CN107505468A - 一种用于检测人白介素10的检测试剂及其应用 - Google Patents

一种用于检测人白介素10的检测试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人白细胞介素10（interleukin10，IL10）的检测试剂，其技术方案要点是包括有生物素化抗体工作液、HRP标记链霉亲和素工作液、抗体预包被酶标板、HRP显色底物和标准品，所述生物素化抗体工作液中包含生物素标记的单克隆抗体IL10‑4A6，单克隆抗体IL10‑4A6的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链；抗体预包被酶标板中包含单克隆抗体IL10‑2D12，单克隆抗体IL10‑2D12的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链，最终达到了对人白细胞介素10具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点。

Description

一种用于检测人白介素10的检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及人白细胞介素10检测领域，特别涉及一种用于检测人白介素10的检测试剂及其应用。
背景技术
白细胞介素interleukin 缩写为IL，白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
1989年Fiorentino研究小组在小鼠中发现人白细胞介素10（Interleukin-10 人白细胞介素10)并成功进行了基因克隆。1990年该研究小组又成功分离并克隆了人类白细胞介素10（人白细胞介素10)，从此开启了对人白细胞介素10这一免疫网络中重要调节因子的研究先河。人白细胞介素10是具有多种功能的细胞因子，因为最初发现人白细胞介素10具有抑制Th1细胞释放细胞因子等作用，所以人白细胞介素10有细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor,CSIF),B细胞衍生的T细胞生长因子(B cell-derived T sell growth factor, B-TCGF）等别名。
人白细胞介素10的分子量为35～40KD，通常为二聚体；主要由TH2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的B细胞产生。
人白细胞介素10(IL-10)是一种多能的、在免疫调节和宿主防御反应中具有广泛效应的分子，是一种能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子，由Th2细胞分泌，能抑制Th1细胞（辅助性T细胞）合成IL-2、IFN-γ（IFN- γinterferon-gamma 干扰素一γ）。了解人白细胞介素10含量变化，对于了解各种疾病的免疫调节具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测人白细胞介素10的检测试剂，其对人体白细胞介素10具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于检测人白细胞介素10（interleukin10，IL10）的检测试剂，包括有生物素化抗体工作液、HRP标记链霉亲和素工作液、抗体预包被酶标板、HRP显色底物和标准品，所述生物素化抗体工作液中包含生物素标记的单克隆抗体IL10-4A6，单克隆抗体IL10-4A6的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链；抗体预包被酶标板中包含单克隆抗体IL10-2D12，单克隆抗体IL10-2D12的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。
本发明的目的二：一种高灵敏度单克隆抗体，包括具有可变区氨基酸序列如SEQID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链。
本发明的目的三：一种高灵敏度单克隆抗体，包括具有可变区氨基酸序列如SEQID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。
本发明的目的四：一种如权利要求1所述的检测试剂在人白细胞介素10检测中的应用。
本发明的目的五：一种用于检测人白细胞介素10的试剂盒，所述的试剂盒内配置有权利要求1所述的检测试剂。
较佳的，包括包被的抗IL10的单克隆抗体酶标板、生物素标记的抗IL10的单克隆抗体溶液、HRP标记链霉亲和素工作液、HRP显色底物和标准品。
较佳的，所述单克隆抗体IL10-2D12的最佳包被浓度范围1.5-3ug/ml，所述单克隆抗体IL10-4A6的最佳检测抗体工作浓度1:1800-2200，最低检出浓度可达pg级水平。
本发明的目的六：一种如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，将含有人白细胞介素10的待测物质放入包被抗IL10的单克隆抗体IL10-2D12的酶标板上，加入生物素标记的抗IL10的单克隆抗体IL10-4A6溶液反应，再加入HRP标记链霉亲和素工作液反应，随后加入HRP显色底物，根据显色OD值对照标准曲线计算待测物质中人白细胞介素10的含量。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、杂交瘤细胞可以在体外稳定地培养并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体；
2该单克隆抗体以其特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，可以很好的应用于人体血清、血浆、细胞上清中IL10含量的检测。
附图说明
图1为提取的阳性克隆子质粒，进行双酶切鉴定，最终得到的正确的转化子测序；
图2为通过SDS-PAGE检测蛋白质表达情况；
图3为轻链和重链可变区氨基酸序列；
图4为抗体包被浓度与检测抗体工作浓度的检测数据。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
实验所用试剂：HAT培养基（购自Sigma公司）、HT培养基（购自Sigma公司）、RPMI1640培养基（购自GIBCO公司）、羊抗鼠IgG-HRP抗体（购自Sigma公司）、羊抗鼠IgG-FITC抗体（购自Sigma公司）、胎牛血清（购自GIBCO公司）、DMSO（购自Sigma公司）、50%PEG（购自Sigma公司 分子量1450）、DMEM培养基（购自GIBCO公司）。
S1：IL10基因克隆
HMC-1细胞培养12h后加刺激物刺激，收取刺激后细胞样品，提取其总RNA。随后参照反转录试剂盒进行反转录cDNA，42℃反应1 h,95℃ 5min后终止反应，以所生成的反转录产物cDNA为模板，通过PCR扩增人IL10基因。
