KR102235096B1 - 식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도 - Google Patents

식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 탄저병, 식물 병원성 바이러스 및 식물 유충의 방제효과가 우수한 신규한 페니실리움 파실리 균주와 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 페니실리움 파실리 균주는 Penicillium paxilli Chm121 균주로서 기탁번호가 KCTC 14334BP인 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도{Penicillium paxilli microorganism having an effect of preventing plant disease and insect damage and use thereof}
본 발명은 식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 탄저병은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채(野菜), 수목(樹木) 등 300 여종의 농작물, 식물에 Glomerella, Colletotrichum 속에 의하여 주로 발생되고 있으며, 그 피해는 대단히 심각하다.
고추탄저병은 고추역병과 더불어 고추 생산에 커다란 저해요인 중의 하나로 5 종의 탄저병이 잎, 줄기, 가지, 종자 및 과일에 병을 일으키는데, 주로 성숙한 과일에 발생하는 과일탄저병에 의한 피해가 95 % 이상으로 가장 피해가 직접적이고 치명적이다. 탄저병은 근래 고추 재배에서 크게 문제가 되고 있으며, 푸른 과실과 붉은 과실에 모두 병을 일으키는 탄저와 주로 붉은 과실에 검은 점이 겹무늬로 생기면서 썩는 흑색 탄저가 있다.
특히, 고추탄저병(anthracnose)은 진균계의 자낭균문에 속하는 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속에 의해 발생하는데, 유묘기에는 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 고추 열매는 콜레토트리쿰 클로에오스포리오이데스(C. gloeosporioides)와 콜레토트리쿰 아큐타툼(C. acutatum)에 의해 발병된다. 이 병원균은 자낭포자와 분생포자를 형성하여 주변으로 전염시키고 균사나 분생포자 형태로 월동한다. 발병을 위한 최적 온도는 26~28℃이고 습한 환경에서 발병하기 쉽다. 탄저병은 주로 풋고추가 생성되어 수확기까지 주로 발생하며 발생 초기에는 과실에 수침상으로 원형반점이 생기고 점차 원형으로 확대되어 간다. 병이 심하게 진전되면 담황색의 포자덩어리가 형성되어 과실이나 줄기가 말라 죽게 된다.(George N.Agrios, Plant pathology, World Science, 5th edition, p. 483-487, 2006)
상기와 같은 식물 탄저병은 다대한 농약의 처리를 통해 이루어져 왔다. 그러나, 계속적인 화학 농약의 사용은 그 동안 무차별한 남용으로 인해 농약 중독, 지하수 오염, 토양 오염, 인축에 대한 독성, 농산물 중의 잔류, 각종 병해충 및 잡초에 대한 저항성 개체 출현 등과 같은 부작용을 초래하였다. 한편, 1992년 UN 환경개발회의의 리우 선언 이후 지구 환경 보호를 위한 노력이 진행되었고, WTO가 설립되면서 환경과 무역을 연계시킨 국제 무역 다자간 협상, 즉 그린라운드가 본격적으로 진행되면서 인류에게 식량을 제공하는 농업도 환경친화적 농업으로 전환이 필요하였다. 이러한 화학 농약 사용의 문제점을 해결하기 위해 미생물 자체 또는 그 기능을 직접 및 간접적으로 이용하는 생물 농약이 최근에 주목을 받고 있다.
"생물 농약"이란 농작물의 해충 및 병원미생물, 잡초를 방제하기 위하여 자연환경에서 분리 채집된 미생물 및 천연 물질, 천적 등을 제품화한 것으로 정의하고 있다. 이러한 생물 농약은 화학 농약에 비하여 약효의 발현 및 지속기간이 길며, 농약의 개발기간 및 개발비용이 화학 농약에 비해 저렴하고, 인축에 대한 독성 및 환경파괴 등과 같은 부작용이 없다는 장점이 있다.
이에, 상기와 같은 식물 탄저병에서는 기존의 화학 농약을 사용하는 대신 생물 농약을 사용하는 시도가 이루어져 왔다. 특히, 식물탄저병의 방제를 위해 Bacillus 속 또는 Streptomycess 속에 의한 미생물 처리가 주로 이루어져 왔다.
농약의 피해를 줄이고 청정 유기농을 진행하는데 있어 Bacillus 등의 계통의 세균을 많이 검증해왔으나, 단편적인 연구에 국한되어 있었다. 이에, 제어기술의 향상과 지구생태계 미생물의 다양한 연구개발이 필요하며, 산업화의 전용단계는 아직 요원한 것으로 보인다. 더욱이 전용(專用)미생물제제의 생물농약은 아직 등록이 안 되어 있고, 시장에도 거의 없는 상태이다. 단지 몇 건의 특허와 유사 바이오 농약이 있으나, 그 효과는 미약하여 기존의 화학농약과 경쟁력이 없으며, 올바른 미생물 균형자(均衡子)의, 조정자(調整子)의 개발이 아직 많이 부족하다. 대부분의 농작물은 공통적인 병원체(곰팡이 균, 바이러스 등)로 인하여 10여종의 병충해 질병을 갖게 되므로, 이를 바르게 대응하면, 모든 병충해는 예방 제어가 가능하다. 병충해는 특수한 조건에서 품종의 내병성, 환경, 병원균이 다 중복되는 접점에서 발생되는데, 이때 균형조정자의 역할이 중요하다고 본다. 종자, 공기, 토양, 곤충을 통하여 전파 매개되는 병원체는 미생물 균형자의 작용으로 조절이 가능한 과정이다.
