CN108261565B - 一种疝补片、制备方法及其在疝修补中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疝补片、制备方法及其在疝修补中的应用。该疝补片是由异体皮原料经完全去除可引起宿主免疫排斥反应的所有细胞、完整地保留与原有组织结构相同的细胞外基质而制成；所述脱细胞异体真皮基质的拉伸强度3.0MPa‑7.0MPa、缝合强度18N‑22N、拉伸伸长率为10％‑30％、顶破强度20KPa‑30KPa。本发明疝补片具有诱导组织生成的作用，在植入人体后能被人体组织细胞识别为自体组织，很快有新生血管和成纤维细胞长入，引导细胞沿其胶原框架有序生长，达到补充、特别是快速修复的目的，补片补入后24周而不降解。

Description

一种疝补片、制备方法及其在疝修补中的应用
技术领域
本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体涉及一种疝补片及其制备方法和在疝修补中的应用。
背景技术
疝是指任何脏器或组织离开了原来的位置，通过人体正常或不正常的先天或后天形成的薄弱点、缺损或孔隙进入另一个部位。疝按部位分为腹股沟直疝、腹股沟斜疝、股疝、脐疝、白线疝、切口疝，按其性质分为易复性疝、难复性疝、嵌顿疝、绞窄疝等。一般症状：站立时突出，仰卧后消失，按压即可回入腹腔。疝首先影响患者的消化系统，从而出现下腹部坠胀、腹胀气、腹痛、便秘、营养吸收功能差、易疲劳和体质下降等症状。又由于腹股沟部与泌尿生殖系统相邻，所以老年患者易出现尿频、尿急、夜尿增多等膀胱或前列腺疾病；小孩则可因疝的挤压而影响睾丸的正常发育；而中青年患者则易导致性功能障碍。还由于疝囊内的肠管或网膜易受到挤压或碰撞引起炎性肿胀，致使疝回纳困难，导致疝嵌顿，出现肠梗阻、肠坏死等危险情况。因此，疝修补在外科临床治疗中是重要课题。
临床对疝补片的要求是：(1)在组织液中不发生物理性质紊乱；(2)化学性质稳定，不引起炎症或异物反应，无致癌性，也不引起变态反应和过敏，可消毒灭菌；(3)术中操作简便，能够随意裁剪，制成所需的形状:(4)能够对抗机械变形；(5)抗感染。
随着材料学的迅猛发展，各种疝修补材料已广泛应用到临床中，材质涵盖聚丙烯/聚酯/聚四氟乙烯/聚偏二氟乙烯等不可吸收合成材料、聚乳酸/聚己内酯等可吸收合成材料、复合材料、动物源性材料、同种异体材料等。应用人工合成材料的疝修补片应用临床后，使得疝修补的治疗得到长足进步，但随着其应用时间的延长，不可降解的合成材料组织相容性较差的问题已越来越突出，这使得寻找一种新的疝修补材料成为领域中共同关注的问题。
伴随着免疫学和组织工程技术的发展，脱细胞异体真皮基质逐渐发展成为一种新型的组织修复材料。脱细胞异体真皮基质取材于人体皮肤组织，经特殊的理化、生化处理，去除了可能引起免疫排异反应的所有成份，但完整地保留了原有组织的纤维立体支架结构，植入后很快有新生血管和成纤维细胞长入，取得了良好的临床效果。
目前脱细胞异体真皮基质主要通过Dispase-Triton法和NaCl-SDS法制备。前者通过化学除垢剂联合其他辅助试剂去除皮肤组织内的细胞和抗原成分，如在含有EDTA和胰蛋白酶或DispaseII酶的溶液中脱除细胞，后在TritonX-100中孵育制得；后者通过高渗氯化钠和SDS制备，但会残留较多抗原成分。除此之外，还有胰蛋白酶消化法、反复冻融法、NaOH销蚀法、平衡盐孵育法等制备方法，但较前两种应用较少。上述制备方法是制备脱细胞异体真皮基质的通用方法，并未考虑疝修补对补片拉伸强度、弹性、伸长性的特殊需要，尤其是腹内压对疝修补补片抗张力作用、弹性的要求，在应用于疝修补的治疗时，可能存在拉伸强度较低、弹性较小而不能满足腹壁膨胀需要的患者的需求。
国内目前已经有应用于疝修补的脱细胞异体真皮材料的产品上市，但需用生理盐水保存，有效期短，储存运输不便。本发明针对上述问题提出新的解决方案。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种具备较高的拉伸强度、缝合强度和拉伸伸长率等生理特征、且更适用于疝修补患者的脱细胞异体真皮基质及其相关产品。
为克服以上现有技术中疝修补材料和方法的不足，本发明经过酶处理、表面活性剂超声处理、DNA酶处理、交联处理、冷冻干燥等多步骤协同操作，制备了一种新的脱细胞异体真皮基质材料，并将其制作成疝修补补片，用于疝的修复治疗。
本发明首先提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶，或者所述酶为磷脂酶和蛋白酶；
步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；
步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；
步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；
