CN110278942B - 一种细胞保存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞保存液及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明先将胆固醇与丁二酸酐反应，并进行氯化，制得氯化胆固醇丁二酸酯，然后将氯化胆固醇丁二酸酯与葡萄糖反应，制得改性葡萄糖，其次将明胶与硝酸银混合，制得改性明胶，将改性葡萄糖与改性明胶混合制得添加剂，最后将添加剂与双蒸水混合，并加入氯化钠、甲醛、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫柳汞钠，制得细胞保存液。本发明制备的细胞保存液对不同细胞都具有较好的保存性，可在不同细胞上进行应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种细胞保存液及其制备方法和应用。
背景技术
细胞，是生命最基本的单位，在很多方面均具有应用价值。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
与普通的生物制品和药品不同，细胞制品中，维持细胞活性是一个极大的挑战。生理盐水作为常用的输注介质，在临床应用上方便安全，但是细胞在生理盐水中活性的下降速度非常快，10小时之内细胞的活性丧失就达到30％之多，因此只适合细胞短暂保存，即时输注。血浆可以较好的维持细胞活性，但是，血浆中含有大量未知成分，异体输注存在安全隐患，同体输注则成本极高。
申请号：200510112642.1，发明名称：“细胞保存液及其调制方法、细胞保存方法、细胞培养方法”的专利申请公开了不含血浆的细胞保存液，如由葡萄糖5.5mM、钠离子143.8mM、钾离子5.4mM、碳酸氢根离子和/或碳酸根离子23.7mM、钙离子1.8mM、镁离子0.8mM、氯化物离子130.8mM、磷酸根离子1.0mM、硫酸根离子0.8mM和纯水组成的保存液1；由甘露醇5.5mM、钠离子143.8mM、钾离子5.4mM、碳酸氢根离子和/或碳酸根离子23.7mM、钙离子1.8mM、镁离子0.8mM、氯化物离子130.8mM、磷酸根离子1.0mM、硫酸根离子0.8mM和纯水组成的保存液2。用通常作为细胞保存液的磷酸缓冲液和生理盐水(含有2.5％v/v人白蛋白)与前述保存液1和保存液2保存细胞4天后，细胞存活率分别为26.9％、11.9％、73.6％和39.8％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种专利名称，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液主要包括以下重量份数的原料组分：80～120份双蒸水，5～15份氯化钠，5～8份甲醛，0.1～0.5份氯化钾，2～12份十二水磷酸氢二钠，0.1～0.7份磷酸二氢钾和0.1～0.5份硫柳汞钠。
一种细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液还包括以下重量份数的原料组分：0.5～1.5份添加剂。
作为优化，所述添加剂是由改性葡萄糖和改性明胶共同制备而成；所述改性葡萄糖是由酰氯化胆固醇丁二酸酯与葡萄糖反应后，在与聚乳酸混合制得；所述改性明胶由明胶与银离子反应制得。
作为优化，所述细胞保存液主要包括以下重量份数的原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾，0.5份硫柳汞钠和0.8份添加剂。
作为优化，一种细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将胆固醇与吡啶按质量比1：28～1：30混合，并加入胆固醇质量1.0～1.5倍的丁二酸酐，于氮气氛围下搅拌反应后，减压蒸馏，得粗产品；将粗产品与乙醇溶液按质量比1：10混合，加热后，冷却结晶，得预处理粗产品，将预处理粗产品与乙醇中重结晶，干燥；
(2)将步骤(1)所得物质与三氯甲烷按质量比1：10～1：12混合，并加入步骤(1)所得产品质量10～12倍的氯化亚砜，搅拌反应后，旋蒸浓缩，得改性胆固醇丁二酸酯，将改性胆固醇丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：3混合；
(3)将葡萄糖与二甲基亚砜按质量比1：50混合，并加入葡萄糖质量0.3～0.6倍的三乙胺和葡萄糖质量1～3倍的步骤(2)所得物质，于氮气氛围下，搅拌反应，透析，干燥；
(4)将明胶与水按质量比1：30混合，并加入明胶质量0.2～0.3倍的硝酸银，搅拌混合后，旋蒸浓缩；
(5)将步骤(4)所得物质与步骤(3)所得物质按质量比1：5混合，
(6)将双蒸水与与氯化钠按质量比9：1～10：1混合，并加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，双蒸水质量0.005倍的硫柳汞钠和双蒸水质量0.008倍的步骤(5)所得物质，搅拌混合，并调节pH至7.3～7.5，得细胞保存液。