PCR扩增所用引物序列如下：
上游引物：5’-TTTGAATTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCT-3’；
下游引物：5’-TTTCTCGAGTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’。
PCR程序为: 94℃ 30s、56℃50s、72℃ 1min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。随后利用引入的双酶切位点Eco RI/Xho I进行双酶切，经纯化后进行基因重组。
基因重组：将经过酶切纯化的IL10基因3μL、PET-28A表达载体1μL、2×ligasebuffer 5μL和T4连接酶1μL混合后置于16℃连接12h，随后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并涂布于含50μg/ml 卡那霉素的LB平板，重组菌落形成后，以单个菌落接种液体LB后抽提重组质粒；以引入的双酶切位点Eco RI/Xho I进行双酶切鉴定，结果如图一所示。阳性质粒转化表达菌株BL21，挑取阳性克隆子培养并测序。
S2: IL10的表达纯化
将构建好的重组菌株诱导表达，于不同的时间点收取诱导表达样品，同时做未诱导菌株和空载体菌株对照。通过SDS-PAGE检测蛋白质表达情况。结果如图二所示。确定蛋白质表达后，超声波破碎菌体，将上清液和沉淀区分开，通过SDS-PAGE检测蛋白质以何种形式表达。检测结果表明蛋白质以不溶性的包涵体形式表达，将包涵体复性处理并纯化，得到目的蛋白。
S3：免疫动物
以上述IL10蛋白为抗原与等体积的佛氏完全佐剂乳化，乳化后向雌性BALB/c鼠背部皮下注射；2周后换用不完全佐剂乳化抗原，乳化后注射；间隔至少1个月后，采用不完全佐剂乳化抗原再次免疫；在融合前三天通过腹腔注射抗原进行加强免疫。
S4：细胞融合
骨髓瘤（SP2/0）细胞活化:
解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液(RPMI-1640,添加小牛血清)中,置于37℃、5%CO2条件下培养箱培养;3-5d后进行传代；
收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取0.5~1×106个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5min后无菌操作取瘤。
剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础液充分研磨后补加10 mL 1640液，静置2 min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL1640液，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mL基础1640液中。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 r/min离心 15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640液清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640液中，计数后备用。
免疫脾细胞的制备：
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
饲养细胞的制备：
取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%C02培养箱中待用。
融合及选择性培养：
将1-2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min，离心8 min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50% PEG0.8 mL (sigma)，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液10ml。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250ul/孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
S5：杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10ug/ml；向微孔中每孔加100ul,轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1h；甩掉孔内液体；洗涤3次，每次2～3分钟。
封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加200ul封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min,甩掉孔内液体,拍干,用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样:将待测的杂交瘤每孔取50ul上清液按顺序加入酶标孔中,轻轻摇匀.37℃ 1h,洗涤,拍干。
加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释至工作浓度，每孔加入100ul，轻轻摇匀，置37℃ 1h;然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100ul,轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50ul。
判定结果：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果，根据颜色深浅判定。
杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/毫升；
将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100ul/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记；
特异性抗体的检测:在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。
S6：单克隆抗体的大量制备
建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价。
S7：单克隆抗体IL10-4A6与IL10-2D12可变区序列测定
提取杂交瘤细胞总RNA：采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；合成cDNA：按照索莱宝反转录试剂盒合成cDNA第一条链；
