CN104817642A - 抗人ror1单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗人ror1单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗人ROR1单克隆抗体及其制备方法与应用，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区各具有3个CDR，重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或NO:27，CDR2为SEQ ID NO:22或NO:28，CDR3为SEQ ID NO:23或NO:29；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:24或NO:30，CDR2为SEQ ID NO:25或NO:31，CDR3为SEQ ID NO:26或NO:32。本发明的单体稳定性好，特异性强，通过的对特定细胞的监控就可以提前检测到白血病特异性标记，还可以结合乳腺癌细胞中的ROR1靶点，有利于沉默实验完成。

Description

抗人ROR1单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种抗人ROR1单克隆抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种人源化的抗人ROR1单克隆抗体及其制备方法，以及所述单克隆抗体在癌细胞治疗的示踪和靶向应用。
背景技术
受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor，ROR1)蛋白最初是在20世纪90年代发现的，之所以被称为孤儿受体，是因为其功能未知。之后有研究人员发现ROR1能在胚胎发育过程中高水平表达，并在胚胎肌肉和骨骼发育调控中扮演了重要的角色。但是在接下来的胎儿发育过程中，这种蛋白的表达被关闭了，成人正常细胞和组织中通常并不表达ROR1。但是，癌细胞是一个例外。
在2008年，Kipps博士研究组发现Wnt5a配体和ROR1相互作用可以提高白血病细胞的生存能力。ROR1应答产生的抗体可以阻碍机体生存信号，而且可以特异性地将这种白血病细胞作为毁灭靶目标。这项研究还指出ROR1抗原仅仅在白血病细胞中被发现，它可以开发为一种癌症没有被检测到的时候，白血病的鉴别或监控治疗后细胞存在状态的特异性标记。
在2012年，Kipps研究组发表研究报告在胚胎发育过程中表达的蛋白ROR1在许多不同类型的癌症中存在，但在正常产后组织中不表达。在这一基础上，研究人员进行了沉默实验，他们在人类乳腺癌细胞中沉默了ROR1蛋白，结果发现这减缓了癌细胞的生长速度，并在实验室和动物实验中都得到了证实。
目前没有针对ROR1的特异性抗体。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种对人ROR1特异性的单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供分泌表达抗ROR1的单克隆抗体的细胞株。
本发明的另一目的在于提供所述抗ROR1的单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述抗ROR1的单克隆抗体的应用。
本案发明人经大量实验研究，制得了一种抗人ROR1的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体是人源化的，其亲和力已经达到0.1nM的水平。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
具体而言，一方面，本发明提供了一种抗ROR1的人源化单克隆抗体，该抗体具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，其中：重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27，重链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28，重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29，轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:30，轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:31，轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32。
根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23，或者分别为SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29；所述轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26，或者分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。在本发明的一具体实施方案中，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23，所述轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26。在本发明的另一具体实施方案中，本发明的单克隆抗体，所述重链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29；所述轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。
