CN115216034A - 丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或涂层及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或涂层及其制备,具体涉及到在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜及其制备方法和应用,以及在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层及其制备方法和应用。本发明在温和条件下混合丝蛋白和溶菌酶的溶液,即可在气/液或固/液界面得到纳米级薄膜或涂层。薄膜或涂层的性能可以通过改变混合溶液中的两种蛋白质的比例来进行调控。因此具有制备方法简单、条件绿色温和、原料成本低廉等优势。所得纳米薄膜或涂层可与各种材料表面结合,因此在表面改性、生物医用等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及属于天然高分子材料技术领域,尤其是涉及丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或涂层及其制备,具体涉及到在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜及其制备方法和应用,以及在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层及其制备方法和应用。
背景技术
纳米级蛋白质薄膜或涂层是一种具有优异生物相容性和可修饰性的二维纳米材料,为现代材料界提供了多种机遇,在表面改性、生物材料、光刻、光学、电子等各个领域都有实际意义。在这些应用中,通常需要材料具有宏观尺寸,然而蛋白质薄膜通常是通过微观构建单元自组装所形成的,因此在米级或更高的尺度上,要想真正地与一般的宏观材料相媲美仍然是一个挑战。
类淀粉样蛋白如溶菌酶由于其优异的自组装能力和丰富的相转变行为被用于制备蛋白质纳米薄膜上。
例如,中国专利CN105153443B公开了利用溶菌酶制备生物蛋白质二维纳米薄膜的方法,该方法利用溶菌酶分子与三(2-羧乙基)膦盐酸盐发生相转变反应生成的纳米颗粒在气/液界面通过表界面诱导自组装形成一层生物蛋白质二维纳米薄膜,或者在膜的制备过程中直接将基材与溶液表面接触,使溶菌酶相转变生成的纳米颗粒通过表界面诱导直接在液固表面自组装形成二维纳米薄膜,即原位生长于基材表面。该专利称其所制备的生物蛋白质二维纳米薄膜的厚度约为30~80nm左右,表面粗糙度小,透明度高,且具有较好的粘附性,可用于对基材表面进行改性。然而该专利中利用溶菌酶制成的薄膜力学性能较差,限制了其应用。
中国专利CN108854599A公开了一种基于交联溶菌酶的透析膜及其应用,该透析膜是溶菌酶相转变形成的二维纳米薄膜用戊二醛交联后粘附在PET核孔膜上,形成的以交联溶菌酶纳米薄膜为致密皮层、PET核孔膜为支撑层的透析膜。该发明透析膜易实现大面积制备,同时又具有低成本、低能耗、环保等特点,避免了传统聚合物膜合成过程中的步骤繁琐及环境污染问题,且透析膜具有较好的生物相容性,对不同分子具有大小选择性分离,能够完全截留3.2nm以上的分子,对小分子有较快的扩散速率,可作为血液净化膜,清除尿素、肌酸肝及中大分子毒素和硫酸吲哚酚,是一种较为理想的透析膜材料。然而该专利中,溶菌酶相转变形成的二维纳米薄膜是用戊二醛交联的,并且交联后粘附在PET核孔膜,由于戊二醛有一定的毒性,导致其应用场所受限。
发明内容
为了克服现有技术中类淀粉样蛋白组装形成的蛋白质纳米膜力学性能较差的问题,本发明提供一种丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或涂层及其制备。
本发明具体提供在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜及其制备方法和应用,以及在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米涂层及其制备方法和应用。
为了提高类淀粉样蛋白组装形成的蛋白质纳米膜的力学性能,本发明引入了力学性能和生物相容性良好的丝蛋白,将其与溶菌酶成膜的体系复合,在气/液界面得到了力学性能优异,具有可转移性的丝蛋白/溶菌酶纳米薄膜。同时,本发明还进一步在固/液界面得到了稳定且与基材结合紧密的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
本发明提供的方法,制备过程快速、便捷,可在两分钟内就形成薄膜或涂层;制备条件简便温和,绿色环保,得到的薄膜或涂层完全由蛋白质组成,将蛋白质的生物相容性得到了很好的保持;制备得到的薄膜或涂层对任意材料表面都有较强的结合力,为材料表面改性提供了一种绿色平台;此外,基于本发明的技术方案,目前已在实验室内得到了宏观尺寸的薄膜或涂层。因此,这种简单快速的制备方法也为其今后的工业化大规模生产提供了可行性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明首先提供在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的方法,包括以下步骤:
获得混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液,将混合溶液盛在容器中,孵育一段时间后,在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
这里面的气/液界面是指混合溶液的表面和混合溶液上方空气之间的界面。
在本发明的一个实施方式中,在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的方法,具体包括以下步骤:
(1)制备丝蛋白溶液;
