CN115845141A

CN115845141A - 一种干态羊膜的制备方法及应用

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Publication number: CN115845141A
Application number: CN202310187395.XA
Authority: CN
Inventors: 林永亮; 罗锦荣; 何海娜; 吴有陵; 刘艳丽
Original assignee: Geneway Chengdu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Geneway Chengdu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-02
Filing date: 2023-03-02
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2043-03-02
Also published as: CN115845141B

Abstract

本发明属于医用材料技术领域，提供一种干态羊膜的制备方法及应用，其制备步骤包括：增韧处理、增厚及亲水处理、促进组织再生处理和干燥处理等。本发明提供的干态羊膜的制备方法，醇溶液保护下的冷冻干燥处理可以提供氢键作用，更好维持天然湿态羊膜的柔韧性、减少水的结晶对冻干过程中羊膜材料结构的破坏。本发明制备的羊膜具有增强的缝合强度，方便手术缝合；增加厚度及亲水性，便于术中贴合创面；更强的促进组织再生性能；维持天然湿态羊膜的柔韧性和羊膜中生长因子和胶原蛋白的活性等特点，且可以室温下长期保存及运输。

Description

一种干态羊膜的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，尤其涉及一种干态羊膜的制备方法及应用。

背景技术

爬行类、鸟类、哺乳类等动物，在胚胎发育早期，从胚胎四周的表面开始，形成了围绕胚胎的胚膜，胚膜的内层，叫羊膜。羊膜为单层上皮细胞互相连接构成的薄膜，是一层半透明的薄膜，与覆盖在胎盘、脐带的羊膜层相连接。

人体羊膜为人体胎盘的最内层，含有上皮细胞，光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02～0.5mm。人体羊膜在伤口护理方面具有广阔的临床应用，包括眼科、骨科及口腔科的伤口管理及术后修复。羊膜可阻止白细胞浸润，抑制多种蛋白酶的活性，通过抑制相应的蛋白酶，从而减轻炎症程度、缩短炎症持续时间；羊膜还含有丰富的溶解酶、裂解体和补体，可以抑制炎症反应。

现有羊膜产品主要包括湿态羊膜及冷冻干燥羊膜。湿态羊膜的优点是柔软性较好，术中可以较好地贴合创面，缺点是需要低温保存、冷链运输。冷冻干燥羊膜的优点是可以常温保存，缺点是材料较脆，在包装、储存、运输及使用过程中易出现破裂的情况；其在临床使用前需进行复水操作，且即使复水后羊膜难以恢复原有新鲜状态，很难完全贴合创面。此外，现有冷冻干燥羊膜在亲水性、促进组织再生性能及抵抗辐照损坏方面仍存在不足。

中国专利201610303279.X记载了一种易保存生物羊膜的制备方法，说明书中公开了其处理步骤包括将羊膜清洗酶解，过滤后加入甘油浸泡，并用生理盐水冲洗，得粗生物羊膜，之后取壳聚糖和无菌水，混合加入磷酸溶液，茶多酚、酪蛋白以及过硫酸铵，再次混合加热并加入甲壳素，得混合液，随后将得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通过微波反应，冲洗过滤，置于无菌净化间自然晾干，从而得到易保存生物羊膜的制备方法。这种方法可以一定程度提升羊膜的缝合强度，但强度、厚度以及促进再生能力等仍有进一步提升的必要性。

综上所述，亟需开发一种新型干态羊膜，以克服现有技术的不足，更大程度满足临床需求。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种干态羊膜的制备方法及应用，旨在克服现有技术的不足，更大程度满足临床需求；本发明提供的干态羊膜的制备方法，醇溶液保护下的冷冻干燥处理可以提供氢键作用，更好维持天然湿态羊膜的柔韧性、减少水的结晶对冻干过程中羊膜材料结构的破坏。本发明制备的羊膜具有增强的缝合强度，方便手术缝合；增加厚度及亲水性，便于术中贴合创面；更强的促进组织再生性能；维持天然湿态羊膜的柔韧性和羊膜中生长因子和胶原蛋白的活性等特点，且可以室温下长期保存及运输。

解决以上技术问题的本发明中的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）增韧处理：将新鲜羊膜与含有A-B结构单元的化合物进行第一步反应，实现在新鲜羊膜上引入碳碳双键结构单元；随后将含有碳碳双键结构单元的羊膜与含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物C在引发剂的参与下进行第二步反应，同时实现小分子与生物大分子与人体羊膜的化学结合实现增韧；其中所述新鲜羊膜为人体羊膜，以及猪、牛的羊膜。

（2）增厚及亲水处理：将羊膜浸泡于亲水大分子物质溶液中增厚；

（3）促进组织再生处理：将羊膜浸泡于促进组织再生物质溶液中进行处理，使具有更强的促进组织再生性能；

（4）干燥处理，在醇溶液中梯度脱水后进行干燥处理；

（5）辐照灭菌：将(4)步骤处理后的干态羊膜，采用电离辐射灭菌处理，即得到干态羊膜产品。所述的辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为 20KGy～30kGy，辐照时间为18h～30 h。

所述增韧处理中A-B结构单元的A为伯胺反应基团，B为碳碳双键结构单元，其中A为伯胺反应基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸酯及环氧基中的一种或几种，B为丙烯酸或甲基丙烯酸；