根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8所示。根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明中，将该单克隆抗体命名为1G8单克隆抗体。根据本发明的另一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；本发明中，将该单克隆抗体命名为3F4单克隆抗体。
本发明中，进一步地，在所述的重链可变区的氨基酸和轻链可变区的氨基酸序列基础上，在重链可变区(VH)的N端加上针对重链分泌表达优化的信号肽序列，在VH的C端加上人IgG1-Fc恒定区序列(CH1-CH3)，构造出了重链全长的氨基酸序列。同时在轻链可变区(VL)的N端加上轻链分泌表达优化的信号肽序列，在VL的C端加上人Kappa恒定区序列，构造出轻链的全长氨基酸序列。即，根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链恒定区为人IgG1-Fc恒定区，轻链恒定区为人κ链恒定区。
根据本发明的一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQID NO：6所示；该抗体为本发明的抗ROR1的人源化单克隆抗体1G8的一具体示例。根据本发明的另一具体实施方案，本发明的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10和SEQID NO：12所示；该抗体为本发明的抗ROR1的人源化单克隆抗体3F4的一具体示例。
另一方面，本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者编码所述单克隆抗体的重链和/或轻链。
另一方面，本发明还提供了一种分泌表达本发明所述的抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株。
根据本发明的具体实施方案，本发明的单克隆抗体表达细胞系是采用UCOE载体技术及ClonePix单克隆筛选技术筛选得到的。更具体地，所述的分泌抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株是按照以下方法制备得到的：将带有编码本发明所述的抗体的重链的抗体基因的表达载体、带有编码本发明所述的抗体的轻链的抗体基因的表达载体分别转入大肠杆菌DH5α菌株，进行扩增培养，抽提纯化质粒DNA；其中，所述的表达载体优选为UCOE载体，构建带有抗体基因的表达载体的具体操作可以参照现有技术进行；将所得纯化的质粒DNA转染CHO细胞；转化的CHO细胞使用嘌呤霉素进行筛选，并在半固体选择培养基上进行稀释，使用ClonePix FL进行克隆挑选。优选地，挑出多个单克隆细胞系在FreeStyleTM CHO培养基中进行悬浮化扩大培养，对上清进行ELISA检测抗体表达量，从中挑选培养过程中抗体最高表达量在200mg/L以上的克隆，即为所述的细胞株。
在本发明的一具体实施例中(参见实施例4)，本发明筛选得到多株能够高表达抗ROR1单克隆抗体的克隆作为本发明的细胞株，其中，这些细胞株分别命名为：1G8-5(本发明中亦命名为1G8-5C3)、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9、3F4-2G7、3F4-5A6、3F4-3D4、3F4-2C4、3F4-2A10。其中，1G8-5C3、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9能高效地分泌表达本发明的抗ROR1的人源化单克隆抗体1G8；3F4-2G7、3F4-5A6、3F4-3D4、3F4-2C4、3F4-2A10能分泌表达本发明的抗ROR1的人源化单克隆抗体3F4。特别是，细胞株1G8-5C3经过简单流加工艺培养后，单克隆抗体产量可高至2.1g/L，且抗体纯度高(可达100％)，并具有很高的亲和力(达到0.1nM级别)，极具产业化应用前景和价值。本发明的细胞株1G8-5C3已于2015年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.10583；分类命名：受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1人乳腺癌细胞。
另一方面，本发明还提供了所述的抗ROR1的人源化单克隆抗体的制备方法，其包括：培养本发明所述的分泌表达所述抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株，收集细胞培养液，离心，上清液经0.45μm过滤后进Protein A柱亲和纯化，得到抗ROR1的人源化单克隆抗体。
实验证明，本发明的方法所制备得到的抗ROR1的人源化单克隆抗体，其产量高，极具产业化应用前景和价值；且纯度高(可高达98％以上)、亲和力强(亲和力可达到纳米级别甚至0.1nM级别)，在临床上具有重要的价值。
具体地，细胞株的培养过程可以参照所属领域中的相关现有技术进行。本发明中优选采用Feedbatch补料流加培养方式。
综上所述，本发明采用UCOE载体技术及ClonePix单克隆筛选技术，筛选出一些单克隆抗体表达细胞系，并据此提供了一种抗ROR1的人源化单克隆抗体及其制备方法与应用，本发明的单克隆抗体纯度高、是人源化的，其亲和力已经达到0.1nM的水平，在临床上具有重要的应用价值。
附图说明
图1：1G8和3F4重链可变区与轻链可变区的序列示意图。
图2：抗-人ROR11G8单抗使用ClonePix FL进行半固体培养基单克隆筛选时的荧光图片。
图3与图4：1G8-5C3流加培养工艺数据图表。
图5与图6：3F4-2C7流加培养工艺数据图表。
图7：Anti-Human ROR1mAb 1G8的SEC-HPLC分析谱图。
