KR20040012397A

KR20040012397A - 백강잠 101ａ로부터 분리, 정제한 뇌신경성장 촉진물질(4ｅ, 6ｅ, 2ｓ,3ｒ)-2-ｎ-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌

Info

Publication number: KR20040012397A
Application number: KR1020020045967A
Authority: KR
Inventors: 조세연; 정이연; 이강노; 권학철; 김선녀
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청); 이강노
Priority date: 2002-08-03
Filing date: 2002-08-03
Publication date: 2004-02-11
Also published as: KR100487112B1

Abstract

본 발명은 신경세포성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하기 위하여 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물로부터 분리, 정제한 신규 뇌신경활성 물질인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌 및 그 약제학적 제제에 관한 것이다.

본 발명에서는 백강잠 101A의 추출물과 이의 활성성분에 대하여 퇴행성 뇌질환에 중요하게 관여하는 신경세포 축색돌기 성장촉진 및 신경영양인자 단백질 증강효과를 PC 12 세포를 이용하여 검색한 결과 증강 및 신경세포 성장 촉진에 탁월한 작용을 가지면서 세포독성은 없는 백강잠 101A로부터 분리한 신규화합물인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌을 제공함으로써 알쯔하이머, 파킨슨 및 중풍과 같은 퇴행성 뇌질환에 의하여 유발되는 신경세포 위축 및 손상을 경감시켰으며, 아울러 국민건강 증진과 양잠농가의 새로운 소득원으로의 역할이 기대된다.

Description

백강잠 101Ａ로부터 분리, 정제한 뇌신경성장 촉진물질 (4Ｅ, 6Ｅ, 2Ｓ, 3Ｒ)-2-Ｎ-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌{A new sphingolipid, (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-Eicosanoyl-4,6-tetradeca sphingenine of Beauveria bassiana 101A having enhancement of the neurite outgrowth}

본 발명은 신경세포성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하기 위하여 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물로부터 분리, 정제한 신규 뇌신경활성 물질인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게 닌((4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-Eicosanoyl-4,6-tetradeca sphingenine) 및 그 약제학적 제제에 관한 것이다.

누에(Bombyx mori, 누에과 Bombycidae) 유충의 피부에 백강균 101A를 접종한 후 적당한 온도와 습도 조건하에서 일정기간 사육하면 누에충체에 균사체가 형성되며 강직현상을 나타내고 결국에는 죽게 되는데 이 죽은 충체를 백강잠(Bombycis corpus)이라고 한다. 백강잠은 고문헌 처방예로 보면 중풍으로 인하여 구안와사, 소아의 경기치료, 두통의 치료, 폐결핵의 치료 등에 이용되어 왔고¹⁾임상적 보고로는 당뇨병 및 급선유선염등에 이용된 예가 있다.

또한 백강잠은 미백효과가 뛰어나 화장료 조성물 등의 미백제의 성분으로 사용되고 있으며, 미생물 살충제의 주원료로도 사용되고 있다.

국내특허공개공보 제99-85202호에서는 치매병 예방 및 치료용 조성물을 제조하는데 백강잠을 여러 가지 한약재와 함께 첨가하여 사용하였다.

그러나, 백강잠이 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 활성물질을 함유하고 있다는 사실을 밝혀내지는 못하였으며, 백강잠 추출물의 여러 활성물질 성분을 분리하고, 그 각각의 활성성분이 가지는 기능에 대한 보고가 현재까지는 이루어지지 않고 있었다.

또한 뇌신경 세포와 관련하여 세포독성이 없으면서 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방할 수 있는 기능을 가지는 물질의 필요성도 대두되었다.

