KR101452833B1 - 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 통해 제조된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은 코디세핀의 회수율이 뛰어나 고함량의 코디세핀이 포함된 추출물을 제조할 수 있으며, 기존에는 버려지던 동충하초 균사체의 배양여액으로부터 코디세핀이 포함된 유효성분을 추출함으로써 우수한 비용절감 효과를 가져올 수 있다. 또한, 상기 동충하초 균사체의 배양여액의 추출물은 혈관 질환의 치료 효과가 우수하여 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌졸중 등의 혈관질환의 약학 조성물로도 이용할 수 있다.

Description

코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물 {Manufacturing method for extract of culture broth in vegetable worms containing high concentrated cordycepin and the composition comprising the same for treating or preventing vascular diseases}
본 발명은 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색 등의 뇌혈관 질환 및 심장질환 등의 혈관질환은 사망원인 1, 2위를 차지하고 있는 성인병이다. 이러한 성인병은 현대사회로 발전하면서 식생활 양식의 변화 및 내외부적인 환경 스트레스로 인해 중장년층에서 빈번하게 발생하고 있다. 이들 질환의 주요 발병원인은 혈전으로 알려져 있으며, 혈전은 과잉 혈소판 응집에 의해 매개되는 병리현상으로 인식되고 있다. 혈소판은 혈관 손상시 콜라겐, 트롬빈, ADP 등과 같은 각종 작용물질의 자극에 의해 활성화되어 점착반응, 방출반응 및 응집반응을 일으킨다. 이러한 반응들은 지혈에 관련되어 있지만, 혈전 등을 포함하는 혈관 질환의 발병에 중요한 역할을 수행한다.
동충하초(冬蟲夏草, vegetable worms)는 곤충을 기주로 하여 자실체를 발생하는 버섯으로 현재 전 세계적으로 수백여종이 존재하며(Mycologia, 50, 169~222, 1985), 국내에서는 80여종이 있다고 알려져 있다(Kyo-Hak publishing co. Seoul, 13~18, 1996). 그 중에서 특히 자낭균강 맥각균과 코디셉스속(Cordyceps sp.)의 동충하초가 고대로부터 결핵, 천식, 마약중독해독, 자양강장제 등의 한약재로 사용된 것으로 보고된 바 있다(Sci. Rept. Tokyo Bunrika daikaku Sect. B., 5, 253~260, 1940 ; Icons of Medicinal Fungi from China Science Press China., p.575, 1989 ; USDA Agricultural Reserch Service, 1990). 약용으로 이용되는 대표적인 동충하초는 주로 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 오피오글로쏘이데스(Cordyceps ophioglossoides), 코디셉스 소보리페라(Cordyceps sobolifera), 코디셉스 베아우베리아(Cordyceps beauveria), 코디셉스 바씨아나(Cordyceps bassiana) 등이다.
한편 상기 동충하초의 유용성분으로 가장 주목받고 있는 코디세핀(cordycepin)은, 1950년 쿠닝햄(Cunningham) 등에 의해 밝혀진 이후, 약리 활성에 관해 많은 연구가 이루어졌다. 코디세핀은 m-RNA의 합성을 저해하고 항세균, 항진균, 면역증강 및 항암효과가 있는 것으로 주로 알려져 있다.(Nature, 166, 949~954, 1950 ; Cancer Res., 21, 216~220, 1961 ; Biochem. Biophys. Acta., 80, 640~647, 1964).
최근에는 코디세핀의 혈소판 응집억제 작용에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데, 이에 대한 예로, 한국등록특허 제464876호에서는 동충하초의 코디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물이 개시되어 있다. 또한, 코디세핀 성분을 분리 정제하는 방법으로서, 한국공개특허 제2001-0054264호에 동충하초로부터 분리 추출된 항암제용 코디세핀과 그 제조방법이 개시되어 있다. 한편, 한국등록특허 제509718호에서는 상기 한국공개특허 제2001-0054264호에 개시된 분리방법들이 HPLC를 이용한 정제방법이기에, 상기 방법을 통해서는 활성물질을 소량으로밖에 분리하지 못해, 상업적으로는 적당하지 않음을 개시하고 있다. 따라서, 상기 한국등록특허 제509718호에서는 큰번데기동충하초로부터 코디세핀과 아데노신을 유효성분으로 포함하는 조코디세핀 분획물의 분리정제 방법으로서, (1) 큰번데기동충하초로부터 물 가용성 추출물 및 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급알콜 가용성 분획물을 수득하는 1단계, (2) 양이온교환수지에 흡착시켜 pH 6.0 이상에서 수득된 용출액으로 추가정제하는 2단계, (3) TLC를 통해 코디세핀과 아데노신을 포함하는 분획물을 수집하는 단계 및 음이온교환수지를 통과시켜 색소를 제거하고 용리시키는 3단계 및 (4) 흡착제에 불순물을 제거하여 최종 정제하는 4단계로 이루어진 제조공정을 개시하고 있다.
