PT1554374E - Processo para a cultura em grande escala de linfócitos-t num sistema homogéneo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A CULTURA EM GRANDE ESCALA DE LINFÓCITOS-T NUM SISTEMA HOMOGÉNEO

Campo da invenção 0 campo da invenção refere-se à cultura de células in vitro e expansão em grande escala de células humanas isoladas.

Arte anterior

Uma abordagem à terapia antitumoral baseia-se na utilização de linhas celulares isoladas ex vivo, ou células dotadas de actividade citotóxica.

No inicio dos anos 90 isolaram-se várias linhas celulares de linfócitos-T derivadas de crianças com leucemia linfoblástica de células-T aguda, designada por TALL. Estas incluem as linhas de células-T TALL-104, TALL-107, TALL-103/2, descritas por 0'Connor et al. (Blood, 1991, 77: 1534-1545) e por Cesano e Santoli (In vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28: 648-656). Elas exibem caracteristicas tão interessantes que são actualmente utilizadas com sucesso no tratamento de tumores em modelos animais e no homem (Cesano et al., Blood 1991, 87:393-403; Cesano et al., Câncer Res., 1996, 56: 3021— 3029, US 5272082; US 5683690; US 5702702) . 4622

As linhas celulares são dotadas de actividade citotóxica, especificamente antitumoral e são activas contra diferentes tipos de tumor: a caracteristica principal destas células é a de serem não-restritas a MHC (Cesano et al., J. Immunol., 1993, 151: 2943-2957) e portanto poderem ser administradas a qualquer paciente, independentemente do fenótipo de antigénios de histocompatibilidade. Além disso, ao contrário de alguns tipos de linfócitos citotóxicos, tais como, por exemplo, TIL e LAK, as linhas celulares TALL não necessitam, após administração in vivo, de um tratamento concomitante com linfocinas. Esta é outra vantagem das referidas células, uma vez que a administração simultânea de linfocinas tem várias desvantagens.

Além disso, os linfócitos TALL foram testados com sucesso numa variedade de tumores. Estas são as razões porque eles são considerados uma alternativa terapêutica interessante. No entanto, os sistemas de expansão celular até agora utilizados são limitados, porque as células preparadas para imunoterapia adoptiva derivam de culturas crescidas em frascos individuais, como descrito em Cesano et al., Câncer Res., 1996 56: 4444-4452 e Visonneau et al., Clin. Câncer Res., 1997, 3: 1789-1797, embora sejam utilizados desde há muito tempo dispositivos de cultura de células em grande escala, como os utilizados na preparação de anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes. Assim, é altamente desejável um sistema de cultura em grande escala, adequado para células deste tipo. 2 4622

Sumário

Constitui um objecto da presente invenção proporcionar um processo para a expansão e crescimento em grande escala de linfócitos TALL com base na utilização de um sistema de cultura homogéneo, em que o referido sistema de cultura é uma pilha de várias câmaras. A expressão "quantidade em grande escala de linfócitos TALL" refere-se a lxlO9 células, pelo menos.

Em particular, o fermentador ou sistema homogéneo utilizado no processo reivindicado é uma Cell-factory—, que consiste de preferência de uma pilha de 10 câmaras. Os linfócitos que podem ser expandidos de acordo com o presente procedimento são seleccionados do grupo constituído por TALL-104, TALL-107, TALL-103/2, opcionalmente geneticamente modificado.

De acordo com outra forma de realização, a invenção refere-se a um processo de amostragem celular, em que o referido processo se baseia em selar o colector de enchimento do saco, o que cria pelo menos uma câmara de amostragem contendo um número de células suficiente para amostragem.

Descrição das figuras A figura 1 é um gráfico que ilustra os niveis de glucose e a densidade celular das células TALL crescidas em frasco. 3 4622

Determinaram-se os seguintes parâmetros em 15 frascos de TALL: número de células/ml (-♦-) e níveis de glucose (barra a cheio).

Descrição pormenorizada da invenção A invenção refere-se a um procedimento para a expansão em grande escala de linfócitos TALL, em que pelo menos 1 x 109 células são cultivadas num sistema homogéneo que consiste de uma única unidade de fermentação.

Os linfócitos TALL (leucemia linfoblástica aguda de células-T) são linhas de linfócitos-T citotóxicos derivadas de um paciente pediátrico com leucemia linfoblastóide e incluem as linhas TALL-104, TALL-107, TALL-103/2, como descrito em 0'Connor et al., Blood, 1991, 77, 1534:1545, e Cesano e Santoli, In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28: 648-656). A linha celular preferida é TALL-104. As células TALL podem também ser modificadas geneticamente.

Até agora elas foram exclusivamente amplificadas em frascos individuais obtendo-se até um máximo de aproximadamente lxlO8 células/frasco T175.

Deste modo, a preparação de sacos contendo quantidades terapeuticamente eficazes de células, compreendidas na gama de 105 a 1012 células, de preferência de 1 x 107 a lxlO10 e ainda mais preferencialmente de 1 x 108 a 2,5 x 109 envolvia, até 4 4622 agora, a amplificação simultânea de um grande número de frascos individuais.

De acordo com as definições da invenção, o crescimento em frascos individuais representa um sistema de cultura heterogéneo, uma vez que cada frasco representa um microambiente de cultura diferente. Consequentemente e de acordo com as linhas de orientação da FDA: "Guidance for Industry: Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy" (CBER, Março 1998, Ponto III) do departamento de saúde dos EUA - que recomenda um controlo separado de cada mistura de células preparada num sistema independente - as células derivadas de cada frasco individual de acordo com os métodos da arte anterior representam lotes diferentes e, portanto, deverão ser controladas de forma independente. Segue-se que o desenvolvimento de um sistema de cultura de células homogénea para utilização terapêutica e, em especial, de células TALL, representa uma enorme vantagem, também no que se refere aos controlos dos lotes.