신경세포 영양물질 중 신경성장인자(nerve growth factor; 이하 "NGF"라 한다)는 신경세포에서 신경돌기(neurites)의 성장을 자극하고 중추신경계의 신경의 생존과 유지에 중요한 역할을 하기 때문에 퇴행성 뇌질환의 치료에 좋은 효능을 가질 것으로 추측되고 있다. 또한 최근에는 NGF가 알츠하이머 병과 관련된 콜린성 전뇌의 퇴화의 진전을 정지시키거나 혹은 지연시킬 수 있다는 실험동물 결과들이 나오고 있다.^4),5)NGF를 포함하여 촉진인자(trophic factors)들은 신경분화와 세포의 사멸과 같은 과정에 관여함으로써 신경퇴화성 질병을 치료하는 가장 강력한 접근 방법으로 알려져 있다. 동시에 알츠하이머 병이 진행되는 동안 사멸하는 것으로 알려진 콜린성신경을 NGF가 자극함으로써 인지·행동 능력을 개선하고 신경계의 퇴화를 억제한다. 임상연구로는 NGF의 두개골을 통한 주입으로 환자의 언어담당 기억을 증진시킨다는 보고도 있다.^6),7)그러므로 알츠하이머 병을 치료하는 수단으로 NGF나 신경활성 효과를 갖는 화합물을 선정하는 것은 합리적인 접근이라 할 수 있기 때문에 이러한 유사화합물에 의한 새로운 치료 가능성과 응용성도 점점 확대된다 할 수 있다. 그러나 내인성 NGF는 분자량이 매우 큰 펩타이드 중합체(polypeptide)이기 때문에 BBB(blood brain barrier, 혈액뇌 장벽)를 통과하지 못한다. 그러므로 NGF 부족으로 인하여 뇌에 생기는 질병을 치료하기 위해서는 일차적으로 뇌에 직접 주사를 해야만 치료효과를 최대화할 수 있는데, 이는 이용하기 쉽지 않은 방법이다. 또한 복강주사 등의 방법으로 투여할 경우 단백질 분해효소에 의하여 쉽게 대사되기 때문에 그 효능을 기대할 수 없게 된다. 그러므로 천연물로부터 neuriteoutgrowth 증강작용과 더불어 신경활성을 갖는 저분자량 화합물의 도출은 퇴행성 뇌질환 치료제의 탐색방법으로 의미있다고 할 수 있겠다.

이에 본 발명자들은 신경세포 성장에 관련된 연구를 수행한 결과 백강잠 101A가 세포독성은 거의 없으면서 신경세포 성장을 증강시키는 것을 확인하였으며, 본 발명은 이를 기초로 하여 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신경세포 성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 효과를 갖는 신규화합물을 백강잠 101A 추출물로부터 분리, 정제하여 제공하는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 상기 백강잠 101A 추출물로부터 분리, 정제한 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌((4E, 6E, 2S, 3R)-2-N -Eicosanoyl-4,6-tetradecasphingenine)를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 백강잠의 세포독성을 제거하면서 신경세포 성장 촉진활성을 가짐으로써 노인성 치매등과 같은 신경보호 활성을 갖도록 한 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌의 약제학적 제제에 관한 것이다.

도 1은 PC 12 세포주에 백강잠 101A로부터 분리된 신규화합물을 처리한 후 신경세포성장에 미치는 효과를 보여준다

PC 12 cells in 6-well plates were treated with compound and NGF, and neurite outgrowth was measured under a microscope at 6d-post treatment. Fresh medium with compounds or NGF was changed every day. Each value represents the mean+S.D. (n=30). **Significantly different from NGF value at the level of p<0.01. ***Significantly different from NGF value at the level of p<0.001.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용한 백강잠 101A는 대한민국 농촌진흥청 잠사곤충부에서 백강균의 아종인Beauveria bassiana101A를 새로이 개발하여 유충의 피부에 접종하여 일정 조건하에서 사육하여 얻은 것이다.

본 발명에 따른 백강잠 101A 추출물은 백강잠 101A를 물, 저급알코올, 초산에틸 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축 및 동결건조하여 제조한 것이다. 상기 백강잠 101A의 추출물을 제조하는 방법으로는 초음파 추출법, 여과법, 환류추출법을 사용할 수 있고, 이 밖에도 통상적으로 사용되는 추출법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 상기 추출물의 농축, 분획물 제조 및 동결건조과정 역시 통상적으로 알려진 방법으로 수행할 수 있다.