步骤五，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，振荡处理，得半成品E；
步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；
步骤七，将半成品F取出，投入到盛有交联剂溶液的容器中，浸泡24-36小时，得半成品G；
步骤八，将半成品G用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品H；
步骤九，将半成品H用注射用水清洗浸泡，得成品I，即为脱细胞异体真皮基质；可以直接作为疝补片使用或用作制备疝补片的材料。
一般地，可将上述方法制得的脱细胞异体真皮基质保存于生理盐水中；为延长其保存期，也可进行灭菌处理(例如辐照灭菌)。
为便于上述脱细胞异体真皮基质的储存及运输，延长其有效期，进一步地，上述方法还包括以下步骤：
步骤十，将成品I取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥，得成品J；或者，进一步还包括
步骤十一，将成品J取出，包装，灭菌，得成品K。
进一步地，步骤一中所述蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶(中性蛋白酶，分散酶)等中的一种或多种。
在某些实施方式中，前述步骤一中的酶为磷脂酶、或磷脂酶与胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。进一步地，所述酶溶液pH值为7.0-8.0。优选地，磷脂酶浓度为0.05g/L-0.4g/L，和/或所述蛋白酶(或其中胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶任一种)的浓度为0.05g/L-0.2g/L。更进一步地，所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的一种或多种，优选磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的质量比为1:1:1:1。
在某些实施方式中，前述步骤一振荡处理条件为振荡0.5-4小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。
在某些实施方式中，前述步骤三所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的SDS(十二烷基硫酸钠)，或所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。进一步地，超声浸泡条件为：40-80KHz，100-400W，温度为1-20℃，超声3-8分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。
在某些实施方式中，前述步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-8g/L，pH 7.0-8.0；优选浓度为4-6g/L。
在某些实施方式中，前述步骤五中振荡处理条件为振荡2-8小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。
在某些实施方式中，前述步骤七中使用的交联剂溶液含有交联剂A、交联剂B和缓冲剂，其中，交联剂A为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三氮唑等中的一种或几种；交联剂B为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等中的一种或几种，缓冲剂为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的一种或几种。磷酸盐缓冲溶液可按本领域常规方法配制。用缓冲剂将交联剂溶液pH值调整至5.0-7.0，交联剂A与交联剂B的摩尔比为1:5-1:2，交联剂B的浓度为2.5-10g/L；进一步地，交联温度为1-10℃。
进一步地，所述交联剂溶液可用水作为溶剂。
在某些实施方式中，前述步骤二、步骤四、步骤六、步骤八振荡处理条件为振荡1-2小时，振荡转速为80-150rpm，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次，温度为1-5℃。
在某些实施方式中，前述步骤九注射用水清洗浸泡条件为振荡2小时，振荡转速为80-150rpm，温度为1-5℃，更换注射用水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。
