CN112143696A - 包含干细胞活性物质组合物的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包含干细胞活性物质组合物的试剂盒及其制备方法，所述组合物包含干细胞和培养基，所述培养基为低血清培养基或无血清培养基。所述包含干细胞活性物质的组合物具有高的冻融可靠性。

Description

包含干细胞活性物质组合物的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于试剂盒以及细胞及细胞培养技术领域，其涉及包含干细胞活性物质的组合物及其制备方法，尤其涉及包含干细胞活性物质的组合物、包含该组合物的试剂盒及其制备方法。

背景技术

干细胞具有增殖和分化潜能，是种具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞，换言之，其是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。

由于干细胞的所述特性，使其具有广泛的应用，目前已经用干细胞制备可以应用于多种疾病的试剂或试剂盒，或者制备保健试剂或试剂盒。

在使用干细胞开发新疗法的过程中，来自不同来源的间充质干细胞具有巨大的潜力。例如，干细胞已用于美容领域进行抗衰老研究，人体衰老的根源实质上都是细胞的衰老和减少，而细胞的衰老和减少则是由干细胞老化引起的，目前关于衰老的研究已经步入到分子水平，细胞衰老牵涉到很多生物分子的复杂机制，如能实现再生细胞代替衰老细胞，使细胞的再生和衰老实现均衡，延缓衰老有可能成为现实。自20世纪50年代，全世界已经有数百万人接受细胞疗法，细胞疗法其中之一即是干细胞疗法，衰老进程中干细胞不断丢失，因此及时补充干细胞可使抗衰老成为可能。目前脂肪干细胞抗衰老已经初步应用于临床并取得确切疗效，脂肪间或骨髓间充质干细胞等在动物实验中已被证实有抗衰老作用，且已具有一定的理论基础和依据。

CN106591228A公开了一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；(2)对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞。

CN107982197A公开了一种含有干细胞成分的组合物，其特征在于，按总质量分数100％计，包括20％-100％干细胞浓缩液和完全培养基0-80％，所述的组合物中还添加有维生素E和人参提取物。

CN108450460A公开了一种人脂肪干细胞冻存液，其由如下各组分组成：0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v，最后用DMEM培养基定容至100ml。

CN108410818A公开了一种用于人脂肪干细胞培养的培养基，该培养基在高糖型DMEM细胞培养液的基础上加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL，还原型谷胱甘肽10μg/mL，亚油酸5μg/mL和多肽30μg/ml组成。

CN108130310A公开了一种干细胞培养基，包括基础培养基，细胞生长因子、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂。

CN104805054B公开了一种干细胞无血清培养基，其由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物为：血清替代物5％(v/v)、维生素C 50ug/ml、干细胞生长因子2ng/ml、人血小板源生长因子20ng/ml和L-谷氨酰胺2mmol/ml，所述血清替代物为Ultroser G。

CN108410804A公开了一种促进脂肪干细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)脂肪干细胞的分离培养：取患者或健康志愿者皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2-3次，用眼科剪和眼科镊除去脂肪组织膜和血管并剪成1mm3大小的碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化40min，期间搅拌4-5次，消化结束后加入完全培养基，1500r/min离心10min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/L EDTA 37℃消化3-5min，完全培养基终止消化，1:2比例传代；(2)脂肪干细胞的诱导增殖：取传代细胞以1.5×104/cm²的密度接种于含有完全培养基的培养瓶中，37℃，5％CO₂培养48h后，更换培养基为不完全培养基，同时加入假白榄烷型二萜类化合物继续培养24-72h。

CN108315297A公开了一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法，所述方法包括脂肪干细胞制备、脂肪间充质干细胞的传代培养、细胞收获。在培养基中加入5ng/mlEGF+5ng/ml FGF+5ng/ml IFN-γ+5ng/ml TNF-α+1％L-GlutaMAX，这些因子同时加入培养体系中可以有效促进MSC的增殖，从而有效缩短培养时间。

CN108220230A公开了一种人脂肪干细胞的分离与培养方法，其包括以下步骤：步骤1：采用Liberase消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞后得到人脂肪干细胞；步骤2：采用无血清培养基培养人脂肪干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人表皮生长因子；重组人碱性成纤维细胞生长因子；重组人转化生长因子-β；重组人血小板衍生生长因子-BB；重组人干细胞因子；还原型谷胱甘肽；辅酶A；生物素；MEM维生素溶液；MEM氨基酸溶液；MEM非必需氨基酸溶液；GlutaMAX添加剂；胰岛素-转铁蛋白-硒溶液；庆大霉素。