이에 보다 더 정확하고 강력한 친환경 농업의 유기농을 견인할 미생물 전용 바이오 제제에 대한 필요성이 있다. 현재 시장은 친환경 전용 바이오 농약을 고대하고 있다.
한국 등록특허 제 10-1681810 호 한국 등록특허 제 10-1349087 호 한국 등록특허 제 10-0854721 호 한국 등록특허 제 10-0602430 호 한국 등록특허 제 10-0239209 호 한국 등록특허 제 10-0815106 호 한국 등록특허 제 10-0952632 호 한국 등록특허 제 10-1079294 호 한국 등록특허 제 10-0976760 호 한국 등록특허 제 10-1156035 호 한국 등록특허 제 10-1182020 호 한국 등록특허 제 10-1406823 호 한국 등록특허 제 10-1407191 호 한국 등록특허 제 10-1466219 호 한국 등록특허 제 10-1642772 호
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자는 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 동충하초 강의 진균류로서 바람직한 전용 미생물 농약 제제를 제공하고자 한다. 본 발명의 일측면에서, 생태계 생물권의 항상성(homeostasis)을 조절할 수 있는 균형자 미생물을 제공하고자 하며, 본 발명은 새로운 획기적인 자연계 균주를 분리 규명하여, 식물 탄저병을 비롯한 식물 병충해의 발생을 근원적으로 치유, 예방하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 일측면은 식물 탄저병과 더불어서 세계적으로 900 여종의 식물에 피해를 주고 있고, 한국에서도 고추, 토마토, 국화 등 29종의 작물에서 탄저병과 같이 발생되는 고추의 토마토 반점위조(斑點萎凋) 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 병을 탄저병과 동시에 방제하는 미생물 제제를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 일측면은 농작물의 탄저병과 TSWV를 동시에 제어 이외에, 기주식물 별꽃에서 총채벌레를 매개충으로 하여 전파되는 TSWV 바이러스는 관련특허가 전무한 상태이다. 본 발명은 이러한 어려운 문제를 해결할 수 있고, 생태계의 균형조정자가 될 수 있는 획기적인 신 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 14334 BP로 기탁된 페니실리움 파실리 Chm121 (Penicillium paxilli Chm121) 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페니실리움 파실리 Chm121 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 페니실리움 파실리 Chm121 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 하나의 다른 목적은 상기 페니실리움 파실리 Chm121 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물에 기생하는 유충의 방제 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은 식물 병원성 미생물 및 식물 병원성 바이러스에 항균력을 갖는 페니실리움 파실리 (Penicillium paxilli ) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균)계 Ascomycota문(子囊菌) Eurotiomycetes강(눈꽃동충하초) Eurotiales목(메주곰팡이) Trichocomaceae과(腐生) Penicillium속 paxilli종의 strain으로서 경기도 산악지역에서 순수분리한 야생종이며, 농작물 탄저균 Glomerella sp.와 Colletotrichum sp.의 10여종에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 10 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 미생물은 식물 탄저균인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 탄저균은 Glomerella속 탄저균 및 Colletotrichum속 탄저균 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 ITS 1,2의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 페니실리움 파실리 Chm121인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 14334BP인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 Glomerella속 및 Colletotrichum acutatum 42509, Colletotrichum acutatum 43126, Colletotrichum acutatum 44886, Colletotrichum acutatum 45723, Colletotrichum acutatum 40042, Colletotrichum acutatum 40689, Colletotrichum acutatum 40691, Colletotrichum acutatum 40804, Colletotrichum acutatum 42508 및 Colletotrichum coccodes 40009 탄저균 중 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물에 기생하는 유충의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 중 어느 하나 이상인, 식물에 기생하는 유충의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 식물 병원성 미생물, 식물 병원성 바이러스 또는 식물에 기생하는 유충 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균)계 Ascomycota문(子囊菌) Eurotiomycetes강(눈꽃동충하초) Eurotiales목(메주곰팡이) Trichocomaceae과(腐生) Penicillium속 paxilli종의 strain으로서 경기도 산악지역에서 순수분리한 야생종이며, 농작물 탄저균 Glomerella sp.와 Colletotrichum sp.