作为优化，步骤(3)透析所用透析袋为截留分子量14000～17000的透析袋。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在制备细胞保存液时加入添加剂，首先添加剂中含有经酰氯化胆固醇丁二酸酯改性的葡萄糖，在加入产品中后，可对血红蛋白产生特定吸附，从而减少红细胞对细胞检测的影响，并且提高产品使用后细胞的存活率，其次，葡萄糖在经过酰氯化胆固醇丁二酸酯的改性后，具有双亲性，在加入产品中后，可在产品使用过程中分布于细胞表面，从而配合产品内其他物质维持细胞形态，再者，添加剂中加入了经硝酸银改性的明胶，在添加剂加入产品中后，改性明胶可在改性葡萄糖的作用下分布于产品之中，使产品在在使用过程中将细胞保存于产品中，减少产品内部的溶氧量，从而降低细胞的氧化，进而提高产品使用后细胞的存活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中制作的细胞保存液的各指标测试方法如下：
活性检测：将脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和CIK细胞分别以2×108cell/mL加入各实施例所得细胞保存液与对比例产品中，于温度为2℃的条件下保存。
间充质干细胞：分别取在细胞保存液保存12h、24h、48h后的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞悬液5mL，调整细胞密度为5×106cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v：v)＝3:1充分混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活力及体积检测。
CIK细胞：取在保存液保存12h、24h、48h后的CIK细胞，充分吹打均匀；调整CIK细胞密度为1×107cell/mL；按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v：v)＝9:1的比例，充分混匀两者。取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活力及体积检测。
实施例1
一种细胞保存液，按重量份数计，主要包括以下原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾，0.5份硫柳汞钠和0.8份添加剂。
一种细胞保存液的制备方法，所述细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将胆固醇与吡啶按质量比1：30混合于烧瓶中，并向烧瓶中加入胆固醇质量1.2倍的丁二酸酐，向烧瓶中以25mL/min的速率通入氮气，并于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应3h后，减压蒸馏，得粗产品；将粗产品与质量分数为90％的乙醇溶液按质量比1：10混合，于温度为70℃的条件下搅拌混合30min后，冷却结晶，得预处理粗产品，将预处理粗产品与乙醇中重结晶，并于温度为70℃的条件下干燥3h；
(2)将步骤(1)所得物质与三氯甲烷按质量比1：12混合于烧杯中，并向烧杯中加入步骤(1)所得产品质量12倍的氯化亚砜，于温度为50℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应5h后，旋蒸浓缩，得改性胆固醇丁二酸酯，将改性胆固醇丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：3混合；
(3)将葡萄糖与二甲基亚砜按质量比1：50混合于三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入葡萄糖质量0.5倍的三乙胺和葡萄糖质量2倍的步骤(2)所得物质，向三口烧瓶中以30mL/min的速率通入氮气，于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应7h，透析，并将透析后产物于温度为70℃的条件下干燥2h；
(4)将明胶与水按质量比1：30混合于锥形瓶中，并向锥形瓶中加入明胶质量00.3倍的硝酸银，于温度为80℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合3h后，旋蒸浓缩；
(5)将步骤(4)所得物质与步骤(3)所得物质按质量比1：5混合，
(6)将双蒸水与与氯化钠按质量比10：1混合于搅拌机中，并向搅拌机中加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，双蒸水质量0.005倍的硫柳汞钠和双蒸水质量0.008倍的步骤(5)所得物质，于温度为40℃，转速为280r/min的条件下搅拌混合30min，并调节pH至7.5，得细胞保存液。