在某些实施方式中，前述步骤十冻干保护剂溶液由磷酸盐缓冲液、透明质酸和糖组成，其中透明质酸的浓度为0.4-0.8mg/100mL，糖的浓度为10-20mg/100mL，所述糖为海藻糖、乳糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨醇、甘露糖、葡萄糖中的一种或几种。所述磷酸盐缓冲溶液(PBS)可按本领域常规方法配制，优选为10mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液。
在某些实施方式中，前述步骤十的冷冻干燥步骤具体为将成品I于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa。
在某些实施方式中，前述步骤十一的包装为将成品J装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
本发明还包括上述方法制备的脱细胞异体真皮基质(也可称做疝补片)。
本发明制备的脱细胞异体真皮基质的拉伸强度3.0MPa-7.0MPa、缝合强度18N-22N、拉伸伸长率为10％-30％、顶破强度20KPa-30KPa。
所述脱细胞异体真皮基质(疝补片)在使用前需先进行如下操作：20℃-35℃生理盐水中完全浸泡(复水)15分钟。
可以根据实际需要将上述脱细胞异体真皮基质制成适当的尺寸，优选其尺寸为宽1-20cm，长1-20cm。
本发明还包括上述脱细胞异体真皮基质在制备治疗疝损伤的修复材料中的应用。
所述疝损伤可以是腹壁疝、食管裂孔疝、膈疝、盆底疝，腹壁疝包括手术切口疝、造口疝、脐疝、白线疝、半月线疝等。
本发明另一方面提供一种用于疝修补的试剂盒，含有前述的脱细胞异体真皮基质(疝补片)。所述试剂盒，还可以进一步包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、可吸收手术线、含注射用水的安瓿瓶、注射器等。
本发明异体皮原料来源于自愿捐献者(例如非活体)的皮肤。
本发明脱细胞异体真皮基质的保存条件为阴凉干燥处，相对湿度小于等于45％。
本发明根据疝修补治疗的需要，改进和优化了脱细胞异体真皮基质的制备工艺。该产品是将人体捐献体的皮肤，经过特殊的生物技术处理，将组织中可引起宿主免疫排斥反应的所有细胞清除掉，同时完整地保留与原有组织结构相同的细胞外基质，通过冷冻干燥处理，使其更便于储存和运输。通过对该产品不断地深入研究发现，由于在去除免疫排异反应成分的同时，完整地保留了原有组织的立体支架结构，作为细胞支架，它具有诱导组织生成的作用，在植入人体后能被人体组织细胞识别为自体组织，很快有新生血管和成纤维细胞长入，引导细胞沿其胶原框架有序生长，达到补充、特别是快速修复的目的，补片补入后24周而不降解。
本领域使用脱细胞异体真皮基质对疝修补时，需要将离开原来位置的脏器或组织复位，然后将脱细胞异体真皮基质补片与缺损部位周围组织缝合固定，而为了避已经复位的脏器或组织再次离开原位，需要提高缝合密度，因此需要脱细胞异体真皮基质补片具有较高的缝合强度。
本发明脱细胞异体真皮基质能够同时满足上述疝修补手术需求。本发明通过酶处理、表面活性剂溶液超声处理联合进行脱细胞，能够达到很好地脱细胞效果，且对真皮基质的损伤较小，有利于提高组织产品机械性能，获得较好的弹性和韧性，提高组织的撕裂、缝合强度，且有助于DNA水解酶处理步骤中除去真皮基质中残留的DNA，降低了细胞毒性和排斥反应。
进一步的，患者在咳嗽及蹦跳时腹内压是最大，约170mmHg(1mmHg＝0.133KPa)，因此需要脱细胞异体真皮基质补片可以提供至少180mmHg的张力。对于需要腹壁膨胀的患者，如：运动员、孕妇等，需要脱细胞异体真皮基质补片具有较好的弹性和韧性。因此，疝修补手术对修补材料的韧性、拉伸伸长率、致密性和顶破强度有着特殊的要求。本发明发现在脱细胞处理之后引入交联剂处理的操作能够将真皮基质中胶原蛋白进行交联，且交联剂并不进入胶原蛋白中，通过交联，既对真皮基质进行修复、增强胶原的强度，又不引入其他物质、安全无毒，进一步提高脱细胞异体真皮基质材料致密性和顶破强度，控制拉伸伸长率；更进一步地，经过交联处理后的异体真皮基质材料一方面力学性能更适于疝修补修补手术，另一方面通过交联可以延长在体内的吸收降解，有利于血管化和组织转归；同时对制备获得的脱细胞异体真皮基质材料进行冻干处理，加入透明质酸和多糖类作为冻干保护剂，冻干过程中形成的冰晶将会变小，可有效减少冰晶对脱细胞异体真皮基质中胶原骨架的破坏，也能够协同增加材料的缝合强度等机械性能，复水后能够恢复弹性和韧性。
进一步的，经过对工艺操作的不断筛选和优化，最终获得了本发明制备脱细胞异体真皮基质的方法。通过本发明制备获得的脱细胞异体真皮基质的拉伸强度3.0MPa-7.0MPa、缝合强度18N-22N、拉伸伸长率为10％-30％、顶破强度20KPa-30KPa，能够满足疝修补修复对于补片材料的强度等机械性能的需要。
