CN107912425A - 一种可输液的细胞冻存管试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可输液的细胞冻存管试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：细胞冻存液、医用橡胶瓶塞、石墨烯导热套及冻存管。本发明通过优化细胞冻存液的组分及配比，提高冻存过程中细胞的存活率；选用大体积的冻存管及与冻存管相匹配的石墨烯导热套，使得解冻过程中传热更为均匀；解冻后将冻存管原有的瓶盖更换为医用橡胶瓶塞，直接用于输液；避免多步操作引发的污染；本发明提供的可输液的细胞冻存管试剂盒新颖实用，高效便捷，石墨烯导热套及冻存液提高了冻存及解冻的细胞存活率，可更换的医用橡胶瓶塞避免了冻存管内细胞回输体内存在的污染问题，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种可输液的细胞冻存管试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种可输液的细胞冻存管试剂盒及其应用。
背景技术
免疫细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成各种组织器官的原始细胞。免疫细胞可在体外培养、诱导和分化，在细胞移植、基因治疗、细胞治疗和组织工程领域被广泛应用。癌症是困扰人类健康的首要问题，细胞免疫治疗为肿瘤的预防和治疗提供了广阔的前景。但是在临床实际应用的过程中，存在部分肿瘤患者自身免疫细胞难以采集、细胞扩增能力差、免疫细胞与其它治疗方式的时间窗口难以配合等诸多问题：此外，从药物研发和生产的角度，新鲜免疫细胞的异地运输、保存条件和存活时间都受到一定限制。在免疫细胞的研究和运输过程中，需要用到细胞冻存管将细胞冻存，然后复苏用于研究或临床应用。细胞可以在-196℃下长期存活，但在冻存和复温过程中极可能遭受损伤而死亡，而且在治疗时将冻存管内细胞取出回输到患者体内的步骤繁琐，容易造成污染。
CN204763021U公开了一种新型细胞冻存管，包括管体(1)和设置在所述管体(1)上的管盖(2)，所述管体(1)呈扁平型，所述管体(1)宽为20-30mm，厚3-7mm，高50-115mm，所述管盖(2)与所述管体(1)螺纹连接。该实用新型提供的新型细胞冻存管，可用于容纳中等容量的细胞样本，而且冻存管中心与外壁之间的间距较小，复苏冻存细胞时，复温速率高，固液转变时间短，有利于保持细胞的存活率和活性。但上述实用新型没有解决细胞回输的污染问题，而且结构复杂，制作工艺繁琐。
CN104026118A公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。具体地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10％二甲基亚砜、10-90％人供体血浆和0.01-80％免疫细胞基础培养基。但该发明没有解决细胞回输的污染问题，且冻存液耗费大量血浆，成本较高。
因此，免疫细胞的有效冻存及洁净回输为免疫细胞作为药物进行产业化应用提供必要的基础技术保障，提供一种高效方便的细胞冻存管试剂盒具有广阔的应用前景和市场价值。
发明内容
本发明提供了一种可输液的细胞冻存管试剂盒及其应用，通过石墨烯导热套及冻存液提高冻存及解冻的细胞存活率，可更换的医用橡胶瓶塞避免了冻存管内细胞回输体内存在的污染问题，该试剂盒新颖实用，高效便捷，具有广阔的应用前景和市场价值。
第一方面，本发明提供一种可输液的细胞冻存管试剂盒，所述试剂盒包括细胞冻存液、医用橡胶瓶塞、石墨烯导热套和冻存管，其中，石墨烯导热套在细胞解冻时安装在冻存管外部。
发明人在实践研究的过程中，发现普通冻存管在冻存细胞过程中存在诸多问题，例如：冷冻及解冻过程损伤大，细胞存活率低，回输患者体内时操作步骤繁琐，容易污染，因此经过反复实验探索和实践，优化细胞冻存液组分和配方，特异性添加了γ聚谷氨酸，并创造性地选用了可更换的医用橡胶瓶塞，方便解冻后的细胞直接回输患者体内，避免了污染。同时将导热系数极高的石墨烯材料切割为冻存管导热套，在解冻过程能够加快热量传导速率，生物样品内部的传热更为均匀，避免造成较大热应力，保证较高的细胞存活率。各部件协同增效，组成细胞冻存管试剂盒，显著提高了细胞冻存及解冻的存活率，避免了回输患者体内产生的污染。