优化方案中所述含有A-B结构单元的化合物为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯或甲基丙烯酸环氧丙酯中的一种。

所述增韧处理中将新鲜人体羊膜与含有A-B结构单元的化合物反应，A-B结构单元的化合物质量浓度为1%～5%，第一步反应温度为4℃～37℃，反应时间为2h～48h。

所述C为含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物，其中大分子的分子量为10KDa-100KDa，如明胶甲基丙烯酸酯；小分子的分子量小于200Da，如丙烯酸。

所述第二步反应温度为4℃～37℃，反应时间为2h～48h，以C总量计，小分子和大分子质量浓度范围均为2%～10%。

所述添加引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物，其混合物质量浓度范围为0.1%～1%，优化方案中硫酸铵和亚硫酸氢钠质量浓度比为1：1，引发剂可以引发碳碳双键之间的聚合反应。

所述增厚及亲水处理中亲水大分子物质质量浓度为10%～30%，反应温度为48℃～52℃，反应时间为1h～3h；所述亲水大分子物质包括明胶、透明质酸钠或硫酸软骨素一种或几种。

所述促进组织再生物质为HC-HA/PTX3复合物（Heavy chain (HC)-hyaluronan(HA)/pentraxin 3 (PTX3)，即重链(HC)-透明质酸(HA)/ 正五聚蛋白3 (PTX3) 复合物）。

促进组织再生处理中HC-HA/PTX3复合物质量浓度为1%～5%，反应温度为3℃～5℃，反应时间为1h～3h；

所述步骤（4）中干燥处理方式包括但不限于冷冻干燥、真空干燥、风干或吸水纸吸干；优化方案中将经过辐照处理的羊膜在醇溶液中梯度脱水后进行干燥，得到干态人体羊膜。

所述干燥处理中在醇溶液中梯度脱水，醇溶液为乙醇和丙三醇，优选的梯度脱水方式为50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇混合溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇混合溶液2h。

进一步优选地，所述干燥处理为冷冻干燥，冷冻温度为﹣38℃～﹣42℃，干燥时间为48h～72h。

本发明所述制备方法制得的干态羊膜相比于现有冷冻干燥羊膜的效果如下：

（1）具有增强的缝合强度，方便手术缝合；

本发明中增韧处理中使用的“含有碳碳双键结构单元的人体羊膜与含碳碳双键结构单元的小分子（分子量小于200Da）及生物大分子（分子量为10KDa～100KDa）的混合物”，含碳碳双键结构单元的小分子物质（分子量小于200Da）在羊膜的空隙中易于渗透及扩散，含碳碳双键结构单元的生物大分子（分子量为10KDa～100KDa）能够在羊膜表面发挥物理缠绕的作用，同时使用这两种物质与含有碳碳双键结构单元的羊膜发生共同聚合化学反应，有效地提高了羊膜的韧性，即缝合强度。且这种处理方案相比于单独使用一种含碳碳双键结构单元的小分子或生物大分子，其增韧效果有大幅提升。

（2）增加厚度及亲水性，便于术中贴合创面；

（3）更强的促进组织再生性能；

（4）醇溶液保护下的冷冻干燥处理可以提供氢键作用更好维持天然湿态羊膜的柔软性、减少水的结晶对冻干过程中羊膜材料结构的破坏、维持羊膜中生长因子和胶原蛋白的活性；

（5）终端辐照灭菌，保证最终制备得到的干态羊膜的无菌水平及病毒灭活效果，极大地提高了临床使用的安全性。

本发明中方法制备的干态羊膜应用，可在眼科手术、皮肤缺损修复、肌腱修复及防黏连、脊柱手术中抑制感染和炎性反应，减少瘢痕形成和保护暴露的神经根的应用。制备的干态羊膜可以室温下长期保存及运输。

附图说明

图1为本发明中制备方法反应示意图；

图2为本发明中缝合强度测试对比图；

图3为本发明中厚度测试对比图；

图4为本发明中亲水性测试对比图；

图5为本发明中促进组织再生性能测试对比图；

图6为本发明中辐照保护效果测试对比图；

图7为本发明中羊膜对比图。

（注：左图作为对照例1即采用常规冷冻干燥方法制备得到的羊膜，呈现出较大脆性；右图为采用本发明中优选实施例制备得到的羊膜，呈现出良好的韧性）

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明中做进一步的阐述：

干态羊膜的制备步骤中：

（1）增韧处理：将新鲜羊膜与含有A-B结构单元的化合物进行第一步反应，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元；随后将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜与含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物C在引发剂的参与下进行第二步反应，同时实现小分子与生物大分子与人体羊膜的化学结合，实现增韧，如图1中内容所示。

增韧处理中A为伯胺反应基团，B为碳碳双键结构单元，其中A为伯胺反应基团，具体包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸酯及环氧基， B为丙烯酸、甲基丙烯酸；C为含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物，其中大分子的分子量为10KDa-100KDa，如明胶甲基丙烯酸酯；小分子的分子量小于200Da，如丙烯酸。

其中，含有A-B结构单元的化合物为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯或甲基丙烯酸环氧丙酯中的一种，其结构式分别如下：