本发明的脱细胞异体真皮基质较之市场同类产品(例如国内某企业生产的来源于脱细胞异体真皮基质补片)更有优势，其展现出的有益效果包括：本发明的脱细胞异体真皮基质拉伸强度远高于同类产品，本发明的脱细胞异体真皮基质在进行拉力检测时，拉力增加到补片的最大拉伸强度后缓慢断裂，而同类产品补片则在拉力增加到补片的最大拉伸强度后瞬间断裂，拉伸伸长率也优于同类产品；本发明的脱细胞异体真皮基质的缝合强度是同类产品补片的1.91倍；病理学检测显示，本发明的脱细胞异体真皮基质补片无异常炎性反应，伴有血管和胶原形成。
综上，本发明的脱细胞异体真皮基质作为疝修补材料具有以下优点：(1)就产品性能来说，本发明的脱细胞异体真皮基质是经过工艺改进的产品，产品的机械性能得到提高，拉伸强度3.0MPa-7.0MPa、缝合强度18N-22N、拉伸伸长率为10％-30％、顶破强度20KPa-30KPa，较之市场上的其他同类产品具有更适于疝修补的机械性能；(2)就产品效果来说，动物实验中显示，本发明的脱细胞异体真皮基质植入24周后，有成纤维细胞及胶原形成，可见新生血管，发生炎症的程度较轻，较之市场上的其他同类产品更接近于正常组织、效果更好；(3)具有良好的安全性，无细胞毒性和排斥反应，成功率高。
附图说明
图1：脱细胞异体真皮基质拉伸强度对比结果；
图2：对照组脱细胞异体真皮基质拉伸长度结果；
图3：实验组脱细胞异体真皮基质拉伸长度结果；
图4：脱细胞异体真皮基质拉伸伸长率对比结果；
图5：脱细胞异体真皮基质补片植入不同时间的一般观察对比结果；
图6：脱细胞异体真皮基质补片植入后12周病理学检测对比结果；
图7：脱细胞异体真皮基质补片植入后24周病理学检测对比结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1脱细胞异体真皮基质的制备方法
将异体真皮原料投入浓度为0.2g/L磷脂酶和0.1g/L胰蛋白酶溶液中，酶溶液pH值为7.0，温度为37℃，100rpm振荡2小时，更换一次酶溶液，重复此过程一次，得半成品A；磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D按照质量比1:1:1:1的混合物。
将半成品A取出，投入生理盐水中浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，振荡转速为80rpm，温度为2℃，得半成品B。
将半成品B投入到含有0.2g/L的TritonX-100溶液中，50KHz，220W，超声5分钟，浸泡3小时，重复此过程3次，得半成品C。
将半成品C取出，投入生理盐水中浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得半成品D。
将半成品D投入到盛有浓度为5g/L、pH为7.0的DNA水解酶溶液中，温度为37℃，振荡处理4小时，振荡转速为20rpm，得半成品E。
将半成品E投入生理盐水中浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得半成品F。
将半成品F取出，投入到交联剂溶液中，5℃条件下浸泡30小时，得半成品G；
交联剂溶液含有N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和磷酸盐缓冲溶液，其中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为5g/L，N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的摩尔比为1:5，用磷酸盐缓冲溶液调整交联剂溶液pH至5.5。
将半成品G投入生理盐水中浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得半成品H。
将半成品H投入生理盐水中浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得成品I，即为脱细胞异体真皮基质。
将成品I取出，置于冻干保护剂溶液中；于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa；得成品J。
所述冻干保护剂溶液由10mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液、透明质酸和海藻糖组成，其中透明质酸的浓度为0.4mg/100mL，海藻糖的浓度为15mg/100mL。
将成品J取出，装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品K(疝补片)。
实施例2脱细胞异体真皮基质的制备方法
将异体真皮原料投入浓度为0.1g/L磷脂酶和0.1g/L胰蛋白酶溶液中，酶溶液pH值为7.0，温度为37℃，100rpm振荡2小时，更换一次酶溶液，重复此过程一次，得半成品A；磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D按照质量比1:1:1:1的混合物。