한편, 동충하초 균사체를 현탁배양할 경우 코디세핀이 배양여액으로 분비되는 사실은 이미 잘 알려진 사실이나 배양여액으로부터 다량의 코디세핀을 신속하게 분리하는 방법에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다. 따라서 본 발명자들은 동충하초의 자실체나 균사체로부터 코디세핀을 함유한 조성물을 분리해내는 종래기술과는 달리, 동충하초 균사체의 배양여액의 pH를 조절하고, 이를 부탄올 용액으로 추출하는 것만으로도 코디세핀 회수율이 최대한 높아져 코디세핀이 고농도로 함유된 추출물을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한국등록특허 제464876호 (동충하초의 코르디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물, 2004.12.24. 등록) 한국공개특허 제2001-0054264호 (동충하초로부터 항암제용 코디세핀의 제조방법, 2001.07.02. 공개) 한국등록특허 제509718호 (큰번데기동충하초로부터 항암 및 항백혈병 활성을 갖는아데노신을 함유하는 조 코디세핀의 분리 정제 방법, 2005.08.16. 등록)
Mains E.B., North America entomogenous Cordyceps. Mycologia 50, 169~222, 1985. Sung J.M., Cordyceps of Korea. Kyo-Hak publishing co. Seoul, 13~18, 1996. Kobayasi Y., The genus Cordyceps and its allies., Sci. Rept. Tokyo Bunrika daikaku Sect. B., 5, 253~260, 1940. Jianzhe Y. et al., Icons of Medicinal Fungi from China Science Press China., p.575, 1989. Humber R.A., Fungal pathogens of insects, spiders, and mites; isolation, preservation and identification., USDA Agricultural Reserch Service, 1990. Cunningham K.G. et al., Cordycepin, a metabolic product from cultures of Cordyceps militaris(Linn.) Link. Nature, 166, 949~954, 1950. Jagger D.V. et al., Inhibition of Ehrlich mouse ascite tumour growth by cordycepin., Cancer Res., 21, 216~220, 1961. Rottman F. et al., The inhibition of purine biosynthesis de novo in Bacillus subtilis by cordycepin., Biochem. Biophys. Acta., 80, 640~647, 1964.
본 발명의 목적은 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은,
(1공정) 동충하초 균사체의 배양여액을 pH 4.0 이상이 되도록 조절한 뒤, 30~70brix로 농축하는 단계;
(2공정) 상기 동충하초 균사체 배양여액의 30~70brix 농축액을 pH 4.0 이상이 되도록 조절하는 단계;
(3공정) 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액에, 부탄올 용액을 첨가하여 1차 추출한 뒤, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리하는 단계;
(4공정) 상기 1차 추출액의 상등액을 분리하고 남아있는 잔사에, 부탄올 용액을 첨가하여 2차 추출하고, 상기 2차 추출액의 상등액을 분리하는 단계; 및,
(5공정) 상기 3공정에서 분리된 1차 추출액의 상등액과 상기 4공정에서 분리된 2차 추출액의 상등액을 혼합한 뒤 여과하고, 상기 여과액을 건조하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 1공정에서 이용된 동충하초의 균사체는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 오피오글로쏘이데스(Cordyceps ophioglossoides), 코디셉스 소보리페라(Cordyceps sobolifera), 코디셉스 베아우베리아(Cordyceps beauveria) 및 코디셉스 바씨아나(Cordyceps bassiana)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 균사체일 수 있다.
상기 1공정의 동충하초 균사체의 배양여액은,
동충하초 균사체를 고체배지에 접종하여 배양하는 단계;
상기 고체배양된 동충하초 균사체를 액체배지에서 배양하는 단계; 및,
상기 액체배양된 동충하초 균사체의 배양액을 여과하여 동충하초 균사체의 배양여액을 얻는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 3공정에서, 부탄올 용액으로서, 바람직하게는 100% 부탄올을 사용할 수 있다.
상기 3공정에서, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액 100 중량부를 기준으로 부탄올 용액이 200~2000 중량부가 첨가될 수 있다.
또한, 상기 3공정에서, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액에 부탄올 용액을 첨가하고, 2~10시간 동안 교반하여 1차 추출이 수행될 수 있다.
상기 4공정에서, 부탄올 용액으로서, 바람직하게는 75~85% 부탄올 수용액인 수포화 부탄올을 사용할 수 있다.
상기 4공정에서, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리한 후 남아있는 잔사에, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액 100 중량부를 기준으로 부탄올 용액이 200~2000 중량부가 첨가될 수 있다.
또한 상기 4공정에서, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리한 후 남아있는 잔사에 부탄올 용액을 첨가하고, 2~10시간 동안 교반하여 2차 추출할 수 있다.
상기 5공정의 건조과정은, 여과액을 감압농축한 후, 공비농축 및 동결건조하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제공하며, 바람직하게는, 상기 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 혈관 질환은 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 더 자세하게 설명한다.
