KR20220073362A - 백강잠 생성능이 우수한 신규한 보베리아 바시아나 hy-51 균주 및 이의 이용 - Google Patents

백강잠 생성능이 우수한 신규한 보베리아 바시아나 hy-51 균주 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백강잠 생산율이 우수한 신규한 백강균 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP) 및 이의 이용에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)는 동종동속 균주에 비해 백강잠 생산율이 현저히 우수하고, 상기 신규 균주로부터 제조된 백강잠의 추출물은 신경세포 보호 및 항산화능을 갖는 바, 신경세포 보호 및 항산화 용도로 다양하게 적용될 수 있다.

Description

백강잠 생성능이 우수한 신규한 보베리아 바시아나 HY-51 균주 및 이의 이용{New Beauveria bassiana HY-51 strain excellent ability to produce Bombyx batryticatus and uses thereof}
본 발명은 백강잠 생성능이 우수한 신규한 보베리아 바시아나 HY-51 균주 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)를 이용한 백강잠 생산 방법, 상기 방법으로 제조된 백강잠의 추출물을 포함하는 신경세포 보호 및 항산화능을 갖는 기능성 조성물에 관한 것이다.
곤충병원성 균주인 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana, 백강균)는 나비목, 메뚜기목, 딱정벌레목 등 넓은 기주범위를 가지면서 농업해충, 산림해충 방재를 위한 화학적 살충제의 대체재로써, 환경오염을 방지하기 위한 친환경 농업살충 용도로 연구되어 왔다(Bull. Soc. Bot. Fr. 53: 34-40, 1912).
보베리아 바시아나는 적당한 습도와 온도에서 누에(Bombyx mori)의 표피에 부착된 후 가수분해 효소로 키틴 분해효소(Chitinases)와 단백질 가수분해효소(Protease), 지방 분해효소(Lipases)를 분비하여 직접 내부로 침입하며(Microbiology-SGM 152: 2855-2864, 2006; Microbiology-SGM 153: 3448-3457, 2007; Environmental and microbial relationships, vol 4. pp 185-201, 1997, Springer-Verlag, Heidelberg), 누에의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 누에를 4~5일이면 치사시키고, 이 과정에서 상기 누에는 강직현상이 일어나는 굳음병이 생겨 결국 죽게 되는데(Entomol. Exp. Appl. 45: 151-156, 1987), 이 죽은 충체를 "백강잠(Bombyx batryticatus)"이라고 한다.
보베리아 바시아나는 현재까지 약 500여 종 이상이 보고되고 있으나, 백강잠 생산능이 우수한 백강균을 선별하기는 아직까지 어려운 실정이다.
동양의학에 따르면 백강잠은 중풍으로 인한 구안와사, 풍사, 경련 등에 진정효과가 있고, 두통, 결핵, 부인병, 소아병 치료 및 기미 제거와 종기 치료제 등 다양한 효능이 있다고 기록되어 있다(중약대사전, 도서출판 정담 pp. 2015, 1997). 또한, 항경련, 항간질 효과, 알츠하이머병의 치료 효능과 함께 항응고, 항종양, 항균, 항진균, 항산화 효과와 당뇨병에 대한 약리적인 효과가 보고되어 있어(Molecules. 22: 1779, 2017), 한약재로써 뿐만 아니라 건강보조식품의 원료로 이용되고 있다. 또한, 백강잠은 갈색거저리 애벌레, 누에번데기, 벼메뚜기, 쌍별귀뚜라미, 장수풍뎅이 애벌레, 흰점박이꽃무지 애벌레와 함께 국내에서 식용곤충으로 식품공전에 등록되어 있다.
최근 들어, 세계적으로 곤충 소재에 대한 관심도가 높아지고 곤충 식품에 대한 필요성이 대두되면서 식용 곤충 시장의 규모가 계속적으로 증대되고 있다. 특히, 백강잠은 다른 식용 곤충과 달리 누에의 영양학적 효과와 더불어 백강균이라는 미생물과 접목되면서 그 약리적인 효과가 증가하고 더 높은 활용도와 다양성을 가질 수 있다는 장점이 있다.
그러나 현재 시중에 소비되고 있는 백강잠은 국내에서 생산하는 경우가 거의 없으며 대부분의 수입에 의존하고 있는 실정이다. 국내에서 생산되는 백강잠의 경우도 누에를 사육하는 과정에서 의도치 않게 백강균에 감염되어 생산된 백강잠을 수집하여 판매하는 경우로 그 제품에 대한 품질관리가 이루어지지 않고 있으며, 안전성 검정도 부족한 실정이다. 또한, 한약재로 수입되는 백강잠은 수입 유통 시 약사법에 의해 유해물질 관리기준이 적용되지만, 식품으로 수입 유통 시에는 식품위생법의 적용에 의해 곰팡이 독소 기준이 적용되지 않아 안전성 관리가 필요하다.
