CN104383609B

CN104383609B - 一种可调控细胞粘附的材料在筛选内皮细胞和平滑肌细胞中的应用

Info

Publication number: CN104383609B
Application number: CN201410624718.8A
Authority: CN
Inventors: 计剑; 任科峰; 常皓
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: CN104383609A

Abstract

本发明公开了一种可调控细胞粘附的材料，由基底材料和涂层组成，所述涂层的制备方法包括：(1)分别配制聚阳离子电解质溶液和聚阴离子电解质溶液；(2)将基底材料浸泡于聚阳离子电解质溶液中，取出后洗涤除去聚阳离子电解质溶液；(3)将步骤(2)中得到的基底材料浸泡于聚阴离子电解质溶液中，取出后洗涤除去聚阴离子电解质溶液；(4)重复步骤(2)和步骤(3)若干次后，得到聚电解质组装涂层；所述涂层的厚度为1nm～10μm。该材料无需负载生物活性因子就可调控细胞的粘附程度，实现材料周围细胞粘附程度的改变，与现有技术相比，本发明材料更加安全和稳定。

Description

一种可调控细胞粘附的材料在筛选内皮细胞和平滑肌细胞中的应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种可调控细胞粘附的材料。

背景技术

在医疗器械和植入体等表面构建载药超涂层，通过药物释放可实现疾病治疗、预防、抗菌、提高界面生物相容性等功能。

层状组装方法通过相互作用的两种物质在基底上的交替吸附构建超涂层，具有操作简单、条件温和、对基底无选择性等优点。该方法作为一项构建功能涂层技术已经在生物医用、光电元件、人工智能等多个前沿领域得到了广泛深入的研究及应用。

聚电解质也称高分子电解质，是一类线型或支化的合成和天然水溶性高分子，其结构单元上含有能电离的基团。通常，聚电解质具有大量的带电基团，根据带电基团的不同，可以分为聚合物酸、聚合物碱和两性聚合物。溶解时，聚合物酸的质子离去形成聚合物阴离子，聚合物碱能接受质子形成聚合物阳离子。

现有技术中，已大量聚电解质组装涂层制备方法的报道，例如：授权公告号为CN102319662B的专利申请公开了一种基于层层组装技术制备自修复聚电解质涂层的方法，其步骤如下：A.将聚阳离子构筑基元和聚阴离子构筑基元分别溶于溶剂配成一定浓度、一定pH值的溶液；B.将处理后的基底浸入到聚阳离子溶液中1～30分钟，然后将基底从聚阳离子溶液中取出，水洗除去基底表面物理吸附的物质后经N2吹干；C.将步骤B的基底再浸入到聚阴离子溶液中1～30分钟，然后将基底从聚阴离子溶液中取出，水洗除去基底表面物理吸附的物质后经N2吹干，从而完成一个沉积周期涂层的制备；D.重复步骤B、C，从而在基底上制备得到多个沉积周2期的自修复聚电解质涂层。其中，聚阳离子为聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯基亚胺、明胶、聚四乙烯基吡啶、聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐、壳聚糖、聚L-赖氨酸、聚苯胺中的一种或几种；聚阴离子为聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸钠、海藻酸钠、透明质酸、磺化聚醚醚酮、磺化葡聚糖中的一种或几种；溶剂为水、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或氯仿。

细胞行为包括了细胞粘附、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化以及细胞功能。调控细胞行为对于研究细胞行为，组织工程和细胞治疗技术领域有着重要的意义。例如，特异性的诱捕循环癌细胞的粘附，对于癌症检测提供了重要手段；诱导造血干细胞分化对于组织功能领域有着重要的意义。

现有的调控细胞行为的涂层的制备方法主要是在材料表面固定某些功能性的生物活性分子(包括细胞特异性抗体，生长因子，诱导因子或者具有生物活性的多肽等)构建出负载生物活性因子的涂层，例如，有研究报道在材料表面修饰一种多肽RGD涂层后，能够有效地诱导内皮细胞的粘附和快速增殖(McNichols，C.，et al.(2014).″Investigating surface topology and cyclic-RGD peptide functionalization on vascular endothelialization.″Journal of Biomedical Materials Research Part A 102(2)：532-53)。又如，材料表面构建出一种具有细胞活性配体的涂层，能够有效诱捕癌细胞结合到涂层表面(Shen，Q.L.，et al.(2013).″Specific Capture and Release of Circulating Tumor Cells Using Aptamer-Modified Nanosubstrates.″Advanced Materials 25(16)：2368-2373)。