상기 1공정의 동충하초 균사체의 배양여액은, 통상의 방법으로 제조되는 동충하초 균사체의 액체배양을 통해 얻은 배양액을 여과하여 얻을 수 있으며, 그 배양 방법에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 바람직하게는,
동충하초 균사체를 고체배지에 접종하여 배양하는 단계;
상기 고체배양된 동충하초 균사체를 액체배지에서 배양하는 단계; 및,
상기 액체배양된 동충하초 균사체의 배양액을 여과하여 동충하초 균사체의 배양여액을 얻는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 고체배지로는 통상적인 미생물 배양용 고체배지가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PDA(Difco Potato Dextrose Agar) 등이 사용될 수 있다.
상기 액체배지에서 동충하초 균사체를 배양하는 단계는 배양횟수를 제한하지는 않지만, 1~6회에 걸쳐 단계적으로 배양하는 것이 균사체의 배양 활성을 증강시키기에 적합하다.
상기 액체배지에 이용될 수 있는 배지는, 통상적인 미생물 배양용 액체배지가 사용될 수 있으며, 바람직하게는, WIMG 생산배지(Glucose 20g/ℓ, Yeast extract 10g/ℓ, MgSO4 2.5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 0.46g/ℓ, Glycine 1g/ℓ)가 사용될 수 있다.
상기 고체배양은 20~30℃에서 5~15일 동안 배양될 수 있으며, 상기 액체배양은 20~30℃, 교반속도 50~500rpm에서 5~15일 동안 배양될 수 있으며, 경우에 따라, 통기량 0.1~2.0vvm의 조건을 추가하여 액체배양할 수도 있다.
또한, 상기 동충하초 균사체의 배양액은 통상적인 여과방법을 통해 여과가능하며, 바람직하게는 여과지, 부직포, 솜 등을 이용해 여과할 수 있다.
또한, 상기 1공정에서 동충하초 균사체 배양여액의 pH 4.0 미만이 되면 코디세핀의 회수율이 낮아질 수 있다. 배양 직후의 배양여액의 pH는 통상적으로 3.0~7.0 이내이며, 이 때, pH 4.0 미만의 배양여액을 농축하게 되면 코디세핀의 회수율이 낮아지게 된다. 또한, pH 조절은 4.0 이상이면 모든 pH 조건에서 코디세핀의 회수율이 높아지나, 바람직하게는 pH 4.0~10.0이 좋으며, 더욱 바람직하게는 pH 4.0~7.0이 더 좋다.
상기 1공정에서, 동충하초 균사체의 배양여액을 농축하는 단계는, 감압농축 방법을 이용해 농축할 수 있다. 상기 감압농축은 회전진공농축기를 사용하여 수행할 수 있다.
상기 1공정의 동충하초 균사체의 배양여액을 30~70brix로 농축함으로써, 배양여액의 부피를 줄여 제조공정을 용이하게 할 수 있으며, 제조시간 및 비용을 감축할 수 있다. 즉, 농축액의 농도가 30brix보다 낮을 경우, 그 만큼 농축액의 부피가 늘어나기 때문에 첨가되는 부탄올의 양이 늘어나서 경제적 부담이 발생하고, 코디세핀의 추출 수율이 낮아질 수 있다. 한편, 농축액의 농도가 70brix을 초과하게 되면, 이 후의 공정에서 교반 및 현탁이 잘 되지 않아서 추출이 잘 되지 않아, 마찬가지로 코디세핀의 추출 수율이 낮아질 수 있다.
상기 1공정 또는 2공정에서 pH의 조절은 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액이나 황산 수용액, 염산 수용액 등을 이용하여 조절할 수 있다.
상기 2공정에서 pH를 다시 조절하는 것은, 농축 과정에서 pH가 4.0 미만으로 낮아질 수 있기 때문이다. 또한, pH 조절은 4.0 이상이면 모든 pH 조건에서 코디세핀의 회수율이 높아지나, 바람직하게는 pH 4.0~10.0이 좋으며, 더욱 바람직하게는 pH 4.0~7.0이 더 좋으며, 가장 바람직하게는 pH 4.0~6.0이 제일 좋다.
상기 3공정 또는 4공정에서, 2공정의 pH가 조절된 농축액 100 중량부를 기준으로 부탄올 용액이 200~2000 중량부가 첨가될 수 있는데, 바람직하게는 200~600 중량부가 첨가되는 것이 좋다.
상기 3공정에서, 부탄올 용액으로서, 모든 농도의 부탄올 용액을 사용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 100% 부탄올을 사용할 수 있다.
상기 4공정에서, 부탄올 용액으로서, 모든 농도의 부탄올 용액을 사용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 75~85% 부탄올 수용액인 수포화 부탄올을 사용할 수 있다.