将半成品A取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，振荡转速为80rpm，温度为2℃，得半成品B。
将半成品B投入到含有0.2g/L的SDS溶液中，10mMEDTA，50KHz，220W，超声7分钟，浸泡2小时，重复此过程3次，得半成品C。
将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡1小时，振荡转速为100rpm，温度为4℃，得半成品D。
将半成品D投入到盛有浓度为7g/L、pH为7.0的DNA水解酶溶液中，温度为30℃，振荡处理3小时，振荡转速为30rpm，得半成品E。
将半成品E投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡1小时，振荡转速为100rpm，温度为4℃，得半成品F。
将半成品F取出，投入到交联剂溶液中，10℃条件下浸泡32小时，得半成品G。其中，
交联剂溶液含有1-羟基苯并三氮唑、二环己基碳二亚胺和2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，其中，二环己基碳二亚胺的浓度为4g/L，1-羟基苯并三氮唑与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:4，用2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物调整溶液pH至5.5。
将半成品G投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡1小时，振荡转速为100rpm，温度为4℃，得半成品H。
将半成品H投入盛有注射用水的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得成品I，即为脱细胞异体真皮基质。
将成品I取出，置于冻干保护剂溶液中；于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa；得成品J。
所述冻干保护剂溶液由10mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液、透明质酸和甘露醇组成，其中透明质酸的浓度为0.6mg/100mL，甘露醇的浓度为10mg/100mL。将成品J取出，装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品K(疝补片)。
实验例1脱细胞异体真皮基质的生物学性能检测
对实施例1-2制备获得的脱细胞异体真皮基质(即成品K，疝补片)及国内某企业生产的脱细胞异体真皮基质(对照组)的机械特性等生物学性能进行测试，性能指标包括拉伸强度、缝合强度、顶破强度、拉伸延长率、含水量、DNA残留量，具体检测结果如表1所示。结果显示，本发明产品韧性和弹性良好、便于缝合、牵拉，且有足够的拉伸强度，能够满足疝修补补片的治疗需要。
表1脱细胞异体真皮基质复水后检测结果
脱细胞异体真皮基质 实施例1产品 实施例2产品 对照组
拉伸强度(MPa) 6.25 6.01 2.42
缝合强度(N) 21.2 20.6 12.9
顶破强度(KPa) 24.9 24.2 20.4
拉伸伸长率(％) 20.2 19.8 21.2
含水量(％) 4.3 4.2 4.9
DNA残留量(ng/mg) 0.7 0.8 1.0
实验例2脱细胞异体真皮基质用于疝修补
将前述实施例1制备的脱细胞异体真皮基质(即成品K，疝补片)用于实验动物疝修补修复。
1实验动物及实验材料
1.1实验动物
所使用的实验动物模型为标准新西兰大白兔，体重为体重2.5-3.5kg。
1.2实验材料
实验组疝补片材料为实施例1制备的脱细胞异体真皮基质(即成品K，疝补片)，对照组疝补片材料为国内已上市的来源于脱细胞异体真皮基质补片。
2实验方法
2.1手术过程及术后管理
实验组：选用健康新西兰白兔3只，体重3-4kg。肌肉注射速眠新Ⅱ(0.1ml/kg)和氯胺酮(30mg/kg)麻醉，麻醉后仰卧位固定。于下腹部正中位置剃毛，备出8cm×6cm的一片皮肤区域，常规消毒，铺孔巾。于剑突下5cm处行正中切口切开皮肤、皮下组织及腹壁肌，切口长约1～2cm。分别于腹膜外植入3cm×4cm的经过消毒的前述实施例1制备的脱细胞异体真皮基质补片。采用4/0缝合线逐层关闭腹壁及皮肤切口。术后给予动物肌肉注射青霉素80万单位，每天一次，连续3天；