作为优化，步骤(3)透析所用透析袋为截留分子量14000～17000的透析袋。
实施例2
一种细胞保存液，按重量份数计，主要包括以下原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾，0.5份硫柳汞钠和0.8份添加剂。
一种细胞保存液的制备方法，所述细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将胆固醇与吡啶按质量比1：30混合于烧瓶中，并向烧瓶中加入胆固醇质量1.2倍的丁二酸酐，向烧瓶中以25mL/min的速率通入氮气，并于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应3h后，减压蒸馏，得粗产品；将粗产品与质量分数为90％的乙醇溶液按质量比1：10混合，于温度为70℃的条件下搅拌混合30min后，冷却结晶，得预处理粗产品，将预处理粗产品与乙醇中重结晶，并于温度为70℃的条件下干燥3h；
(2)将步骤(1)所得物质与三氯甲烷按质量比1：12混合于烧杯中，并向烧杯中加入步骤(1)所得产品质量12倍的氯化亚砜，于温度为50℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应5h后，旋蒸浓缩，得改性胆固醇丁二酸酯，将改性胆固醇丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：3混合；
(3)将葡萄糖与二甲基亚砜按质量比1：50混合于三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入葡萄糖质量0.5倍的三乙胺和葡萄糖质量2倍的步骤(2)所得物质，向三口烧瓶中以30mL/min的速率通入氮气，于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应7h，透析，并将透析后产物于温度为70℃的条件下干燥2h；
(4)将双蒸水与与氯化钠按质量比10：1混合于搅拌机中，并向搅拌机中加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，双蒸水质量0.005倍的硫柳汞钠和双蒸水质量0.008倍的步骤(3)所得物质，于温度为40℃，转速为280r/min的条件下搅拌混合30min，并调节pH至7.5，得细胞保存液。
作为优化，步骤(3)透析所用透析袋为截留分子量14000～17000的透析袋。
实施例3
一种细胞保存液，按重量份数计，主要包括以下原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾，0.5份硫柳汞钠和0.8份添加剂。
一种细胞保存液的制备方法，所述细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将明胶与水按质量比1：30混合于锥形瓶中，并向锥形瓶中加入明胶质量00.3倍的硝酸银，于温度为80℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合3h后，旋蒸浓缩；
(2)将双蒸水与与氯化钠按质量比10：1混合于搅拌机中，并向搅拌机中加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，双蒸水质量0.005倍的硫柳汞钠和双蒸水质量0.008倍的步骤(1)所得物质，于温度为40℃，转速为280r/min的条件下搅拌混合30min，并调节pH至7.5，得细胞保存液。
实施例4
一种细胞保存液，按重量份数计，主要包括以下原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾和0.8份添加剂。
一种细胞保存液的制备方法，所述细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将胆固醇与吡啶按质量比1：30混合于烧瓶中，并向烧瓶中加入胆固醇质量1.2倍的丁二酸酐，向烧瓶中以25mL/min的速率通入氮气，并于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应3h后，减压蒸馏，得粗产品；将粗产品与质量分数为90％的乙醇溶液按质量比1：10混合，于温度为70℃的条件下搅拌混合30min后，冷却结晶，得预处理粗产品，将预处理粗产品与乙醇中重结晶，并于温度为70℃的条件下干燥3h；
(2)将步骤(1)所得物质与三氯甲烷按质量比1：12混合于烧杯中，并向烧杯中加入步骤(1)所得产品质量12倍的氯化亚砜，于温度为50℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应5h后，旋蒸浓缩，得改性胆固醇丁二酸酯，将改性胆固醇丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：3混合；