의 10여종에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 농작물 탄저균 이외 TSWV 바이러스의 제어에도 매우 탁월한 효과를 나타내어 곰팡이 균류 이외 농작물 바이러스 제어에도 활용이 가능하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 실험실과 공장에서 25℃, PDA(potato dextrose agar, pda), PDB(potato dextrose broth, pdb)배지에서 용이하게 배양할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 대규모 생산이 조기에 가능하며, 고추 및 농작물의 탄저병, 바이러스 병해에 다양하게 적용할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 전용 미생물 제제로서 친환경 및 유기농 농작물 재배에 혁신적인 기여를 할 수 있다. 전용 미생물제제의 등록과 국내외 바이오 제제를 현저히 앞서가는 획기적인 친환경 농업 향상의 우수 상품이 될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균주의 특성상 병충해 유충의 균사침투 및 균사증식으로 대사산물의 기능 활성에 의한 병충해 유충의 사멸이 가능하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 곤충, 나방 유충에 의한 농작물, 식물, 특히 소나무 재선충의 방제에도 효과가 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 고내열성으로 고추농사 절기상 5월초~9월초 사이에 시비함이 적합하다. 이는 각기 다른 농작물 절기에도 기온이 높은 경우에 더 효율적인 기능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 고추탄저균, TSWV바이러스 감염부위를 선택 집중적으로 제어하는 균사 증식 및 감염원을 분해 사멸시키는 분자 신호전달 과정을 보여준다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본원발명 실시예 1에서 대한민국 경기도 산악지역에서 분리한 균주를 PDA 배지에서 순수계대 배양 1주 후의 사진이다.
도 2는 본원발명 실시예 2에서 PDA 배지에서 상기 실시예 1의 균주를 2~3주 배양한 사진 및 균사의 위상차 사진(400배, ph2)이다.
도 3은 ITS 시퀀스의 참고도면이다.
도 4a는 본원발명 실시예 1 균주의 ITS 서열 분석 결과이다.
도 4b는 본원발명 실시예 1 균주의 계통도이다.
도 5는 농진청으로부터 분양받은 탄저균의 실제 사진이며, 도 6은 도 5 탄저균의 종류를 도식화한 것이다.
도 7은 Colletotrichum acutatum 45723 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사) 이다.
도 8은 Colletotrichum acutatum 40042 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 9은 Colletotrichum acutatum 43126 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 10은 Colletotrichum acutatum 42508 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 11은 Colletotrichum acutatum 44886 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 12은 Colletotrichum acutatum 42509 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 13은 Colletotrichum acutatum 40804 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 14은 Colletotrichum acutatum 40691 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 15은 Colletotrichum acutatum 40689 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사)이다.
도 16은 Colletotrichum coccodes 40009 균주를 pda배지에 배양후 Penicillium paxilli Chm121를 접종하여 재배양시 나타난 탄저균의 사멸과 Chm121의 대거증식형태 (흰부분 균사) 이다.
도 17은 면천 노지(露地) 시험포에서 토마토 반점위조 바이러스(TSWV)에 감염된 고추시료에서 분리한 TSWV균주를 PDA배지상에서 제어하는 Penicillium paxilli Chm121 (흰 균사) 균주사진이다.
도 18은 면천 노지 시험포에서 탄저병에 감염된 고추시료에서 분리한 탄저균주를 PDA 배지상에서 제어하는 Penicillium paxilli Chm121 (흰 균사) 균주 사진이다.
도 19는 자연상태의 토마토 반점위조 바이러스(TSWV)로 감염된 면천 노지 시험포의 고추 시료이다.(2020.8.10.)
도 20은 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 2일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양 하였다.(2020.8.14.)
도 21은 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 7일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양하였다.(20.8.19.)
도 22는 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 9일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양하였다.(20.8.21.)
도 23은 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 14일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양하였다.(20.8.26.)
도 24는 자연상태의 고추 탄저균으로 감염된 면천 노지 시험포의 고추시료 사진이다.(2020.8.10)
도 25는 Penicillium paxilli Chm121을 접종 후 2일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양하였다.(2020.8.14.)
도 26는 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 7일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25 C 배양하였다.(20.8.19.)