对照组：选用健康新西兰白兔3只，体重3-4kg。肌肉注射速眠新Ⅱ(0.1ml/kg)和氯胺酮(30mg/kg)麻醉，麻醉后仰卧位固定。于下腹部正中位置剃毛，备出8cm×6cm的一片皮肤区域，常规消毒，铺孔巾。于剑突下5cm处行正中切口切开皮肤、皮下组织及腹壁肌，切口长约1～2cm。分别于腹膜外植入3cm×4cm的经过消毒的国内一企业生产的来源于脱细胞异体真皮基质补片补片。采用4/0缝合线逐层关闭腹壁及皮肤切口。术后给予动物肌肉注射青霉素80万单位，每天一次，连续3天；
空白组：不做手术处理，待检测时取相同区域组织，作为对比。
2.2观察项目
1)补片力学指标检测
使用生物力学检测仪检测补片植入体内前的拉伸强度、拉伸长度和拉伸伸长率。
2)一般情况观察及植入后补片形态变化
观察动物术后的进食情况、活动状态，观察伤口有无感染，有无皮下血肿等；植入动物体内1周、4周、12周、24周补片的形态变化。
3)观察补片植入动物体内后不同时间点的降解程度
通过检测植入动物体内1周、4周、12周补片的拉伸强度和拉伸伸长率来反映补片的降解程度。
4)组织切片观察
取补片植入后12周、24周取材，用HE染色方法观察补片植入不同时间点组织病理变化。
2.3样本收集方法
将兔子耳缘静脉注射氯化钾法处死，于剑突下5cm处行正中切口切开皮肤、皮下组织及腹壁肌，切口长约1～2cm，观察人工材料与周围组织长合情况，小心用手术刀将附有人工材料的腹膜组织完整的分离取下，将补片修剪成约10mm*1mm的长条，实验组补片的厚度为1mm，对照组补片的厚度约为1.5mm，直接存放于37％甲醛溶液中固定，4℃保存。
3实验结果
3.1补片力学指标检测
1)实验组补片拉伸强度大于对照组
如图1所示，实验组补片的拉伸强度均数为6.01MPa，远高于对照组均数为2.42MPa；在植入1周时，实验组和对照组拉伸强度基本未变，且拉伸强度一直保持到12周。
2)两种补片拉伸变形的特性不同
如图2所示，对照组补片在进行拉力检测时，拉力增加至14N后缓慢断裂；如图3所示，实验组补片则是增加到60.1N后会缓慢断裂。
3)拉伸伸长率
如图4所示，实验组补片的拉伸伸长率为20.2％，稍低于对照组补片的21.2％；当实验组补片植入动物体内1周后其拉伸伸长率呈逐渐增加趋势，对照组补片植入1周后拉伸伸长率稍有降低，并且随着时间的延长，拉伸伸长率呈逐渐降低趋势，但降低幅度并不大。
3.2一般情况观察及植入后补片形态变化
两组术后观察期内新西兰白兔进食情况、活动状况与术前无明显差异，伤口无感染，无皮下血肿。
如图5所示，补片在植入动物体内后12周，实验组补片在形态上无明显变化，而对照组有轻微变形。
3.3病理学检测(HE染色)
如图6-7结果显示：植入后12周，可以看到两组补片的形态排列紧密，结构完整；空白组肌纤维完整、排列整齐；对照组可见炎性细胞(中性粒细胞)、巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞；实验组可见炎性细胞浸润，成纤维细胞及胶原形成，可见新生血管。植入后24周，对照组可见大量的纤维细胞和胶原形成；实验组可见纤维细胞和少量炎性细胞，伴有血管的和胶原形成。
3.4实验结论
通过补片植入不同时间的一般观察发现：与对照补片相比，实验补片拉伸强度、缝合强度明显更高，拉伸伸长率稍低；补片被植入家兔体内后，随着补入时间的延长，拉伸伸长率呈逐渐增加趋势，拉伸强度的变化不大；通过补片植入不同时间的病理学检测(HE染色)发现：在补片植入12周时，有一定的炎性细胞浸润，补片周围被新生的肉芽组织包围，补片结构清晰完整；植入24周时，实验组可见纤维细胞和少量炎性细胞，伴有血管的和胶原形成。
可见，实验组补片在植入动物体后无异常的炎性反应，其生物力学结果和体内降解性能都满足疝气补片应用要求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (15)

1.一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，其特征在于，制备方法由如下步骤组成：
步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶和蛋白酶；所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D按照质量比为1:1:1:1的混合物；所述蛋白酶为胰蛋白酶；
所述酶溶液pH值为7.0-8.0；
所述磷脂酶浓度为0.05g/L-0.4g/L；
所述蛋白酶的浓度为0.05g/L-0.2g/L；
步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；
步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的SDS，或所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的Triton X-100；
步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；