增韧处理中将新鲜羊膜与含有A-B结构单元的化合物进行第一步反应，A-B结构单元的化合物质量浓度为1%～5%。

增韧处理中含碳碳双键结构单元的分子量小于200Da的小分子，包括丙烯酸，其结构式如下：

，

增韧处理中含碳碳双键结构单元的分子量为10KDa～100KDa的生物大分子，为明胶甲基丙烯酸酯，其结构式如下：

增韧处理中在引发剂参与的条件下进行第二步反应，小分子和生物大分子质量浓度均为2%～10%。

具体实施例如下：

实施例1

如图1中所示，一种干态羊膜的制备方法，步骤如下：

（1）增韧处理：

配制质量浓度为1%的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液，采用绷板固定新鲜人体羊膜以保持其平整，随后与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液反应，反应温度为4℃，反应时间为2h，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元。随后在生理盐水中清洗，备用。

分别配制质量浓度为4%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为2%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。小分子丙烯酸能够有效渗透扩散进入羊膜，生物大分子明胶甲基丙烯酸酯能够在人体羊膜表面发挥物理缠绕的作用，同时实现小分子与生物大分子与人体羊膜的化学结合，可以实现增韧。

（2）增厚及亲水处理：将羊膜浸泡于质量浓度为10%的明胶水溶液中，反应温度为50℃，反应时间为2h。

（3）促进组织再生处理：

将羊膜浸泡于质量浓度为1%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为4℃，反应时间为2h。原材料经过这一步处理，使膜在后续临床使用过程中，具备促进再生的功能。

（4）干燥处理：

将步骤（3）中处理后的人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为48h，得到干态人体羊膜。

（5）辐照灭菌：将(5)步骤处理后的干态羊膜，采用电离辐射灭菌处理（剂量为25kGy，辐照时间为24h），即得到干态羊膜产品。

实施例2

一种干态羊膜的制备方法，步骤如下：

（1）增韧处理：

配制质量浓度为2%的甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯水溶液，采用绷板固定新鲜人体羊膜以保持其平整，随后与甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯水溶液反应，反应温度为5℃，反应时间为4h，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元。随后在生理盐水中清洗，备用。

分别配制质量浓度为4%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为2%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜进入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为5℃，反应时间为4h。得到增韧的人体羊膜。

（2）增厚及亲水处理：

将人体羊膜浸泡于质量浓度为15%的明胶水溶液中，反应温度为48℃，反应时间为3h。

（3）促进组织再生处理：

将人体羊膜浸泡于质量浓度为2%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为3℃，反应时间为3h。

（4）干燥处理：

将步骤（3）中处理后的人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣38℃，干燥时间为50h，得到干态人体羊膜。

（5）辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为20kGy，辐照时间为30 h。

实施例3

一种干态羊膜的制备方法，包括步骤：

（1）增韧处理

配制质量浓度为5%的甲基丙烯酸环氧丙酯水溶液，采用绷板固定新鲜人体羊膜以保持其平整，随后与甲基丙烯酸环氧丙酯水溶液反应，反应温度为4℃，反应时间为2h，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元。随后在生理盐水中清洗，备用。

分别配制质量浓度为8%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为4%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.4%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）增厚及亲水处理

将人体羊膜浸泡于质量浓度为10%的明胶水溶液中，反应温度为50℃，反应时间为2h。

（3）促进组织再生处理

将人体羊膜浸泡于质量浓度为1%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（4）干燥处理

（5）辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为30kGy，辐照时间为18 h。

实施例4

一种干态羊膜的制备方法，包括步骤：

（1）增韧处理

配制质量浓度为4%的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液，采用绷板固定新鲜人体羊膜以保持其平整，随后与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液反应，反应温度为4℃，反应时间为2h，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元。随后在生理盐水中清洗，备用。

分别配制质量浓度为10%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为5%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）增厚及亲水处理

（3）促进组织再生处理

（4）干燥处理

将步骤（3）中处理后的人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣42℃，干燥时间为60h，得到干态人体羊膜。

（5）辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为28kGy，辐照时间为20 h。

实施例5

一种干态羊膜的制备方法，包括步骤：

（1）增韧处理

配制质量浓度为5%的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液，采用绷板固定新鲜人体羊膜以保持其平整，随后与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺水溶液反应，反应温度为4℃，反应时间为2h，实现在新鲜人体羊膜上引入碳碳双键结构单元。随后在生理盐水中清洗，备用。

分别配制质量浓度为16%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量50KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为8%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）增厚及亲水处理

（3）促进组织再生处理

将人体羊膜浸泡于质量浓度为2%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（4）干燥处理

将步骤（3）中处理后的人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为72h，得到干态人体羊膜。

（6）辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为22kGy，辐照时间为27 h。

实施例6

一种干态羊膜的制备方法，包括步骤：

（1）增韧处理

分别配制质量浓度为20%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量100KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为10%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）增厚及亲水处理

（3）促进组织再生处理

将人体羊膜浸泡于质量浓度为5%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（4）干燥处理

（5）辐照灭菌处理，电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为24kGy，辐照时间为25 h。

实施例7

其它结构如实施例1中内容，新鲜羊膜为牛羊膜，其中增韧处理中第一步反应温度为37℃，反应时间为6h，含A-B结构单元物质溶液质量浓度为3%；增韧处理中第二步反应，反应温度为37℃，反应时间为10h，小分子和生物大分子以C总量为计，质量浓度均为6%，引发剂为质量浓度为1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。