따라서 수입 및 유통되는 백강잠의 안전성 문제를 해결하고, 품질관리 방법을 확보하기 위해 수입 대체 및 국내 생산 백강잠 생산기술 개발이 절실히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 누에로부터 백강잠 생산능이 우수한 백강균 확보 및 상기 백강균을 이용한 백강잠 생산 방법을 확립하고, 상기 방법으로 제조된 백강잠의 추출물을 포함하는 신경세포 보호 및 항산화능을 갖는 기능성 소재를 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 누에에 접종되어 백강잠을 생산할 수 있는 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 백강잠 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 백강잠 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠에 용매를 처리하는 단계를 포함하는, 백강잠의 추출물 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 누에에 접종되어 백강잠을 생산할 수 있는 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)을 제공한다.
본 발명에서 용어, "보베리아 바시아나(Beauveria bassiana, 백강균)"는 곤충병원성 균주로써 나비목, 메뚜기목, 딱정벌레목 등 넓은 기주범위를 가지면서 농업해충, 산림해충 방재에 널리 적용되는 균주이다.
상기 보베리아 바시아나는 적당한 습도와 온도에서 누에(Bombyx mori)의 표피에 부착된 후 가수분해 효소로 키틴 분해효소(Chitinases)와 단백질 가수분해효소(Protease), 지방 분해효소(Lipases)를 분비하여 직접 내부로 침입하며(Microbiology-SGM 152: 2855-2864, 2006; Microbiology-SGM 153: 3448-3457, 2007; Environmental and microbial relationships, vol 4. pp 185-201, 1997, Springer-Verlag, Heidelberg), 누에의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 누에를 4~5일이면 치사시키고, 이 과정에서 상기 누에는 강직현상이 일어나는 굳음병이 생겨 결국 죽게 되는데(Entomol. Exp. Appl. 45: 151-156, 1987), 이 죽은 충체를 "백강잠(Bombyx batryticatus)"이라고 한다.
구체적으로 본 발명의 보베리아 바시아나 HY-51 균주는 백강잠으로부터 분리하여 얻은 것이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주를 배양하여 형태학적 특성을 관찰한 결과, 보베리아 바시아나의 전형적인 특징인 백색 균사와 포자가 관찰되어 보베리아 바시아나 균주임을 확인하였으며(도 1A-C), 상기 균주의 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과, Genbank 데이터베이스에 등록된 기존 보베리아 바시아나 균주들의 염기서열 간의 상동성을 분석한 결과 약 99%의 상동성을 나타내었고, 국립농업유전자원센터에서 분양받은 보베리아 바시아나 KACC 40039(도 3에 KA-40으로 표시) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고 염기서열을 분석한 결과 상기 분리된 보베리아 바시아나 균주와 보베리아 바시아나 KACC 40039 균주 간의 상동성이 98.23%로 확인되었다(도 3). 이에 본 발명자들은 신규 분리한 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 한국생명공학연구원에 2019년 6월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 13867BP를 부여받았다.
본 발명의 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 장기간 안정적으로 보존하기 위하여, 물에 글리세롤을 혼합하여 만든 보관용액에 균체를 풀어 -70℃에서 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여　동결건조할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 다양한 공지의 방법에 의해 장기 보존 형태가 될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 백강잠 생산용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 본 발명의 균주인 보베리아 바시아나 HY-51 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하기만 한다면, 이외에 어떤 물질도 당업자의 필요에 따라 첨가되어 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 백강잠 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (a) 본 발명의 균주인 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 배양한 보베리아 바시아나 HY-51 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 누에에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 접종된 누에를 백강잠으로 형성시키고, 형성된 백강잠을 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계는 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 보베리아 바시아나 균주를 배양하는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 균주 배양 및 포자 생성을 증진시키기 위해 미강, 밀기울, 보리, 귀리, 차조, 현미, 백미, 또는 수수 중 선택되는 어느 하나 이상의 탄소원 3.5%v/v, 누에가루, 번데기가루, 콩가루, 대두박, 난백가루, 또는 난황가루 중 선택되는 어느 하나 이상의 질소원 0.5%v/v, 및 한천 1.5%v/v를 증류수 1L에서 충분히 섞어 혼합한 다음 121℃에서 15분 동안 가열 멸균하여 페트리 디쉬에 분주 및 냉각한 고체배지에서 배양할 수 있고, 구체적으로 상기 고체배지는 탄소원으로 미강, 밀기울, 또는 보리, 질소원으로 번데기가루, 대두박, 또는 콩가루를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 고체배지는 탄소원으로 미강, 질소원으로 번데기갈를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주의 배양 조건은 보베리아 바시아나 균주를 배양하는 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 온도 20~30℃, 습도 85% 이상에서 7일 이상 배양할 수 있고, 구체적으로 온도 25℃, 습도 90%에서 7~14일간 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 광조건은 조명을 어둡게 하는 것이 균사가 자라는데 유용하나 명조건 : 암조건 비율을 16 시간 : 8 시간으로 조정할 경우 균주의 기주 곤충 감염율을 높일 수 있다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 배양한 보베리아 바시아나 HY-51 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 누에에 접종하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 보베리아 바시아나 HY-51 균주의 포자를 누에에 접종하였으며, 상기 포자는 배양한 균주에 흰색 분말 형태의 하얀 포자(conidia)가 다량 형성되었는지 확인한 후, 고체배지 표면의 포자를 수득하였다. 수거한 포자는 2~4일간 건조 후 체(Sieve mesh, 425μm)를 이용하여 거르고 포자 가루(conidia powder) 형태로 냉장 보관하였다.