EP2016075407A公开了一种组合物，其包含基本上同质且免疫抑制的成人脂肪组织来源的干细胞(ASC)群体在无蛋白质的冷冻保护剂中的混悬液，其浓度为至少1x10⁷个细胞/mL。

US2012/060684A公开了干细胞增强疗法，其披露了用于治疗患者的方法，该患者将得益于患者的干细胞的刺激，该方法包括给予患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。

WO2017/051421A公开了一种用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：(a)从身体组织或器官分离细胞；以及(b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集MSC的细胞群体。

“抗肿瘤干细胞活性物质研究进展”，李娇，《中国生化药物杂志》，2017，37(3)：20-26，对近来抗肿瘤干细胞活性物质研究进展进行了综述，以期为抗肿瘤活性物质研究提供参考。

“干细胞抗衰老的理论研究与进展”，单莎瑞等，《中国组织工程研究》，第17卷第23期，2013.6，以衰老的学说研究、评定为引子，对目前干细胞与抗衰老的关系进行综述。

“间充质干细胞增殖、衰老及分化：Wnt信号通路经典与非经典的调控作用”，施剑明等，《中国组织工程研究》，2014年41期，综述了Wnt信号通路调控间充质干细胞增殖、衰老及分化的研究进展，结果表明Wnt信号通路广泛参与调控间充质干细胞多种生物学特性。经典Wnt信号通路对间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化具有双向调控作用，并能够促进其衰老及向神经细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化。

然而，在上述现有技术中，细胞冷冻保存期间遇到的很大困难是冷冻和解冻(即冻融)过程的细胞致死性，这给干细胞冷冻保存方案和业务带来极大挑战。

因此，本领域需要一种具有高的冻融可靠性的包含干细胞活性物质的组合物以及包含这种组合物的试剂盒。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人在深入研究的基础上，经过大量模拟与实践，通过联合研发，提供了以下技术方案。

在本发明的一方面，提供了包含干细胞活性物质的组合物，其中该组合物包含干细胞和培养基。

优选地，该组合物还包含冷冻保护剂。

特别优选地，所述冷冻保护剂由0.5-2.0wt.％DMSO，1-5wt.％谷胱甘肽、1-5wt.％海藻糖和85-97wt.％胎牛血清(FBS)组成。

对于细胞的冷冻保存，二甲基亚砜(DMSO)是最常见的细胞冷冻保存剂。DMSO可以防止细胞内冰的形成，但是已知其在室温下是有毒的。因此，在通过几个洗涤步骤的解冻后通常需要除去DMSO。因此不含DMSO或者低浓度的DMSO的冷冻保护剂和保存方法具有重要意义。海藻糖是一种无毒的葡萄糖二糖，具有在冷冻过程中稳定和保存细胞和细胞结构的良好能力，然而单纯的海藻糖由于其自身结构特点，无法克服“玻璃化”机制存在的缺陷，稳定细胞结构的作用受到限制，而谷胱甘肽可以有效降低“玻璃化”机制所存在的缺陷，即防止结冰的状态，并且海藻糖和谷胱甘肽的组合能够更有效发挥替代水的水驱替机制。本发明人发现，DMSO与海藻糖和谷胱甘肽三者的组合能够有效降低DMSO浓度，获得更好的干细胞(例如脂肪间充质干细胞)活力而不损伤细胞膜和细胞内冰形成，并保持其干性和分化特征。本发明人研究发现，当采用本发明的冷冻保护剂和保存方法时，所述干细胞可以被冷冻保存并恢复的期限可达18个月。与此形成对比的是，如果采用常规的DMSO﹢胎牛血清冷冻保护剂，干细胞可以被冷冻保存并恢复的期限通常只有8-10个月。

进一步优选地，所述冷冻保护剂由0.5-1.0wt.％DMSO，1-3wt.％谷胱甘肽、1-3wt.％海藻糖和90-96wt.％胎牛血清(FBS)组成。

进一步优选地，所述冷冻保护剂还包含磷酸盐缓冲剂，使得其pH值为7.2-7.6。即，当包含磷酸盐缓冲剂时，所述冷冻保护剂由0.5-1.0wt.％DMSO，1-3wt.％谷胱甘肽、1-3wt.％海藻糖和90-95wt.％胎牛血清(FBS)以及磷酸盐缓冲剂组成，所述磷酸盐的量使得冷冻保护剂的pH值为7.2-7.6。