图8：Anti-Human ROR1mAb 1G8的SDS-PAGE电泳图。
图9：Anti-Human ROR1mAb 3F4的SEC-HPLC分析谱图。
图10：Anti-Human ROR1mAb 3F4的SDS-PAGE电泳图。
用于专利程序的生物材料保藏：
保藏日期：2015年04月16日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：CGMCC No.10583；
分类命名：受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1人乳腺癌细胞。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的方法，按照所属领域的常规操作进行。
实施例1利用噬菌体展示技术从抗体库中筛选抗人ROR1单克隆抗体的可变区基因
1.1人源抗体库构建
人源抗体库构建按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001Nov 1；257(1-2)：185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。
简而言之，从外周血淋巴细胞制备免疫球蛋白重链和轻链的基因，用PCR方法进行体外扩增，并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点，以人ROR1蛋白(Cat#RO1-H522y,ACROBiosystems Inc)为抗原，筛选到相应的特异性抗体。
1.2人源抗体库的筛选
将复苏的抗体库菌液1.5毫升加入新鲜LB培养基13毫升，在50毫升三角瓶中于37℃恒温220RPM震荡培养14-18小时。收获菌液，并测定OD600值，此时OD600应为2-4之间。将菌液转移至50ml离心管中，在高速低温离心机中(Eppendorf，5418R)10000rpm、4℃高速离心10min，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，此时检测噬菌体滴度，在2×1011以上。
人ROR1蛋白(Cat#RO1-H522y,ACROBiosystems Inc)为抗原，包被25毫升细胞培养瓶，包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。
倒掉瓶中的液体，使用10毫升PBS(含1％Tween-20)洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃震荡培养16小时。重复进行4个循环。
将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。
取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作480个克隆(5块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000rpm离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。
取96孔板5块，每孔中加入人ROR1蛋白(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。
然后加入1μl HRP标记的小鼠抗M13单抗(Abcam ab50370)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS溶液200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上(Thermofisher MK3)读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
通过上述过程筛选出了100个阳性克隆，Top10最强的克隆的亲和力测定结果见表1。根据读数确定其中亲和力最强两个克隆(克隆编号分别为1G8、3F4)，用于后续实施例的研究。
表1
      
实施例2抗体高变区编码序列的测序及抗体全序列的获得
将实施例1得到的克隆的菌株(1G8、3F4)，分别在5毫升LB培养基中扩增，用Lifetechnologies公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒(Cat#K1910-01)纯化质粒DNA。
使用人源抗体已知的人kappa和IgG1序列设计可变区通用引物，进行PCR扩增，获得的轻链和重链可变区。
PCR引物：VL-F：5’CGTACGGTGGCTGCACCATCT 3’(SEQID NO：33)；
VL-R：5’CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 3’(SEQID NO：34)；
VH-F：5’GCTAGCACCAAGG GCCCATCGG 3’(SEQID NO：35)；
VH-R：5’GATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG GC 3’(SEQID NO：36)。
PCR反应使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara,货号DR010B)进行：20μl 10*PrimeSTAR buffer，16μl 2.5mM dNTP，14μl 10μM重链或轻链恒定区引物对，4μl DNA模版，2μl PrimeSTAR DNA Polymerase，反应体系200μl。扩增条件：变性94℃4min；变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，30个循环；延伸72℃5min。
PCR反应获得的VH及VL产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。