(2)使用缓冲溶液稀释丝蛋白溶液,使丝蛋白终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(3)使用缓冲溶液配制溶菌酶溶液,使溶菌酶终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(4)使用缓冲溶液配制三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐终浓度为5—100mmol/L,并调节其pH为4.0—11.0;
(5)将步骤(2)、(3)、(4)所得三种溶液均匀混合;
(6)将(5)所得混合溶液盛在容器中,孵育一段时间后,在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
在本发明的一个实施方式中,混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液中,丝蛋白与溶菌酶的质量比例为1:10—10:1,优选为1:5—5:1。
在本发明的一个实施方式中,所述丝蛋白溶液为纯再生丝素蛋白溶液,或者为除纯丝蛋白溶液外还含其他成分的混合溶液或悬浊液,所述其他成分包括水溶性高分子、功能性无机材料或药物分子等。
在本发明的一个实施方式中,所述缓冲溶液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液等,pH值约为7.0。
在本发明的一个实施方式中,所述孵育时间为2分钟以上。
本发明所得丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜可以通过捞具捞起,本发明中,在气/液界面的捞膜方式为用任何适宜大小的捞具将气/液界面丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜从界面中捞起。
本发明所得丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜可以稳定存在且具有自支撑性能。由于有丝蛋白的存在,所以丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜具有良好的力学强度,使得本发明所得丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜具有可转移性,可转移至任意基材表面,且可多次叠加转移。
本发明还提供在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层的方法,包括以下步骤:获得混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液,将基材浸泡于所得混合溶液或者将基材倒扣于所得混合溶液表面,孵育一段时间后,在固/液界面即基材表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。这里所述固/液界面是指基材的固体表面与混合溶液之间形成的固/液界面。
在本发明的一个实施方式中,所述在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层的方法,具体包括以下步骤:
(1)制备丝蛋白溶液;
(2)使用缓冲溶液稀释丝蛋白溶液,使丝蛋白终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(3)使用缓冲溶液配制溶菌酶溶液,使溶菌酶终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(4)使用缓冲溶液配制三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐终浓度为5—100mmol/L,并调节其pH为4.0—11.0;
(5)将步骤(2)、(3)、(4)所得三种溶液均匀混合;
(6)将基材浸泡于(5)所得混合溶液或者倒扣于(5)所得混合溶液表面,孵育一段时间后,在基材表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
在本发明的一个实施方式中,混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液中,丝蛋白与溶菌酶的质量比例为1:10—10:1,优选为1:5—5:1。
在本发明的一个实施方式中,所述丝蛋白溶液为纯再生丝素蛋白溶液,或者为除纯丝蛋白溶液外还含其他成分的混合溶液或悬浊液,所述其他成分包括水溶性高分子、功能性无机材料或药物分子等。
在本发明的一个实施方式中,所述缓冲溶液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液等,pH值约为7.0。
在本发明的一个实施方式中,所述基材选择为有机材料、无机材料或高分子材料中的一种或几种的混合。本发明的方法对于基材的普适性非常广,可以适用于不同种类的基材,可以直接在基材表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
在本发明的一个实施方式中,所述孵育时间为2分钟以上。
本发明还提供采用上述方法制备得到的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
本发明还提供采用上述方法制备得到的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
本发明还提供所述丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或所述丝蛋白/溶菌酶纳米涂层在表面改性、生物医用等领域中的应用。
本发明的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或丝蛋白/溶菌酶涂层是利用溶菌酶与三(2-羧乙基)膦盐酸盐发生相转变反应以及丝蛋白与溶菌酶之间的静电吸引等相互作用所生成的复合物在气/液或固/液界面自组装形成的,其厚度可调控约为10nm—300nm左右,具有良好的透明性、稳定性、粘附性及界面普适性。