도 27는 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 9일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25 C 배양하였다.(20.8.21)
도 28는 Penicillium paxilli Chm121을 접종후 14일 경과된 감염부위의 Chm121 균사 증식상태이다. 상기 배양은 25℃ 배양하였다.(20.8.26)
도 29는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포전의 탄저균이 자연발생(태풍 장마이후), 감염된 면천 노지 시험포 상태이다.(2020.9.8)
도 30는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 6일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추 부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.14)
도 31는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 9일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(20.9.17)
도 32는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 15일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.23)
도 33는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 6일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.14)
도 34는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 9일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.17)
도 35는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 9일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.17)
도 36는 Penicillium paxilli Chm121 분무 살포후 9일 경과, 탄저균이 감염된 특정 고추부위에 증식된 Chm121 균주의 균사 상태(흰 부분)이다.(2020.9.17)
도 37는 면천 노지 시험포의 Penicillium paxilli Chm121 균주 분무 살포과정으로, 2020.9.8.~9.23 자의 사진이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값 들 뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들 뿐 만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 균주는 한국 산악지역에서 분리한 Penicillium paxilli Chm121 균주이며, 상기 균주는 한국농진청의 고추탄저균 KACC: Colletotrichum sp.를 분양하여 Colletotrichum acutatum 42509, 43126, 44886, 45723, 40042, 40689, 40691, 40804, 42508 및 Colletotrichum coccodes 40009 10여종을 pda배지에서(도 1), 그리고 시험포에서 채취한 비이커 내의 탄저고추 시료에서 탄저균을 모두 제어하는 효과를 확인하였다. 또한, 본 발명의 균주는 노지(露地)의 고추밭 시험포에서도 자연발생된 탄저균을 선택적으로 제어하는 효과를 확인하였다. 또한, 본 발명의 균주는 TSWV(Tomato spotted wilt virus, 토마토 반점위조 바이러스)가 감염된 노지 시험포에서 채취한 고추, 비이커 내의 고추시료에서도 TSWV가 선택적으로 제어 치유되는 현상을 나타내었다. 본 발명의 균주는 섭씨 121도 30분 멸균에서도 죽지 않고 살아남는 고 내열성 균주로 확인되었으며, 그러한 기능은 고추 및 농작물의 고온 성숙 환경에서 탄저병 및 TSWV를 효율적으로 제어하는 작용으로 보고 있다.
농작물의 탄저병을 발생시키는 탄저균은 진균류로서 농약 및 생물제제로서 제어하기가 대단히 어려운 미생물 종이며, TSWV를 발생시키는 바이러스도 제어하기 어렵다. 이러한 특성과 여건에서 본원발명은 생태계의 균형자가 될 수 있는 Keystone species의 신 균주를 찾아내어 근원적인 대책을 확립하고자 한다. 농업, 자연 생태계의 균형자로서 기능과 작용을 할 수 있는 미생물 균주를 자연계에서 찾아내어 생태 순리에 맞게 활용하고자 한다. 농업의 청정유기농 향상과 지구환경의 복원에 역할을 할 수 있을 것이다.
본원발명은 Penicillium paxilli의 strain으로서 고추탄저병, TSWV(고추 토마도 반점 위조바이러스병, Tomato spotted wilt virus) 바이러스의 질병에 획기적인 제어기능을 하는 미생물제제를 제공한다.
본원발명의 Penicillium paxilli Chm121은 고추 이외 대부분 농작물(고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 등)의 탄저병과 TSWV 바이러스 질병에 사용가능한 미생물제제이다.
본원발명은 PDB(potato dextrose broth) 배지와 기타 조성 배지에서 배양한 본원발명의 균주의 멸균 처리된(121℃) 배양액을 이용한 고추 및 기타 농작물의 탄저병, TSWV감염의 제어방제 방법을 제공한다.
본원발명은 PDB 배지와 기타 조성된 배지에서 배양한 본원발명의 균주의 생균 배양액을 이용한 고추 및 기타 농작물의 탄저병, TSWV의 제어방제 방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Penicillium paxilli Chm121 배양액 멸균체와 배양액 생균을 원심분리한 후 순수 상등액 및 멤브레인 등의 여러 여과방식에 의한 여과를 한 후 순수 여과액 그리고 이들 여과액, 상등액, 순수배양액을 재공정하여 만든 분말, 과립 등의 형태로 탄저균과 TSWV 등의 병충해 방제와 토양개량 등에 사용하는 방법과 제품을 제공한다.
본원발명은 기탁번호가 KCTC 14334BP인 Penicillium paxilli Chm121 야생 분리 신균주 및 이를 포함한 미생물 제제를 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Penicillium paxilli Chm121 및 이를 포함한미생물 제제를 사전 분무 살포하는 단계를 포함하는, 고추밭 주변 별꽃 등의 풀밭 꽃노랑 총채벌레 매개충의 유충제어(Chm121의 특성상 유충침투 균사기능 및 균사증식으로 유충사멸)로 TSWV 감염의 근원적인 방제방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Penicillium paxilli Chm121 및 이를 포함한미생물 제제를 대상 식물에 공급되는 토양 및 수분 중 어느 한 곳 이상에 분무 살포하는 단계를 포함하는, 농작물 탄저병의 예방방법을 제공한다.