PCR克隆可变区序列：根据genbank中小鼠抗体序列的保守位点设计引物，以cDNA为模板扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为94℃ 30s、56℃50s、72℃ 1min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过琼脂糖凝胶回收连接在T载体上，挑取阳性转化子，送至上海生工进行测序。其中引物序列分别为：重链可变区序列5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWG-3'和5’-TGAGGAG ACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCC-3’其中S,M,R,W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G,W=A/T,轻链可变区引物5’-GACATTG AGCTCACCCAGTCTCCA-3’和5’-CCGTTTTATTTCCAGCTTGG TCCC-3’。得到基因测序结果:4A6细胞株重链可变区序列长336bp，编码112个氨基酸，序列如SEQ ID NO 1所示；轻链可变区序列长324bp，编码108个氨基酸，序列如SEQ ID NO2所示。2D12细胞株重链可变区序列长351bp，编码117个氨基酸，序列如SEQ ID NO 3所示；轻链可变区序列长294bp，编码98个氨基酸，序列如SEQ ID NO4所示。
S8：生物素标记单克隆抗体IL10-4A6
将纯化后的单克隆抗体IL10-4A6用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释到1mg/ml；交互用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0),对抗体充分透析；
用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg;向1ml抗体溶液中加入120μL NHSB溶液，室温下持续搅拌，保温2-4小时，随后加入9.6μL 1 mol/L NH4Cl ，室温下搅拌10分钟。在4℃条件下对上述产物充分透析后，将样品上Sephadex G-25,以PBS缓慢洗脱，收集洗脱峰，将生物素标记的单克隆抗体IL10-4A6置于-20℃保存。
S9：单克隆抗体IL10-2D12包被酶标板的制备：
1、使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；
2、包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将IL10-2D12稀释至蛋白质含量为2μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；
3、经过上述步骤后，用5%脱脂奶粉或者0.1BSA封闭反应板的每个孔，每孔0.2ml，1h。洗涤3次，抽真空，-20℃保存。
试剂盒的使用
本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定人血清样本中白细胞介素10的水平。使用过程如下：
1、将标准样品进行倍比稀释（320pg/ml,160pg/ml,80pg/ml, 40pg/ml,20pg/ml）后加入酶标板反应孔中，同时将待检样品0.1ml置于包被酶标板反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔) ；
2、加生物素化的检测抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体IL10-4A6(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤3次，加入HRP标记的链霉亲和素0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
3、加底物液显色：于各反应孔中加入HRP底物显色液，0.1ml，37℃10～30分钟；
4、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml；
5、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，测定OD值后根据标准曲线计算IL10含量。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种用于检测人白细胞介素10（interleukin10，IL10）的检测试剂，其特征在于：包括有生物素化抗体工作液、HRP标记链霉亲和素工作液、抗体预包被酶标板、HRP显色底物和标准品，所述生物素化抗体工作液中包含生物素标记的单克隆抗体IL10-4A6，单克隆抗体IL10-4A6的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链；抗体预包被酶标板中包含单克隆抗体IL10-2D12，单克隆抗体IL10-2D12的特征为具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。
2.一种高灵敏度单克隆抗体，其特征在于：包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链。
3.一种高灵敏度单克隆抗体，其特征在于：包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。
4.一种如权利要求1所述的检测试剂在人白细胞介素10检测中的应用。
5.一种用于检测人白细胞介素10的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒内配置有权利要求1所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：包括包被的抗IL10的单克隆抗体酶标板、生物素标记的抗IL10的单克隆抗体溶液、HRP标记链霉亲和素工作液、HRP显色底物和标准品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体IL10-2D12的最佳包被浓度范围1.5-3ug/ml，所述单克隆抗体IL10-4A6的最佳检测抗体工作浓度1:1800-2200，最低检出浓度可达pg级水平。
8.一种如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：将含有人白细胞介素10的待测物质放入包被抗IL10的单克隆抗体IL10-2D12的酶标板上，加入生物素标记的抗IL10的单克隆抗体IL10-4A6溶液反应，再加入HRP标记链霉亲和素工作液反应，随后加入HRP显色底物，根据显色OD值对照标准曲线计算待测物质中人白细胞介素10的含量。
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