CN106665562A - 一种脐血造血干细胞冻存管 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐血造血干细胞冻存管,包括冻存管主体,该冻存管主体的内壁设有包被层,包被层为γ聚谷氨酸材质。本发明提供的冻存管内壁含有γ聚谷氨酸包被层,使用本发明冻存管冻存脐血造血干细胞时,‑80℃冻存6个月细胞数量和活性无明显下降,显著优于现有技术。因此,脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明提供的冻存管在‑80℃冻存;超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。
Description
技术领域
本发明属于干细胞领域,具体涉及一种脐血造血干细胞冻存管。
背景技术
脐血干细胞是脐血中的一种具有分化潜能的原始细胞,具备自我更新和增殖的能力,并能在特定因素的影响或诱导下,向各种细胞或组织分化。脐血造血干/祖细胞具有高度的自我更新能力或复制能力,能保持干细胞数量恒定,并能进一步分化为各系祖细胞及成熟细胞。CD34抗原是分离纯化造血干/祖细胞的主要标志,脐血中的CD34+细胞群在数量、质量和增殖能力方面高于外周血,脐血中的造血干/祖细胞具有更原始、更强的增殖分化能力。近年来,脐血造血干细胞移植已发展为一种高科技生物治疗手段,广泛应用于许多疾病的治疗,包括恶性血液病、自身免疫性疾病、严重免疫缺陷症等,临床证明具有一定的疗效。
冷冻保存是脐血保存和造血干细胞移植的关键。已知,脐血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后的数量和活性无明显变化,冻存效果较好,因而建议脐血干细胞长期保存应置于液氮中。鉴于-80℃冻存的方法方便、成本较低、应用广泛,6个月以内的冻存采用-80℃冻存更为方便。徐长根等研究(-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响,临床输血与检验2010年4月第12卷第2期)发现,脐血细胞在-80℃下保存1、2、3、4、8周后,各组的有核细胞数和CD34+数的差异无统计学意义,而在冻存16、32周后较1周的差异有统计学意义(P<0.05)。台盼蓝拒染率在8、16、32周较1周的差异均有统计学意义(P<0.05)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种脐血造血干细胞冻存管,用于脐血造血干细胞在-80℃条件下6个月以内的有效冻存。
上述目的是通过如下技术方案实现的:
一种脐血造血干细胞冻存管,包括冻存管主体,该冻存管主体的内壁设有包被层,包被层为γ聚谷氨酸材质。
优选地,所述γ聚谷氨酸的分子量为70万克/摩尔。
优选地,γ聚谷氨酸包被层的厚度为0.2-0.4mm。
一种制备上述脐血造血干细胞冻存管的方法,包括如下步骤:
步骤S1,将无菌γ聚谷氨酸溶于无菌水中,制成浓度为0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm滤膜过滤,备用;
步骤S2,取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售冻存管中,置于35-45℃无菌条件静置2-4小时;
步骤S3,倾倒冻存管中剩余溶液,用无菌水清洗2-3次,置于无菌条件备用。
本发明的有益效果:
本发明提供的冻存管内壁含有γ聚谷氨酸包被层,使用本发明冻存管冻存脐血造血干细胞时,-80℃冻存6个月细胞数量和活性无明显下降,显著优于现有技术。因此,脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明提供的冻存管在-80℃冻存;超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。
附图说明
图1为本发明冻存管结构示意图,图中1为γ聚谷氨酸包被层;
图2为包被冻存组和常规冻存组6个月冻存期内台盼蓝拒染率变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如教科书和实验指南中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件,为本领域普通技术人员熟知或易于获知。
实施例1本发明冻存管的制备
取市售2mL康宁冻存管自制本发明提供的冻存管,具体步骤如下:
步骤S1,将无菌γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌,分子量70万克/摩尔)溶于无菌水中,制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm滤膜过滤,备用;