상기 (b) 단계의 포자는 유화제인 트윈 80(Tween 80) 희석액에 혼합하여 포자 현탁액을 제조 후, 이를 누에에 분무하여 접종할 수 있다.
상기 포자 현탁액은 0.01 내지 2%v/v 농도의 트윈 80 용액에 포자를 0.05~5%v/v로 첨가하여 제조하는 것일 수 있고, 구체적으로 0.05~0.5%v/v 농도의 트윈 80 용액에 포자를 1~3%v/v로 첨가하여 제조하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.1%v/v 농도의 트윈 80 용액에 포자를 1~3%v/v로 첨가하여 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 0.1%v/v 트윈 80 용액을 이용하여 1~3%v/v 포자 현탁액을 제조하여 누에에 분무 접종할 경우 백강잠 생성율이 가장 높았으며, 이 때 포자 계수는 107~108 conidia/ml 수준임을 확인하였다.
또한, 상기 (b) 단계의 누에는 5령 누에일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 4령 누에에 포자 현탁액 접종시에 보베리아 바시아나 HY-51의 백강잠 생성율은 66.2%이었고, 보베리아 바시아나 KACC40039의 백강잠 생성율은 24.5%이었다. 또한 5령 누에에 포자 현탁액 접종시에 보베리아 바시아나 HY-51의 백강잠 생성율은 70.1%이었고, 보베리아 바시아나 KACC40039의 백강잠 생성율은 27.4%이었다. 그러나 4령 누에의 경우 크기가 작아 생성된 백강잠의 크기는 3.9 ± 0.3 cm, 무게는 0.3 ± 0.1 g 이었으며, 5 령 누에에 접종하여 생성된 백강잠은 크기가 6.1 ± 0.2 cm, 무게는 0.6 ± 0.1 g으로 나타나, 5 령 누에에 접종하였을 때 백강잠의 크기와 무게가 두배 정도 증가하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 보베리아 바시아나 HY-51 균주는 동종동속 균주인 보베리아 바시아나 KACC40039 균주에 비해 백강잠 생성률이 월등히 높게 나타났을 뿐만 아니라 4령 누에에 비해 5령 누에에 접종하는 것이 백강잠 생산에 유리함을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠에 용매를 처리하는 단계를 포함하는, 백강잠의 추출물 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 상기 본 발명의 균주인 보베리아 바시아나 HY-51 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 백강잠 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 건조된 백강잠을 분쇄하고 이를 물, 탄소수 1 내지 4(C1~C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 구체적으로 물 또는 C1~C4의 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 더욱 구체적으로 물 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 이때, 추출용매는 백강잠의 건조중량의 2 ~ 100 배로 하는 것이 바람직하다. 일례로 건조된 백강잠 분말에 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 구체적으로 물 또는 에탄올을 넣고 일정기간 70~100℃에서 추출한 다음, 여과하여 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출은 70℃로 추출할 경우에는 3시간, 80℃로 추출할 경우에는 1시간, 100℃로 추출할 경우에는 10분 동안 방치할 수 있고, 이후 여과, 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백감장 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물일 수 있고, 상기 열수 추출물의 경우 i) 건조된 백강잠 분말(1 g)에 증류수 10 ml를 첨가한 후 강하게 교반한 다음 70℃에서 3시간 동안 추출한 후 추출물을 2,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 종이여과지(Whatman, No.2)로 여과하였다. 여과된 추출물에 NaOH 또는 HCl 용액을 추출물 부피의 1% 내외로 첨가하여 pH를 7.4로 조정한 후 0.45 μm 막 필터로 여과하여 열수 추출물을 제조하거나, ii) 건조된 백강잠 분말(1 g)에 증류수 10 ml을 첨가한 후 강하게 교반하고 80℃에서 1시간 동안 추출한 후 추출물을 2,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 1차 상등액을 분리하였다. 남은 펠렛에 증류수 10 ml을 넣고 80℃에서 30분 동안 2차 추출한 후 2,000g에서 10분 동안 원심분리하여 2차 추출물의 상등액을 분리하였다. 2차 추출물의 상등액을 1차 추출물의 상등액과 혼합한 후 최종 용량이 20 ml이 되도록 증류수를 첨가하고, 0.45 μm 막 필터로 여과하여 열수 추출물을 제조하는 것일 수 있다. 또한, 에탄올 추출물의 경우 건조된 백강잠 분말 0.5 g에 95%v/v 에탄올 10 ml를 첨가하여 강하게 교반한 다음 100℃에서 10분 동안 추출하였다. 추출물을 7,000g에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 여과지(Whatman, No. 2)로 여과한 후 감압 하에 농축한 건조물에 무수초산 2 ml를 넣어 용해시켜 에탄올 추출물을 제조하는 것일 수 있다.