본원발명은 본원발명의 균주인 Penicillium paxilli Chm121 및 이를 포함한미생물 제제를 분무 살포하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충을 포함한 기타 농작물의 곤충, 나방 등의 유충을 방제하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은 식물 병원성 미생물 및 식물 병원성 바이러스에 항균력 및 길항작용(拮抗作用)을 갖는 페니실리움 파실리 (Penicillium paxilli ) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주는 균류 뷴류학상 Fungi(곰팡이 균)계 Ascomycota문(子囊菌) Eurotiomycetes강(눈꽃동충하초) Eurotiales목(메주곰팡이) Trichocomaceae과(腐生) Penicillium속 paxilli종의 strain으로서 대한민국 경기도 산악지역에서 순수분리한 야생종이며, 농작물 탄저균 Glomerella sp.와 Colletotrichum sp.의 10여종에 탁월한 제어효과를 가지고 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 10 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 균주는 110℃ 내지 500℃의 온도 및 10 분 내지 3일이하 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 미생물은 식물 탄저균인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물 탄저균은 Glomerella속 탄저균 및 Colletotrichum속 탄저균 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 ITS 1,2의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 페니실리움 파실리 Chm121인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 14334BP인, 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 탄저균은Glomerella 속 및 탄저균은 Colletotrichum acutatum 42509, Colletotrichum acutatum 43126, Colletotrichum acutatum 44886, Colletotrichum acutatum 45723, Colletotrichum acutatum 40042, Colletotrichum acutatum 40689, Colletotrichum acutatum 40691, Colletotrichum acutatum 40804, Colletotrichum acutatum 42508 및 Colletotrichum coccodes 40009 중 어느 하나 이상인, 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물 병원성 바이러스는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)인, 식물 병원성 바이러스의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물에 기생하는 유충의 방제 방법을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채, 수목 중 어느 하나 이상인, 식물에 기생하는 유충의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 식물 병원성 미생물, 식물 병원성 바이러스 또는 식물에 기생하는 유충 방제용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 농작물 병충해 제어 미생물 Chm121 균주의 분리
동충하초 강에 속하는 담자균은 그 종과 생태계의 기능이 여타 곰팡이에 비하여 인간의 음식, 약용에 밀접하고 형태적으로도 좀 더 용이하게 식별이 되는 희소한 가치를 지닌 유용 담자계통의 곰팡이 균이다. 이런 동충하초균을 탐색하던 중 이들의 기능이 단순한 식용, 약용 뿐만 아니라, 병충해의 원인 병원체도 대사적으로 충분히 제어 및 생태 진화적인 연관이 되 있을 것으로 사료되었다. 대개의 경우 신규의 야생종은 인체의 구성예와 같이, 또 원석의 혼합물체와 같이 수많은 생물 종의 공생체로서 복합 복잡계 구조로 구성되어 있어서 그 순수한 특정한 종을 분리하는 것은 대단히 어려운 경우가 대부분이다.
이런 특성을 활용하여 먼저 포자 및 균사 수준에서 특정 배지 PDA 등에서 동충하초의 자실체 형태로부터 균사, 포자분리를 100여회 이상 1년간 실시하였다. 그 후 형태적으로 순수해 보이는 균사 포자의 시작점을 확인하고, 이를 100회이상 계대배양을 통하여 그 순수성을 확보하였다.
그 분리지역은 경기도 산악부근에서부터 동충하초 흰 곰팡이에서 순수분리 하였다. 도 1은 분리된 균주의 PDA 배지에서 1주 배양후의 사진이다.
실시예 2. Chm 121 균주의 생물학적 또는 화학적 형태 파악
상기 실시예 1에서 분리된 균주는 격막의 포자와 희고 긴 나선형의 막대모양의 균사를 가지고 있었다. 도 2를 보면 PDA 배지에서 상기 실시예 1의 균주를 2~3주 배양한 사진 및 균사의 위상차 사진(400배, ph2)를 확인할 수 있다. 배양초기 2~4일의 엷은 균사는 10일이 경과하면서 두꺼운 균사복합체의 흰 덩어리 모양의 균사돌기들을 장기간 형성한다.
이런 형태적인 변화는 병원체의 활동을 공간적으로 제어하면서 상기 실시예1에서 분리된 균주의 세포가 만드는 항균 길항물질들이 병원체의 기능을 원천 차단하는 것으로 사료된다. 상기와 같은 균사에는 격막세포가 있는데, 상기 격막세포가 식물 탄저균 및 TSWV 바이러스 등의 병원체를 감지하는 신호전달 과정과 제어 길항물질을 분비하는 기능을 수행하는 것으로 파악된다.
실시예 3. Chm 121 균주의 동정 (genomic marker인 ribosomal RNA operon에 의한 균주 동정분류)
상기 실시예 1에서 분리하고 실시예 2에서 생물학적 특성을 파악한 균주를 동정한 결과, 눈꽃 동충하초강에 속하는 Penicillium paxill 의 strain을 가짐을 확인하였다. 구체적으로 하기와 같은 과정을 거쳤다.
경기도 산악지역에서 분리한 흰 곰팡이를 상기 실시예 1과 같이 순수 계대 한 후, 그 플레이트 배양배지 균주를 서울대학교 농생명과학 공동기기원(NICEM)에 분석을 의뢰하였다.