(3)将葡萄糖与二甲基亚砜按质量比1：50混合于三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入葡萄糖质量0.5倍的三乙胺和葡萄糖质量2倍的步骤(2)所得物质，向三口烧瓶中以30mL/min的速率通入氮气，于温度为70℃，转速为300r/min的条件下搅拌反应7h，透析，并将透析后产物于温度为70℃的条件下干燥2h；
(4)将明胶与水按质量比1：30混合于锥形瓶中，并向锥形瓶中加入明胶质量00.3倍的硝酸银，于温度为80℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合3h后，旋蒸浓缩；
(5)将步骤(4)所得物质与步骤(3)所得物质按质量比1：5混合，
(6)将双蒸水与与氯化钠按质量比10：1混合于搅拌机中，并向搅拌机中加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾和双蒸水质量0.008倍的添加剂，于温度为40℃，转速为280r/min的条件下搅拌混合30min，并调节pH至7.5，得细胞保存液。
作为优化，步骤(3)透析所用透析袋为截留分子量14000～17000的透析袋。
对比例
一种细胞保存液，按重量份数计，主要包括以下原料组分：100份双蒸水，12份氯化钠，8份甲醛，0.5份氯化钾，10份十二水磷酸氢二钠，0.7份磷酸二氢钾。
一种细胞保存液的制备方法，所述细胞保存液的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将双蒸水与与氯化钠按质量比10：1混合于搅拌机中，并向搅拌机中加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，于温度为40℃，转速为280r/min的条件下搅拌混合30min，并调节pH至7.5，得细胞保存液。
效果例
下表1给出了采用本发明实施例1至4与对比例的细胞保存液中不同细胞活性的分析结果。
表1
从表1中的实验数据可看出，在产品中加入添加剂可有效提高产品对细胞的保护，从而提高使用产品保存细胞后，细胞的存活率，并且，从表1中实验数据可看出，本发明制得的产品对不同细胞都具有较好的保存效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (2)
1.一种细胞保存液的制备方法，其特征在于，主要包括以下制备步骤：
(1)将胆固醇与吡啶按质量比1：28～1：30混合，并加入胆固醇质量1.0～1.5倍的丁二酸酐，于氮气氛围下，搅拌反应后，减压蒸馏，得粗产品；将粗产品与乙醇溶液按质量比1：10混合，加热后，冷却结晶，得预处理粗产品，将预处理粗产品与乙醇中重结晶，干燥；
(2)将步骤(1)所得物质与三氯甲烷按质量比1：10～1：12混合，并加入步骤(1)所得产品质量10～12倍的氯化亚砜，搅拌反应后，旋蒸浓缩，得改性胆固醇丁二酸酯，将改性胆固醇丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：3混合；
(3)将葡萄糖与二甲基亚砜按质量比1：50混合，并加入葡萄糖质量0.3～0.6倍的三乙胺和葡萄糖质量1～3倍的步骤(2)所得物质，于氮气氛围下，搅拌反应，透析，干燥；
(4)将明胶与水按质量比1：30混合，并加入明胶质量0.2～0.3倍的硝酸银，搅拌混合后，旋蒸浓缩；
(5)将步骤(4)所得物质与步骤(3)所得物质按质量比1：5混合，
(6)将双蒸水与与氯化钠按质量比9：1～10：1混合，并加入双蒸水质量0.08倍的甲醛，双蒸水质量0.005倍的氯化钾，双蒸水质量0.1倍的十二水磷酸氢二钠，双蒸水质量0.007倍的磷酸二氢钾，双蒸水质量0.005倍的硫柳汞钠和双蒸水质量0.008倍的步骤(5)所得物质，搅拌混合，并调节pH至7.3～7.5，得细胞保存液。
2.根据权利要求1所述的一种细胞保存液的制备方法，其特征在于，步骤(3)透析所用透析袋为截留分子量14000～17000的透析袋。
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| Title |
|---|
| 胆固醇疏水改性葡聚糖/聚乳酸杂化囊泡的形成机理及药物释放研究;张志华;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20090415(第4期);正文第24-26页 * |
| 胆固醇-聚( D, L-乳酸) 的制备及软骨细胞相容性研究;余贯华 等;《高分子学报》;20060228(第1期);第136-140页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110278942A (zh) | 2019-09-27 |
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