이러한 백강잠 101A의 추출물은 물, 알코올 또는 물과 알코올 혼합용매로 추출한 후 세포독성 분획을 제외한 분획물로부터 분리한 생리활성 성분이며, 여기에서 분리, 정제한 뇌신경물질의 하나가 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌(C₃₄H₆₅NO₃)이다.

따라서 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 백강잠 추출물로부터 분리, 정제한 뇌신경활성 물질인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌에 관한 것이다.

상기 화합물은 무정형 백색분말상으로서 HR-FAB-MS 스펙트럼을 ([M+Na]⁺m/z 558.4874) 통하여 분자식이 C₃₄H₆₅NO₃임을 확인하였고 NMR 기법을 사용하여 활성물질의 화학구조를 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌으로 결정하였다. 이 물질은 천연에서 처음 분리 보고되는 물질이다. 본 발명에서 추출한 화합물은 신경영양 인자(neurotrophic factor)과 같이 신경세포 성장 증강효과와 더불어 이들의 역할을 대체하는 효과도 나타냄으로써 신경세포 영양물질과 관련된 퇴행성 뇌질환에 응용할 수 있다.

PC12 세포는 rat 크롤친화성세포종(pheochromocytoma) 기원의 노르아드레날린성의 세포계(noradrenergic cell line)로 NGF에 민감하게 반응하여 정상적인 교감신경 뉴런(sympathetic neuron)의 많은 특징을 가지므로 NGF 작용기전 연구의 시험관내 모델로 이용되고 있다. 즉 PC12 세포주는 혈청(serum)이 포함된 배지에서 분열하고 NGF가 배지에 첨가되면 신경축색 성장을 보이나, 혈청이 없는 상태에서 배양하면 사멸로 죽게 되는데 이러한 세포사멸은 또한 NGF에 의해 억제되는 것으로 알려지고 있다.⁸⁾백강잠 101A의 메탄올 추출물과 이를 극성에 따라 분획한 소분획물, 즉 헥산 분획물을 PC12 세포에 처리한 결과 유의적인 신경세포 성장 촉진효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명은 상기 백강잠 101A의 추출물에서 분리, 정제한 신규화합물인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌의 약제학적 제제에 관한 것이다.

(4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 뇌질환 치료 및 예방을 위한 약학적 제제는 임상적용시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데 제제화시에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제. 붕해제, 계면활성제 등의 희석제나 부형제를 사용하여 조제되어질 수 있다. 이러한 고형제제는 정제, 산제, 환제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 백감잠류의 시료에 적어도 한가지 이상의 부형제를 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제가 이용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골 tween 61.등이 사용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 살펴볼 수 있지만 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 백강잠 101A 추출물의 제조

백강잠 101A는 농촌진흥청 잠사곤충부에서 공급받아 사용하였다. 백강잠 101A 건조분말 1.5kg을 메탄올로 상온에서 5회 반복추출하고 60℃에서 3회 추출하여 얻어진 추출액을 감압농축하여 120g의 메탄올 추출물을 얻었다. 평균수득률은 8%이상이었다.

[실시예 2] 백강잠 101A 현탁액의 분획물 제조

감압농축된 메탄올 추출물을 H₂O에 현탁시킨후 헥산(800㎖×3)으로 분획물 55g을 얻었다. 분획에 대한 NGF 활성을 측정한 결과(표 1), 헥산 분획에서 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며 분획으로부터 활성 성분 분리를 수행하였다.

[실시예 3] 백강잠(Beauveria bassiana101A)으로부터 단일 화합물 분리

헥산분획 55g에 대하여 헥산-초산에틸-메탄올 혼합용매(5:1:0, 3:1:0, 1:1:0, 10:10:1, 5:5:1, 2:5:1 및 0:5:1)로 메탄올 함량을 높여가며 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 4개의 소분획으로(H-1∼H-4) 나눈 다음, H-1 분획(30g)을 헥산-초산에틸(3:1)을 유출용매로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 3개의 소분획(H-11∼H-13)을 얻었다. H-13 분획(4.6g)에 대하여 디클로로메탄-메탄올(1:1)을 유출용매로 한 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 수행한 후 역상 Lobar^?A 컬럼 크로마토그래피(90% MeOH)를 수행하여 화합물(15 mg)을 얻었다.

