KR20150074336A - 젤라틴 코팅을 이용한 중간엽 줄기세포의 혈청 비의존성 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계; b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계; 및 c) 배지 조성물에 중간엽 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계; 및 b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 제시된 혈청 비의존성 배지를 이용할 경우 우태아혈청과 같은 동물 혈청이나 인간 혈청을 사용하지 않고도 중간엽 줄기세포를 대량 배양하는 것이 가능하다.

Description

젤라틴 코팅을 이용한 중간엽 줄기세포의 혈청 비의존성 배양 방법{METHOD FOR SERUM-INDEPENDENT CULTURE OF MESENCHYMAL STEM CELL USING GELATIN COATING}

본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴(gelatin)으로 코팅하는 단계; b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계; 및 c) 배지 조성물에 중간엽 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계; 및 b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 세포로서 자기 재생을 통해 오랫동안 분열을 할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 나누어진다. 이를 이용한 연구적인 측면에서 성체 줄기세포의 잠재 능력은 배아줄기세포보다 제한적인 단점이 있으나, 윤리적인 문제가 적어 성체 줄기세포를 대상으로 많은 연구가 진행되고 있다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells)로도 불리는 다능성 세포(multipotent cell)이다. 중간엽 줄기세포는 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있다.

생체에서와는 달리 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위해서는, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거로 한 생체 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용하여 왔다. 이에 인간 줄기세포를 배양하기 위한 다양한 배지 조성물이 제시되고 있는데, 우태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)과 같은 동물 혈청을 함유하는 배지를 이용하여 인간 줄기세포를 배양하는 방법이 통상적이다. 하지만 이러한 방법은 우태아혈청으로 배양한 세포를 태아 혈청이 없는 용액으로 세척하더라도 상당량이 세포 내 잔류하여 강력한 이종 항원으로 작용하는 문제가 있고, 또한 광우병과 같은 이종간 전달 가능한 질병의 감염 가능성을 내포하고 있다. 결국, 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 배양과정에서 인간 유래 물질이거나 안정성이 명확히 입증된 물질들만을 사용해야만 하기 때문에 기존에 제시된 방법들은 한계가 있다.

이와 관련하여, 한국 공개특허공보 제2005-0099724호 등에는 동물 유래의 혈청 대신 인간 혈청을 사용한 배지가 제시되어 있고, 한국 공개특허공보 제2007-0104735에는 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양 배지가 제시되어 있다. 또한, 한국 공개특허공보 제2010-0006452호에는 인간 탯줄 유래 섬유모세포를 지지세포로 이용한 인간 배아 줄기세포의 배양 방법이 제안되어 있다. 하지만, 인간 유래 물질 또한 동종간 전달가능한 질병의 감염 가능성을 배제할 수 없으므로, 안정성이 보다 확보된 물질을 이용해야 한다.

한편, 한국 공개특허공보 제2008-0007726호에는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 배양 방법을 제시하면서 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계를 개시하고 있으나, 골수나 다른 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포 등에는 적용될 수 없고 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에만 적용될 수 있다고 기재되어 있고, 또한 우태아혈청이 포함된 α-MEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다고 기재되어 있다.

본 발명에서는 우태아혈청이나 인간 혈청을 사용하지 않고 중간엽 줄기세포를 배양하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명에서는 혈청이 전혀 함유되지 않은 배지로 중간엽 줄기세포를 배양할 수 있게 함으로써 줄기세포의 안전한 임상적용 등을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하고, 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 넣은 후, 중간엽 줄기세포를 접종하여 배양할 경우 세포 성장률이 상승함을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 혈청 비의존성 배지를 이용할 경우 우태아혈청과 같은 동물 혈청이나 인간 혈청을 사용하지 않더라도 중간엽 줄기세포를 대량 배양하는 것이 가능하다.

도 1은 지방 유래 줄기세포를 이용한 실시예 1과 비교예 1을 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 골수 유래 줄기세포를 이용한 실시예 2와 비교예 2를 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 지방 유래 줄기세포를 이용한 실시예 1과 비교예 1을 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 후의 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 골수 유래 줄기세포를 이용한 실시예 2와 비교예 2를 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 후의 세포수를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴(gelatin)으로 코팅하는 단계; b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계; 및 c) 배지 조성물에 중간엽 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 a) 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계; 및 b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 우태아혈청과 같은 동물 혈청이나 인간 혈청을 사용하지 않고 중간엽 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우에는 혈청 비의존성 배지만으로 1 계대 정도만 배양이 가능하지만, 본 발명의 혈청 비의존성 배지를 이용하는 경우 2 계대 이상 배양이 가능해진다. 또한, 젤라틴을 코팅하는 경우 배지 조성물에 추가적인 영양분을 포함시키지 않더라도 중간엽 줄기세포를 충분히 배양 가능하다.

본 발명의 혈청 비의존성 배지에 따르는 경우, 동일 계대에서 젤라틴을 코팅하지 않은 경우에 비해 세포 배양 형태 및 세포 성장이 훨씬 우수하다. 또한, 젤라틴을 배양 용기에 코팅함으로써 세포 성장률도 높아져 최종 수득되는 세포수가 크게 많아진다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간의 지방, 태반, 제대혈 또는 골수에서 추출된 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하다. 또한, 인간 배아 줄기세포를 분화시켜 중간엽 세포로 유도한 후 추출된 것을 중간엽 줄기세포로 사용할 수 있다. 일례로서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 성인의 지방 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포와 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하며, 이중 지방 유래 중간엽 줄기세포는 지방 조직 내에 존재하는 세포에 대해 몇 단계의 정제 과정을 거쳐서 수득할 수 있고, 골수 유래 중간엽 줄기세포도 지방 유래 세포와는 다른 방식의 정제 과정을 거쳐 수득 가능하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 적용 가능한 중간엽 줄기세포는 지방 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포이다.