结果显示在序列表中。
对于单克隆抗体1G8而言，SEQ ID NO：1和SEQID NO：2分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体1G8的重链可变区和轻链可变区的VH和VL氨基酸编码序列。参见图1，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，分别编号为CDR1、CDR2、CDR3，其中：重链：CDR1：QFKLEGYP(SEQID NO：21)；CDR2：YKTNLRSI(SEQID NO：22)；CDR3：NPKLRIGGSVDEEGR(SEQID NO：23)。轻链：CDR1：QSINSGYV(SEQID NO：24)；CDR2：GIPDRFSGS(SEQID NO：25)；CDR3：NDQKSDGPWT(SEQID NO：26)。
对于单克隆抗体3F4而言，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体3F4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸编码序列。参见图1，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，分别编号为CDR1、CDR2、CDR3，其中：重链：CDR1：QFRSTWGYP(SEQID NO：27)；CDR2：SGDKWENE(SEQID NO：28)；CDR3：GSKRIDWVGSGKGRY(SEQID NO：29)。轻链：CDR1：AQSVSYNY(SEQID NO：30)；CDR2：SGGSDDT(SEQID NO：31)；CDR3：DDQFEEWTFYW(SEQID NO：32)。
在已测定的VH和VL氨基酸序列基础上，在VH的N端加上针对重链分泌表达优化的信号肽序列，在VH的C端加上人IgG1-Fc恒定区序列(CH1-CH3)，构造出了重链全长的氨基酸序列。同时在VL的N端加上轻链分泌表达优化的信号肽序列，在VL的C端加上人Kappa恒定区序列，构造出轻链的全长氨基酸序列。
对于单克隆抗体1G8而言，SEQ ID NO：4和SEQID NO：6分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体1G8的重链和轻链全长的氨基酸编码序列；
对于单克隆抗体3F4而言，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体3F4的重链和轻链全长的氨基酸编码序列。
将构造出的氨基酸编码序列SEQ ID NO：4和SEQID NO：6及SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行密码子优化及全基因合成。
对于单克隆抗体1G8而言，SEQ ID NO：3和SEQID NO：5分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体1G8的重链和轻链全长的核酸编码序列；
对于单克隆抗体3F4而言，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11分别是本发明获得的ROR1单克隆抗体3F4的重链和轻链全长的核酸编码序列。
实施例3抗体可变区编码序列的表达载体的克隆与构建
使用Life technologies公司的GeneSeamless Cloning and Assembly Kit(lifetechnologies Cat#A13288)进行载体构建。将1G8和3F4的重链和轻链分别构建至UCOE载体中。UCOE载体购买于Millipore公司。
引物设计：
UCOE-1G8-H-S：gttagttaagttaacggccggccATGGGCTGGTCCCTGATTC(SEQ ID NO：13)；
UCOE-1G8-H-AS：cgactacgtggccgcgctagcTTATTTACCCGGAGACAGGGAG(SEQ ID NO：14)；
UCOE-1G8-L-S：gttagttaagttaacggccggccATGGACTTCCAGGTCCAG(SEQ ID NO：15)；
UCOE-1G8-L-AS：cgactacgtggccgcgctagcTTAACACTCTCCCCTGTTGAAG(SEQ ID NO：16)；
UCOE-3F4-H-S：gttagttaagttaacggccggccATGGGCTGGTCCCTGATTC(SEQ ID NO：17)；
UCOE-3F4-H-AS：cgactacgtggccgcgctagcTTATTTACCCGGAGACAGGGAG(SEQ ID NO：18)；
UCOE-3F4-L-S：gttagttaagttaacggccggccATGGACTTCCAGGTCCAG(SEQ ID NO：19)；
UCOE-3F4-L-AS：cgactacgtggccgcgctagcTTAACACTCTCCCCTGTTGAAG(SEQ ID NO：20)。
使用上述引物，将1G8和3F4和VH及VL序列进行PCR，然后与人IgG1-Fc及人Kappa的恒定区PCR产品进行三片段重组构建(操作按照试剂盒说明完成)。
挑取重组构建获得的平板，每块平板各挑取5个单克隆分别至5ml LB培养基中，过夜培养。第二天提取质粒，进行PCR鉴定。PCR鉴定正确的质粒委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行载体测序确认。确认构建得到带有抗体基因的表达载体。
实施例4CHO细胞的转染与克隆的筛选