상기 5공정의 여과 과정은 1~3회 반복 수행할 수 있다. 또한, 상기 5공정의 여과 과정은, 통상적인 여과방법을 통해 수행가능하며, 바람직하게는 여과지, 부직포, 솜 등을 이용해 여과할 수 있다.
상기 5공정의 여과액은 감압 농축방법을 이용해 농축할 수 있으며, 잔존하는 용매를 완전히 제거하기 위해 물과 함께 공비농축을 한 후 감압건조, 분무건조, 또는 동결건조 등의 통상적인 건조 방법을 이용하여 건조할 수 있으며, 바람직하게는 동결건조 할 수 있다. 상기 감압농축 또는 감압건조는 회전진공농축기를 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법을 통해 얻은 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은 필요에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 유기용매(n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올)와 물의 분배, 컬럼 크로마토그래피에 의한 방법, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법 등을 단독 또는 적합하게 조합하여 더욱 정제할 수 있으며, 필요에 따라 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 크로마토그래피에는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 박층크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 중압크로마토그래피(MPLC, medium pressure liquid chromatography) 및 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 혈관 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은 천연물 유래의 조성물이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제가 첨가될 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 상기 건강기능식품으로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림을 포함한 낙농제품, 스프, 이온음료를 포함한 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제를 포함한 영양 공급용 제품이 포함될 수 있다.
본 발명은 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 통해 제조된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물은 코디세핀의 회수율이 뛰어나 고함량의 코디세핀이 포함된 추출물을 제조할 수 있으며, 기존에는 버려지던 동충하초 균사체의 배양여액으로부터 코디세핀이 포함된 유효성분을 추출함으로써 우수한 비용절감 효과를 가져올 수 있다. 또한, 상기 동충하초 균사체의 배양여액의 추출물은 혈관 질환의 치료 효과가 우수하여 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌졸중 등의 혈관질환의 약학 조성물로도 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지기 위해, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달할 수 있기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 동충하초 균사체의 분리 및 확인>
동충하초 자실체 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)의 조각을 2~3% 차아염소산나트륨 수용액에 1분간 살균한 후 살균된 자실체를 PDA 배지가 들어있는 페트리 디쉬(Petri-dish)의 뚜껑에 테잎(tape)으로 고정시켜 뚜껑을 덮었다. 이 후 PDA 배지 상에 떨어진 자낭포자로부터 생장한 균사체를 분리하여 이를 새로운 PDA 배지에 이식하고 동충하초 균사체 모균주로 이용하였다.
<실시예 2. 동충하초 균사체의 배양>
상기 실시예 1에서 분리 및 확인된 동충하초 균사체를 PDA(Difco Potato Dextrose Agar) 고체배지에 접종하여 24℃, 21일 동안 균체가 전체적으로 활착되도록 배양하여 1차 종배양하였다. 이 후, 상기 1차 종배양된 동충하초 균사체를 멸균된 메스를 이용하여 가로 세로 약 5㎜의 조각으로 잘라 10조각을 100㎖의 YM 배지(yeast minimal media, Glucose 10g/ℓ, Malt extract 3g/ℓ, Pepton 5g/ℓ, Yeast extract 3g/ℓ)가 들어있는 500㎖ 배플삼각플라스크(baffled flask)에 접종하여 24℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 100rpm으로 교반하면서 7일 동안 배양하였다. 2차 종배양 완료 후 수거된 동충하초 균사체를 블렌더(waring blender, Cole parmer Co.)를 이용하여 균질화시킨 후 3차 종배양으로서 200㎖ WIM(Glucose 20g/ℓ, Yeast extract 10g/ℓ, MgSO4 2.5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 0.46g/ℓ) 배지를 넣은 1ℓ 배플 삼각플라스크(baffled flask)에 상기 2차 종배양액을 10%(v/v)로 접종하였고, 24℃ 진탕배양기에서 100rpm으로 교반하면서 4일 동안 배양하였다. 4차 종배양은 상기 3차 종배양액을 3.6ℓ의 WIM 배지에 10%(v/v)로 접종한 후 배양온도 24℃, 통기량 0.25vvm, 교반속도 100rpm에서 1일 동안 배양하였다. 5차 종배양은 상기 4차 종배양액을 36ℓ의 WIM 배지에 10%(v/v)로 접종한 후 배양온도 24℃, 통기량 0.25vvm, 교반속도 100rpm에서 1일 동안 배양하였다.
본배양은 상기 4차 종배양액을 360ℓ의 WIMG 생산배지(Glucose 20g/ℓ, Yeast extract 10g/ℓ, MgSO4 2.5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 0.46g/ℓ, Glycine 1g/ℓ)에 10%(v/v)로 접종한 후 배양온도 24℃, 통기량 0.05~0.5vvm, 교반속도 50~100rpm에서 10일 동안 배양하여 최종적으로 동충하초 균사체의 배양액을 얻었다.