优选地，所述细胞冻存液包括γ聚谷氨酸、二甲基亚枫、葡萄糖、肝素纳或人血白蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述γ聚谷氨酸的浓度为0.3-0.5mg/mL，例如可以是0.3mg/mL、0.4mg/mL或0.5mg/mL。
优选地，所述二甲基亚枫的体积浓度为18-20％，例如可以是18％、19％或20％。
优选地，所述葡萄糖的质量浓度为10-15％，例如可以是10％、11％、12％、13％、14％或15％。
优选地，所述肝素纳的浓度为200-600U/mL，例如可以是200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL或600U/mL。
优选地，所述人血白蛋白的质量浓度为30-35％，例如可以是30％、31％、32％、33％、34％或35％。
优选地，所述细胞冻存液包括0.4mg/mL的γ聚谷氨酸、19％的二甲基亚枫、13％的葡萄糖、400U/mL的肝素纳和33％的人血白蛋白。
优选地，所述γ聚谷氨酸的数均分子量为(8-10)×105，例如可以是8×105、9×105或10×105，优选为9×105。
优选地，所述冻存管的体积为10-50mL，例如可以是10mL、20mL、30mL、40mL或50mL，优选为30mL。
优选地，所述细胞冻存液还包括医用注射液，所述医用注射液包括无菌注射用水、生理盐水或电解质注射液中的任意一种。
优选地，所述医用橡胶瓶塞的尺寸与冻存管管口相匹配。
优选地，所述医用橡胶瓶塞的材质为天然橡胶、异戊橡胶或丁苯橡胶中的任一种。
所述医用橡胶瓶塞的形状不做限定，能与冻存管相匹配且用于输液并不被污染即可。
在细胞解冻后将冻存管盖更换为医用橡胶瓶塞，用于输液。
优选地，所述石墨烯导热套的内径等于所述冻存管的外径。
优选地，所述石墨烯导热套的导热系数为3000-5000W/m·k，例如可以是3000W/m·k、3200W/m·k、3500W/m·k、3800W/m·k、4000W/m·k、4300W/m·k、4500W/m·k或5000W/m·k，优选为4000W/m·k。
作为一种优选技术方案，所述试剂盒包括细胞冻存液、与冻存管管口相匹配的医用橡胶瓶塞、导热系数为3000-5000W/m·k的石墨烯导热套和体积为10-50mL的冻存管；
细胞冻存液包括数均分子量为(8-10)×105的γ聚谷氨酸0.3-0.5mg/mL、18-20％的二甲基亚枫、10-15％的葡萄糖、200-600U/mL的肝素纳和30-35％的人血白蛋白；
所述细胞冻存液还包括医用注射液，所述医用注射液包括无菌注射用水、生理盐水或电解质注射液中的任意一种；
所述医用橡胶瓶塞的材质为天然橡胶、异戊橡胶或丁苯橡胶中的任一种；
所述石墨烯导热套的内径等于所述冻存管的外径。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述试剂盒用于免疫细胞保存和输液中的应用；
优选地，所述的免疫细胞包括：T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞和CAR-T细胞中的任一种或至少两种的组合。
试剂盒在使用时，将细胞冻存液与准备冻存的细胞混合，加入冻存管中，进行常规冻存操作，解冻时将石墨烯导热套安装在冻存管上，恒温水浴解冻，输液时，将冻存管盖更换为医用橡胶瓶塞，进行回输患者体内。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的试剂盒通过优化细胞冻存液的组分及配比，避免较大体积的冰晶形成，提高冻存过程中细胞的存活率；同时使得在复温过程中，选用大体积的冻存管及与冻存管相匹配的石墨烯导热套，使得解冻过程中传热更为均匀，避免造成较大热应力，保证较高的细胞存活率。解冻后将冻存管原有的瓶盖更换为医用橡胶瓶塞，直接用于输液，避免多步操作引发的污染。