ITS rRNA sequence의 분석에 의한 균주동정을 서울대학교 농생명과학 공동기기원(NICEM) 유전체분석센터에서 실시하였다.
ITS sequence는 곰팡이 균주를 분류 동정하기 위한 universal DNA barcode marker이다. 진핵세포의 곰팡이는 일반적인 박테리아 균주의 16S rRNA 분석을 하지 않는다. 진핵세포의 곰팡이들이 공통적으로 포함하는 rRNA는 5.8S ribosomal RNA 와 large subunit(26, 28S) ribosomal RNA를 포함하고 있으며, 이 들 rRNA 들의 특정 부위의 RNA 서열인 ITS(internal transcribed spacer) 1 및 2 을 분석하였다. 이는 도 3과 같다.
ITS 서열 분석을 위해, 상기 실시예 1의 곰팡이균 배양체에서 DNA를 추출한 후, ITS 시퀀스를 추적할 수 있는 universal primer를 PCR로 증폭시켜서, DNA sequence를 결정하였다(PCR 증폭→ 전기영동→ barcode sequencing→ sequence editing→ Barcode library). 그 후 그 시퀀스를 NCBI data base에 접목하여 상동성의 비교로 분류 동정을 실시하였다. 시퀀스는 DNA로 나타나지만 그 origin은 ribosomal RNA이다. 즉 ITS1, 2를 universal barcode marker로 사용하여 동정하는 것이다.
더 자세히 보면, ITS rDNA(DNA sequence that code for ribosomal RNA)를 추출하고, 여기에 관련된 PCR nucleotide(Universal primer)를 사용하여 유전자를 증폭시키고 이를 전기영동 및 해독기로 읽으면 DNA시퀀스가 나타나 그 서열을 표시한 것이 아래 도 4a의 시퀀스이다.
그 다음 이 시퀀스를 NCBI data base에 접목하면 기존 균주와 상동성이 대비되어 속, 종을 추정할 수 있게 되며, 이미 표준화된 글로벌 표준 동정 분류법이다.
상기 실험에 따라 분석된 균주의 ITS sequence는 하기 서열목록 1의 서열과 같았다.
[실시예 1 균주의 동정 분류]
서열목록 1 : ITS region sequence
CTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGCTCAGATTGTCAAATGATTGTCTCGGCAAGGAGACGGTTCGAAGCATGAACACCATAAATACTTCAACACCACAGCGCAGATAATTATCACACTGAAGGCGATCCGTAAGATTCACGCTAATGCATTTCAGAGGAGTCGACCGACAAGGGCCGACACAACCTCCAAGTCCAAGCCCGCTAAACCTTCATTACAAAAATTTAGGGGTTGAGAATACCATGAGACTCAAACAGGCATACTCCTCGGAATACCAAGGAGTGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATATAAATGTGTTATACACAGTTGACATTCTATAACTGAAGCGTTTGTAGTAAAACATAAGAAAGAAAAACGGCTTGTTCAACCGAAGACCTCTCGCGAGATCCTGGAAGCTTCCACCATTTTTTTCTCTTACATAAAGTGCACAGAGGTTAAGAGTGGATGAGCCAGGCGTGCACATGCCTCGTGAGAGGCCAGCTACAACCCGTTCAAAACTCGATAATGATCCTTCCGC
상기 서열 목록 1과 대조군으로 페니실리움 파실리 균주로 잘 알려진 하기 WZ-212 균주의 ITS sequence를 분석 비교하였다.
분석 결과 서열목록 1의 균주는 Penicillium paxilli WZ-212 와 Internal transcribed spacer 1의 partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene 및 internal transcribed spacer 2의 complete sequence; 및 large subunit ribosomal RNA gene의 partial sequence와 거의 유사한 것으로 확인하였다.
이에 분리된 균주를 Penicillium paxilli의 strain인 것으로 확인하였고, Chm121로 명명 확인하였다. 분리된 균주의 계통도는 도 4b와 같았다.
한편, 상기 균주를 한국생명공학연구원에 2020년 10월 15일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 14334 BP 로 수탁되었다.
실시예 4. Chm121 균주의 PDA(potato dextrose agar)배지상의 탄저균 억제효과 확인
상기 Chm121이 식물 탄저균에 효과가 있는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
한국 농촌진흥청으로부터 표준 탄저균주(도 5)를 분양 받았다.
종류는 Colletotrichum acutatum 42509, Colletotrichum acutatum 43126, Colletotrichum acutatum 44886, Colletotrichum acutatum 45723, Colletotrichum acutatum 40042, Colletotrichum acutatum 40689, Colletotrichum acutatum 40691, Colletotrichum acutatum 40804, Colletotrichum acutatum 42508 및 Colletotrichum coccodes 40009 이였다. 도 6 참조
실험 방법은 농진청에서 분양받은 상기의 표준균주를 PDA배지에서 먼저 1주간 배양을 하고난 후, PDB액상 배지에서 5일간 배양된 Chm121 균주를 1,000ul 마이크로 피펫으로 200ul 씩 분양균주가 충분히 자란 PDA배지위에 분주하였다. 그후 1주~4주간 25 ℃ 인큐베이터에 정치하면서 반응변화를 관찰하였다.