상기 i)의 방법으로 제조된 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물은 항산화 또는 신경세포 보호 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 시판 백강잠-1과 시판 백강잠-2의 열수 추출물이 각각 1.3 mg/ml와 1.2 mg/ml의 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타나는 것에 비해 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물은 1.9 mg/ml 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타내었다. 상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물의 항산화 활성은 백강균 JN19M2W1과 JN15R2W1을 접종하여 생산된 백강잠의 열수 추출물들이 0.43~0.45 mg/ml 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타낸 것을 확인한 선행 연구(한국등록특허 제 10-1604034호)에 비해서도 현저히 높았다.
또한, 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물을 처리하였을 때 시판 백강잠 또는 누에의 열수 추출물보다 더 효과적으로 PC12 세포의 신경돌기의 성장이 증가하여 돌기 사이 연결 현상이 나타남을 확인하였다.
상기 결과는 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠 열수 추출물이 동종동속 균주를 접종하여 생성된 백강잠에 비해 항산화 효과가 우수할 뿐만 아니라 PC12 세포의 분화를 유도하는 신경세포 보호 효과가 현저히 우수함을 시사하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 백강잠의 추출물은 항산화 또는 신경세포 보호 효과를 갖는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어 및 상기 백강잠 추출물의 신경세포 보호 효과는 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물이 약학적 조성물로 적용될 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 100 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 200mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로는 경구 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 애완동물을 포함하는 개념이다.
상기 조성물이 식품 조성물로 적용될 경우, 본 발명의 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 상기 식품 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄 산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로도 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분을 포함하는 것 이외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어 및 상기 백강잠 추출물의 항산화 효과는 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물로 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물 및 식품 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 조성물이 화장료 조성물로 적용될 경우, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 유효성분을 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 80 중량%, 구체적으로 0.0005 내지 70 중량%, 더욱 구체적으로 0.001 내지 60 중량% 포함할 수 있다. 상기 함량이 0.0001 중량% 미만이면 본래 목적하는 활성을 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 80 중량%를 초과하면 증가하는 함량만큼 뚜렷한 효과의 증대가 기대되지 않아 비경제적이며, 화장료 조성물의 안전성에 문제를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 신규한 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)는 동종동속 균주에 비해 백강잠 생산율이 현저히 우수하고, 상기 신규 균주로부터 제조된 백강잠의 추출물은 신경세포 보호 및 항산화능을 갖는 바, 신경세포 보호 및 항산화 용도로 다양하게 적용될 수 있다.
도 1은 신규 균주인 보베리아 바시아나 HY-51 균주(KCTC 13867BP)를 계대배양한 백강균 사진(A)과 이를 광학현미경(1,000배)로 관찰한 사진(B), 이를 전자현미경 SEM(Scanning Electron Microscope)(2,500 배)으로 관찰한 형태학적 사진(C), 및 보베리아 바시아나 HY-51 균주에 감염되어 생산된 백강잠 사진(D)이다.
도 2는 신규미생물인 보베리아 바시아나 HY-51(KCTC 13867BP)와 보베리아 바시아나 KACC40039의 DNA 염기서열 간의 상동성을 검색해 본 결과이다.
도 3은 보베리아 바시아나 HY-51(KCTC 13867BP)의 계통도를 나타낸 도면이다.
도 4는 각 균주별로 4령, 5령 누에에 보베리아 바시아나 균주인 HY-51과 KACC40039의 포자희석액을 감염시켜 생산된 백강잠의 비율을 나타낸 결과이다.
도 5는 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 감염시켜 생산된 백강잠과 시판 백강잠 및 선행특허 균주(JN19M2W1과 JN15R2W1)를 감염시켜 생산된 백강잠의 DPPH 라디칼 소거 항산화 활성을 비교한 결과이다.
도 6은 PC12 세포에서 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 감염시켜 생산된 백강잠 (HY-51백강잠)과 시판 백강잠 및 누에의 열수 추출물 처리에 따른 신경돌기의 성장 촉진을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 백강잠이 함유하는 암모늄옥살산 확인을 위해 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 감염시켜 생산된 백강잠(HY-51 백강잠)과 시판 백강잠-1 및 시판 백강잠-2의 열수 추출물에 염화칼슘을 첨가하여 생성된 칼슘옥살산의 생성량을 확인한 결과이다.
