐发酵需要每升每小时不少于2立方米的空气通气量，经过50吨发酵罐中试生产表明，本发明生产的单细胞蛋白中粗蛋白含量在55%以上，氨基酸总量可达50%，游离氨基酸含量约为40%，B族维生素含量约400mg/kg，是替代畜禽饲料蛋白的理想原料，并可按一定量替代鱼粉蛋白添加于动物饲料中，经毒理学试验结果，是一种安全、无副作用的的饲料添加剂，本发明所得菌体湿重达300～350g/L，解决了甲醇蛋白在生产过程中不能实现高密度发酵问题，并经50吨发酵罐进行工业化生产测试表明，本发明实现了工业化生产，并取得了良好的效果，本发明甲醇转化率达45%以上，发酵周期短、遗传稳定性和安全性好，具体如下： 

对8批次的5L和10L发酵罐中发酵的甲醇蛋白产量分别进行检测（见表1），5L发酵罐中各批次湿菌体产量均在108-150g/L之间，其平均值为125g/L；10L发酵罐中各批次湿菌体产量均在180-250g/L之间，其平均值为212.5g/L。

表1. 8批次的5L和10L发酵罐甲醇蛋白产量 

    对10批次50L发酵罐发酵并对甲醇蛋白产量分别进行检测（见表2），50L发酵罐中各批次湿菌体产量均在250- 300g/L之间，其平均值为272g/L。该发酵结果比较稳定，每批次甲醇蛋白产量的偏差在8%以内。

表2 50L发酵罐10批次甲醇蛋白发酵结果 

对甲醇蛋白生产菌株在5m³发酵罐进行的6批次发酵结果进分析，发现发酵罐中各批次湿菌体产量均在310-355g/L之间，其平均值为331g/L（表3）。

表3. 6批次的5m³发酵罐甲醇蛋白产量 

    对甲醇蛋白生产菌株在50m³发酵罐的6批次产品进行跟踪检测，发酵罐中各批次湿菌体产量均在350-400g/L，其平均值为374g/L (表4)。

表4. 6批次的50m³发酵罐甲醇蛋白产量 

喂养统计数据：

试验组是在饲料中添加20-30%的本发明蛋白干粉，对照组是不混喂本发明蛋白干粉，饲料、饮水和饲养制度两组均相同。各选227只生畜，其中，仔猪112只，肉牛115只，选择体重5-12公斤，体重差异25%的仔猪，每天加料6次，平均每头仔猪日采食量为512g，喂养10天，测试结果：试验组每头平均日增重412g，成活率96%，对照组每头平均日增重350g，成活率85%，仔猪试验组的体况明显优于对照组仔猪的体况；选用260公斤的肉牛，日喂2次，间隔12小时，早晚各喂1次，平均每头肉牛日采食量为6.5公斤，喂养15天，试验组肉牛的精神状态明显优于对照组，基本未出现畜群闹栏骚动，皮毛较光亮，肢蹄强健，试验组采食量高于对照组10%；试验组比对照组平均增重5-8%，在发病率方面：试验组肉牛未出现疾病，未出现食欲不振及消化不良的现象，而对照组出现5例食欲不振，少食；肉牛试验组的体况明显优于对照组肉牛的体况，本发明生产的单细胞蛋白中活细胞数达180亿/g，加到饲料中喂养动物，改善动物体内微生态环境，改善动物体质。

Claims (2)

1.一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；

将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子，所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以YPD液体培养基体积1%～5%的接种量接入到YPD液体培养基的中，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子，所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

2）、一级种子培养：

A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行降温，当YPD液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

二级种子培养在5m³发酵罐中进行，二级种子培养基采用BSM液体培养基，步骤如下：5m³发酵罐中装BSM液体培养基体积为3m³；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15L/m³，二水硫酸钙0.4Kg/m³，硫酸钾8Kg/m³，七水硫酸镁6Kg/m³，甘油36Kg/m³和微量元素溶液3L/m³加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15L，二水硫酸钙0.4Kg，硫酸钾8Kg，七水硫酸镁6Kg，甘油36Kg和微量元素溶液3L加水至1m³；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；

用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将培养好的一级种子30L接种到3m³的BSM液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度30～32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养24~30h，得二级种子；

4）、发酵罐甲醇蛋白生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子的BSM液体培养基相同的培养基，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3～4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m³发酵罐内的发酵培养基降温到30℃～35℃；用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m³发酵罐内pH值为5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养16~20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到36～40，湿重达到100～120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达350～400g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉。

2.根据权利要求1所述的单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、摇瓶种子培养：

将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24小时后，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子；

2）、一级种子培养：

A、在50L发酵罐中先加水10L，再投入300克酵母提取物、600克胰蛋白胨、600克葡萄糖，搅拌溶解，然后再加水至30L得YPD液体培养基，打开罐体蒸汽阀进口，通蒸汽进发酵罐夹套层，将YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，同时，对发酵罐的空气过滤器和取样口灭菌10min，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，同时使冷却水进入罐体夹套对培养基降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，接种前检查种子质量，要求无杂菌污染，菌体生长良好，出芽整齐，接种后，控制发酵罐温度30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

将3m³BSM液体培养基装入5m³发酵罐中，用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将30L一级种子通过压力管道接种到5m³发酵罐内pH值为4.8～5.0的BSM液体培养基中，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养30h，得二级种子；

4）、50m³发酵罐中甲醇蛋白的发酵生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子所用BSM液体培养基相同配方，首先将30m³发酵培养基投入到配料罐内，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到125℃，进入层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，当进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，打开50m³发酵罐内盘管冷却管进水阀门，对发酵培养基降温；待发酵培养基温度降到30℃时，用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将3m³二级种子接种到50m³发酵罐内的pH值为5.0的30m³发酵培养基中开始发酵，发酵温度30℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到40，湿重达到120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧上升高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72小时后，取样测定菌体湿重达392g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到两个25m³的发酵液储罐中，静置沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，离心获得菌泥，收集到发酵液储存罐中，向发酵液储存罐中加入2m³清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，进料流量为1吨/小时，进行喷雾干燥，收集蛋白干粉。