进一步优选地，所述冷冻保护剂的渗透压为350-360mOsm/L。

如本领域技术人员所通常理解，所述冷冻保护剂可以按照本领域的常规冷冻保护剂用量使用或加入。

本发明方法可显著减少DMSO的用量，从而可减少用于冷冻保存干细胞的DMSO的量可以减少细胞在不处于冷冻状态时所遭受的损害，减少对干细胞的损伤将导致更多数量的活细胞可用于离体扩增，研究显示，在本发明中，在冷冻/解冻过程中，较低浓度的DMSO在保存细胞方面效果明显增强。并且，向患者输入较少的DMSO可具有减少不良反应的优点。

优选地，所述干细胞为间充质干细胞。更优选地，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。最优选地，所述脂肪间充质干细胞为人源性脂肪间充质干细胞。

优选地，所述培养基为低血清培养基或无血清培养基。

优选地，所述培养基为无血清培养基。

优选地，所述干细胞为5×10⁵个至5×10⁶个，所述培养基为100-600mL。

优选地，所述冷冻保护剂为1.0-5.0ml。

在本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其含有上述包含干细胞活性物质的组合物。

优选地，在该试剂盒中，干细胞和培养基分开存放。

更优选地，所述干细胞悬浮在所述冷冻保护剂中。

优选地，干细胞存放于液氮中，所述培养基的储存温度为约-20℃至2℃，优选-20℃。更优选地，悬浮在在所述冷冻保护剂中的干细胞(即干细胞悬浮液)存放于液氮中，所述培养基的储存温度为约-20℃。

所述试剂盒的结构和构造可以采取本领域中的常规试剂盒设计。

本领域技术人员可以意识到，在所述包含干细胞活性物质的组合物中，所述干细胞、冷冻保护剂和培养基的用量可以等比例放大或缩小。

在本发明的一个进一步特别优选的实施方式中，本发明还对培养基进行了改进。本发明的培养基优选如下：其由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物为：血清替代物2％(v/v)，2-巯基乙醇5.5μM，L-谷氨酰胺2mM，干细胞生长因子5ng/ml，LIF 1000U/mL和0.1wt％明胶，以及非必需的氨基酸100μM。

优选地，所述干细胞生长因子优选为选自bFGF、TGF-β和PDGF-BB中的任一种。

更优选地，所述干细胞生长因子优选为bFGF、TGF-β和PDGF-BB的组合。进一步优选地，其三者含量(以ng/ml计)比例可以为(1-5):(1-5):(1-5)。

优选地，所述血清替代物可以为Ultroser G。

为了实现培养介质的低血清或无血清，需要加入生长因子以提高体外扩增。研究发现，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以增加人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外增殖，特别是当细胞以低密度接种时，转化生长因子(TGF)-b(即TGF-β)可致使β-联蛋白(b-catenin)以Smad3依赖性方式快速核转位，从而可以增强hMSCs的增殖，血小板衍生生长因子(PDGFs)是hMSCs的有效有丝分裂原，可诱导hMSCs的增殖和迁移。

本发明人进一步研究显示，其它生长因子(例如bFGF和TGF-β)对hMSC增殖具有协同促进作用，发现bFGF，TGF-b和PDGF-BB的组合对于在无血清培养基中扩增hMSCs是非常重要的，所述协同作用能够显著提高hMSCs的增殖，从而实现培养介质的低血清或无血清。因此，如前文所示，优选使用三者的组合，其三者含量(以ng/ml计)比例可以为(1-5):(1-5):(1-5)。

为了提高生长因子的稳定性并且促进生长因子的促进效果，一种简单有效的方法是将它们固定在生物表面上。一种常规的方法是使用明胶来增强其在生物表面的固定，明胶的使用可以使细胞更易贴壁。然而，现有的明胶，无论是A型明胶或B型明胶，其对细胞的贴壁效果欠佳。本发明人为了提高其贴壁效果，进一步优选地，对明胶进行交联改性。即，所述明胶优选为通过以下方法制得的改性明胶：将明胶溶于30-60℃的软化水中，得到5-10％(w/v)溶液，将京尼平以0.5-4.0wt％重量百分比添加到上述溶液中，在50℃下持续搅拌，直至观察到混合物的粘度增加并开始形成凝胶，然后将其浇铸在培养皿上并在室温下干燥48小时，将干燥的样品在软化水中洗涤，即得交联改性的明胶。