도 8은 대한약전외한약규격집(KHP)에 따른 백강잠 확인 분석법에 따라 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 감염시켜 생산된 백강잠 (HY-51 백강잠)과 시판 백강잠-1, 시판 백강잠-2 및 누에의 에탄올 추출물을 농축하고 무수초산에 용해시킨 후 황산을 첨가하여 누에와 달리 백강잠은 초록색으로 변하는 양상을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 보베리아 속 신규 균주의 분리 및 동정
기주 곤충인 누에 사육 과정에서 자연적으로 형성된 백강잠을 채취하여 이로부터 균주를 분리 배양하였다. 상기 분리된 균주를 형태학적으로 동정하고, SDA(Sabraud Dextrose Agar) 배지에 계대하여 25℃에서 12일 동안 배양한 사진 및 광학현미경(1,000배), 전자현미경 SEM(Scanning Electron Microscope)(2,500 배)으로 형태학적 특성을 관찰한 결과, 보베리아 바시아나의 전형적인 특징인 백색 균사와 포자가 관찰되어 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주임을 확인하였다(도 1A-C).
상기 분리된 보베리아 바시아나 균주의 분자생물학적 특징을 알아보기 위해 보베리아 바시아나 균주의 DNA 염기서열을 ITS1 정방향 프라이머(서열번호 2) 및 ITS4 역방향 프라이머(서열번호 3)에 의한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction) 방법으로 증폭하였다. 증폭된 보베리아 바시아나 균주의 염기서열과 Genbank 데이터베이스에 등록된 기존 보베리아 바시아나 균주들의 염기서열 간의 상동성을 분석한 결과 약 99%의 상동성을 나타내었다. 또한, 국립농업유전자원센터에서 분양받은 보베리아 바시아나 KACC 40039(도 2에 KA-40으로 표시) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고 염기서열을 분석한 결과 상기 분리된 보베리아 바시아나 균주와 보베리아 바시아나 KACC 40039 균주 간의 상동성이 98.23%로 확인되었다(도 2). 상기 분리된 보베리아 바시아나 균주를 신규한 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51)로 동정 및 명명하였다. 보베리아 바시아나 HY-51의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 계통도를 도 3에 나타내었다. 상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주는 한국생명공학연구원에 2019년 6월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 13867BP를 부여받았다.
실시예 2. 신규 균주의 배양 및 포자 생산을 위한 고체배지 선별
실시예 1에서 동정한 보베리아 바시아나 균주를 배양하고 이의 포자를 생산하기 위해 고체배지를 선별하였다. 성분 배합을 달리한 고체배지를 각각 제조하고, 상기 각 고체배지에서의 균주 배양 정도 및 포자의 생성 정도를 분석하였다.
구체적으로, 탄소원(미강, 밀기울, 보리, 귀리, 차조, 현미, 백미, 수수) 또는 SDA 3.5%v/v, 질소원(누에가루, 번데기가루, 콩가루, 대두박, 난백가루, 난황가루) 0.5%v/v, 및 한천 1.5%v/v를 증류수 1L에서 충분히 섞어 혼합한 다음 121℃에서 15분 동안 가열 멸균하여 페트리 디쉬에 분주 및 냉각한 후 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하고 온도 25℃, 습도 90% 조건에서 7일간 배양하였다. 균사체의 크기가 커지는 정도, 수득된 포자의 무게, 및 포자의 계수를 파악하고 이를 통해 균주 배양 및 포자 생산이 우수한 고체배지에서 탄소원 및 질소원의 배합을 확인하였다. 비교군으로 SDA 배지를 사용하였다.
상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주의 포자 생산에 바람직한 탄소원은 미강, 밀기울, 및 보리이고 질소원은 번데기가루, 대두박, 및 콩가루임을 확인하였으며, 탄소원으로 미강, 질소원으로 번데기가루를 사용하였을 때 포자 생산이 가장 우수한 것을 확인하였다.
실시예 3. 신규 균주로부터 포자 수득
실시예 2의 고체배지에서 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 온도 25℃, 습도 90%에서 12~14일간 계대배양하였다. 광조건은 조명을 어둡게 하는 것이 균사가 자라는데 유용하나 명조건 : 암조건 비율을 16 시간 : 8 시간으로 조정할 경우 균주의 기주 곤충 감염율을 높일 수 있다. 상기 배양조건에 맞추어 일정한 온도 및 습도 조건하에서 배양한 균주에 흰색 분말 형태의 하얀 포자(conidia)가 다량 형성되었는지 확인한 후, 고체배지 표면의 포자를 수거하였다. 수거한 포자는 2~4일간 건조 후 체(Sieve mesh, 425μm)를 이용하여 거르고 포자 가루(conidia powder) 형태로 냉장 보관하였다.