Adicionalmente, a amplificação num sistema heterogéneo, que consiste de vários frascos individuais, pode acarretar riscos elevados de contaminação devido a operações de manuseamento repetidas a ser realizadas pelo operador.

As células TALL normalmente crescem em suspensão mas, surpreendentemente, não podem ser amplificadas ou expandidas em sistemas conhecidos para o escalonamento industrial de células deste tipo, e.g. frasco giratório 5 4622 ou miniPERM. Deste modo, quando a quantidade de células a ser produzidas excede 109, tal como por exemplo para a produção de doses terapêuticas de 2,5 x 109 células pelo menos, os passos de expansão de células tornam-se extremamente complexos, uma vez que os frascos maiores (T175) disponíveis comercialmente permitem obter 1,5-2 x 108 células TALL, no máximo. A requerente verificou, surpreendentemente, que as referidas células podem ser crescidas e expandidas de forma eficiente num sistema homogéneo, tal como uma Cell-factory— que é normalmente utilizado para células dependentes de ancoragem. Pelo contrário, o frasco giratório ou outros fermentadores convencionalmente utilizados para o crescimento em grande escala de células em suspensão, e.g., células de hibridoma que exibem características de crescimento semelhantes a células TALL, resultam inadequados. A expressão "produção em grande escala" significa a produção de pelo menos 1 χ 109 células TALL num sistema homogéneo.

No procedimento da invenção, os dados referentes ao número de células têm uma tolerância de aproximadamente 5%, que representa o erro possível na contagem de células determinada na câmara de Burker. Por exemplo, a indicação de 1 χ 106 células refere-se efectivamente a um número de células de 0,95 χ 106 a 1,05 χ 106. O erro de medição é variável e depende do método de medição adoptado. 6 4622

De acordo com o procedimento da invenção, a expansão de TALL numa Cell-factory— é de preferência precedida de uma pré-expansão que consiste de uma série de expansões volumétricas no mesmo frasco (em que por frasco se entende um recipiente de cultura de células) por meio de adições sucessivas de meio completo fresco à cultura e por passagens de transferência da cultura completa para frascos de maior volume e, por fim, para os frascos de maior volume e por fim para os frascos de maior volume e maior superfície disponíveis comercialmente, tais como os frascos T175.

De acordo com uma característica preferida da presente invenção, a pré-expansão é realizada até se obterem cerca de 3-4 x 108 células totais, das quais cerca de 2-2,5 x 108 células são utilizadas para a inoculação em cada Cell-factory— e cerca de 1-1,5 x 108 células são mantidas em paralelo em frascos de cultura T175 . A divisão da cultura de células, realizada para levar os valores de densidade celular novamente para os valores de inoculo óptimos, i.e. 0,7 a 1 x 108 células/ml, é aqui designada por "passagem". A esta densidade as células rapidamente atingem uma densidade de aproximadamente 2,5 x 109 células/ml. A pré-amplificação é de preferência realizada num meio completo, mais preferencialmente IMDM, contendo glutamina 2 mM, soro fetal de bovino (FBS) numa concentração de 2 a 20%, de preferência 5% e citocinas, 7 4622 de preferência interleucinas e mais preferencialmente IL-2 ou IL-5. A IL-2 é preferencialmente adicionada numa quantidade de 100 IU/ml a cada 48-72 h. No sistema homogéneo, o meio da fase de amplificação é o mesmo que para a fase de pré-amplificação, mas o soro fetal de bovino é substituído, pelo menos em parte, por soro humano AB. A referida substituição também pode ser realizada antes da transferência de células para o sistema de cultura de células homogéneo, por exemplo, nas últimas passagens da fase de pré-amplificação. O IMDM pode ser substituído por outro meio de cultura, tal como, por exemplo, RPMI, F12 de Ham, etc. O meio é de preferência isento de antibióticos.

Um meio, de preferência IMDM contendo glutamina 2 mM, mas isento de antibióticos é aqui designado por "meio completo"; este pode ser suplementado com FBS ou soro humano.

As interleucinas, de preferência IL-2 ou IL-5, são adicionadas ao meio de cultura das células a cada 48 a 72 h, numa concentração final de 50 a 150 IU/ml, mais preferencialmente de 100 IU/ml.

As células são incubadas a 37°C e numa mistura de ar compreendendo de preferência de 5 a 12% CO2, de preferência 10% de CO2. Todas as passagens que envolvem operações de manuseamento de células ou meio de cultura são realizadas em condições estéreis, e.g., numa hotte de segurança biológica de fluxo laminar vertical (classe 100) . 8 4622

De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, a cultura de pré-amplificação é iniciada a partir de um tubo ou frasco de cultura MCB (Master Cell Bank) congelado, armazenado em azoto liquido e contendo 1 x 107 a 2 x 107 células/tubo/ml que é descongelado num banho termostático a 37°C. 0 conteúdo do frasco é adicionado, numa câmara de fluxo laminar, com um volume 8 a 10 vezes maior de solução de descongelação fria (IMDM completo compreendendo FBS a 20%) . As células são centrifugadas (a 15000 rpm durante 10 min) . Uma vez removido o sobrenadante por aspiração, adiciona-se ao sedimento celular 10 ml de meio completo e as células ressuspensas são transferidas para um frasco T25. Adiciona-se IL-2, diluida com meio completo, a uma concentração final de cerca de 100 IU/ml. Quando a densidade celular obtida é tal que as células ocupam toda a superfície do frasco, como se observa sob um microscópio invertido, a cultura de células é expandida em duas vezes o volume de meio (e amplificada em dois frascos T25) . Para este fim, adiciona-se um volume igual de meio fresco e a cultura é dividida em dois frascos iguais para restaurar a densidade celular óptima (densidade celular de inoculo) que geralmente varia de 0,7 a 1 x 106 células/ml e em que o volume de cada frasco corresponde ao volume inicial.