所述改性处理的明胶具有更佳的溶胀和溶解特性，例如，与未经改性的明胶相比，3h溶胀度提高20-30％，能够显著提高细胞贴壁效果。

研究发现，明胶的溶胀和溶解行为显著影响细胞粘附和增殖。京尼平交联会在大分子之间形成叔酰胺和酯键，这对明胶的溶胀度和溶解度、润湿性以及机械抗性具有积极影响，还可以提高明胶的水稳定性和机械刚度。关于该培养基，本发明人拟另行进行专利申请。

如本领域通常所理解，所述培养基中添加物的含量比例计算基准是以培养基总量计。

在本发明的又一方面，提供了制备上述组合物或上述试剂盒的方法，该方法包括将各组分进行组合，其中所述干细胞通过包括如下步骤的方法制得：(1)组织的分离提取；(2)组织的消化；和(3)细胞的培养。

优选地，步骤(1)组织的分离提取包括：获取包含干细胞的动物或人体组织。例如，对于人源性脂肪间充质干细胞，从知情并签名同意的抽脂患者中收集健康供体的脂肪组织样品(如得自专业塑形医院)。

优选地，步骤(2)组织的消化包括：将组织(例如上述脂肪组织)置于生理溶液(NaCl 0.9％)中，将其在磷酸盐缓冲盐水(优选包含PBS：NaCl137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM和KH₂PO₄ 1.8mM)中洗涤两次，切成片，并用包含3mg/mL的I型胶原酶消化(例如得自Sigma-Aldrich)和4mg/mL的分散酶(BR，例如得自Sigma-Aldrich)的PBS溶液，在37℃的水浴中持续振摇60分钟，然后添加含有10％FBS的DMEM培养基，之后加入红细胞裂解缓冲液(优选包含NH₄Cl 155mM，KHCO₃ 10mM和EDTA0.1mM，pH 7.3)，在在室温下孵育10分钟并终止消化。

优选地，步骤(3)细胞的培养包括：将步骤(2)获得的细胞悬浮液离心(优选在1200rpm下离心8分钟)，将离心分离得到的沉淀物浸入含有10％FBS，L-谷氨酰胺2mM，青霉素100U/mL、链霉素100mg/mL和0.5mM细胞分化促进剂的DMEM中，并置于具有过滤阀的培养瓶中，将该培养瓶在37℃下于5％CO₂中孵育，并且每周更换培养基两次，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞传代培养或储存在液氮中，得到干细胞。

所述细胞分化促进剂可采用本领域常规的细胞分化促进剂。

优选地，所述细胞分化促进剂(亦即诱导剂)为下式(I)所示化合物：

该化合物提取和分离自天然草药降香的树干心材，其可以采用有机溶剂提取和柱层析纯化进行分离。降香已被用于治疗各种疾病，包括血液病、肿胀、缺血、坏死和风湿性疼痛，植物化学研究报告来自降香的酚类化合物，如异黄烷酮、异黄酮、新黄酮和查耳酮具有各种有益的性质，如抗氧化，抗微生物和抗炎作用。

通过标准茜素红染色试验，茜素红染色的定量显示式(I)所示化合物显着增加干细胞早期和晚期分化。该化合物还可以上调基质蛋白的表达，并增加干细胞例如成骨干细胞中矿化结节的形成(参考图3茜素红染色试验结果)，从而提高细胞的分化。

研究显示，本发明的所述酶消解法使细胞免受蛋白水解和机械应力的影响，并且在外植体培养过程中确保完整的组织碎片，为迁移细胞提供了有利环境，细胞因子和生长因子可以有效释放到培养基中，基质细胞产量更高，增殖时间更短，与机械法相比，细胞收率提高20-30％。

本发明的干细胞在解冻处理后，形成粘附的异质细胞群，其由多边形和纺锤形细胞组成，类似于新鲜干细胞的成纤维细胞样形状，表明本发明的干细胞冷冻保存方法具有特别好的效果。

如本领域所已知，干细胞能够带来多种新疗法。例如，脂肪来源的干细胞是多能细胞，已显示出再生医学的潜力，其不仅分化为间充质谱系细胞，还分泌各种生长因子，如研究发现脂肪来源的干细胞促进可以通过生长因子分泌生长毛发，可以使用脂肪来源的干细胞条件培养基治疗脱发，并能取得较好的效果；所述干细胞还可以用于神经再生。本发明有效降低了细胞冷冻保存期间的冻融过程的致死性，该长周期干细胞保存活性为这些疗法提供了保证。