(2)本发明提供的可输液的细胞冻存管试剂盒新颖实用，高效便捷，试剂盒制作简单，易实现且不受细胞种类的限制。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1试剂盒的组装
配置细胞冻存液：将数均分子量为(8-10)×105的γ聚谷氨酸0.3-0.5mg/mL、18-20％的二甲基亚枫、10-15％的葡萄糖、200-600U/mL的肝素纳和30-35％的人血白蛋白和医用注射液混匀后4℃冰箱待用。
将配置好的细胞冻存液与体积为10-50mL的冻存管以及与冻存管相匹配的医用橡胶瓶塞和导热系数为3000-5000W/m·k的石墨烯导热套组装成试剂盒。
实施例2
配置细胞冻存液：将数均分子量为9×105的γ聚谷氨酸0.4mg/mL、19％的二甲基亚枫、13％的葡萄糖、400U/mL的肝素纳和33％的人血白蛋白和医用注射液混匀后4℃冰箱待用。
冻存细胞：取培养扩增后的CAR-T细胞至离心管中，300g离心5min。用PBS洗涤两遍，计数。根据计数结果，用实施例1制备得到的预冷的细胞冻存液重悬CAR-T细胞，使得细胞密度在1×108/mL，将细胞转移至冻存管，然后转移至梯度降温冻存盒至-80℃冰箱过夜后再转移至液氮保存6个月。解冻时，从液氮罐取出细胞，将石墨烯导热套装置于冻存管外部，置于37℃水浴锅解冻。
实施例3
配置细胞冻存液：将数均分子量为8×105的γ聚谷氨酸0.3mg/mL、18％的二甲基亚枫、10％的葡萄糖、200U/mL的肝素纳和30％的人血白蛋白和医用注射液混匀后4℃冰箱待用。
冻存细胞：取培养扩增后的CAR-T细胞至离心管中，300g离心5min。用PBS洗涤两遍，计数。根据计数结果，用预冷的冻存液重悬CAR-T细胞，使得细胞密度在1×108/mL，将细胞转移至冻存管，放置-80℃冰箱过夜后再转移至液氮保存6个月。解冻时，从液氮罐取出细胞，将石墨烯导热套装置于冻存管外部，置于37℃水浴锅解冻。
实施例4
配置细胞冻存液：将数均分子量为1×106的γ聚谷氨酸0.5mg/mL、20％的二甲基亚枫、15％的葡萄糖、600U/mL的肝素纳和35％的人血白蛋白，其余组分为医用注射液和医用注射液混匀后4℃冰箱待用。
冻存细胞：取培养扩增后的CAR-T细胞至离心管中，300g离心5min。用PBS洗涤两遍，计数。根据计数结果，用预冷的冻存液重悬CAR-T细胞，使得细胞密度在1×108/mL，将细胞转移至冻存管，然后转移至梯度降温冻存盒至-80℃冰箱过夜后再转移至液氮保存6个月。解冻时，从液氮罐取出细胞，将石墨烯导热套装置于冻存管外部，置于37℃水浴锅解冻。
对比例1
与实施例2相比，除了不装置有石墨烯导热套外，其他条件与实施例2相同。
对比例2
与实施例2相比，除了冻存液不含有γ聚谷氨酸外，其他条件与实施例2相同。
对比例3
与实施例2相比，除了γ聚谷氨酸的浓度改为1mg/mL外，其他条件与实施例2相同。
对比例4
与实施例2相比，除了不含有二甲基亚枫外，其他条件与实施例2相同。
对比例5
与实施例2相比，除了二甲基亚枫的含量改为30％外，其他条件与实施例2相同。
对比例6
与实施例2相比，除了不含有肝素纳外，其他条件与实施例2相同。
对比例7
与实施例2相比，除了肝素纳的浓度为800U/mL外，其他条件与实施例2相同。
对比例8
与实施例2相比，除了不含有葡萄糖外，其他条件与实施例2相同。
对比例9
与实施例2相比，除了葡萄糖的含量改为20w/v％外，其他条件与实施例2相同。
对比例10
与实施例2相比，除了不含有人血白蛋白外，其他条件与实施例2相同。
对比例11
与实施例2相比，除了人血白蛋白的含量改为40％外，其他条件与实施例2相同。
实验检测
取实施例2-4和对比例1-11的少量解冻后细胞用台盼蓝染色法检测细胞活率，结果见表1；
表1
样品 活率(％) 样品 活率(％)
实施例2 98.7 对比例5 82.3
实施例3 98.6 对比例6 81.6
实施例4 98.65 对比例7 84.8
对比例1 85 对比例8 86.4
对比例2 88.4 对比例9 82.3
对比例3 87.6 对比例10 83.7
对比例4 86.5 对比例11 81.0