Para manter uma troca de gases óptima no meio de cultura, o volume médio óptimo de cultura de células num frasco T25 está compreendido entre 7 e 12 ml, de preferência 10 ml; num frasco T75 é de 20 a 60 ml, de 9 4622 preferência 40 ml; num frasco T175 é de 40 a 200 ml. Os volumes acima são aproximados e referem-se a condições de densidade celular óptima.

Após descongelação, a densidade celular óptima é normalmente atingida após 3 a 7 dias, de preferência após 5 dias. Após aproximadamente 3 dias, as células são transferidas de 2 frascos T25 para 2 frascos T175; as células que permanecem no frasco, se existentes, são recolhidas; adiciona-se IL2 ao meio fresco de acordo com a concentração acima indicada.

Após aproximadamente 3 dias, as células são transferidas de 2 frascos T75 para 2 frascos T175. As células deixadas nos frascos T75, se existentes, são recolhidas por meio de lavagem com meio completo para se atingir um volume final de 40 ml e adiciona-se IL-2 em proporção. Após 2-3 dias as células são passadas de 2 frascos T175 para 4 frascos T175 de 20 ml, a que se adiciona imediatamente o mesmo volume de meio completo e IL-2 em proporção. Após 2 dias, as células são passadas de 4 frascos T175 para 8 frascos T175. Adiciona-se a cada frasco T175 aproximadamente 20 ml de meio completo e IL-2 em proporção. Após aproximadamente 2 dias, adiciona-se aos 8 frascos T175 aproximadamente 40 ml de meio completo compreendendo soro humano numa concentração que varia entre 2% a 10%, de preferência entre 4% a 6%, mais preferencialmente de 5% e IL-2 em proporção. Após 2 dias, adiciona-se aos 8 frascos T175 aproximadamente 80 ml de meio completo contendo IL-2 em proporção. 10 4622 0 volume de colheita final do frasco T175 normalmente varia entre 140 a 180 ml. A fase de pré-amplificação está completada após aproximadamente 15 dias, com um número de células que varia de 0,9 x 109 a 1,1 x 109 (valor este que qeralmente corresponde a 8 frascos T175, cada um contendo 160 ml de suspensão de células) num meio que contém soro humano numa concentração final compreendida entre 2% a 5%, de um modo preferido entre 3% a 4% e opcionalmente soro fetal de bovino (FBS) numa concentração final de 0 a 5%, de um modo preferido de 1,5% a 3%. A passagem de meio contendo FBS para meio contendo soro humano ocorre de preferência durante as duas últimas passagens da fase de pré-amplificação no frasco, de um modo preferido T175, de preferência por diluições sucessivas da cultura que contém FBS com meio fresco contendo soro humano. O inoculo na Cell-factory— é realizado com várias células, na gama de 1,5 a 2,5 x 107/câmara num volume que varia de 1/6 a 1/10, de preferência 1/8 da capacidade do volume final da Cell-factory—. Para o inoculo numa Cell-factory— de 10 câmaras com uma capacidade final de 2 litros, o inoculo é realizado com 1,5 a 2,5 x 108 num volume de meio de 200 a 330 ml, de preferência de 230 a 270 ml, imediatamente adicionados com o mesmo volume de meio completo fresco contendo soro humano a 10% max, de preferência 5% e citocinas, de preferência interleucinas, mais preferencialmente IL-2 ou IL-15, ainda mais 11 4622 preferencialmente IL-2, numa concentração final de 80 a 120 IU/ml, de preferência 100 IU/ml. A cada 3-5 dias, de preferência a cada 4 dias, altura em que as células geralmente duplicam, adiciona-se um volume de meio completo correspondente ao contido na Cell-factory—, para continuar a expansão e crescimento celulares até um volume final máximo de 2 litros/Cell-factory— de 10 câmaras e a um número de células de 1,5 a 2,5 x 109. A amplificação de células TALL na Cell-factory— requer a adição de meio fresco contendo soro humano numa quantidade de 10% no máximo, de preferência de 3 a 7%, mais preferencialmente de 4 a 6%, ainda mais preferencialmente de 5%. Deste modo, na fase de amplificação no sistema de cultura homogénea de acordo com a invenção, não se utiliza de preferência nenhum, ou pouco soro fetal de bovino. Os vestígios de FBS, se existentes, que possam estar presentes no final do processo da invenção são o resultado de diluições sucessivas de meio contendo FBS com o meio contendo soro humano.

Em resumo, de acordo com um esquema geral de procedimento, quer na fase de pré-amplificação em frasco, quer na fase de expansão no sistema homogéneo, a densidade celular no inoculo nunca é inferior a 0,7 x 106 células/ml (valor que corresponde ao valor que se obtém dividindo a cultura de células em 2 ou 3, a cada 48-72 h) e é de preferência de 0, 75 x 106/ml. Pelo contrário, na fase de crescimento final, pouco antes da colheita das 12 4622 células, este nunca excede 2 χ 106 e é de preferência de 1,5 x 106/ml.

Os volumes e o número de células de acordo com o processo da invenção - em que o inoculo é realizado num Cell-factory— de 40 câmaras com uma capacidade máxima de meio de 8 litros e capaz de fornecer uma quantidade total de células crescidas num único sistema homogéneo de aproximadamente 8 - 10 χ 109, foram calculados proporcionalmente.

De acordo com o processo da presente invenção, pode produzir-se pelo menos um saco contendo a dose terapêutica mais elevada de células TALL, i.e. 2,5 χ 109 células (sacos contendo 1 χ 108 a 2,5 χ 109 células) utilizando um sistema de cultura homogénea. Assim, de acordo com outra forma de realização da invenção, o processo inclui também a preparação de sacos de linfócitos TALL congelados, numa quantidade de pelo menos 1 χ 109, caracterizado pelo facto de as referidas células TALL serem expandidas num sistema de cultura homogénea, em que o referido sistema é uma pilha de várias câmaras. Os sacos utilizados têm um volume variável e, deste modo, contêm diferentes doses terapêuticas de células. Utilizam-se de preferência sacos para congelação e para infusão, mais preferencialmente sacos da Baxter Cryocyte.