增厚及亲水处理中亲水大分子物质质量浓度为30%，反应温度为52℃，反应时间为1h；亲水大分子物质为透明质酸钠溶液。

促进组织再生处理中HC-HA/PTX3复合物质量浓度为5%，反应温度为5℃，反应时间为1h。

干燥处理中方式为真空干燥。

实施例8

其它内容如实施例1中，新鲜羊膜为猪羊膜，其中增韧处理中第一步反应温度为20℃，反应时间为20h，含A-B结构单元物质溶液质量浓度为4%；第二步反应，反应温度为20℃，反应时间为15h，小分子和生物大分子以C总量为计，质量浓度均为7%，引发剂为质量浓度为0.5%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。

增厚及亲水处理中亲水大分子物质质量浓度为20%，反应温度为50℃，反应时间为3h；亲水大分子物质为硫酸软骨素溶液。

促进组织再生处理中HC-HA/PTX3复合物质量浓度为3%，反应温度为4℃，反应时间为1h。

干燥处理中为风干或吸水纸吸干。

对比例1

对比例1为现有常规的冷冻干燥方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

将新鲜人体羊膜进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为72h，得到干态人体羊膜。

对比例2

对比例2为参考申请号为201610303279.X的专利《一种易保存生物羊膜的制备方法》所公开的方法制备的干态羊膜。步骤如下：

首先取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23KHz下振荡50min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7 .0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30℃下酶解5h；待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于4℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5次，得粗生物羊膜，备用；随后按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4 .5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30％，搅拌均匀并静置10min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50％的茶多酚、壳聚糖质量1％的酪蛋白及酪蛋白质量1％的过硫酸铵；最后在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50℃，以150r/min搅拌4h后，向其中加入上述壳聚糖质量2％的甲壳素，搅拌均匀，将上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。

对比例3

对比例3为采用 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

将新鲜人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为48h，得到干态人体羊膜。

对比例4

对比例4为“增韧处理”中仅含有一种分子量小于200Da的小分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

（1）增韧处理

配制质量浓度为4%的丙烯酸的水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）干燥处理

将步骤（1）中增韧处理后的人体羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为48h，得到干态人体羊膜。

对比例5

对比例5为“增韧处理”中仅含分子量为10～100KDa的生物大分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

（1）增韧处理

配制质量浓度为4%的明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入明胶甲基丙烯酸酯水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。

（2）干燥处理

对比例6

对比例6为“增韧处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

（1）增韧处理

分别配制质量浓度为4%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯（分子量10KDa）的水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为2%的丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液。分别配制质量浓度为0.2%的硫酸铵及亚硫酸氢钠引发剂水溶液，随后将两种水溶液混合并搅拌均匀，得到质量浓度为0.1%的硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液。将含有碳碳双键结构单元的人体羊膜浸入丙烯酸及明胶甲基丙烯酸酯的混合水溶液，随后加入引发剂硫酸铵及亚硫酸氢钠混合水溶液，引发聚合反应，反应温度为4℃，反应时间为2h。得到增韧的人体羊膜。小分子丙烯酸能够有效渗透扩散进入羊膜，生物大分子明胶甲基丙烯酸酯能够在人体羊膜表面发挥物理缠绕的作用，同时实现小分子与生物大分子与人体羊膜的化学结合，可以实现增韧。

（2）干燥处理

对比例7

对比例7为“增厚及亲水处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

（1）增厚及亲水处理

将新鲜羊膜浸泡于质量浓度为10%的明胶水溶液中，反应温度为50℃，反应时间为2h。

（2）干燥处理

对比例8

对比例8为“促进组织再生处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

（1）促进组织再生处理

将新鲜人体羊膜浸泡于质量浓度为1%的HC-HA/PTX3复合物水溶液中，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（2）干燥处理

将羊膜在醇溶液中梯度脱水，即在室温下（25℃）依次浸入50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇溶液2h。取出后沥干，随后进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为48h，得到干态人体羊膜。

对比例9

对比例9为“干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。步骤如下：

试验例1 缝合强度测试

本测试包含以下材料：实施例1-6及对比例1-9。

其中，实施例1-6为采用本发明所述的5个步骤处理制备得到的干态人体羊膜。对比例1为现有常规的冷冻干燥方法制备的干态羊膜。对比例2为参考申请号为201610303279.X的专利《一种易保存生物羊膜的制备方法》所公开的方法制备的干态人体羊膜。对比例3为采用 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例4为“增韧处理”中仅含有一种分子量小于200Da的小分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例5为“增韧处理”中仅含分子量为10～100KDa的生物大分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例6为“增韧处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例7为“增厚及亲水处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例8为“促进组织再生处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例9为“干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。

测试方法：将样品裁成22 mm×3 mm的矩形用于缝合强度测试（n=6）。用测厚仪测量每个样品的厚度。将每个组织样品的一侧固定于拉力试验机（BioTester, 10 N负载；CellScale，加拿大）的一个夹具上，用针将缝线（聚丙烯单丝4-0）穿过距离另一端边缘0.5cm左右的位置，并将缝线固定于其对面的夹具上。对样品施加恒定的速率10 mm/min拉伸直至缝线被拉出，得到将缝线拉出所需要的力，用样品的厚度和宽度计算出横截面积，最后算得峰值时的应力。