<실시예 3. 동충하초 균사체 배양여액의 농축액 제조>
동충하초 균사체 배양여액 농축공정에서의 pH 및 추출온도가 코디세핀 회수율에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 상기 실시예 2에서 얻은 동충하초 균사체의 배양액을 여과하여 동충하초 균사체를 제거한 배양여액을 얻었다. 이 후, 상기 배양여액 3ℓ씩을 하기 표 1의 조건으로 황산 수용액 또는 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 조절(1차 pH 조절)한 후, 농축액의 농도가 50brix가 되도록 회전진공농축기를 사용하여 농축함으로써 동충하초 배양여액의 50brix 농축액 50g을 얻었다(농축 전 배양여액의 농도는 1~2brix).
조건 조절된 pH 농축온도
실시예 3-1 4.0 60℃
실시예 3-2 5.0 60℃
실시예 3-3 6.0 60℃
실시예 3-4 7.0 60℃
실시예 3-5 10.0 60℃
실시예 3-6 4.0 80℃
실시예 3-7 5.0 80℃
실시예 3-8 6.0 80℃
실시예 3-9 7.0 80℃
실시예 3-10 10.0 80℃
실시예 3-11 4.0 100℃
실시예 3-12 5.0 100℃
실시예 3-13 6.0 100℃
실시예 3-14 7.0 100℃
실시예 3-15 10.0 100℃
실시예 3-16 4.0 40℃
실시예 3-17 10.0 40℃
<비교예 1. 비교대상 동충하초 균사체 배양여액의 농축액 제조>
상기 실시예 3과 동일하게 동충하초 균사체 배양여액의 농축액을 제조하되 농축온도와 pH를 하기 표 2의 조건으로 하여 제조하였다.
조건 조절된 pH 농축온도
비교예 1-1 2.0 60℃
비교예 1-2 3.0 60℃
비교예 1-3 2.0 80℃
비교예 1-4 3.0 80℃
비교예 1-5 2.0 100℃
비교예 1-6 3.0 100℃
비교예 1-7 2.0 40℃
비교예 1-8 3.0 40℃
<실시예 4. 동충하초 균사체 배양여액의 추출물 제조>
다음으로는 동충하초 균사체 배양여액의 용매 추출 공정에서의 pH 및 각 용매 종류가 코디세핀 회수율에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해, 실시예 3-2의 조건으로 동충하초 배양여액의 50brix 농축액을 준비하였다. 이 후, 상기 50brix 농축액 100g을 하기 표 3의 조건으로, pH를 조절(2차 pH 조절)한 뒤, 1차 추출용매 300g을 첨가한 후 60℃에서 4시간 동안 교반하여 1차 추출하였다. 1차 추출된 상등액을 분리한 후 남아있는 농축액에 다시 2차 추출용매 400g을 첨가한 후 60℃에서 4시간 동안 교반하면서 2차 추출하였다. 2차 추출된 상등액을 분리하여 1차 추출 상등액과 혼합한 후 여과지로 2회 여과하였다. 상기 여과액을 회전진공농축기를 사용하여 60℃에서 감압농축하였고, 잔존하는 용매를 완전히 제거하기 위해 물과 함께 공비농축한 후 동결건조하여 동충하초 배양여액의 추출물을 제조하였다.
조건 실시예 3-2
농축액의 pH 조절		 1차 추출용매 2차 추출용매 추출
온도
실시예 4-1 pH 4.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃
실시예 4-2 pH 4.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃
실시예 4-3 pH 5.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃
실시예 4-4 pH 5.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃
실시예 4-5 pH 6.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃
실시예 4-6 pH 6.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃
실시예 4-7 pH 7.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃
실시예 4-8 pH 6.0 수포화 부탄올 100% 부탄올 60℃
< 비교예 2. 비교대상 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조>
본 발명의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 효과를 다른 추출조건과 비교하기 위해 하기 표 4의 조건으로 비교대상 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하였다(표 4 이외의 조건은 상기 실시예 5와 동일하게 하였으며, 하기 표 4에 2차 추출용매가 없는 것은 1차 추출만 수행하여 추출물을 여과 및 건조한 경우임).