目前现有的方法存在着许多的不足，例如：1.方法比较复杂，无法在多种材料基底表面普遍适用；2.在实际应用中，生物活性分子的稳定性和活性无法很好地保持；3.不同批次的生物活性分子的功能性会有差别。4.生物活性分子的加入容易产生炎症反应；5.不适合规模化生产。

发明内容

本发明提供了一种可调控细胞粘附的材料，该材料无需负载生物活性因子就可调控细胞的粘附程度，实现材料周围细胞粘附程度的改变，与现有技术相比，本发明材料更加安全和稳定。

一种可调控细胞粘附的涂层负载材料，由基底材料和涂层组成，所述涂层的制备方法包括：

(1)分别配制聚阳离子电解质溶液和聚阴离子电解质溶液；

(2)将基底材料浸泡于聚阳离子电解质溶液中，取出后洗涤除去聚阳离子电解质溶液；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料浸泡于聚阴离子电解质溶液中，取出后洗涤除去聚阴离子电解质溶液；

(4)重复步骤(2)和步骤(3)若干次后，得到聚电解质组装涂层；

所述涂层的厚度为1nm～10μm。

本发明经实验发现采用聚电解质层层组装方法获得的一定厚度的涂层材料对其周围细胞的行为和功能具有不同的调控作用。

通过深入研究后发现，上述现象的原理在于，材料表面硬度对于细胞粘附具有重要的影响作用。常见生物医用材料，例如金属、无机陶瓷、聚合物等，对于细胞粘附而言，均是较高硬度的材料，细胞可以极为充分的粘附和铺展。而聚电解质组装涂层是一类厚度可调的且较高含水量的低硬度材料，因此细胞粘附会受到抑制。通过在上述高硬度材料表面制备不同厚度的低硬度聚电解质组装涂层，即可调控和降低高硬度材料对细胞粘附的影响程度，从而调控细胞从充分粘附铺展到不粘附的状态。

现有技术中，研究者们通过在涂层上附着生物活性分子等物质来实现对细胞粘附的调控，而聚电解质组装涂层的作用也只在于作为负载平台，研究者们从未报道过如本发明所述的采用现有的聚电解质层层组装方法制备厚度可调的聚电解质组装涂层来调控细胞的粘附行为。

所述聚阳离子电解质溶液为硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯基亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚精氨酸、聚天冬氨酸、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯基吡咯、聚阳离子脂质和胶原中的一种或多种。更优选，所述的聚阳离子电解质为硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖或者聚乙烯基亚胺。

所述的聚阳离子电解质溶液的浓度为10^-5～1g/mL，优选0.1～5mg/mL。

作为优选，所述聚阴离子电解质溶液为脱氧核苷酸、透明质酸、聚丙烯酸、肝素、海藻酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯基磺酸和聚谷氨酸中的一种或多种。更优选，所述的聚阴离子电解质溶液为脱氧核苷酸、透明质酸、聚丙烯酸或者肝素。

所述的聚阴离子电解质溶液的浓度为10^-5～1g/mL，优选0.1～5mg/mL。

步骤(2)和步骤(3)重复的次数为1～500次，优选，10～100次。

所述基底材料为不锈钢、钛合金、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、玻璃和陶瓷。

作为优选，所述基底材料的硬度为100MPa～100Gpa。

所述的细胞为内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和成肌细胞中的一种或两种。

本发明还公开了一种所述的材料在筛选内皮细胞和平滑肌细胞中的应用。作为优选，所述涂层的厚度为100～800nm。该厚度范围内的涂层可实现内皮细胞和平滑肌细胞的分离。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以层层自组装方法将涂层涂覆于基底材料上制备成本发明材料，通过表面的物理因素对细胞行为进行调控，无需在涂层上添加生物活性分子，避免了现有技术中涂层添加生物活性分子后所引起的各类问题；

(2)本发明材料可用于分离和筛选内皮细胞和平滑肌细胞。

附图说明

图1为实施例3中不锈钢表面制备不同厚度的(鱼精蛋白/DNA)涂层后，内皮细胞和平滑肌细胞的粘附情况。

具体实施方式

实施例1

选用316L不锈钢作为基底材料，在基底材料表面构建聚电解质组装涂层，包括以下步骤：

(1)将聚赖氨酸溶解在pH＝7.4的缓冲液中配成1mg/mL聚赖氨酸溶液；将肝素溶解在pH＝7.4的缓冲液中配成1mg/mL肝素溶液；

(2)将不锈钢完全浸泡在聚赖氨酸溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料完全浸泡肝素溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)12次，得到厚度为800nm的涂层。