实验结果表明，如表1和图2所示：

表1：

，

相比于对比例1-9，实施例1-6中的干态人体羊膜缝合强度有大幅提高，且增韧处理中使用的“含有碳碳双键结构单元的人体羊膜与含碳碳双键结构单元的分子量小于200的小分子及分子量为10～100KDa的生物大分子的混合物”，相比于单独使用一种含碳碳双键结构单元的小分子（对比例4）或生物大分子（对比例5），其增韧效果有大幅提升。

也从外出特征来看，如图7所示羊膜对比图，对照例1即采用常规冷冻干燥方法制备得到的羊膜，呈现出较大脆性；采用本发明中优选实施例制备得到的羊膜，呈现出良好的韧性。

试验例2 厚度测试

本测试包含以下材料：实施例1-6及对比例1-9。

其中，实施例1-6为采用本发明所述的5个步骤处理制备得到的干态人体羊膜。对比例1为现有常规的冷冻干燥方法制备的干态羊膜。对比例2为参考申请号为201610303279.X的专利《一种易保存生物羊膜的制备方法》所公开的方法制备的干态人体羊膜。对比例3为采用 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例4为“增韧处理”中仅含有一种分子量小于200的小分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例5为“增韧处理”中仅含分子量为10～100KDa的生物大分子及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例6为“增韧处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例7为“增厚及亲水处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例8为“促进组织再生处理”及 “干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。对比例9为“干燥处理”方法制备的干态人体羊膜。

测试方法：用测厚仪测量每个样品的厚度。裁剪材料为5cm*5cm正方形大小（n=6）。因膜片材料存在厚度不均匀的问题，为避免测量数据因测量位置不一致而导致前后数据出现较大的偏差，选取四个测量位点，尽可能保证前后测试位点一致。测厚仪停顿1~2s，记录较为稳定的数值。

实验结果表明，如表2和图3所示：

表2：

，

相比于对比例1-9，实施例1-6中的干态羊膜厚度有大幅提高，且与“增厚及亲水处理”及 “干燥处理”方法制备的干态羊膜（对比例7）接近。

试验例3 亲水性测试

本测试包含以下材料：实施例1-6及对比例1-9。

测试方法：将材料裁剪为直径1cm的圆片（n=6）并用去离子水清洗3次，将干燥样品用双面胶将样品粘贴于干净载玻片上（光滑面向上），之后使用水接触角测试仪检测并表征干燥样品的表面水接触角。

实验结果表明，如表3和图4所示：

表3：

，

相比于对比例1-9，实施例1-6中的干态羊膜的水接触角，即亲水性有大幅提高，且与“增厚及亲水处理”及 “干燥处理”方法制备的干态羊膜（对比例7）接近。

试验例4 促进组织再生性能测试

本测试包含以下材料：实施例1-6及对比例1-9。

测试方法：将样品（n=6）裁剪后放进48孔板中，将不锈钢环放在样品顶部，防止样品漂浮。向每孔中加入500 mL 表皮细胞悬液（40,000个/mL）。在细胞培养箱中孵化3天。接种48h后，将预期培养3天的样品上清液替换为完全培养基。培养完毕后，用PBS冲洗样品3次，每次5分钟。随后加入200 mL含有10%CCK-8试剂的完全培养基，在细胞培养箱中孵化1h。随后检测培养基在450 nm处的吸光度。吸光度高表明存活细胞数量多。

实验结果表明，如表4和图5所示：

表4：

，

相比于对比例1-9，实施例1-6中的干态羊膜表皮细胞增值率，即促进组织再生性能有大幅提高，且与“促进组织再生处理”及 “干燥处理”方法制备的干态羊膜（对比例8）接近。

试验例5 辐照保护效果测试

本测试包含以下材料：实施例1-6及对比例1-9。

测试方法：将材料（n=6）置于γ-射线辐照箱中，辐照剂量为25kGy。待辐照完成后，取出材料并按照测试例1所述的缝合强度测试方法测试材料的辐照保护效果，即计算辐照后缝合器强度的下降百分比。

实验结果表明，如表5和图6所示：

表5：

，

相比于对比例1-9，实施例1-6中的干态羊膜辐照后缝合强度下降百分比较小，与“干燥处理”方法制备的干态羊膜（对比例9）接近。

试验例6 干态羊膜在皮肤缺损中的应用

选择国际标准实验动物纯种健康新西兰白兔12只，雌雄不限，体重2.5~3.0 kg。随机分为2个处理组：实验组植入本发明实施例1制备的样品，对照组为凡士林油纱组。

具体实验步骤如下：

术前用8%硫化钠溶液背部脱毛，2%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，背部术野皮肤消毒，铺巾。在背部中线两侧制作2×2cm正方形全层皮肤缺损，左侧为实验组，创面植本发明实施例4制备的样品18，右侧为对照组，创面覆盖凡士林油纱。术毕，包扎固定。

