CN103665143A - 诱导成骨多肽、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导成骨多肽，其结构式为KIPKASSVPTELSAISTLYLCC。该诱导成骨多肽具有较强的骨诱导活性、能够大规模合成和价格较低的优点。其克服了现有基因重组BMP-2生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，难以大规模生产，价格过于昂贵等不足，市场前景广阔。

Description

诱导成骨多肽、其制备方法和用途
技术领域
本发明属于临床医学领域，更具体地说它涉及一种诱导成骨多肽，其制备方法及在制备用于促进骨再生、骨缺损修复的药物中的用途。 
背景技术
中国社会逐步步入老龄化社会，中老年性骨科疾病发生率也将大幅度上升，因此中国也将面临人工骨移植材料的极大需求。据统计，中国有肢体不自由患者1500万，由于缺乏重建技术和材料已有300万人截肢，全国每年骨缺损和骨损伤患者近350万，按年手术40万例计算，整个中国骨移植材料的市场规模也将达到24亿人民币以上的规模，这还不包括大量牙科矫形手术中需要的骨移植材料。在美国，每年实施45万例骨移植手术，骨移植材料市场高达80亿美元。对于欧洲市场，骨替代产品35%为合成材料，并且以每年41.7%的速率增长，2000年骨移植手术145775例，骨移植材料市场价值达35亿美元。上述数据尚未包括牙科用骨移植材料。牙科用骨移植材料估计有骨科用骨移植材料的1/4。作为生物医学材料中一个重要的组成部分，人工骨移植材料的市场销售额在以每年50%的速率增长，由此可见人工骨材料的市场规模与潜力将十分巨大。 
目前市场上的人工骨修复材料大都缺少诱导成骨活性因子，这些材料植入人体后成骨的时间和数量受限，一定程度上限制了新骨的形成。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是目前发现唯一能够单独诱导成骨的生长因子，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein BMP)作为最有效的成骨诱导活性物质，已被广泛应用在骨缺修复损及骨折愈合的研究中。其中以BMP-2 的成骨能力最强。但天然的BMP-2 半衰期短，局部应用时很快被稀释和代谢，不仅数量有限，活性不稳定,远远不能满足临床需要，而且混入载体中有许多副作用。 
目前国内外多采用分子生物学和基因工程学等技术生产基因重组骨形态发生蛋白，制备工艺复杂，生产周期长，产率低，价格亦非常昂贵,难以大规模生产。运用转基因技术制备的基因重组BMP-2 （rhBMP2）也存在转染效率低、表达时间较短及病毒载体的潜在致癌性等缺点。2002年美国FDA虽然批准了rhBMP-2基因工程产品，但尚未进入国内。这些问题极大地限制了骨形态发生蛋白的临床应用。 
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，特别是克服现有BMP-2生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，难以大规模生产，价格过于昂贵等不足，而提供一种诱导成骨多肽。 
本发明的另一目的在于提供这样的诱导成骨多肽的合成方法。 
本发明的又一目的在于提供这样的诱导成骨多肽在制备用于促进骨再生、骨缺损修复的药物中的用途。 
本发明提供一种诱导成骨多肽，其特征在于结构式为KIPKASSVPTE LSAISTLYLCC。 
本发明还提供了这样的诱导成骨多肽的合成方法，其特征在于采用采用多肽合成仪通过 FMOC/tBu 固相多肽合成法合成。所得粗肽经过凝胶层析初步纯化，最后经过高效液相色谱法分析其纯度，冷冻而得。 
    本发明的诱导成骨多肽具有较强的骨诱导活性、能够大规模合成和价格较低的优点，其在克服了现有BMP-2生产设备、制备工艺非常复杂，生产周期长，产率低，难以大规模生产，价格过于昂贵等不足的同时，保持了高的骨诱导活性，因此，市场前景十分广阔。    
具体实施方式
下面详细介绍本发明的诱导成骨多肽的细胞试验。 
  