步骤S2,取2mLγ聚谷氨酸溶液加入2mL康宁冻存管中,于40℃无菌条件静置3小时;
步骤S3,倾倒冻存管中剩余溶液,用无菌水清洗3次,置于无菌条件备用。
显微镜观察显示,冻存管内壁形成均匀的γ聚谷氨酸包被层,包被层厚度0.3mm。
γ聚谷氨酸溶液的浓度可以在0.1-0.2mg/mL之间调整,静置温度在35-45℃之间调整,静置时间4-5小时,最终获得的包被冻存管内壁的γ聚谷氨酸包被层厚度在0.2-0.4mm之间。
其他规格的冻存管制备方法类似。
当然,为了提高科研人员的工作效率,可以制备成预包被冻存管成品销售给科研人员。
实施例2冻存管内壁包被对冻存效果的影响
一、实验方法
1、脐血造血干细胞分离
肝素抗凝的脐血用Ficoll作密度梯度离心获得脐血单个核细胞,洗涤后用RPMI1640培养液制成细胞悬液,并调整细胞浓度为5×1010/L。
2、低温冻存
采用含5%DMSO(二甲基亚砜,体积百分浓度)、3%HES(羟乙基淀粉,质量体积百分浓度)和4%HSA(人血白蛋白,质量体积百分浓度)的RPMI 1640培养液作为细胞冷冻保护剂,在试管中将等体积的细胞冷冻保护剂(4℃预冷)缓慢加入细胞悬液(4℃预冷)中,边加边混匀,然后分装于2ml的冻存管中。在4℃冰箱中平衡30min后置于-80℃冰箱直接冻存,分别冻存0.5、1、3、6个月后42℃快速复温并检测各项指标。
实验分为包被冻存组和常规冻存组,包被冻存组采用实施例1制备的γ聚谷氨酸包被冻存管,常规冻存组直接使用市售的常规冻存管。每组每个时间点设5个重复。
3、指标检测
有核细胞计数:用白细胞稀释液稀释细胞悬液后,血细胞计数板计数,重复3次取均值。
流式细胞仪检测CD34+:取50μl有核细胞悬液,加入20μl FITC标记的抗CD34+抗体,阴性对照加入20μl鼠IgG1-FITC,避光室温孵育20min,用PBS洗3次,最后加0.5ml含0.1%多聚甲醛的PBS,上机分析。在FSC-SSC散点图上,以阴性对照设门(淋巴细胞群),在FITC荧光参数直方图上设定阴性。分析软件为Cellquest。
采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数:取0.5ml细胞悬液置于EP管,再加入约0.1ml0.5%台盼蓝染液,混合2min后制片,镜检。采用血细胞计数板计数,计算台盼蓝拒染率。
应用SPSS 11.0软件,采用单因素方差分析实验数据。
二、实验结果
包被冻存组和常规冻存组脐血造血干细胞冻存0.5、1、3、6个月后有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(%)见表1和图2。
表1各指标检测结果(n=5)
表1和图2表明,包被有γ聚谷氨酸的冻存管对脐血造血干细胞具有冻存保护作用,在6个月冻存期间,其有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(细胞存活率)均没有显著变化。而使用常规无γ聚谷氨酸包被层的冻存管冻存脐血造血干细胞时,虽然0.5月、1月细胞数量和活性无明显下降,但是3月细胞数量和活性显著下降,6月下降更明显。因此,脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明提供的冻存管在-80℃冻存;超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (4)
1.一种脐血造血干细胞冻存管,包括冻存管主体,其特征在于:该冻存管主体的内壁设有包被层,包被层为γ聚谷氨酸材质。
2.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞冻存管,其特征在于:所述γ聚谷氨酸的分子量为70万克/摩尔。
3.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞冻存管,其特征在于:γ聚谷氨酸包被层的厚度为0.2-0.4mm。
4.一种制备权利要求1-3任一所述脐血造血干细胞冻存管的方法,其特征在于,包括:
步骤S1,将无菌γ聚谷氨酸溶于无菌水中,制成浓度为0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm滤膜过滤,备用;
步骤S2,取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售冻存管中,置于35-45℃无菌条件静置4-5小时;
步骤S3,倾倒冻存管中剩余溶液,用无菌水清洗2-3次,置于无菌条件备用。
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