术后观察：术后1W、2W、3W、4W观察创面愈合情况，测量伤口大小，计算伤口愈合率。术后4W取愈合区组织用病理学观察。

创面愈合率＝愈合面积／原创面面积×100

创面愈合率两组间采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

结果如下：

对照组：伤后1W均见较多渗出物及不同程度坏死物，2W可见深红色痂皮，3W创面明显缩小，痂皮变小、色淡，4W伤口愈合。

实验组：伤后创面与人工皮肤紧密贴合，创面少许渗液及积血，1W时无渗出，2W创面明显缩小，3W伤口表面小许痂皮，愈合组织可见大量被毛生长，4W伤口完全愈合，表皮有毛长生长，详见表6和表7：

表6平均创面愈合时间(n=32)：

，

；

表7实验组和对照组创面愈合率比较：

，

，/>

；

从上述结果可以看出，本发明提供的干态羊膜的生物相容性好，无免疫排斥性，无毒无菌，跟传统的油纱相比较，可以加快创面组织愈合，减少疤痕形成，并能部分使创面皮肤组织完全再生。

试验例7 干态羊膜在肌腱修复中的应用

选择国际标准实验动物纯种健康新西兰白兔60只，雌雄不限，体重2.5~3.0 kg。随机分为3个处理组：实验组植入本发明实施例3制备的样品，对照组1为聚乳酸膜组，对照组2为空白对照组。

兔趾肌腱动物模型具体实验步骤：

（1）实验分组

羊膜实验组：取20只新西兰大白兔（2±0.5kg）采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，大白兔放入固定盒中将兔子左肢伸出固定盒外，用剃须刀将兔左后肢毛除尽后，用碘伏进行消毒处理。手术部位为兔中指屈指肌腱，用手术刀在手术部位行纵切口，找出屈指肌腱，用血管钳挑起后，手术剪造缺损（宽度约为肌腱的1/2），缺损的肌腱采用Bunnell缝合方式缝合，所用的缝合线为5-0单股聚丙烯缝合线，缝合后用本公司制备的生物羊膜，对缝合处进行缠绕包裹。清理止血后采用4-0丝线对外部伤口进行缝合。最后采用石膏将手术肢固定3周。

聚乳酸膜组：取20只新西兰大白兔手术方法与实验组手术方法相同，肌腱缝合后用聚乳酸防黏连膜包裹缝合处后对外周伤口缝合、石膏固定。

空白对照组：取20只新西兰大白兔手术方法与实验组手术方法相同，只是将肌腱缝合完后直接对外周伤口进行缝合，石膏固定。

以上操作均使用无菌手术器械，严格按照临床手术要求进行。术后3天内对实验动物注射头孢唑林（40mg/天）抗菌，注射carprophen（4mg/kg）减轻疼痛感。每天观察实验兔子的精神状态及活动情况。

（2）术后取材

术后3周拆除所有试验兔子的石膏，观察其自由活动的情况，特别是手术肢的活动情况，并且对手术趾进行手动的牵拉，在牵拉的过程中感觉趾的伸缩阻力，与正常趾是否有明显差异。

术后3周、6周分别从羊膜实验组、聚乳酸膜组与空白对照组中随机抽选10只兔进行取材观察，先用手术刀片将手术部位划开，大体观察肌腱的粘连情况，并采用前述评价方法对粘连程度进行评价及统计学分析。耳缘静脉注射空气20 mL 处死动物，立即取出手术部肌腱，使用电子万能试验机（型号：RGM-6002T）对各组样品进行拉伸强度测试，以5 mm/min 速度对试样施加拉力。样品破坏后，计算机自动输出各组标本的弹性模量数据，评价肌腱生物力学特征。

（3）肌腱的粘连情况观察和统计分析结果

表8兔趾肌腱术后整体粘连程度评分结果：

，

表9 有效率分析，采用卡方检验：

，

预防兔趾屈肌腱断裂修复后屈肌腱与周围组织粘连，通过采用兔趾模型进行羊膜组、聚乳酸膜组以及空白对照组的有效性对比研究，结果表明羊膜组表现出最佳的防粘连的效果。经卡方检验，羊膜组防兔趾屈肌腱粘连有效率为100.00%（20/20），聚乳酸膜组防兔趾屈肌腱粘连有效率为85.00%（17/20），空白对照组防兔肌腱粘连有效率为20.00%（4/20）。羊膜组分别与聚乳酸膜组以及空白对照组的有效率均存在显著性差异（P<0.05）。

（4）拉伸实验分析结果显示，各个观察时间点羊膜组和聚乳酸膜组以及空白对照组肌腱弹性模量均得到明显改善。术后第3周，羊膜实验组肌腱弹性模量（最大断裂荷载量）明显优于聚乳酸膜组和空白对照组(P<0.05）；术后第6周，羊膜组和聚乳酸膜组以及空白对照组样本弹性模量未见显著差异。说明羊膜在修复早期即可有效提高损伤肌腱的抗拉伸强度，羊膜组表现出最佳的肌腱修复效果（详见表10）。

表10肌腱生物力学特征结果：

，

羊膜组分别与聚乳酸膜组、空白对照组比较，

；

试验例8 干态羊膜在脊柱手术中的应用

选成年新西兰兔60只，体重2.0~3.0 kg，雌雄不拘。依据椎板缺损处硬膜外覆盖物的不同，将60只白兔随机分为干态羊膜组、聚乳酸膜组和空白对照组，每组20只。

无菌操作下取后正中切口长约20mm，逐层切开，剪去L5 棘突，用微型椎板咬骨钳咬除L5 椎板，造成10mm×5mm的硬脊膜裸露区，去除硬膜外脂肪。彻底止血后，根据术前随机分组，在硬膜外分别覆盖干态羊膜（实施例6制备的样品）和聚乳酸膜，无任何间置物覆盖组作为空白对照组。所有动物术后同等条件下分笼饲养，不服任何药物。