在涂层上培养内皮细胞，内皮细胞在涂层表面能够部分粘附，细胞与细胞易形成细胞团簇。而相对于没有聚电解质组装涂层的不锈钢表面，内皮细胞充分均匀粘附，不能形成团簇。

实施例2

选用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为基底材料，在基底材料表面构建聚电解质组装涂层，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶解在pH＝4.4的缓冲液中配成1mg/mL壳聚糖溶液；将透明质酸溶解在pH＝7.4的缓冲液中配成1mg/mL透明质酸溶液；

(2)将PET浸泡在壳聚糖溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料浸泡在透明质酸溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)8次，得到厚度为200nm涂层

在涂层表面培养间充质干细胞，细胞在涂层表面维持较低的粘附，而在无涂层材料表面细胞不能粘附。

实施例3

选用316L不锈钢作为基底材料，在基底材料表面构建涂层，包括以下步骤：

(1)将硫酸鱼精蛋白溶解在纯水中配成1mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液；将鱼精脱氧核糖核酸溶解在纯水中配成1mg/mL脱氧核糖核酸溶液；

(2)将聚二甲基硅氧烷基底浸泡在硫酸鱼精蛋白溶液中，经过一段时间后取出，用纯水洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料浸泡脱氧核糖核酸溶液中，经过一段时间后取出，用纯水洗涤；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)12次，厚度为360nm涂层。

在涂层表面同时培养内皮细胞和平滑肌细胞，内皮细胞能够粘附，而平滑肌细胞不能粘附。而单纯聚二甲基硅氧烷表面，两种细胞均有粘附，无差异表现。由此实现内皮细胞的选择性获取。

实施例4

选用聚二甲基硅氧烷材料作为基地材料，在基底材料表面构建涂层，包括以下步骤：

(1)将聚丙烯胺溶解在150mM的NaCl水溶液中配成1mg/mL聚丙烯胺溶液；将聚苯乙烯磺酸钠溶解在150mM的NaCl水溶液中配成1mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液；

(2)将聚二甲基硅氧烷基底完全浸泡在聚丙烯胺溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料完全浸泡在聚苯乙烯磺酸钠中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)100次，厚度为800nm涂层

在涂层表面培养成纤维细胞，结果显示细胞无法粘附。而在单纯的聚二甲基硅氧烷表面进行相同细胞粘附，成纤维细胞粘附良好。

实施例5

选用玻璃作为基底材料，在基底材料表面构建涂层，包括以下步骤：

(1)将胶原溶解在pH＝5.4的缓冲液中配成1mg/mL胶原溶液；将海藻酸溶解在pH＝7.4的缓冲液中配成1mg/mL海藻酸溶液；

(2)将聚丙烯材料浸泡在胶原溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料浸泡在海藻酸溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)30次，厚度为300nm涂层。

在涂层表面培养内皮细胞，内皮细胞可以稳定粘附14天。而在单纯的玻璃表面培养内皮细胞，细胞粘附情况较差，14天后较多细胞脱附。

实施例6

选用陶瓷作为基地材料，在基底材料表面构建涂层，包括以下步骤：

(1)将聚二烯丙基二甲基氯化铵溶解在pH＝7.4的150mM的NaCl水溶液中配成1mg/mL聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液；将肝素溶解在pH＝7.4的150mM的NaCl水溶液中配成1mg/mL肝素溶液；

(2)将聚苯乙烯基底完全浸泡在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料完全浸泡在肝素溶液中，经过一段时间后取出，用pH＝7.4的缓冲液；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)20次，厚度为200nm涂层

在涂层表面培养成肌细胞，细胞可以粘附，呈现正常的梭形形态。而在无涂层的陶瓷材料表面，细胞呈现星型形态，不是正常的成肌细胞形态。

Claims

1.一种可调控细胞粘附的材料在筛选内皮细胞和平滑肌细胞中的应用，其特征在于，所述材料由基底材料和涂层组成，所述涂层的制备方法包括：

(1)分别配制聚阳离子电解质溶液和聚阴离子电解质溶液；

(4)重复步骤(2)和步骤(3)若干次后，得到聚电解质组装涂层；

所述聚阳离子电解质溶液为硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯基亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚精氨酸、聚天冬氨酸、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯基吡咯、聚阳离子脂质和胶原中的一种或多种；

所述聚阴离子电解质溶液为脱氧核苷酸、透明质酸、聚丙烯酸、肝素、海藻酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯基磺酸和聚谷氨酸中的一种或多种；

所述基底材料为不锈钢、钛合金、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、玻璃和陶瓷中的一种；

所述基底材料的硬度为100MPa～100GPa；所述涂层的厚度为100～800nm。