실시예 4. 신규 균주를 활용한 백강잠 생산 조건 선별
실시예 1에서 분리한 신규한 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 이용하여 백감장 생산 효과를 확인하였다. 비교군으로 보베리아 바시아나 KACC40039 균주를 사용하였다.
4-1. 유화제 적정 농도
실시예 3의 방법으로 각 균주의 포자 가루를 수득하고, 유화제인 트윈 80(Tween 80) 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 및 2%v/v 농도로 희석한 각 희석액에 포자를 1~3%v/v로 혼합하여 포자 현탁액을 제조하였다. 포자 현탁액을 누에 표면이 촉촉해질 정도로 분무하여 접종한 후 항온/항습기(24℃/80%)에서 배양하면서 누에가 단단하게 굳어져 죽는 것을 골라낸 뒤 표면에 하얀 가루가 생길 때까지 적당한 온도와 습도를 유지하면서 숙성 기간을 거쳐 백강잠을 생산하고, 생성율을 확인하였다.
그 결과, 트윈 80 농도별로는 0.1%v/v 농도의 트윈 80 용액에서 백강잠 생성율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 반면에 0.05%v/v 농도의 트윈 80 용액에서는 백강잠 생성율이 가장 낮았고, 또한 0.5%v/v 이상의 높은 농도에서 백강잠 생성율이 다시 낮아지는 경향이 나타났다. 이에, 포자 현탁액을 제조시 트윈 80 용액의 농도는 0.05~0.5%v/v인 것이 백강잠 생성에 적합함을 알 수 있으며, 이후 실험에서는 0.1%v/v 트윈 80 용액으로 포자 현탁액을 제조하여 사용하였다.
4-2. 균주 포자 적정 비율
0.1%v/v 트윈 80 용액에 보베리아 바시아나 균주의 포자를 0.5, 1, 3, 및 5%v/v의 비율로 혼합하여 포자 현탁액을 제조하였다. 제조된 포자 현탁액은 혈구측정기(hemocytometer, C-Chip, INCYTO, Korea)를 이용하여 포자의 계수를 확인하였고 누에에 분무 접종하여 백강잠 생성율을 확인하였다.
그 결과, 1~3%v/v의 비율로 포자를 포함하는 포자 현탁액 접종 시 백강잠의 생산율이 높게 나타났으며, 이 때 포자 계수는 107~108 conidia/ml 수준임을 확인하였다.
이에 따라, 0.1%v/v 트윈 80 용액을 이용하여 1~3%v/v 포자 현탁액을 제조하여 누에에 분무 접종할 경우 백강잠 생성율이 가장 높은 것으로 확인되었다.
4-3. 누에 접종 시기
백강잠 생산에 있어 가장 효율적인 누에에 대한 포자 현탁액 접종 시기(령)를 확인하기 위해 4령과 5령 누에에 보베리아 바시아나 HY-51과 보베리아 바시아나 KACC40039의 포자 현탁액을 각각 분무 접종하여 백강잠 생성율을 확인하였다.
그 결과, 도 4와 같이 4령 누에에 포자 현탁액 접종시에 보베리아 바시아나 HY-51의 백강잠 생성율은 66.2%이었고, 보베리아 바시아나 KACC40039의 백강잠 생성율은 24.5%이었다. 또한 5령 누에에 포자 현탁액 접종시에 보베리아 바시아나 HY-51의 백강잠 생성율은 70.1%이었고, 보베리아 바시아나 KACC40039의 백강잠 생성율은 27.4%이었다. 그러나 4령 누에의 경우 크기가 작아 생성된 백강잠의 크기는 3.9 ± 0.3 cm, 무게는 0.3 ± 0.1 g 이었으며, 5 령 누에에 접종하여 생성된 백강잠은 크기가 6.1 ± 0.2 cm, 무게는 0.6 ± 0.1 g으로 나타나, 5 령 누에에 접종하였을 때 백강잠의 크기와 무게가 두배 정도 증가하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 보베리아 바시아나 HY-51 균주는 보베리아 바시아나 KACC40039 균주에 비해 백강잠 생성률이 월등히 높게 나타났을 뿐만 아니라 4령 누에에 비해 5령 누에에 접종하는 것이 백강잠 생산에 유리함을 알 수 있다.
실시예 5. 백강잠 추출물의 제조
실시예 4의 방법에 따라 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 이용하여 생산한 백강잠, 비교군으로 시중에서 구입한 시판 백강잠-1 및 시판 백강잠-2을 믹서기를 이용하여 분쇄한 후 하기의 3 가지 방법으로 추출물을 제조하였다.