观察内容和方法：

标本收集处理各组分别于术后2、4、8、12周时各处死5只，动物处死后完整取出包括骶棘肌及椎体附件在内的L5 段脊柱，福尔马林溶液固定后行石蜡包埋切片，厚度5μｍ。分别对组织切片行HE、Masson和苦味酸-天狼猩红染色。

光学显微镜观察在普通光学显微镜下观察硬膜外瘢痕分布及与硬膜和神经根的关系；

计算机图像分析(Axiioplan2 image, 美国)计算出不规则形态的瘢痕横切面面积，将其与椎管面积的比值作瘢痕指数测定。

统计学分析采用方差分析和ｑ检验。

结果：

通过普通显微镜观察，术后2周空白组硬膜外有大量的肉芽组织填充缺损，由背侧向椎管侧方延伸,有的达神经根部。聚乳酸膜组和羊膜组肉芽组织和成纤维细胞增生不活跃，羊膜片基质及基底膜肿胀疏松，有少许成纤维细胞和炎性细胞浸润。术后4周空白组胶原纤维增多，部分成纤维细胞转化为纤维细胞，毛细血管减少，聚乳酸膜组和羊膜组成纤维细胞较少，胶原纤维稀少，硬膜外间隙存在。羊膜与其后方纤维组织相融合，结构模糊，与硬膜间无粘连；胶原密度低,无明显炎性反应。8周时肉芽组织纤维化，空白组胶原致密，硬膜与瘢痕粘连，并见骨组织在原椎板缺损处形成，它与硬膜间有瘢痕存在。聚乳酸膜组胶原密度低，无明显炎症反应；硬膜外瘢痕少，与硬膜无粘连；聚乳酸膜降解成红染无结构小碎片。术后12周时空白组可见大量胶原纤维,排列紧密紊乱；细胞成分基本消失，硬膜与瘢痕粘连致密，并与新生椎板相连。羊膜组术后8周及12周，瘢痕面积缩小，细胞成分稀少，新生骨板下硬膜表面无粘连，部分标本有硬膜外脂肪再生，羊膜片被胶原取代。

微机图像处理系统计算侵入椎管内瘢痕面积与整个椎管面积的比值,测量3张切片，取其均值，计算椎管内相对瘢痕指数。2周内椎板缺损处修复以肉芽组织形成为主，胶原纤维较少，瘢痕指数差异不显著(Ｐ>0.05)。4周时胶原纤维增多，瘢痕初步形成，羊膜组数值最小，显示了干态羊膜预防粘连作用(Ｐ<0.01)。8周时聚乳酸膜逐步膨胀为凝胶，发挥其预防粘连特性，但仍较羊膜组差(Ｐ<0.01)。12周时羊膜组和聚乳酸膜组瘢痕指数都较空白组小(Ｐ<0.01)，但两组间差异有显著性(Ｐ<0.05)(见表11)。

表11 干态羊膜不同时间相对瘢痕指数比较（n=5；

；%）：

，

ｑ检验：干羊膜组与空白组比较

；与聚乳酸膜比较/>

，

。

从上述试验结果可以发现，本发明提供的干态羊膜在脊柱手术中通过抑制感染和炎性反应，减弱炎性介质的释放，减少局部成纤维细胞浸润、减少瘢痕形成、预防粘连，对暴露的神经根起到保护作用。

试验例9 干态羊膜在眼科手术中的应用

建立动物模型：取20只新西兰兔（2±0.5kg）采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，右眼向上侧身固定，用剃须刀去除右眼周围绒毛和睫毛，用碘伏进行消毒处理。用奥布卡因对眼表进行局部麻醉，干滤纸吸去角膜上多余水分，用浸润了浓度为1mol/L的H2SO4溶液的直径约6 mm的单层圆形滤纸,贴附于角膜中央区域表面，计时30秒除去滤纸。用干滤纸吸去角膜上多余酸液后用大量生理盐水冲洗 5 min。造模一周后观察创面愈合情况，去除烧伤较轻已自愈和过重烧伤角膜全层的模型，取中轻度烧伤。自身修复能力不能使创面愈合的16个模型用于修复实验。

手术方法：手术操作均使用无菌手术器械，严格按照临床手术要求进行。

（1）羊膜实验组

随机取8只烧伤模型（2±0.5kg）采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，前后肢用绳子固定，手术洞巾包裹实验兔全身，用电动剃须刀将兔右眼周围绒毛去除干净，用碘伏进行消毒处理，尽量减少对手术过程和后期角膜修复的影响。手术部位为角膜酸烧伤模型创面区域，在显微镜下首先对受损部位进行清创，用宝石刀将坏死的角膜上皮、组织彻底清理干净。取实施例6制备的干态羊膜，置于无菌生理盐水浸泡，复水30～40min，然后将羊膜（上皮面向上）平铺覆盖在整个角膜表面，接下来在整个角膜上（覆盖羊膜）覆盖一层隐形眼镜，将多余羊膜材料翻起包裹隐形眼镜边缘作为保护，防止缝线拉裂隐形眼镜。用10-0尼绒线“米”字型缝合固定隐形眼镜8针。术后两周酌情更换羊膜材料，第四周后均完全去除羊膜及隐形眼镜。