본 발명에서 사용되는 젤라틴의 농도는 0.05 % 내지 1.0 %인 것이 바람직하다. 상기 농도 범위 미만인 경우에는 젤라틴이 거의 코팅되지 않아 코팅 효과가 거의 없을 수 있으며, 반대로 상기 농도 범위를 초과하는 경우 코팅된 젤라틴의 두께가 지나치게 두껍거나 딱딱해져 최적의 세포 배양 조건을 달성하기 어려워질 수 있기 때문이다.

일 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 무혈청 배지 조성물은 우태아혈청 등이 배제된 통상의 세포 배양액일 수 있다. 예를 들어, DMEM/F-12를 사용할 수 있다. 무혈청 배지 조성물은 혈청 대체물(serum replacement), 사이토카인 등이 더 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혈청 대체물로 무이종성 혈청 대체물(XF-SR; xenofree-serum replacement) 1 % 내지 30 %, 사이토카인으로 FGF2 1 ng/ml 내지 10 ng/ml 등이 포함될 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

젤라틴 코팅

세포 배양 12 시간 전에 12 웰 배양 플레이트(미국 Corning Co. 제조)에 0.1 % 농도의 젤라틴을 코팅하고, PBS(Phosphate Buffer Saline)로 2 회 세척하였다.

세포 접종 및 배양

한국 CEFO Co.에서 제공받은 지방 유래 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다. 지방 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro ADMSC 배지(CEFO Co. 제조)를 이용하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro BMMSC 배지(CEFO Co. 제조)를 이용하였다.

실시예 1(지방 유래 중간엽 줄기세포)과 실시예 2(골수 유래 중간엽 줄기세포)는 상기 젤라틴 코팅된 배양 접시에 하기 표 1과 같은 배지 조성물을 넣고, 웰 당 19,000 세포를 접종하고, 37℃, 5 % CO₂, 90 % 이상의 습도 조건 하에서 배양하였다.

비교예 1(지방 유래 중간엽 줄기세포)과 비교예 2(골수 유래 중간엽 줄기세포)는 젤라틴 코팅을 하지 않은 배양 플레이트를 이용한 것 이외에는 실시예와 동일한 방식으로 배양하였다. 즉, 하기 표 1과 같이 실시예와 비교예의 배지 조성은 젤라틴 코팅 여부에만 차이를 두었다.

기본 배지로는 DMEM/F12(미국 Invitrogen사 제조)를 사용하였고, 2 % XF-SR(Xenofree 혈청 대체물; 미국 Invitrogen사 제조)과 5 ng/ml bFGF(미국 PeproTech사 제조)를 더 포함시켰다.

실시예	중간엽 줄기세포	젤라틴 코팅	기본 배지	보충제	사이토카인
실시예 1	지방 유래	0.1 % 젤라틴 코팅	DMEM/F12	2 % XF-SR	5 ng/ml bFGF
실시예 2	골수 유래	0.1 % 젤라틴 코팅	DMEM/F12	2 % XF-SR	5 ng/ml bFGF
비교예 1	지방 유래	코팅하지 않음	DMEM/F12	2 % XF-SR	5 ng/ml bFGF
비교예 2	골수 유래	코팅하지 않음	DMEM/F12	2 % XF-SR	5 ng/ml bFGF

지방 유래 줄기세포를 이용한 실시예 1과 비교예 1을 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 이미지를 도 1에 나타내었고, 골수 유래 줄기세포를 이용한 실시예 2와 비교예 2를 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 이미지를 도 2에 나타내었다.

세포수 계수

배양 중인 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 0.25 % 트립신(미국 Hyclone사 제조)을 12 웰 플레이트에 200 ㎕씩 처리하여 5 분 동안 반응시킨 후, Epp. Tube에 세포를 포집하였다. 포집된 세포를 PBS로 2 회 세척한 후 Cell Counter Solution Kit(한국 NanoEnTek사 제조)로 염색하여 ADAM Cell Counter(한국 NanoEnTek사 제조)를 이용하여 세포를 계수하고 그래프로 나타내었다.

지방 유래 줄기세포를 이용한 실시예 1과 비교예 1을 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 후의 세포수를 도 3에 나타내었고, 골수 유래 줄기세포를 이용한 실시예 2와 비교예 2를 계대배양 없이 3 일 동안 배양한 후의 세포수를 도 4에 나타내었다.

도 1 내지 도 4의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예의 혈청 비의존성 배지에 따르는 경우, 동일 계대에서 젤라틴을 코팅하지 않은 비교예에 비해 세포 성장이 훨씬 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예에서는 세포 성장률도 크게 높아져 최종 수득되는 세포수가 비교예 보다 월등히 높았다.

Claims (8)

1. 하기 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법:
   a) 배양 용기를 젤라틴(gelatin)으로 코팅하는 단계;
   b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계; 및
   c) 배지 조성물에 중간엽 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서,
   중간엽 줄기세포가 지방 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   a) 단계에 이용되는 젤라틴의 농도가 0.05 % 내지 1.0 %인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   무혈청 배지 조성물이 혈청 대체물(serum replacement)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법.
5. 하기 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법:
   a) 배양 용기를 젤라틴으로 코팅하는 단계; 및
   b) 젤라틴으로 코팅된 배양 용기에 무혈청 배지 조성물을 투입하는 단계.
6. 제 5 항에 있어서,
   중간엽 줄기세포가 지방 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   a) 단계에 이용되는 젤라틴의 농도가 0.05 % 내지 1.0 %인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법.
8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   무혈청 배지 조성물이 혈청 대체물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 배양용 배지의 제조 방법.
   

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