上述实施例3中构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌DH5α菌株，然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用lifetechnologies公司的FreeStyleTM MAX试剂盒(K9000-20)转染CHO-S细胞，轻链和重链的比例为1:1，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞使用10μg/ml Puromycin进行筛选，14天后，在半固体选择培养基上进行稀释，6天后，使用ClonePix FL进行克隆挑选。每个单抗各挑出的96个单克隆细胞系在FreeStyleTM CHO培养基(Cat#12651-014)中进行悬浮化扩大培养，14天左右，对上清进行ELISA检测实验，根据ELISA结果挑选表达量高的克隆。
每个单抗获取Top5的高表达克隆作为候选细胞株。所挑选的1G8单抗高表达的5个克隆的编号分别为：1G8-5C3、1G8-2D1、1G8-6H4、1G8-2E10、1G8-3B9；所挑选的3F4单抗高表达的5个克隆的编号分别为：3F4-2G7、3F4-5A6、3F4-3D4、3F4-2C4、3F4-2A10。
各克隆在培养过程中第7天及第13天的表达量检测数据参见表2。
表2
      
图2为抗-人ROR11G8(Anti-Human ROR11G8)单抗使用ClonePix FL进行半固体培养基单克隆筛选时的荧光图片。
实施例5单克隆抗体的表达量鉴定
在125ml摇瓶中，对两株单克隆抗体细胞系1G8-5C3和3F4-2G7进行简单的Feedbatch补料流加培养，以确定其表达量及单产。在整个Feedbatch培养过程中，每天取样进行检测。培养过程中表达量的监控和确认采用MAbPacTM Protein A高效液相色谱(HPLC)柱进行分析。
具体地，1G8-5C3单克隆细胞系在CO2摇床中培养的培养条件如下：
培养在125ml摇瓶中进行，培养体积为25ml。摇床的温度控制在37℃，摇床转速为135RPM，CO2浓度为8％，接种密度为0.5×106cell/ml，培养基为F17(Lifetechnologies,Cat#A1383503)。
请结合参见图3及图4所示的1G8-5C3流加培养工艺数据。在接种后120小时，细胞密度达到4X106cell/ml的时候进行第一次补料，补料2.5ml CHO CD EfficientFeed(Lifetechnologies,Cat#A10241-01)，在接种后168小时，当细胞密度达到8×106cell/ml的时候进行第二次补料，补料3ml CHO CD EfficientFeed；在接种后216小时，当细胞密度达到10×106cell/ml的时候进行第三次补料，补料2ml CHO CD EfficientFeed；在接种后264小时，当细胞活率接近80％的时候进行第四次补料，补料1ml CHO CD EfficientFeed；在接种后360小时后，当细胞活率接近70％的时候收获，此时的细胞培养IVC为2400左右。
经过16天的流加培养，1G8-5C3最高细胞密度可维持在1.2×107cell/ml，细胞IVC可达到2400，单克隆抗体产量可达到2.1g/L。
3F4-2G7单克隆细胞系在125ml摇瓶中培养，以0.5×106cell/ml接种密度接种，其他培养条件同1G8-5C3的培养条件。
请结合参见图5及图6所示的3F4-2G7流加培养工艺数据。在接种后120小时，细胞密度达到4×106cell/ml的时候进行第一次补料，补料2.5ml CHO CD EfficientFeed(Lifetechnologies,Cat#A10241-01)，在接种后168小时，当细胞密度接近6×106cell/ml的时候进行第二次补料，补料3ml CHO CD EfficientFeed；在接种后216小时进行第三次补料，补料1.25ml CHO CDEfficientFeed；在接种后264小时及288小时，当细胞活率接近80％的时候进行第四次及第五次补料，补料0.5ml CHO CD EfficientFeed；在接种后360小时后，当细胞活率接近70％的时候收获，此时的细胞培养IVC为1400左右。
3F4-2G7与1G8-5C3的培养过程中的最高细胞密度、细胞收获IVC及单克隆抗体产量比较列于表3。
表3
      
本发明的细胞株1G8-5C3已于2015年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.10583；分类命名：受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1人乳腺癌细胞。提交保藏时所用的自命名为1G8-5。
实施例6单克隆抗体的生产与纯化
收集实施例5中培养得到的细胞培养液上清，使用冷冻离心机4℃下，10000RPM高速离心10分钟，离心上清液经过0.45μm滤器进行过滤澄清。过滤后培养液进Protein A柱亲和纯化(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.198362:1)，层析介质使用GE公司的MabSelect SURE(Cat#17-5438-03)，0.1M pH2.7柠檬酸缓冲液洗脱。亲和层析洗脱峰用1M Tris pH9.0调pH3.5，室温孵育1hr。样品加入固体NaCl至终浓度1.5M，调pH7.5，0.45μm过滤后进ButylSepharose FF疏水层析分离，20mM Na3PO4，pH 7.5洗脱。HIC洗脱峰用6M HCl调pH6.3，进CM Sepharose FF分离，50mM Citrate/250mM NaCl pH7.3洗脱。最终产品0.22μm过滤后冻干保存。终产品经SEC-HPLC检测纯度。13％SDS-PAGE电泳分析。
抗-人ROR1mAb 1G8的SEC-HPLC分析图谱参见图7，主要数据列于表4。
表4
      
# Time Area Height Width Purity％
1 14.584 4763.1 136.1 0.5203 100