（2）空白对照组

取其余8只烧伤模型，手术方法与实验组手术方法相同，不使用生物羊膜，术后同样覆盖隐形眼镜保护创面，其余操作及后期护理与实验组相同。

术后评价：观察并拍照记录如下评价项目。

（1）每天观察实验兔子的精神状态及活动情况、观察角膜修复情况。

（2）动物实验评价标准：整体观察角膜修复后的形态，按照下表分类对动物实验中角膜的修复情况进行评价，如下表12。

表12：

，

（参考全国眼外伤职业眼病学组的分度标准，以及Roper—Hall对眼部化学损伤程度的分级）

评价指标为0-1级为有效，2-4级为无效，整体有效性评价时单项无效即判定无效，评价后对所有数据进行统计学分析。

（3）采用上述“动物实验评价标准”评价方法，于术后1周、4周、8周观察空白对照组和羊膜实验组的角膜浑浊度及角膜新生血管情况。于4周和8周对空白对照组和羊膜实验组进行荧光素钠染色，观察角膜上皮缺损面积。综合评估生物羊膜修复眼表的安全性和有效性。

结果分析：

（1）术后血管化评分结果，如下表13：

表13：

，

（2）术后瘢痕化评分结果，如下表14：

表14：

，

（3）术后上皮化评分结果，如下表15：

表15：

，

（4）有效率分析，如下表16：

表16：

，

通过采用兔角膜酸烧伤模型进行羊膜组与空白组的有效性对比研究，结果表明，本发明提供的干态羊膜组能较好辅助修复角膜中轻度酸烧伤，术后8周评价结果与空白组存在显著性差异（P<0.05）。

经卡方检验，本发明提供的干态羊膜修复角膜酸烧伤有效率为87.5%（7/8），空白对照组有效率为25%（2/8），实验组（羊膜组）有效率空白对照组存在极显著差异（P<0.05）。

上述实施/试验例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）增韧处理：将新鲜羊膜与含有A-B结构单元的化合物进行第一步反应，然后将含有碳碳双键结构单元的羊膜与含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物C在引发剂的参与下进行第二步反应；

（3）促进组织再生处理：将羊膜浸泡于促进组织再生物质溶液中进行处理；

（4）干燥处理：在醇溶液中梯度脱水后进行干燥处理；

（5）辐照灭菌：将(4)步骤处理后的干态羊膜，采用电离辐射灭菌处理，即得到干态羊膜产品。

2.根据权利要求1所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述A-B结构单元中A为伯胺反应基团，B为碳碳双键结构单元，优化方案中所述A为N-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸酯和环氧基中的一种或几种，B为丙烯酸或甲基丙烯酸；

进一步优化方案中，所述含有A-B结构单元的化合物为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯或甲基丙烯酸环氧丙酯中的一种；所述A-B结构单元的化合物质量浓度为1%～5%，第一步反应温度为4℃～37℃，反应时间为2h～48h。

3.根据权利要求2所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述C中含碳碳双键结构单元的分子量小于200Da的小分子，优化方案中为丙烯酸；所述含碳碳双键结构单元的分子量为10KDa～100KDa的生物大分子，优化方案中为明胶甲基丙烯酸酯；进一步优化方案中，以C总量计，所述生物大分子与小分子质量浓度范围均为2%～10%，第二步反应温度为4℃～37℃，反应时间为2h～48h。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合液，其混合液质量浓度范围为0.1%～1%；优化方案中硫酸铵和亚硫酸氢钠质量浓度比为1：1。

5.根据权利要求1所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述增厚及亲水处理中亲水大分子物质质量浓度为10%～30%，反应温度为48℃～52℃，反应时间为1h～3h；优化方案中所述亲水大分子物质为明胶、透明质酸钠或硫酸软骨素一种或几种。

6.根据权利要求1所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述促进组织再生物质为HC-HA/PTX3复合物，反应温度为3℃～5℃，反应时间为1h～3h；优化方案中HC-HA/PTX3复合物质量浓度为1%～5%。

7.根据权利要求1所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中干燥处理中方式包括但不限于冷冻干燥、真空干燥、风干或吸水纸吸干；优化方案中将经过增韧处理的羊膜在醇溶液中梯度脱水后进行冷冻干燥，得到干态羊膜。

8.根据权利要求7所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述干燥处理中在醇溶液中梯度脱水，醇溶液包括乙醇、丙三醇，优选的梯度脱水方式为50%乙醇水溶液2h、75%乙醇水溶液2h、75%乙醇+25%丙三醇混合溶液2h、80%乙醇+20%丙三醇混合溶液2h。

9.根据权利要求7或8所述的一种干态羊膜的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥，冷冻温度为﹣38℃～﹣42℃，干燥时间为48h～72h。

10.根据权利要求1所制备的干态羊膜的应用，其特征在于：在眼科手术、皮肤缺损修复、肌腱修复及防黏连、脊柱手术中抑制感染和炎性反应，减少瘢痕形成和保护暴露的神经根的应用。