실험 결과는 도 7 내지 16과 같았다. 탄저균의 표준균주에 대한 Chm121 균주반응은, Chm121의 흰균사 증식으로 나타난 것과 같이 1주부터 4주간동안 흰균사가 대거 증식되면서 농진청 탄저균주의 점차적인 사멸을 공통적으로 확인할 수 있었다.
실시예 5. Chm121 균주의 PDA(potato dextrose agar)배지상의 TSWV 억제효과 확인
상기 Chm121 이 TSWV에 효과가 있는 지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
면천 노지 시험포에서 토마토 반점위조 바이러스(TSWV)에 감염된 고추시료에서 TSWV균주를 분리하였다.
실험 방법은 면천의 노지 고추밭 시험포에서 채취한 토마토 반점위조 바이러스(TSWV)에 감염된 고추시료에서 감염부분의 절편을 PDA 배지에 접종하여 10일 정도 배양하면서 TSWV 균주가 증식되었고, 이를 계대시킨 후, PDA배지에 증식된 균주위에 PDB 액상에서 1주간 사전 배양된 Chm121을 300ul씩 분주하여, 1주일 이상 반응변화를 관찰하였다.
실험 결과는 도 17와 같았으며, Chm121에 의하여 TSWV균주는 거의 소멸되는 모양을 나타내었다.
실시예 6. Chm121 균주의 PDA(potato dextrose agar)배지상의 탄저균 억제효과 확인
상기 Chm121 이 탄저병에 감염된 고추에 효과가 있는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
면천 노지 시험포에서 탄저병에 감염된 고추시료에서 탄저균을 분리하였다.
실험 방법은 면천의 노지 고추밭 시험포에서 채취한 탄저병에 감염된 고추시료에서 감염부분의 절편을 PDA 배지에 접종하여 10일 정도 배양하면서 탄저균주가 증식되었고, 이를 계대시킨 후, PDA배지에 증식된 균주위에 PDB 액상에서 1주간 사전 배양된 Chm121을 300ul씩 분주하여, 1주일 이상 반응변화를 관찰하였다.
실험 결과는 도 18와 같았으며, Chm121에 의하여 탄저균주는 대부분 소멸되는 모양을 나타내었다.
탄저균에 대한 Chm121 균주반응의 균사증식과 탄저균의 억제 소멸로 농진청 표준 탄저균주의 사멸을 재확인할 수 있었다.
실시예 7. Chm121 균주의 인규베이터내 비이커 테스트 상의 고추 탄저균 및 고추 TSWV 억제효과 확인
1. TSWV 효과 확인
상기 Chm121이 노지 시험포의 고추에 자체적으로 감염된 TSWV에 효과가 있는지 재확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 추가적으로 진행하였다.
도 19에서와 같이 TSWV가 감염된 고추 과실전체를 면천 노지 시험포에서 채취하여, 채취한 시료 그대로를 비이커에 넣고, 사전에 1주일 이상 25 ℃에서 PDB 액상배양을 한 Chm121 균주를 각 300~500ul 씩 감염부위 중심으로 분주하여, 알미늄 호일로 덮개를 하였다(도 20). 그 뒤 25 ℃에 3~4주간 정치하면서 반응변화를 관찰하였다. 1주에서 3주에 갈수록 Chm121 균주는 증식현상이 TSWV 감염부위 중심으로 Chm121 흰균사가 집중 증식되는 모양을 나타내어, Chm121은 TSWV 바이러스에 대한 민감한 신호감지와 사멸기전을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험 결과는 도 20 내지 도 23과 같았다.
2. 탄저병 효과 확인
상기 Chm121이 노지 시험포의 고추자체 감염된 탄저병에 효과가 있는지 재확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
도 24에서와 같이 탄저병이 감염된 고추 과실전체를 면천 노지 시험포에서 채취하였다. 채취한 시료 그대로를 비이커에 넣고, 사전에 1주일 이상 25 ℃에서 PDB 액상배양을 한 Chm121 균주를 각 300~500ul 씩 감염부위 중심으로 분주하여, 알미늄 호일로 덮개를 하였다.
그 뒤 25 ℃에 3~4주간 정치하면서 반응변화를 관찰하였다. 실험 결과는 도 25 내지 도 28과 같았다.
1주에서 3주에 갈수록 Chm121 균주는 증식현상이 탄저병 감염부위 중심으로 Chm121 흰균사가 집중 증식되는 모양을 나타내어, Chm121은 탄저병에 대한 민감한 신호감지와 사멸기전을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 탄저병과 TSWV 병에 대한 반응사멸 기전이 유사함을 보여주는 것이다.