Para preparar sacos para utilização terapêutica, as células da Cell-factory— na altura da colheita são colocadas num tubo estéril de 50 ml e irradiadas, de acordo com métodos conhecidos na arte, num acelerador de 13 4622 partículas beta (betatron). O método foi validado de modo a fornecer a mesma quantidade de partículas que as fornecidas por uma fonte tradicional, tal como Csl37. 0 método que utiliza o betatron tem a vantagem de não ser radioactivo e originar uma irradiação uniforme da solução. Uma vez irradiadas, as células são centrifugadas (a 1500 rpm durante 10 min). Nesta altura, é retirada uma amostra de células para testes qualitativos.

As células irradiadas, juntamente com os componentes da suspensão final e os sacos estéreis são colocados numa câmara de fluxo laminar. As células são suspensas na solução de congelação que consiste de Rimso 50 (DMSO a 50%) (20%) e albumina de soro bovino a 5% (80%) em 8 a 30 ml de meio, mais preferencialmente em 10 a 25 ml de meio completo contendo doses de células TALL na gama de 1 x 108 a 2,5 x 109. De preferência, a densidade celular no saco varia entre 106 a 108 células/ml. As células irradiadas podem ser armazenadas A 4°C durante não mais de 24h antes de serem congeladas. A concentração de células é avaliada por contagem, num microscópio, numa câmara de Burker, ou por outros métodos conhecidos dos peritos na arte. Os sacos são cheios em condições estéreis.

Após os sacos estarem cheios, eles são selados, e.g., por selagem a quente, transversalmente em relação ao colector de enchimento, em dois, de preferência três pontos, para criar uma, ou de preferência, duas câmaras que contêm células e em que estas células são designadas 14 4622 por "amostras autênticas" para o fim da presente invenção. As aliquotas de células contidas nas duas porções do colector do saco estão separadas, mas derivam do mesmo lote de cultura.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o volume da suspensão de células contido nas câmaras do colector é de 0,1 a 1 ml, de preferência de 0,3 ml e o número de células/câmara é suficiente para pelo menos uma série de controlos de qualidade e/ou esterilidade adequados. As células da(s) câmara que correspondem às amostras autênticas podem ser facilmente removidas sem abrir o saco todo.

As referidas câmaras contendo as "amostras autênticas", o método de selagem do colector do saco num ou mais pontos e o método de formação das amostras autênticas do saco constituem outros objectos da presente invenção.

Os sacos para criopreservação e infusão são congelados a -80°C.

Constitui outro objecto da presente invenção proporcionar um processo para a preparação de sacos congelados de linfócitos TALL numa quantidade de pelo menos 1 x 109 células, em que a referida quantidade deriva de um único sistema de cultura homogénea.

Os controlos de qualidade de células amplificadas de acordo com o processo da invenção podem ser realizados 15 4622 antes da congelação, aquando da colheita a partir do sistema de cultura homogénea, bem como após congelação e têm por intenção verificar a estabilidade das propriedades, tais como as quantidades percentuais de marcadores imunológicos e a actividade biológica do produto acabado de células TALL. AS células produzidas de acordo com a invenção também são estáveis após congelação.

Os controlos de qualidade compreendem preferencialmente as seguintes medições, realizadas de acordo com métodos conhecidos na arte: - viabilidade, de preferência determinada pelo teste de exclusão de azul de tripano; deverá ser de 80% min; - actividade biológica, determinada de preferência por um teste de citotoxicidade (medição de adenilato cinase) embora também se possam utilizar testes alternativos; deve ser superior a uma lise de 60% das células alvo, K562, numa razão de 10/1; - níveis de endotoxina, de preferência determinados pelo teste colorimétrico de lisado de amebócito Lymulius; estes devem ser <0,5 EU/ml; - fenótipo de marcadores imunológicos, de preferência determinado por imunofluorescência (FACS) que deverá originar valores de pelo menos 90% para os marcadores conhecidos como CD3+, CD8 + , CD56+; 16 4622 - proliferação, de preferência realizada pelo teste de incorporação de 3H-TdR, devendo a proliferação medida após 72 h ser pelo menos superior ou igual a duas vezes o valor de ruido de fundo.

De acordo com o método da presente invenção, o parâmetro medido, tal como a percentagem de marcadores imunológicos, a actividade biológica e a actividade de marcadores biológicos, tal como por exemplo o nivel de glucose do meio de cultura, são menos variáveis no crescimento celular no sistema homogéneo do que os medidos em células crescidas num sistema de cultura heterogéneo.

De facto, no sistema de cultura homogéneo Cell-factory— a percentagem de marcadores imunológicos expressos em células TALL é de pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% para CD3+ e CD56+ e de pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 93% para CD8+, enquanto que é menor para células crescidas em frasco. O valor da expressão do marcador CD56+ que resulta preferencialmente em pelo menos 95% min, preferencialmente pelo menos 97%, é maior no processo da invenção do que em células crescidas no sistema de frasco heterogéneo. Além disso, a actividade biológica determinada pelo teste de citotoxicidade em células alvo, que são normalmente de preferência K562, é mais elevado do que o limite aceitável e é sempre superior a 70% em comparação com o controlo que consiste de um número adequado de células onde a lise foi completamente induzida. 17 4622

Além disso, os níveis de glucose medidos provam que as condições metabólicas das células são mais homogéneas em células crescidas na Cell-factory— de acordo com o processo da invenção, em relação às células crescidas em frascos (Figura 1): de facto, enquanto que as medições no frasco dão concentrações de glucose que variam entre 300 e 400 mg/dl, as medições na Cell-factory— originam valores que variam entre 350 a 380 mg/dl.