由表1可知，细胞冻存液的组分及配方在本发明提供的范围内且选用石墨烯导热套时，解冻后细胞存活率均高于98.5％，其中实施例2的存活率最高，为98.7％，而对比例1不装配有石墨烯导热管，与实施例2相比细胞存活率降低超过10％，而对比例2-11中细胞冻存液的组分缺少任一种或超过给定范围，存活率均明显降低。
综上所述，本发明提供的细胞冻存管试剂盒简洁高效，细胞冻存液各组分协同增效，提供细胞冻存过程的存活率，石墨烯导热管加快传热，使得解冻时受热均匀，解冻后细胞存活率高达98.7％，选用医用橡胶瓶塞更换瓶盖，在回输患者体内时更方便操作，避免污染，在免疫细胞冻存和回输治疗过程有巨大的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种可输液的细胞冻存管试剂盒，其特征在于，包括细胞冻存液、医用橡胶瓶塞、石墨烯导热套和冻存管；
其中，石墨烯导热套在细胞解冻时安装在冻存管外部。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞冻存液包括γ聚谷氨酸、二甲基亚枫、葡萄糖、肝素纳和人血白蛋白中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述γ聚谷氨酸的浓度为0.3-0.5mg/mL，优选为0.4mg/mL；
优选地，所述二甲基亚枫的体积浓度为18-20％，优选为19％；
优选地，所述葡萄糖的质量浓度为10-15％，优选为13％；
优选地，所述肝素纳的浓度为200-600U/mL，优选为400U/mL；
优选地，所述人血白蛋白的质量浓度为30-35％，优选为33％；
优选地，所述细胞冻存液还包括医用注射液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞冻存液包括0.4mg/mL的γ聚谷氨酸、19％的二甲基亚枫、13％的葡萄糖、400U/mL的肝素纳和33％的人血白蛋白。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述γ聚谷氨酸的数均分子量为(8-10)×105，优选为9×105。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冻存管的体积为10-50mL，优选为30mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述医用橡胶瓶塞的尺寸与冻存管管口相匹配；
优选地，所述医用橡胶瓶塞的材质为天然橡胶、异戊橡胶或丁苯橡胶中的任意一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述石墨烯导热套的内径等于所述冻存管的外径。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述石墨烯导热套的导热系数为3000-5000W/m·k，优选为4000W/m·k。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞冻存液、与冻存管管口相匹配的医用橡胶瓶塞、导热系数为3000-5000W/m·k的石墨烯导热套和体积为10-50mL的冻存管；
所述细胞冻存液包括数均分子量为(8-10)×105的γ聚谷氨酸0.3-0.5mg/mL、18-20％的二甲基亚枫、10-15％的葡萄糖、200-600U/mL的肝素纳和30-35％的人血白蛋白；
所述医用橡胶瓶塞的材质为天然橡胶、异戊橡胶或丁苯橡胶中的任一种；
所述石墨烯导热套的内径等于所述冻存管的外径。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述试剂盒用于免疫细胞保存和输液中的应用；
优选地，所述的免疫细胞包括：T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞和CAR-T细胞中的任一种或至少两种的组合。
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