조건 실시예 3-2
농축액의 pH 조절		 1차 추출용매 2차 추출용매 추출
온도
비교예 2-1 pH 3.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-2 pH 3.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃
비교예 2-7 pH 6.0 에탄올 - 60℃
비교예 2-8 pH 6.0 에탄올 100% 부탄올 60℃
비교예 2-9 pH 6.0 에탄올 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-10 pH 6.0 메탄올 - 60℃
비교예 2-11 pH 6.0 메탄올 100% 부탄올 60℃
비교예 2-12 pH 6.0 메탄올 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-13 pH 6.0 에틸아세테이트 - 60℃
비교예 2-14 pH 6.0 에틸아세테이트 100% 부탄올 60℃
비교예 2-15 pH 6.0 에틸아세테이트 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-16 pH 6.0 헥산 - 60℃
비교예 2-17 pH 6.0 헥산 100% 부탄올 60℃
비교예 2-18 pH 6.0 헥산 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-19 pH 6.0 에테르 - 60℃
비교예 2-20 pH 6.0 에테르 100% 부탄올 60℃
비교예 2-21 pH 6.0 에테르 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-22 pH 6.0 클로로포름 - 60℃
비교예 2-23 pH 6.0 클로로포름 100% 부탄올 60℃
비교예 2-24 pH 6.0 클로로포름 수포화 부탄올 60℃
비교예 2-28 pH 6.0 100% 부탄올 - 60℃
비교예 2-29 pH 6.0 수포화 부탄올 - 60℃
<실험예 1. 동충하초 균사체 배양여액 농축공정에서의 pH 및 추출온도가 코디세핀 회수율에 미치는 영향 확인>
상기 실시예 3 및 비교예 1의 동충하초 배양여액의 농축액에서, pH를 조절하기 전의 총 배양여액의 코디세핀 총 함량을 100%로 할 때, 상기 50brix 농축액에 포함된 코디세핀의 회수율(%)을 하기 표 5에 나타내었다. 코디세핀의 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였다.
기기 : Waters (Waters e2695 module, Waters 2998 PDA)
컬럼 : Waters Spherisorb?? 10㎛ ODS2 컬럼 (4.6 × 250㎜ Analytical)
유속 : 1㎖/min
파장 :　254㎚
이동상 : 0.01M KH2PO4의 15% 메탄올
조건 조절된 pH 농축온도 코디세핀의 회수율 (%)
실시예 3-1 4.0 60℃ 98.2
실시예 3-2 5.0 60℃ 100.0
실시예 3-3 6.0 60℃ 98.5
실시예 3-4 7.0 60℃ 99.4
실시예 3-5 10.0 60℃ 98.9
실시예 3-6 4.0 80℃ 96.8
실시예 3-7 5.0 80℃ 98.2
실시예 3-8 6.0 80℃ 99.0
실시예 3-9 7.0 80℃ 99.2
실시예 3-10 10.0 80℃ 99.5
실시예 3-11 4.0 100℃ 92.2
실시예 3-12 5.0 100℃ 100.0
실시예 3-13 6.0 100℃ 99.9
실시예 3-14 7.0 100℃ 98.6
실시예 3-15 10.0 100℃ 98.6
실시예 3-16 4.0 40℃ 95.3
실시예 3-17 10.0 40℃ 96.5
비교예 1-1 2.0 60℃ 71.9
비교예 1-2 3.0 60℃ 72.3
비교예 1-3 2.0 80℃ 58.1
비교예 1-4 3.0 80℃ 71.5
비교예 1-5 2.0 100℃ 0.0
비교예 1-6 3.0 100℃ 72.0
비교예 1-7 2.0 40℃ 77.1
비교예 1-8 3.0 40℃ 77.5
상기 표 5를 참고하면, pH 4~10 사이에서 거의 100%에 가까운 코디세핀 회수율을 나타내는 것이 확인된다. 따라서 동충하초 균사체 배양여액을 pH 4.0 이상으로 pH를 조절하는 것이 바람직하다고 판단되었다. 또한, pH4.0 이상에서는 농축시의 온도가 코디세핀의 회수율에 많은 영향을 주지는 않는 것으로 확인되었다.
한편, 낮은 pH로 농축된 시료를 HPLC로 분석한 결과, 코디세핀 peak는 감소하고 다른 위치에 unknown peak가 증가하는 것으로 확인되어, 코디세핀이 분해되어 활성이 없는 다른 화합물로 변환되는 것으로 나타났다.
<실험예 2. 동충하초 균사체 배양여액의 부탄올 추출 공정에서의 용매 및 pH가 코디세핀 회수율에 미치는 영향 확인>
두 번째 pH를 조절하기 전의 최초 동충하초 배양여액의 50brix 농축액의 코디세핀 총 함량을 100%로 할 때, 실시예 4 및 비교예 2의 최종 동충하초 배양여액의 추출물에 포함된 코디세핀의 회수율(%)을 하기 표 6에 나타내었다. 코디세핀의 함량은 실험예 1에 개시된 방법을 동일하게 이용하였다.