De acordo com uma forma de realização simplificada, o processo da invenção compreende qualquer fase de pré-amplificação de cultura de células TALL realizada de acordo com métodos conhecidos na arte, compreendendo um inoculo numa pilha de várias câmaras de 2 x 107 células/câmara, num volume inicial de 1/10 a 1/6 do volume final da pilha de várias câmaras e uma fase de amplificação de células numa pilha de várias câmaras, de preferência numa Cell-factory— de 10 câmaras (com uma capacidade final de aproximadamente 2 1) com um inoculo total de aproximadamente 2 x 108 células em cerca de 250 ml.

Nas condições adoptadas no presente procedimento, na expansão em grande escala na Cell-factory—, a razão entre a densidade de inoculo mínima e a densidade de recuperação máxima no final do ciclo de expansão é optimizada. De facto, de acordo com o método da presente invenção, no final do ciclo de expansão o número de células é aproximadamente dez vezes superior (de 1,5 a 2,5 x 108 células até 1,5 a 2,5 x 109 células), enquanto que o volume é apenas 8 vezes maior. As outras vantagens 18 4622 do sistema de cultura homogéneo são: 1) eliminação das condições de heterogeneidade do crescimento celular, 2) número reduzido de operações de manuseamento e, consequentemente, possibilidade reduzida de contaminação, 3) menos horas de trabalho e menos custos com pessoal.

Outra vantagem do procedimento de acordo com a invenção, que deriva de um menor risco de contaminação em relação aos sistemas de cultura em vários frascos, é a utilização de um meio de cultura isento de antibióticos.

Ainda outra vantagem do procedimento de acordo com a invenção é a utilização de uma concentração de soro humano de preferência de 10% no máximo. Assim, de acordo com o procedimento da invenção, obtém-se uma amplificação de células satisfatória com uma concentração de soro humano preferencialmente na gama de 4 a 6%.

Deste modo, realizando a fase de expansão na Cell-factory—, todo o procedimento para a preparação do saco para a utilização terapêutica de TALL é optimizado e adequado para aplicação em grande escala.

As vantagens do método de expansão de TALL de acordo com a presente invenção podem ser resumidas como se segue: i) os controlos de qualidade limitam-se a uma única unidade de amostragem que corresponde a uma única unidade de produção (Cell-factory—); pelo contrário, a possibilidade de contaminação aumenta quando a expansão é obtida por amplificação num número muito maior de unidades de fermentação individuais, processadas a tempos 19 4622 diferentes e, consequentemente, sujeitas a maiores riscos de contaminação; ii) a utilização de um número limitado de biorreactores resulta numa poupança de tempo de ca. -30% e numa redução de custos de 25%.

Deve ter-se em conta que, de acordo com os métodos já conhecidos na arte para este tipo de células, a quantidade de 2,5 x 109 células correspondendo a aproximadamente 25 sacos de 108 células ou a 1 saco de 2,5 x 109 células foi obtida com 35 T175 e com um volume de meio completo de 2,8 1. Segue-se que, pelo método de acordo com a presente invenção, a poupança em matéria bruta (soro humano, meio, citocinas) é tão elevada quanto aproximadamente 30%.

Obtém-se outra vantagem sobre o número de controlos realizados nos lotes finais, que consistem de 1 x 108 células no máximo no sistema heterogéneo conhecido na arte e de um número 10 vezes maior no lote produzido pelo sistema homogéneo descrito na presente invenção. Na prática, isto significa que o número de controlos é 10 vezes menor.

Exemplos experimentais 1. Materiais

Frascos: Falcon, Beckton Dikinson; cell factory: cat No. 164327 ou 170009, Nunc A/S, Dinamarca; www.nuncbrand.com; 20 4622 meio de cultura: Meio Dulbecco modificado da Iscove, Biowhittaker 12-722, suplementado com glutamina; CM (meio completo) contendo glutamina e soro;

Soro fetal de bovino: Biowhittaker, EUA;

Soro humano, tipo AB, Biowhittaker, IL-2 Proleucina 1, Chiron;

Solução salina: solução salina tamponada com fosfato, Biowhittaker,

Albumina humana (5%), Farma Biagini; RIMSO 50, Baxter,

Sacos para criopreservação e infusão, Cryocyte Baxter. 2.Métodos

Todas as culturas de células foram realizadas num meio estéril, numa câmara de segurança biológica. A cada adição ou remoção os bicos de entrada foram desinfectados com isopropanol ou por chama. 2.1 Preparação do meio

Os lotes de soro foram descomplementados num banho termostático a 56°C, durante 1 h. As garrafas de soro 21 4622 descomplementado foram mantidas a 4°C e utilizadas no espaço de um mês a contar da data da descomplementação. 2.2 Meio completo para a fase de pré-amplificação

Adicionou-se a uma garrafa de 500 ml de IMDM FBS descomplementado (50 ml); a garrafa foi identificada com o lote. O meio completo foi armazenado a 4°C e aquecido até à temperatura ambiente, antes de uso. O meio completo foi utilizado no espaço de um mês, a contar da data de preparação. 2.3 Meio completo para escalonamento em Cell-factory&

Adicionou-se a uma garrafa de 500 ml de IMDM, 25 ml de soro humano AB descomplementado. O meio foi armazenado a 4°C e aquecido à temperatura ambiente, antes de uso. O meio completo foi utilizado no espaço de um mês a contar da data da preparação. 2.4. Preparação de IL-2

Ressuspendeu-se interleucina (18 x 106 IU/frasco) em 20 ml de PBS para se obterem aproximadamente 9 χ 105 IU/ml A solução resultante foi filtrada através de filtros de 0,22 ym e dispensada nos frascos em aliquotas de 1 ml. As aliquotas foram armazenadas a -80°C.