抗-人ROR1mAb 1G8的SDS-PAGE电泳图参见图8。可见清晰的重链和轻链条带。
抗-人ROR1mAb 3F4的SEC-HPLC分析图谱参见图9，主要数据列于表5。
表5
      
# Time Area Height Width Purity％
1 12.587 6.17 0.85 0.9024 1.149
2 14.572 5308.7 158 0.512 98.851
抗-人ROR1mAb 3F4的SDS-PAGE电泳图参见图10。可见清晰的重链和轻链条带。
实施例7表达单克隆抗体的亲和力测定
亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson et al，1980，Anal.BioChem.，107：220)进行，将抗原(Human ROR1protein)浓度固定，按照一定浓度稀释实施例6所纯化的抗体(1G8和3F4)，得到抗体1G8、3F4与人ROR1蛋白结合的标准曲线。
在此基础上，在抗体与抗原结合的饱和浓度范围内，取若干浓度作为抗体亲和力测定的标准浓度点，测定结合抗体及未结合抗体的浓度，根据Scatchard公式计算出1G8和3F4两株单抗的亲和力数值。
结果表明，1G8和3F4两株单抗的亲和力分别达到4.9×10-9和8.3×10-8。
上述结果表明，1G8和3F4两株单克隆抗体具有很高的亲和力，1G8已经达到0.1nM级别。

Claims (10)

1.一种抗ROR1的人源化单克隆抗体，该抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，其中：
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27，
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28，
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29，
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30，
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:31，
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中：
所述重链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23，或者分别为SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29；
所述轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26，或者分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。
3.如权利要求1所述的抗体，其中，且抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8所示。
4.根据权利要求1所述的抗体，该抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者，该抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
5.根据权利要求1或4所述的抗体，该抗体的重链恒定区为人IgG1-Fc恒定区，轻链恒定区为人κ链恒定区。
6.根据权利要求1所述的抗体，该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQID NO：6所示；或者，该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10和SEQID NO：12所示。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1～6任一项所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者编码权利要求1～6任一项所述的抗体的重链和/或轻链。
8.一种分泌表达权利要求1～6任一项所述的抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株。
9.根据权利要求8所述的分泌表达抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株，其是按照以下方法制备得到的：
将带有编码权利要求1～6任一项所述的抗体的重链的抗体基因的表达载体、带有编码权利要求1～6任一项所述的抗体的轻链的抗体基因的表达载体分别转入大肠杆菌DH5α菌株，进行扩增培养，抽提纯化质粒DNA；
将所得纯化的质粒DNA转染CHO细胞；
转化的CHO细胞使用嘌呤霉素进行筛选，并在半固体选择培养基上进行稀释，使用ClonePix FL进行克隆挑选；优选地，挑出多个单克隆细胞系在FreeStyleTMCHO培养基中进行悬浮化扩大培养，对上清进行ELISA检测抗体表达量，从中挑选培养过程中抗体最高表达量在200mg/L以上的克隆，即为所述的细胞株；
更优选地，所述分泌抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株为保藏编号为CGMCC No.10583的细胞株。
10.权利要求1～6任一项所述的抗体的制备方法，该方法包括：
培养权利要求8或9所述的细胞株，收集细胞培养液，离心，上清液经0.45μm过滤后进Protein A柱亲和纯化，得到抗ROR1的人源化单克隆抗体。
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