조건 실시예 3-2
농축액의 pH 조절		 1차 추출용매 2차 추출용매 추출
온도		 코디세핀
회수율 (%)
실시예 4-1 pH 4.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃ 97.6
실시예 4-2 pH 4.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃ 96.7
실시예 4-3 pH 5.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃ 96.5
실시예 4-4 pH 5.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃ 96.8
실시예 4-5 pH 6.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃ 98.9
실시예 4-6 pH 6.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃ 97.6
실시예 4-7 pH 7.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃ 95.2
실시예 4-8 pH 6.0 수포화 부탄올 100% 부탄올 60℃ 92.1
비교예 2-1 pH 3.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 60℃ 76.8
비교예 2-2 pH 3.0 100% 부탄올 수포화 부탄올 100℃ 72.7
비교예 2-7 pH 6.0 에탄올 - 60℃ 57.5
비교예 2-8 pH 6.0 에탄올 100% 부탄올 60℃ 75.9
비교예 2-9 pH 6.0 에탄올 수포화 부탄올 60℃ 76.5
비교예 2-10 pH 6.0 메탄올 - 60℃ 63.6
비교예 2-11 pH 6.0 메탄올 100% 부탄올 60℃ 78.4
비교예 2-12 pH 6.0 메탄올 수포화 부탄올 60℃ 77.4
비교예 2-13 pH 6.0 에틸아세테이트 - 60℃ 18.0
비교예 2-14 pH 6.0 에틸아세테이트 100% 부탄올 60℃ 68.1
비교예 2-15 pH 6.0 에틸아세테이트 수포화 부탄올 60℃ 70.5
비교예 2-16 pH 6.0 헥산 - 60℃ 0.0
비교예 2-17 pH 6.0 헥산 100% 부탄올 60℃ 61.2
비교예 2-18 pH 6.0 헥산 수포화 부탄올 60℃ 56.5
비교예 2-19 pH 6.0 에테르 - 60℃ 0.0
비교예 2-20 pH 6.0 에테르 100% 부탄올 60℃ 65.3
비교예 2-21 pH 6.0 에테르 수포화 부탄올 60℃ 55.1
비교예 2-22 pH 6.0 클로로포름 - 60℃ 0.59
비교예 2-23 pH 6.0 클로로포름 100% 부탄올 60℃ 63.7
비교예 2-24 pH 6.0 클로로포름 수포화 부탄올 60℃ 57.2
비교예 2-28 pH 6.0 100% 부탄올 - 60℃ 62.1
비교예 2-29 pH 6.0 수포화 부탄올 - 60℃ 55.0
** 수포화 부탄올 : 75~85% 부탄올 수용액
상기 표 6을 참고하면, 동충하초 배양여액의 50brix 농축액을 부탄올로 추출하는 공정에서 농축액의 pH에 따라 코디세핀의 회수율이 차이가 나는 것이 확인되었다. 즉, pH 4.0 미만에서는 80% 이하의 낮은 코디세핀 회수율을 나타낸 반면 pH 4.0 이상에서는 90% 이상의 코디세핀 회수율을 보여 회수율이 차이가 무척 큰 것으로 나타났다. 따라서 동충하초 배양여액 농축액을 pH 4.0 이상으로 조절해야 코디세핀의 회수율이 높아지는 것을 알 수 있었다. 한편, pH4.0 이상에서는 부탄올 추출온도가 코디세핀의 회수율에 큰 영향을 주지는 않는 것으로 확인되었다.
<실험예 3. 허혈성 뇌졸중 억제 효과>
상기 실시예 4 및 비교예 2의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 허혈성 뇌졸중 억제 효과를 확인하였다. 실험동물로는 체중 260~300g의 수컷 Spargue-Dawley계 흰쥐를 사용하였으며, 20℃ 정도의 실내온도 및 항습이 유지되면서 12시간의 밤-낮 주기가 일정하게 관리되는 사육실내에서 사육하였다. 또한, 수술 전날 밤부터 수술 당일까지는 먹이공급을 중단하였으며, 물은 지속적으로 공급하였다. 허혈성 뇌졸중의 억제 효과를 확인하기 위해서는, 실험동물을 7:3의 부피비로 혼합된 N2O와 O2 혼합 가스와 3% 이소플루란(isoflurane)으로 마취시킨 후, 실험동물의 온목동맥(common carotid artery)과 바깥목동맥(external carotid artery)을 결찰하고, 손목동맥(internal carotid artery)의 분지점으로부터 19㎜의 probe(약 2.1cm의 4-0 수술용 나일론실의 한쪽 끝을 불에 그을려 둥글게 만듦)를 삽입하여 오른쪽 중간대뇌동맥을 결찰(right sheath endovascular middlecerebral artery occlusion)하여 국소적 뇌허혈을 유발시켰다. 이 후, 90분 동안 중간대뇌동맥의 혈류 흐름을 차단하여 허혈 상태를 유지시킨 후, 수술부위를 다시 노출시켜 probe를 제거하고 재관류시켰다. 재관류시킨 실험동물의 절개된 피부를 수술용 봉합사를 이용하여 완전히 봉합하고, 전 실험과정 중 사용된 hot pad를 이용하여 실험동물의 직장 체온이 36~37℃ 이하로 떨어지지 않도록 계속해서 유지시켰다. 상기 실시예 4 및 비교예 2의 시료는 허혈 유발 후 3시간과 8시간 째에 두번씩 경구투여하였다(각각 100㎎/㎏). 이 때 대조군에는 어떤 시료도 처리하지 않았다. 다음으로는 중간대뇌동맥의 재관류 후 24시간에 동물을 치사시켜 실험동물의 뇌를 적출한 후 뇌형상틀을 이용하여 2㎜ 두께로 뇌절편을 만든 다음 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(2,3,5-triphenyltetrazonlium chloride, TTC) 용액에 37℃에서 20~30분 동안 침적하였다. 발색반응을 확인 후 뇌절편을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정한 후, 뇌경색 부위를 영상분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 허혈에 의한 경색 면적은 전체 뇌부피에 대한 비율(%)로 나타내었으며 이에 대한 결과는 표 7에 나타내었다.