Esta solução (1 ml) foi diluída com meio completo correspondendo ao meio do ponto 2.2 para a fase de pré-amplificação, em seguida com um meio correspondente ao 22 4622 ponto 2.3. para a fase de amplificação, para se obter uma solução de 104 IU/ml. A referida solução foi adicionada à suspensão de células, diluindo a mesma (1/100) com o meio de cultura. 2.5 Controlos do processo

Biocarga: a contaminação microbiana foi determinada no meio completo utilizado para crescer linhas de células TALL (IMDM + soro suplementado) . O meio resultante foi filtrado através de uma membrana com poros de 0,45 ym, o filtro foi removido com uma lanceta estéril e colocado num meio adequado para visualização da contaminação dos microorganismos (o meio utilizado era agar de soja triptico). O filtro foi colocado sobre a placa. A presença de fungos foi detectada após incubação a 20-25°C durante 3 dias pelo menos e a presença de bactérias foi detectada após nova incubação a 30-35°C, durante pelo menos 3 dias. As placas foram inspeccionadas visualmente para verificar o crescimento de microorganismos (100 CFU no máximo).

Monitorização microbiológica: As hottes utilizadas para o processamento de TALL foram controladas para verificar se estavam presentes microorganismos durante o procedimento. Ao mesmo tempo que o operador estava a trabalhar nas células (vazando, enchendo sacos) expôs-se uma placa de Petri com agar TBS na hotte, tapou-se no final do processo e incubou-se a 20-25°C durante pelo menos 3 dias, para detectar a presença de fungos e a 30-35°C durante pelo menos 3 dias, para detectar a presença de 23 4622 bactérias. Foram encontrados microorganismos durante a amostragem em dois casos de operações de manuseamento de frascos, enquanto que não foi detectada nenhuma contaminação nas operações de manuseamento de fábricas de células.

Exemplo 1. Descongelação e amplificação à escala laboratorial

Preparou-se uma solução de descongelação consistindo de meio IMDM suplementado com FBS a 20% e manteve-se a 4°C antes de utilização.

Retirou-se uma ampola contendo células congeladas do recipiente de azoto liquido, descongelou-se de forma adequada e diluiu-se (1:10) com o meio de descongelação. As células foram centrifugadas a uma velocidade baixa, durante 10'. O sedimento foi ressuspenso em 10 ml de meio completo, passou-se para um frasco T25 e adicionou-se IL-2 até uma concentração de 100 IU/ml.

As células foram incubadas a 37°C durante 5 dias num meio ambiente contendo C02 a 10%.

Após uma incubação durante 5 dias, as células foram divididas (1:2) num meio fresco contendo a mesma concentração de interleucina 2 e deixou-se crescer até à confluência que foi mantida durante 2 dias. As células foram cuidadosamente removidas do frasco e transferidas para um frasco T75 contendo um volume de meio final de 20 ml e a mesma concentração de IL-2 (100 IU/ml) . Uma vez 24 4622 atingida a confluência em aproximadamente 2-3 dias, deixaram-se as células em repouso durante mais 2 dias e em seguida amplificou-se num frasco T175 com um volume de meio final de 40 ml e IL-2 (100 IU/ml) . Dois dias mais tarde, adicionaram-se mais 40 ml de meio completo de interleucina; deixaram-se as células crescer durante mais 2 dias e dividiram-se (1:2) em 2 outros frascos T175 num volume final de 80 ml/T175.

Analisou-se a morfologia e densidade das células sob um microscópio. Em seguida as células foram acertadas para um volume final de 150 ml/frasco em meio completo a 5% (IMDM contendo soro humano AB) e adicionou-se IL-2 em proporção.

As células foram divididas (1:2) no mesmo número de frascos T175 num volume final de 150 ml.

Exemplo 2. Crescimento dinâmico de células TALL num fermentador miniPERM e frasco giratório.

As células foram descongeladas, cultivadas em T25 e amplificadas até um número de 7 x 105 células/ml para inoculação em frascos giratórios de 0,5 1, ou em miniPERM.

Fizeram-se algumas medições nos frascos T75 com o fim de estabelecer parâmetros de crescimento: as células foram divididas guando atingiram uma concentração de pelo menos lxl06/ml. Para manter uma viabilidade celular elevada (90% min) e uma taxa de divisão de células maior, 25 4622 a diluição das células nunca era inferior a 7xl05 célula/ml e o crescimento das células nunca excedeu 2xl06/ml. Na concentração máxima de células, o nivel de glucose era de aproximadamente 320-380 mg/ml. Em T175, obteve-se, num volume final de 80 ml, uma concentração de 1,25 x 106 células/ml correspondendo a um total de aproximadamente 100 x 106 células/frasco.

Foi determinado que, para uma maior viabilidade durante a congelação/descongelação, o número mínimo de células/frasco tinha que ser maior do que l,27xl07. Também se observou que as células congeladas na fase de crescimento logarítmico, por sua vez, atingiam a fase de crescimento logarítmico após descongelação, no espaço de 9-10 dias, enquanto que as células congeladas noutras fases do ciclo de crescimento apresentavam um intervalo de tempo maior (10-12 dias).

Frasco giratório. O frasco giratório de 0,5 1 tinha 300 ml de volume de trabalho. A inoculação foi realizada com 1,5 x 107 células; a agitação foi ajustada para 3 rpm; a viabilidade celular foi medida 48 horas mais tarde e verificou-se ser igual a 50%. 120 h mais tarde, todas as células estavam mortas.

Adicionalmente, realizaram-se 3 testes de amplificação em MiniPERM (um biorreactor com uma superfície elevada em relação ao seu volume, ideal para expansão de células em suspensão, tais como células de hibridoma) utilizando CO2 a 10% e adoptando as seguintes especificações: 26 4622 - inoculação com 7xl07 células em 30 ml a 10 rpm. A viabilidade celular começou a diminuir logo após 48 h e todas as células estavam mortas após 4 dias. No segundo teste, a velocidade de agitação diminuiu para 5 rpm. No terceiro dia de crescimento, a viabilidade celular era de 52%; no 6o dia, todas as células estavam mortas. No terceiro teste, a inoculação tinha diminuído para 3 x 107 células e a velocidade de agitação tinha diminuído para 4 rpm. Embora todas as células tenham morrido até ao 5o dia de cultura, no 2o dia a viabilidade celular era ainda bastante elevada (80%); isto sugeriu o quão importante a agitação é para a sobrevivência das células.