附图说明

图1是显示根据本发明的新鲜分离培养的脂肪间充质干细胞的显微图(500X)；

图2是显示根据本发明的新鲜分离培养的脂肪间充质干细胞在冷冻保存15个月后经解冻之后的显微图(500X)；

图3是式(I)所示化合物的标准茜素红染色试验图。

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例和对比例，但本发明并不限于此。

实施例1

取新鲜人源性脂肪间充质干细胞(得自山东省齐鲁干细胞工程有限公司)，其形貌显微图如图1所示。将所述干细胞加入冷冻保护剂中，所述冷冻保护剂由1.0wt.％DMSO(细胞培养基，购自Sigma公司)，2.0wt.％谷胱甘肽(得自北京百奥莱博公司)、2.0wt.％海藻糖(得自国药集团化学试剂有限公司)和95wt.％胎牛血清(FBS)(得自上海玉博生物科技有限公司)组成，所述干细胞为5×10⁶个，所述冷冻保护剂为2.0ml，冷冻保存15个月。在保存期结束后，采用常规解冻方式进行解冻，用显微镜观察其形貌，其形貌如图2所示。

观察发现，干细胞在采用本发明的冷冻保护剂进行冷冻保存后，即使在保存15个月后，同样可获得类似于新鲜干细胞的成纤维细胞样形状，这清楚地显示本发明的所述干细胞冷冻保护剂及其冷冻保存方法具有特别好的保存效果。

此外，还在冷冻保存15个月后进行细胞凋亡检测，并使用Annexin V-FITC/PI试剂盒将其与新鲜干细胞进行比较，其中针对PI的阳性细胞被认为是坏死的，针对膜联蛋白阳性的细胞被认为是早期凋亡，膜联蛋白和PI阳性的细胞被认为是晚期凋亡，而膜联蛋白和PI阴性的细胞是活的。结果显示，冷冻15个月后，PI阳性的解冻细胞为16％，膜联蛋白阳性细胞为1.01％，PI和膜联蛋白阳性细胞为9％，PI和膜联蛋白阴性的细胞为74％。上述结构显示，该实施例的解冻的脂肪间充质干细胞显示出高成活率和高增殖率。

对比例1

重复实施例1，区别仅在于冷冻保护剂用常规的DMSO+FBS保护剂(得自上海甄准生物科技有限公司，其由5.0wt.％DMSO和95wt.％FBS组成)。

在冷冻保存15个月后进行细胞凋亡检测，同样使用Annexin V-FITC/PI试剂盒将其与新鲜干细胞进行比较，采取与实施例1相同的评价指标。结果显示，冷冻15个月后，PI阳性的解冻细胞为21％，膜联蛋白阳性细胞为2.2％，PI和膜联蛋白阳性细胞为11％，PI和膜联蛋白阴性的细胞为65.8％。

由上述实施例和对比例清楚地可以看出，当使用本发明的冷冻保护剂进行干细胞的保存时，干细胞在冻融后显示出高的成活率，这对于大规模的干细胞储存具有特别重要的意义。

对比例2

重复实施例1，区别仅在于冷冻保护剂不包含谷胱甘肽，所述冷冻保护剂由1.0wt.％DMSO，4.0wt.％海藻糖和95wt.％胎牛血清(FBS)组成。

在冷冻保存15个月后进行细胞凋亡检测，同样使用Annexin V-FITC/PI试剂盒将其与新鲜干细胞进行比较，采取与实施例1相同的评价指标。结果显示，冷冻15个月后，PI阳性的解冻细胞为18％，膜联蛋白阳性细胞为1.9％，PI和膜联蛋白阳性细胞为9.1％，PI和膜联蛋白阴性的细胞为71.0％。

由上述实施例和对比例清楚地可以看出，谷胱甘肽与海藻糖的组合使用可以进一步提高干细胞在冻融后显示出高的成活率，这对于大规模的干细胞储存同样具有特别重要的意义。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (5)

1.一种包含干细胞活性物质组合物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含干细胞活性物质组合物；其中该组合物包含干细胞，并且该组合物还包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂由1.0wt.％DMSO、2.0wt.％谷胱甘肽、2.0wt.％海藻糖和95wt.％胎牛血清(FBS)组成；所述干细胞为脂肪间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中所述脂肪间充质干细胞为人源性脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：其中所述干细胞为5×10⁵个至5×10⁶个。

4.根据权利要求1-3任意所述的试剂盒，其特征在于：其中干细胞存放于液氮中。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括将各组分进行组合，其中所述干细胞通过包括如下步骤的方法制得：(1)组织的提取；(2)组织的消化；和(3)细胞的培养。

Images