양성대조군으로는 흥분성 신경독성 억제제인 NMDA 수용체 차단제 MK-801 {(+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine maleate}을 사용하였다.
조건 Infarct volume (%)
실시예 4-1 8.7
실시예 4-6 7.6
실시예 4-7 8.3
실시예 4-8 9.2
비교예 2-1 17.4
비교예 2-7 23.4
비교예 2-9 21.8
비교예 2-15 20.6
비교예 2-17 22.0
대조군 30.0
양성대조군(MK-801) 9.69
표 7에 나타낸 바와 같이 중간대뇌동맥 폐색/재관류 손상 모델 뇌의 뇌경색 부위에서 실시예 4의 시료들은 비교예 2의 시료들에 비해 허혈에 의한 경색 면적의 부피가 현저하게 줄어들어 뇌조직 보호작용이 뛰어난 것으로 확인되었다.
<실험예 4. 독성실험>
실험예 4-1. 급성독성
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군에 10마리, 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았으며, 실험군은 실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 2.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 50배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 투여한 실험군은 모두 생존하였다.
실험예 3-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험
C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 2.0g/㎏ 농도로 1회 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.
<사용예 1. 약학적 제제예>
사용예 1-1. 정제의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물 20g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
사용예 1-2. 주사액제의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물 2g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<사용예 2. 식품 제조예>
사용예 2-1. 조리용 양념의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 0.2~10 중량%로 하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
사용예 2-2. 밀가루 식품의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 0.1~5.0 중량%로 하여 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
사용예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 0.1~1.0 중량%로 하여 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
사용예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 0.1~1.0 중량%로 하여 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<사용예 3. 음료 제조예>
사용예 3-1. 야채쥬스 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
사용예 3-2. 과일쥬스 제조
실시예 4-1의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims (15)

  1. (1공정) 동충하초 균사체의 배양여액을 pH 4.0 이상이 되도록 조절한 뒤, 30~70brix로 농축하는 단계;
    (2공정) 상기 동충하초 균사체 배양여액의 30~70brix 농축액을 pH 4.0 이상이 되도록 조절하는 단계;
    (3공정) 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액에, 부탄올 용액을 첨가하여 1차 추출한 뒤, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리하는 단계;
    (4공정) 상기 1차 추출액의 상등액을 분리하고 남아있는 잔사에, 부탄올 용액을 첨가하여 2차 추출하고, 상기 2차 추출액의 상등액을 분리하는 단계; 및,
    (5공정) 상기 3공정에서 분리된 1차 추출액의 상등액과 상기 4공정에서 분리된 2차 추출액의 상등액을 혼합한 뒤 여과하고, 상기 여과액을 건조하는 단계;를 포함하여 제조되며,
    상기 1공정에서 이용된 동충하초 균사체는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)인 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 1공정의 동충하초 균사체의 배양여액은,
    동충하초 균사체를 고체배지에 접종하여 배양하는 단계;
    상기 고체배양된 동충하초 균사체를 액체배지에서 배양하는 단계; 및,
    상기 액체배양된 동충하초 균사체의 배양액을 여과하여 동충하초 균사체의 배양여액을 얻는 단계;
    를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 3공정에서, 부탄올 용액으로서 100% 부탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3공정에서, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액 100 중량부를 기준으로 부탄올 용액이 200~2000 중량부가 첨가되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 3공정에서, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액에 부탄올 용액을 첨가하고, 2~10시간 동안 교반하여 1차 추출이 수행되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 4공정에서 부탄올 용액으로서 75~85% 부탄올 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 4공정에서, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리한 후 남아있는 잔사에, 상기 2공정의 pH가 조절된 농축액 100 중량부를 기준으로 부탄올 용액이 200~2000 중량부가 첨가되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 4공정에서, 상기 1차 추출액의 상등액을 분리한 후 남아있는 잔사에 부탄올 용액을 첨가하고, 2~10시간 동안 교반하여 2차 추출이 수행되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 5공정의 건조과정은, 여과액을 감압농축한 후, 공비농축 및 동결건조하여 수행되는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 배양여액의 추출물의 제조방법.
  11. 제1항, 제3항 내지 제10항 중의 어느 한 항의 방법으로 제조된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물.
  12. 제11항의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 삭제
  14. 제11항의 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 삭제
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