실시예 8. Chm 121 균주의 노지(露地) 시험포 현장 테스트
상기 실시예 4 내지 7에서 확인한 바와 같이 실험실 단위에서 본원발명 Chm 121 균주는 탄저균과 TSWV에 효과가 있음을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 노지에서 본원발명 균주가 효과가 있는지를 하기와 같이 실험하였다.
면천 노지(露地) 시험포 : 충남 당진시 면천면 자개리 749-3
지역 기상조건: 대전지방 기상청 자료
일시
2020.9.8.~9.23		 평균기온(℃) 평균습도(%) 평균풍속(km/h)
2020년9월8일 20.8~26.2 61~97 1.1~18.2
2020년9월9일 18.7~24.9 67~98 0~12.6
2020년9월10일 18.7~26.5 61~99 0~9.7
2020년9월11일 17.7~24.3 71~99 0~8.6
2020년9월12일 17.2~20.4 87~97 0~7.9
2020년9월13일 16.1~25.4 55~95 0~10.4
2020년9월14일 16.5~24.7 61~99 0~10.1
2020년9월15일 17.6~26.4 55~99 0~7.2
2020년9월16일 18.9~23.3 75~99 0~7.2
2020년9월17일 17.3~22.3 62~99 0~6.8
2020년9월18일 17.4~25.6 33~95 1.1~10.1
2020년9월23일 13.9~22.3 53~79 0~11.9
2020. 8.10 전후로 8번의 태풍으로 인한 농업지역의 작황은 매우 어려운 상태가 되고 있었다. 고추농사의 경우도 태풍 4호, 7호를 거치면서 8.10, 8.20, 9.1경에는 노지의 고추밭 시험포 전체가 탄저병과 토마토 반점위조 바이러스 병으로 뒤덮이는 현상을 나타내었다.
이런 최악의 조건에서 7~8월에 실험실에서 검증된 Penicillium paxilli Chm121 균주를 PDB액상배지에 배양시킨 후, 수질기준이 통과된 지하수에 100~200배 희석하여 시험포 고추탄저병에 3일 간격으로 3~4회 분무 살포하였다(9.8~9.17, 9.23).
현장 사진은 도 29 내지 도 37와 같았다.
9.24 이후 10.23까지 기온의 급강하로(20℃ 내지 5℃) Penicillium paxilli Chm121 균주의 균사가 노지의 시험포 고추에서 더 이상 형성되지 않았다. 농사절기상 5월초에서 8월 중순, 9월초까지 Chm121을 시비함이 더 바람직할 것으로 판단되었다.
한국생명공학연구원 KCTC14334BP 20201015
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Claims (17)

  1. 식물 탄저균 및 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)에 항균력을 갖고, 기탁번호가 KCTC 14334BP인 페니실리움 파실리 (Penicillium paxilli ) Chm121 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 110℃ 이상의 온도 및 10 분 이상의 시간 동안 생존이 가능한 고내열성 균주인, 균주.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식물 탄저균은 Glomerella속 탄저균 및 Colletotrichum속 탄저균 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열목록 1의 rDNA 구조(nuclear ribosomal RNA cistron)의 ITS 1 및 2의 DNA barcode marker 염기서열을 포함하는, 균주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 탄저균은 Colletotrichum acutatum 42509, Colletotrichum acutatum 43126, Colletotrichum acutatum 44886, Colletotrichum acutatum 45723, Colletotrichum acutatum 40042, Colletotrichum acutatum 40689, Colletotrichum acutatum 40691, Colletotrichum acutatum 40804, Colletotrichum acutatum 42508 및 Colletotrichum coccodes 40009 중 어느 하나 이상인, 균주.
  10. 제1항 내지 제2항, 제5항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제.
  11. 제1항 내지 제2항, 제5항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 식물 탄저병의 방제 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 식물은 고추, 감, 사과, 배, 포도, 인삼, 더덕, 도라지, 벼, 보리, 밀, 옥수수, 오미자, 구기자, 블루베리, 참다래, 대추, 매실, 콩, 땅콩, 감자, 고구마, 수박, 참외, 토마토, 딸기, 호박, 오이, 밤, 복숭아, 자두, 감귤, 바나나, 파인애플, 망고, 올리브, 석류, 앵두, 용과, 호두, 마늘, 양파, 무, 배추, 매화, 국화과 식물, 난초, 화초, 커피나무, 소나무, 잣나무, 기타 야채 및 수목 중 어느 하나 이상인, 식물 탄저병 방제 방법.
  13. 제1항 내지 제2항, 제5항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 방제 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1항 내지 제2항, 제5항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 포자; 이의 균사; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 포자, 균사, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 식물 탄저균 또는 토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 방제용 조성물.
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