Ambos os testes de fermentação preliminares demonstraram que as células TALL não podem crescer nas condições tradicionais de crescimento em grande escala, normalmente utilizadas para células em suspensão ou independentes de ancoragem.

Exemplo 3. Amplificação de TALL em grande escala em Cell-factory—

Inoculou-se numa Cell-factory— de 10 câmaras uma suspensão de células (250 ml) obtida a partir do crescimento em T175, como para o Exemplo 1 e contendo aproximadamente 0,8 x 106 células/ml; adicionou-se a mesma quantidade de meio completo. Quatro dias mais tarde, adicionou-se meio completo (500 ml x 3 vezes) até um volume total de 2 1. 27 4622 A Cell-factory— foi esvaziada para frascos estéreis de 250 ml - que foram centrifugados - e foi lavada com PBS estéril; as células foram recuperadas em frascos e centrifugadas de novo. Oito dias após a inoculação, as células recuperadas de uma Cell-factory— eram aproximadamente 2,35 x 109.

Num ciclo de produção tipico numa Cell-factory— de 10 câmaras fizeram-se 72 inoculações e amplificações a partir de um único frasco MCB (Master Cell Bank) congelado. Duração total: 120 dias, cultura de células total: 144 litros. As células obtidas eram aproximadamente 1,44 x 1011. A Tabela 1 mostra os dados obtidos a partir de uma fermentação numa Cell-factory— de 10 câmaras e numa Cell-factory— de 40 câmaras, respectivamente.

Tabela 1 - Rendimentos obtidos numa Cell-factory— de 10 câmaras e numa Cell-factory— de 40 câmaras

Cell factory 10 (2 Cell factory 40 (8 litros) litros) No. 72 31 inoculações Dias 120 120 Volumes 144 248 (litros) No. de células 1,44 x 1011 2,48 x 1011 28 4622 0 conteúdo de células da Cell-factory— foi combinado num frasco estéril de 50 ml e irradiado, como é conhecido, num acelerador de partículas beta (betatron). O método foi validado de modo a fornecer a mesma quantidade de partículas que a que é fornecida por uma fonte tradicional, tal como Csl37. 0 método que utiliza o betatron tem a vantagem de não ser radioactivo e conferir uma radiação uniforme à solução.

Preparação de sacos. Uma vez irradiadas, as células foram centrifugadas (a 1500 rpm durante 10 min). Retirou-se uma amostra de células para testes qualitativos e armazenou-se a 4°C antes de congelar.

As células irradiadas, juntamente com os componentes da suspensão final e os sacos estéreis, foram colocadas numa câmara de fluxo laminar. As células foram ressuspensas na solução de congelação que consistia de Rimso 50 (DMSO a 50%) (20%) e 5% de albumina humana (80%), dependendo da quantidade de células necessária para uma dose terapêutica. As células foram contadas ao microscópio numa câmara de Burker e os sacos foram cheios com o volume adequado, em condições estéreis. Após os sacos estarem cheios, o colector de enchimento foi selado em três pontos; cada saco formou assim uma amostra autêntica. O ciclo Cell-factory— > irradiação > sacos foi repetido um número de vezes suficiente para se obter o número de células necessárias para o lote. 29 4622

Controlos de esterilidade

Os controlos de esterilidade da biocarga, monitorização microbiológica e monitorização de micoplasma foram realizados continuamente nos meios e hottes.

Exemplo 4. Controlos no produto acabado e comparação entre crescimento à escala laboratorial e em grande escala.

Medição dos niveis de glucose: os niveis de glucose foram medidos numa amostra de 15 frascos (de entre os 35 frascos correspondentes à quantidade de células numa Cell-factory—) aquando da colheita de células para preparação do saco. Como se pode ver na Fig. 1, a concentração de glucose e o número de células são altamente variáveis; pelo contrário, numa Cell-factory— de 10 câmaras, aquando da colheita (após 6-10 dias) a glucose apresenta um valor (aproximadamente 380 mg/dl) e as células têm uma densidade (2 x 109/ml). Os diferentes niveis de glucose e as diferentes concentrações de células encontradas no frasco são indicativos de condições metabólicas não homogéneas: de facto, os niveis elevados de glucose no meio correlacionam-se com uma actividade metabólica baixa da cultura de células, enquanto que os niveis de glucose baixos correspondem a uma actividade metabólica elevada da cultura de células. 30 4622

Controlo de qualidade do produto final

Os controlos enumerados na Tabela 2 foram realizados em células irradiadas. Os limites de aceitabilidade dos valores são descritos na coluna do lado direito.

Tabela 2

Teste Método Limites Viabilidade Teste de exclusão de azul de tripano > 80% Actividade Teste de >60% lise de biológica citotoxicidade células alvo K562 numa razão 10/1 Endotoxinas teste colorimétrico do lisado de amebócito Lymulus <0,5 EU/ml Fenótipo Imunofluorescência (FACS) >90% CD3+, CD8\ CD56+ Proliferação Incorporação de 3H-TdR <duas vezes o ruído de fundo, após 4 dias de incubação

Teste de viabilidade A determinação foi realizada diluindo 100 μΐ da suspensão de células antes de colocar num saco com 100 μΐ de solução de azul de tripano. Após uma diluição adequada fez-se um controlo sob um microscópio contando as células coradas numa câmara de Burker. 31 4622

Actividade biológica A determinação da citotoxicidade foi realizada na suspensão de células, antes de colocar num saco, com um kit Toxilight™ (BioWhittaker LT07-217). 0 método baseia-se na medição de adenilato-cinase por bioluminescência. A adenilato-cinase é libertada das células quando perdem a integridade da membrana e converte o substrato ADP em ATP na presença de Mg++, permitindo assim a sua medição. A determinação foi realizada plaqueando 105 células alvo, K562, numa microplaca de vários poços; adicionaram-se células preparadas de acordo com o método, em quantidades de 106, 5 x 105 e 2,5 x 106 para se obterem razões E/A (ou efector/alvo) iguais a 10,5 e 2,5, respectivamente.