本发明的丝蛋白/溶菌酶纳米薄膜具有可转移性,因此可多次叠加,从而得到厚度可调控的涂层。
本发明的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或丝蛋白/溶菌酶涂层的制备方法简单,绿色温和,节能高效,天然高分子的性质在制备过程中得到保留,所制备得到的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或丝蛋白/溶菌酶涂层可用于表面改性、生物医用等领域。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
(1)制备复合材料的原料为丝蛋白,成本低廉,经过美国食品药品监督管理局认证,故丝蛋白基复合材料具有良好的生物相容性;
(2)本发明对丝蛋白及溶菌酶的浓度限制较小,在1mg/mL—50mg/mL的浓度下皆可得到该种材料,且薄膜中两种蛋白质的含量可以通过初始浓度及比例调节变化;
(3)本发明的制备过程快速高效,最短2分钟之内即可在界面形成薄膜或涂层,制备过程中不涉及任何化学交联剂或者生物交联剂,绿色环保,具有推广应用的价值;
(4)本发明所述的丝蛋白溶液及溶菌酶溶液中,还可以有水溶性高分子,功能性无机纳米粒子,药物分子等的混合溶液,可制备具有多功能性的蛋白质复合纳米薄膜或涂层。
附图说明
图1是实施例1制备的在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的照片。
图2是实施例2制备的在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的透过率谱图。
图3是实施例3制备的在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的扫描电镜断面图。
图4是实施例4制备的在玻璃片表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层后刚果红染色的照片。
图5是实施例5制备的在无纺布表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层后的氮元素的扫描电镜能谱图。
图6是实施例6制备的在硅片、聚四氟乙烯表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层前后的水接触角测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释再生蚕丝蛋白水溶液质量浓度为5mg/mL;将三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐缓冲溶液摩尔质量为50mM,用NaOH调节pH至7.0;将溶菌酶溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使溶菌酶质量浓度为5mg/mL;取等体积的三种溶液依次均匀混合,将混合溶液滴加涂覆于洁净的玻璃片表面,在湿润环境下室温静置孵育1小时;将表面有混合溶液的玻璃片放入盛有去离子水的容器中,在水面漂出一张与玻璃片尺寸大小一致的薄膜,即气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米薄膜,这张薄膜可以用捞具捞起,并在晾干过程中保持完整不破裂。
本实施例在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的照片如图1所示。
实施例2
使用实施例1所制备得到的丝蛋白/溶菌酶纳米薄膜转移至洁净的石英片表面。通过紫外分光光度计测试样品在可见光区域的透过率。
在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的透过率谱图如图2所示。
实施例3
使用实施例1所制备得到的丝蛋白/溶菌酶纳米薄膜转移至洁净的硅片表面。将此硅片在液氮中脆断,通过扫描电镜表征样品断面的形貌及厚度。
在气/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的扫描电镜断面图如图3所示。
实施例4
用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释再生蚕丝蛋白水溶液质量浓度为5mg/mL;将三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐缓冲溶液摩尔质量为50mM,用NaOH调节pH至7.0;将溶菌酶溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使溶菌酶质量浓度为5mg/mL;取等体积的三种溶液依次均匀混合。将洁净的玻璃片或者表面贴有镂空图案贴纸的玻璃片倒扣于混合溶液表面,1小时后取出,用去离子水冲洗以去除表面残留的溶液,静止晾干后,将处理后的玻璃片在刚果红水溶液中浸泡12个小时进行染色,再在去离子水中浸泡12个小时以除去非特异性结合的刚果红。
在玻璃片表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层后刚果红染色的照片如图4所示。实际上,图4中间的和右边的均显示红色,而左边的没有红色,只是由于附图是黑白的原因而导致中间的和右边的红色不显示而显示为灰色。
由于组成此丝蛋白/溶菌酶纳米涂层的蛋白质具有β-折叠的二级构象,所以可以被刚果红染色而显示红色。
实施例5
用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释再生蚕丝蛋白水溶液质量浓度为2mg/mL;将三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐缓冲溶液摩尔质量为50mM,用NaOH调节pH至7.0;将溶菌酶溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使溶菌酶质量浓度为2mg/mL;取等体积的三种溶液依次均匀混合。将无纺纱布浸泡在混合溶液中,1小时后取出,用去离子水冲洗以去除表面残留的溶液。将处理后的无纺纱布静置晾干,喷金,通过扫描电镜能谱测试其所含元素。在无纺布表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层后的氮元素的扫描电镜能谱图如图5所示。