1.本发明诱导成骨多肽的合成
通过本领域中公知的FMOC/tBu 固相多肽合成法合成法得到本发明的诱导成骨多肽KIPKASSVPTE LSAISTLYLCC。
  
2. 细胞试验
(1)试验相关仪器设备
仪器名称 型号 生产厂家
洁净工作台 NU-126-006 Nuaire
研究级倒置显微镜 IX41 OLYMPUS
冷冻离心机 5810R EPPENDORF
二氧化碳孵箱 NU4750E Nuaire
(2)试验相关材料
SD MSC一株（RASMX-01001），来源：Cyagen
细胞状态：细胞状态好，形态均一。 
细胞无菌检测结果：阴性 
(3)试验相关试剂
SD大鼠间充质干细胞完全培养基(RASMX-90011-500)、1×PBS（PBS-10001-100），
SD大鼠间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(RASMX-90021-200)，0.25%Trypsin-0.04%EDTA(TEDTA-10001-100)、
（以上试剂均来自Cyagen）
BMP-2(北京义翘神舟生物技术有限公司)
本发明的诱导成骨多肽
碱性磷酸酶测定试剂盒（南京建成科技有限公司）
(4)试验步骤
I、细胞准备：在SD MSC细胞融合达80%时，将细胞进行传代，接种于经0.1%明胶包被过的24孔板中，用于成骨诱导。
A. 细胞消化、接种： 
a. 弃去上清，用1×PBS清洗细胞2次，加入1mlPBS和1ml0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化细胞；
b. 消化1-2分钟，显微镜下可见细胞间隙增大，细胞变圆，用手轻拍培养器皿的壁，立即加入2mL的SDMSC完全培养基终止消化。
c. 用吸管吸取液体，轻轻吹打培养器皿表面，反复3-5次，使细胞彻底脱离瓶皿底壁， 将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入1×PBS洗1-2次，并将洗液一并转移至离心管中。 
d. 1100rpm进行离心4分钟； 
e. 弃去上清加入完全培养液，充分混匀，平均接种于3个包被过明胶的12孔板中，摇匀，放置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。
  
II、诱导成骨多肽的准备：将诱导成骨多肽称量分装成3份（1mg/份），取其中一份进行溶解，其他保存于-20℃冰箱以供备用。加入1ml无菌用水溶解1mg成骨素于离心管中，过滤，分装于EP管中，保存于-80℃冰柜中以供使用。
  
III、诱导成骨：
A. 初诱导：待细胞融合达80%左右时，进行成骨诱导。每组两个复孔，其中2孔阴性对照：使用间充质干细胞完全培养液培养；2孔阳性对照：使用间质干细胞成骨诱导分化完全培养液培养；2孔含10ug/ml的BMP-2间充质干细胞完全培养液培养；2孔含30ug/ml的BMP-2间充质干细胞完全培养液培养；2孔含10ug/ml的本发明的诱导成骨多肽间充质干细胞完全培养液培养；2孔含30ug/ml的本发明的诱导成骨多肽间充质干细胞完全培养液培养。2板重复。
B. 每3天进行诱导换液。 
  
IV. 碱性磷酸酶检测：
取不同检测时间点细胞，根据碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒（南京建成）对各组AKP含量进行检测。具体操作如下：
A. 消化各孔细胞，离心后，进行细胞计数，调整细胞数量，保证50ul细胞重悬液含有大于5×105的细胞。用0.05ml缓冲液重悬细胞，按下表依次加入相应溶液
Figure 2013106812836100002DEST_PATH_IMAGE001
注：0.1mg/ml酚标准应用液的配制：1.1mg/ml的酚标准贮备液：蒸馏水=1：10稀释
B. 立即混匀，520nm，0.5cm 或者1cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。
计算公式： 
V. 实验结果
A. 两周碱性磷酸酶测定：
B. 三周碱性磷酸酶测定：
Figure 2013106812836100002DEST_PATH_IMAGE003
由上述结果可以看出，将本发明的诱导成骨多肽和阳性对照样品的结果进行对比，可以发现本发明的诱导成骨多肽完全能够诱导细胞生长。而将本发明的诱导成骨多肽和BMP-2的样品的结果进行对比，可以发现本发明的诱导成骨多肽能够实现和BMP-2相当的诱导细胞生长的效果，而本发明的诱导成骨多肽由于具有较强的骨诱导活性、能够大规模合成和价格较低的优点，从而相比BMP-2具有广阔的市场前景。
本发明为一种诱导成骨多肽，其结构式为KIPKASSVPTE LSAISTLYLCC。

Claims (3)

1.诱导成骨多肽，其特征在于其结构式为KIPKASSVPTE LSAISTLYLCC。
2.制备权利要求1的诱导成骨多肽的方法，其特征在于采用多肽合成仪通过 FMOC/tBu 固相多肽合成法合成。
3.权利要求1的诱导成骨多肽在制备用于促进骨再生药物的用途。
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