Após as células alvo serem incubadas durante a noite, a % de lise de K562 produzida pelas células preparadas de acordo com o método da presente invenção era sempre > 70% do máximo consistindo de uma amostra de 105 células K562 lisadas por ultrassons.

Endotoxinas O teor de endotoxinas foi determinado numa amostra com colectores preparados como acima referido, a pH neutro, utilizando um kit para o teste LAL cromogénico e aplicando o método descrito na European Pharmacopoeia, 4a Edição, 2002, pp. 140-145. 32 4622

Fenótipo A determinação do fenótipo por medição dos marcadores celulares antes de colocar no saco foi realizada por imunofluorescência (FACS) com marcadores imunológicos adequados (CD3+, CD8+, CD56+) disponíveis do Molmed's Quality Control Labs.

Tabela 3 - marcadores fenotípicos de células TALL crescidas em frascos e em Cell-factory— aquando da colheita de células

Amplificação CD3 CD8 CD56 act.Citotox. 3H timidina Frasco >90% >90% >90% hduas vezes o ruído de fundo após 4 dias de incubação Cell- >98% >93% >97% >70% hduas vezes o factory- med 99% 90 98 ruído de fundo após 4 dias de incubação Lote 1 pré 99% - 99 pós 99 98 99 Lote 2 pré 99 93 99 pós 99 97 92 Lote 3 pré 99 94 95 pós pré: pré-irradiação; pós pós-irradiação; med: média

Teste de proliferação A ausência de proliferação de TALL foi determinada medindo a incorporação da timidina tritiada. Uma amostra da suspensão de células recolhida antes de colocar no 33 4622 saco foi incubada em microplacas a diferentes concentrações, em meio completo (IMDM + soro + IL-2) durante 4 dias. Adicionou-se 3H-TdR (2 yCi/ml, 50 μΐ/poço). Após 3h de incubação a 37°C, mediu-se a radioactividade. Os cpm referentes a células TALL deverão ser < duas vezes o ruido de fundo. A Tabela 3 mostra os dados referentes à proliferação de um lote de células crescido num frasco e no Cell- factory—, respectivamente. A tabela 4 mostra os dados referentes à medição (em diferentes preparações) da presença de marcadores imunológicos, da viabilidade celular, esterilidade e contaminação por micoplasma, se existente, após irradiação da cultura.

Tabela 4 medição de marcadores em células TALL após irradiação citofluorímetro Incorp. timidina de 3H N° de células CD 3 CD 8 CD56 amostra ruído esterilidade mico amostras de fundo 2 2,5 x 99,59 94,8 92,51 24 27 OK negativo 109 6 2,5 x 99,8 91,34 97,17 33 27 OK negativo 109 8 2,5 x 99,88 93 97,84 37 26 OK negativo 109 18 1 x 108 99,59 94,8 92,51 24 27 OK negativo citofluorímetro Incorp. de timidina N° de células CD 3 CD 8 CD56 amostra ruído esterilidade mico 34 4622 amostras de fundo 1 2,5 x 109 99,54 94,63 95, 83 23 24 OK negativo 1 2,5 x 109 99,44 96,24 98,51 37 26 OK negativo 8 1 x 108 99,54 93,36 99,79 34 25 OK negativo citofluorímetro Incorp. de timidina N° de amostras células CD 3 CD 8 CD 56 amostra ruído de fundo esterilidade mico 7 0,5 x 109 99,8 92,3 97,05 82 60 OK negativo 11 0,5 x 109 99,54 93,36 99,79 29 29 OK negativo

Lisboa, 16 de Março de 2007 35

Claims (13)

1. 4622 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a expansão de linfócitos TALL, em que pelo menos 1 x 109 células são crescidas em condições homogéneas numa única unidade de fermentação, caracterizado por a referida unidade de fermentação ser uma pilha de várias câmaras.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida unidade de fermentação é uma Cell-Factory™.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a expansão no sistema homogéneo é precedida por um processo de pré-expansão em frasco até se obter um número de células de 0,7 a 1 x 108.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a densidade celular do inoculo é de pelo menos 0,7 x 101 células/ml e é de preferência igual a 0,7 x 101 células/ml e, na altura da colheita, a densidade é inferior a 2 x 101 células/ml, de preferência inferior a 1 x 101.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a Cell-Factory™ é uma unidade de 10 câmaras. 1 1 Processo de acordo com a reivindicação 1, em que os linfócitos TALL são seleccionados do grupo que consiste das linhas celulares TALL-104, TALL-107, TALL-103/2, opcionalmente geneticamente modificadas. 4622
6. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que TALL são linfócitos TALL-104.
7. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o meio de cultura completo na fase de amplificação da cell-factory também compreende 10% de soro humano no máximo, de preferência na gama de 4 a 6%, ainda mais preferencialmente de 5%, opcionalmente soro fetal numa concentração de 0 a 10% e interleucina numa concentração de 100 IU/ml.
8. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a interleucina-2 é adicionada à cultura de células a cada 48-90 horas.
9. 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que o crescimento celular é realizado num meio de cultura isento de antibióticos.
10. 11. Processo para a preparação de sacos congelados de linfócitos TALL numa quantidade de pelo menos 1 x 109 células, caracterizado por compreender o processo de acordo com as reivindicações 1-10.
11. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que o saco é selado transversalmente no colector de enchimento do saco, pelo menos em dois pontos, para criar pelo menos uma câmara de amostragem contendo um volume de cultura de células que varia entre 0,1 a 1 ml, separado fisicamente da cultura contida no saco, para realizar controlos de qualidade. 2 4622
12. 13. Processo para a preparação de uma dose terapêutica de pelo menos 1 x 109 linfócitos TALL numa cultura homogénea caracterizado por compreender o processo de acordo com as reivindicações 1-10.
13. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que os linfócitos são TALL-104. Lisboa, 16 de Março de 2007 3