5-1. 항산화 및 신경세포 보호효과 효능을 갖는 백강잠 열수 추출물 제조
건조된 백강잠 분말(1 g)에 증류수 10 ml를 첨가한 후 강하게 교반한 다음 70℃에서 3시간 동안 추출한 후 추출물을 2,000g 에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 종이여과지(Whatman, No.2)로 여과하였다. 여과된 추출물에 NaOH 또는 HCl 용액을 추출물 부피의 1% 내외로 첨가하여 pH를 7.4로 조정한 후 0.45 μm 막 필터로 여과하여 열수 추출물을 수득하였다.
5-2. 옥살산암모늄(ammonium oxalate) 함유 백강잠 열수 추출물 제조
건조된 백강잠 분말(1 g)에 증류수 10 ml을 첨가한 후 강하게 교반하고 80℃에서 1시간 동안 추출한 후 추출물을 2,000g 에서 10분 동안 원심분리하여 1차 상등액을 분리하였다. 남은 펠렛에 증류수 10 ml을 넣고 80℃에서 30분 동안 2차 추출한 후 2,000g 에서 10분 동안 원심분리하여 2차 추출물의 상등액을 분리하였다. 분리한 1차 추출물의 상등액과 2차 추출물의 상등액을 합친 후 최종 용량이 20 ml이 되도록 증류수를 첨가하고, 0.45 μm 막 필터로 여과하여 열수 추출물을 수득하였다.
5-3. 백강잠 에탄올 추출물 제조
건조된 백강잠 분말 0.5 g에 95%v/v 에탄올 10 ml를 첨가하여 강하게 교반한 다음 100℃에서 10분 동안 추출하였다. 추출물을 7,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 여과지(Whatman, No. 2)로 여과한 후 감압 하에 농축한 건조물에 무수초산 2 ml를 넣어 용해시켜 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 6. 백강잠 열수 추출물의 항산화 활성
본 발명에 따른 백강잠 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 평가하였다.
구체적으로, 99.9％v/v 에탄올에 용해하여 제조한 0.2 mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; Sigma, USA) 용액 150 ㎕에 상기 실시예 5-1의 방법에 따라 제조한 보베리아 바시아나 HY-51 균주 생산 백강잠, 시판 백강잠-1 및 시판 백강잠-2의 각 열수 추출물을 7.5 ㎕ 첨가하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520nm 에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 항산화능은 2.5 mM의 비타민 E 유사체인 트롤록스(Trolox) ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid; Sigma, USA)를 이용하여 표준곡선을 만들고 그 추세선 식에 따라 나타내었다.
그 결과, 도 5와 같이 시판 백강잠-1과 시판 백강잠-2의 열수 추출물이 각각 1.3 mg/ml와 1.2 mg/ml의 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타나는 것에 비해 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물은 1.9 mg/ml 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타내었다. 상기 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물의 항산화 활성은 백강균 JN19M2W1과 JN15R2W1을 접종하여 생산된 백강잠의 열수 추출물들이 0.43~0.45 mg/ml 트롤록스 등가 항산화 활성을 나타낸 것을 확인한 선행 연구에 비해서도 현저히 높았다.
실시예 7. 백강잠 열수 추출물의 신경세포 보호 활성
PC12 신경세포는 10% 말 혈청(Hyclone사, 미국), 5% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) (Hyclone사), 10 mM HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) (Hyclone사), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin), 그리고 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 RPMI 1640 (Hyclone사) 배지를 이용하여 37℃의 습윤한 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
PC12 세포에서 신경돌기의 성장을 관찰하기 위해 콜라겐 코팅된 24 웰 플레이트에 5% 말 혈청, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 그리고 2 ng/㎖ NGF(nerve grow factor) (Invitrogen사, 미국)이 함유된 RPMI 1640 (Hyclone사) 배지에 3x104 cells/well 세포를 분주하여 배양한 후, 실시예 5-1의 방법에 따라 제조한 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠 열수 추출물, 시판 백강잠-1 열수 추출물 또는 누에 열수 추출물 20 ㎍/㎖을 처리하였다. 시료 처리 48시간 후, 세포주 용액(cell stain solution) (Millipore사, 독일)으로 염색하고 광학현미경을 이용하여 신경돌기의 생성을 촬영하였으며, PC12 세포에서 백강잠 열수 추출물 또는 누에 열수 추출물의 처리에 따른 신경돌기 성장 촉진 정도를 도 6에 나타내었다. 양성대조군으로는 NGF를 사용하였다.
그 결과, 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠의 열수 추출물을 처리하였을 때 시판 백강잠 또는 누에의 열수 추출물보다 더 효과적으로 신경돌기의 성장이 증가하여 돌기 사이 연결 현상이 나타남을 확인하였다(도 6).
상기 결과는 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠 열수 추출물이 PC12 세포의 분화를 유도함으로써 효과적인 신경세포 보호 효능을 나타낸다는 것을 시사하였다.