由于无纺纱布本身不含氮元素,但是在混合溶液中浸泡之后其能谱数据显示含有氮元素,因此证明经过此方法处理后的无纺纱布表面有丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
实施例6
用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释再生蚕丝蛋白水溶液质量浓度为5mg/mL;将三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐缓冲溶液摩尔质量为50mM,用NaOH调节pH至7.0;将溶菌酶溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中,使溶菌酶质量浓度为5mg/mL;取等体积的三种溶液依次均匀混合。将洁净的硅片以及聚四氟乙烯浸泡在混合溶液中,1小时后取出,用去离子水冲洗以去除表面残留的溶液,静止晾干后,通过接触角仪测量基材表面的水接触角,在硅片、聚四氟乙烯表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层前后的水接触角测试结果如图6所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的方法,其特征在于,包括以下步骤:获得混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液,将混合溶液盛在容器中,孵育一段时间后,在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
2.根据权利要求1所述在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备丝蛋白溶液;
(2)使用缓冲溶液稀释丝蛋白溶液,使丝蛋白终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(3)使用缓冲溶液配制溶菌酶溶液,使溶菌酶终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(4)使用缓冲溶液配制三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐终浓度为5—100mmol/L,并调节其pH为4.0—11.0;
(5)将步骤(2)、(3)、(4)所得三种溶液均匀混合;
(6)将(5)所得混合溶液盛在容器中,孵育一段时间后,在气/液界面形成丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
3.在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层的方法,其特征在于,包括以下步骤:获得混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液,将基材浸泡于所得混合溶液或者将基材倒扣于所得混合溶液表面,孵育一段时间后,在基材表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
4.根据权利要求3所述在固/液界面形成的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备丝蛋白溶液;
(2)使用缓冲溶液稀释丝蛋白溶液,使丝蛋白终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(3)使用缓冲溶液配制溶菌酶溶液,使溶菌酶终浓度为1mg/mL—50mg/mL;
(4)使用缓冲溶液配制三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液,使三(2-羧乙基)膦盐酸盐终浓度为5—100mmol/L,并调节其pH为4.0—11.0;
(5)将步骤(2)、(3)、(4)所得三种溶液均匀混合;
(6)将基材浸泡于(5)所得混合溶液或者倒扣于(5)所得混合溶液表面,孵育一段时间后,在基材表面形成丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
5.根据权利要求1或2或3或4所述方法,其特征在于,混合有丝蛋白和溶菌酶的混合溶液中,丝蛋白与溶菌酶的质量比例为1:10—10:1。
6.根据权利要求2或4所述方法,其特征在于,所述丝蛋白溶液为纯再生丝素蛋白溶液,或者为除纯丝蛋白溶液外还含其他成分的混合溶液或悬浊液,所述其他成分包括水溶性高分子、功能性无机材料或药物分子。
7.根据权利要求2或4所述方法,其特征在于,所述缓冲溶液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。
8.采用权利要求1或2所述方法制备得到的丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜。
9.采用权利要求3或4所述方法制备得到的丝蛋白/溶菌酶纳米涂层。
10.权利要求8所述丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或权利要求9所述丝蛋白/溶菌酶纳米涂层在表面改性、生物医用领域中的应用。
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2021
- 2021-04-16 CN CN202110413391.XA patent/CN115216034B/zh active Active
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