步骤五，将半成品D投入DNA水解酶溶液中，振荡处理，得半成品E；
步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；
步骤七，将半成品F取出，投入交联剂溶液中，浸泡24-36小时，得半成品G；所述交联剂溶液含有交联剂A、交联剂B和缓冲剂，其中，所述交联剂A为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三氮唑中的一种或几种；所述交联剂B为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺中的一种或几种；所述缓冲剂为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、磷酸盐缓冲溶液中的一种或两种；所述交联剂A与所述交联剂B的摩尔比为1:5-1:2，所述交联剂B的浓度为2.5-10g/L；
步骤八，将半成品G用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品H；
步骤九，将半成品H用注射用水清洗浸泡，得成品I；
或者，进一步地，还包括以下步骤：
步骤十，将成品I取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥，得成品J；或者，进一步还包括
步骤十一，将成品J取出，包装，灭菌，得成品K。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一振荡处理条件为振荡0.5-4小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤三所述超声浸泡处理的条件为：40-80KHz，100-400W，温度为1-20℃，超声3-8分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-8g/L，pH 7.0-8.0；；和/或，
所述步骤五中振荡处理条件为振荡2-8小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-6g/L。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤七中用缓冲剂将交联剂溶液pH值调整至5.0-7.0；和/或，
交联温度为1-10℃。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二、步骤四、步骤六、步骤八振荡处理条件为振荡1-2小时，振荡转速为80-150rpm，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次，温度为1-5℃；和/或，
所述步骤九注射用水清洗浸泡条件为振荡2小时，振荡转速为80-150rpm，温度为1-5℃，更换注射用水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤十所述冻干保护剂溶液由磷酸盐缓冲液、透明质酸和糖组成，其中透明质酸的浓度为0.4-0.8mg/100mL，糖的浓度为10-20mg/100mL，所述糖为海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖中的一种或几种；和/或，
步骤十所述冷冻干燥包括：将成品I于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤十中所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L、pH为7.0。
10.权利要求1-9任一项所述方法制备的脱细胞异体真皮基质。
11.根据权利要求10所述的脱细胞异体真皮基质，其特征在于，所述脱细胞异体真皮基质的拉伸强度3.0MPa-7.0MPa、缝合强度18N-22N、拉伸伸长率为10％-30％、顶破强度20KPa-30KPa。
12.权利要求10或11所述脱细胞异体真皮基质在制备治疗疝损伤的修复材料中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疝损伤包括腹壁疝、食管裂孔疝、膈疝、盆底疝；腹壁疝包括手术切口疝、造口疝、脐疝、白线疝、半月线疝。
14.一种用于疝修补的试剂盒，其特征在于，含有权利要求10或11所述脱细胞异体真皮基质。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还进一步包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、可吸收手术线、含注射用水的安瓿瓶、注射器中的一种或几种。
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