실시예 8. 백강잠 열수 추출물의 옥살산암모늄 함량 분석
누에가 백강균에 감염되어 백강잠이 되면 백강균이 생성하는 옥살산으로 인해 누에 표면과 누에 체액에 다량의 옥살산암모늄(ammonium oxalate)의 결정이 분말화된 형태로 하얗게 나타나게 된다. 본 실시예에서는 백강잠 열수 추출물에 포함된 옥살산암모늄이 염화칼슘(calcium chloride)을 첨가하여 생성되는 물질인 물에 용해되지 않는 옥살산칼슘(calcium oxalate, CaC2O4)의 무게를 측정하고 화학 반응식을 통해 계산하여 백강잠 열수 추출물이 함유하는 화학반응 전의 옥살산암모늄의 함량을 확인하였다.
구체적으로 실시예 5-2의 방법에 따라 제조한 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠, 시판 백강잠-1 또는 시판 백강잠-2의 열수 추출물 1 ml를 75℃에서 5분 동안 유지한 이후 동량의 0.25 M CaCl2를 하얀색 침전물인 옥살산칼슘이 생성되었다. 침전물이 생성된 추출물을 10,000 x g 에서 15분 동안 원심 분리하여 상등액은 제거하고, 남은 pellet에 증류수를 넣어 강하게 교반하여 세척한 다음 다시 10,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 2차 상등액을 제거하였다. 최종적으로 남은 펠렛인 옥살산칼슘을 감압 하에 건조하여 수분을 완전히 제거한 후 무게를 측정하였다. 측정된 옥살산칼슘 무게로부터 하기 화학식을 이용하여 백강잠 열수 추출물의 옥살산암모늄의 함량을 산출하였다.
(NH4)2C2O4 + CaCl2 → CaC2O4↓+ 2NH4Cl
그 결과, 도 7과 같이 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠 열수 추출물이 함유하는 옥살산암모늄은 열수 추출물의 건조 중량 대비 19.7±0.2% 이 었고, 시판 백강잠-1의 열수 추출물이 함유하는 옥살산암모늄은 9.7±2.2%, 시판 백강잠-2의 열수 추출물이 함유하는 옥살산암모늄은 9.1±0.3%로 확인되어, 본 발명에서 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠 열수추출물의 옥살산암모늄 함량이 시판 백강잠에 비해 2배 이상 높게 나타난 것을 확인하였다.
상기 결과에 따라, 본 발명의 바보베리아 바시아나 HY-51 균주는 백강잠 생산에 유용한 균주로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 대한약전외한약규격집에 따른 백강잠 확인 분석
대한약전외한약규격집(KHP)에 따른 백강잠 확인 분석 방법은 백강잠 가루에 에탄올을 넣어 수욕 상에서 가열하여 추출한 액을 증발농축한 후 무수초산을 넣어 용해시키고 기벽에 따라 황산 1 방울을 서서히 넣어 접계면이 초록색을 띠는 것을 육안으로 확인하여 백강잠임을 확인하는 방법이다.
실시예 5-3의 방법에 따라 제조한 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠, 시판 백강잠-1, 시판 백강잠-2 또는 누에의 에탄올 추출물을 각각 시험관에 넣고 시험관 기벽을 따라 35% 황산 15 μl를 서서히 넣은 결과, 보베리아 바시아나 HY-51 균주를 접종하여 생성된 백강잠은 접계면이 홍색~자색을 거쳐 초록색으로 변색되는 것을 확인하여 백강잠임을 확인하였다(도 8). HY-51 백강잠 에탄올 추출물은 시판 백강잠-1 및 시판 백강잠-2 에탄올 추출물에 비해 강한 초록색을 띠었다. 반면에 누에 에탄올 추출물은 초록색으로 변색되지 않았다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 누에에 접종되어 백강잠을 생산할 수 있는 신규한 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP)는 동종동속 균주에 비해 백강잠 생산율이 현저히 우수하고, 상기 신규 균주로부터 제조된 백강잠의 추출물은 신경세포 보호 및 항산화능을 갖는 바, 신경세포 보호 및 항산화 용도로 다양하게 적용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13867BP 20190620
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Claims (8)

  1. 누에에 접종되어 백강잠을 생산할 수 있는 보베리아 바시아나 HY-51(Beauveria bassiana HY-51) 균주(KCTC 13867BP).
  2. 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 백강잠 생산용 조성물.
  3. (a) 제1항의 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양한 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 농축액, 이의 건조물 및 이의 포자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 누에에 접종하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 접종된 누에를 백강잠으로 형성시키고, 형성된 백강잠을 수득하는 단계;를 포함하는, 백강잠 생산 방법.
  4. 제1항의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠에 용매를 처리하는 단계를 포함하는, 백강잠의 추출물 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 방법.
  6. 제1항의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물.
  7. 제1항의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물.
  8. 제1항의 균주가 누에에 접종되어 생산된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
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