[실시예 4] 단일화합물의 기기분석

¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 Brucker AMX 500 분광계로, MS 스펙트럼은 VG70-VSEQ(VG Analytical, UK)로 측정하였다. 추출 및 컬럼 크로마토그래피용 용매는 1급시약을, 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔은 Kiesel gel 60 (70-230 and 230-400mesh, ASTM Art. 7734 and 9385, Merck)을 사용하였고, 역상(reverse phase) 컬럼 크로마토그래피용 충진제는 LiChroprep RP-18 (40-63㎛, Art. 13900, Merck)를 사용하였다. LPLC는 LiChroprep Si60 Lobar-B column(Art. 10401, Merck)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F₂₅₄precoated plate(Art. 5554, Merck)를 사용하였다.

[실시예 5] 화합물의 구조구명

이러한 기기분석을 통하여 구조는 다음과 같이 결정하였다.

(4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌

White powder, mp. 74℃, [α]_D ²⁰+ 3.2°(c. 0.05, CHCl₃),nm (logε) : 233 (4.23),cm^-1: 3340, 2930, 2850, 1648, 1625, 1535, 1470, 1070, 1050, EI-MS m/z (rel. int.) : 535 (M+, 1), 517 (10), 487 (19), 388 (15), 354 (17), 337 (90), 312 (24), 306 (20), 224 (38), 206 (22), 193 (21), 60 (100), HR-FAB-MS: C₃₄H₆₅NO₃Na Found : 558.4874 Calcd. : 558.4862, FAB-CID MS m/z (rel. int.): 558 (100), 537 (1.9), 528 (0.9), 514 (0.7), 500 (0.7), 486 (1.0), 472 (0.9), 458 (1.1), 444 (0.8), 430 (1.0), 416 (0.8), 402 (0.7), 388(0.8), 374 (1.0), 358 (1.2), 332 (1.0), 318 (2.0), 206 (0.6),¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) : 0.88 (6H, t,J=7.0 Hz, H-14 and H-20), 1.20-1.39 (42H, m, H-9∼H-13, H-4∼H-19), 1.61 (2H, br. sep,J≒7.5 Hz, H-3), 2.06 (2H, m, H-8), 2.22 (2H, t,J=7.5 Hz, H-2), 2.74 (1H, br.s, OH), 2.88 (1H, br.s, OH), 3.70 (1H, br.d,J=10.5 Hz, H-1), 3.89∼3.96 (2H, m, H-1 and H-2), 4.39 (1H, br.s, H-3), 5.61 (1H, dd,J=15.0, 6.0 Hz, H-4), 5.73 (1H, dt,J=15.0, 7.5 Hz, H-7), 6.03 (1H, dd,J=15.0, 10.5 Hz, H-6), 6.26 (1H, br.d,J=7.0 Hz, NH), 6.29 (1H, dd,J=15.0, 10.5 Hz, H-5), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) : 14.78, 14.81 (C-14, C-20), 23.35, 23.39 (C-13, C-19), 26.46 (C-3), 29.85, 29.87, 29.90, 29.98, 30.03, 30.06, 30.20, 30.27, 30.34, 30.36, 30.40 (C-9∼C-13, C-4∼C-17), 32.51, 32.64 (C-12, C-18), 33.35 (C-8), 37.55 (C-2), 55.16 (C-2), 63.21 (C-1), 75.26 (C-3), 129.62, 129.64 (C-5, C-6), 133.46 (C-4), 137.50 (C-7), 174.60 (C-1)

화합물은 무정형 백색분말상으로서 HR-FAB-MS 스펙트럼을 ([M+Na]⁺m/z 558.4874) 통하여 분자식이 C₃₄H₆₅NO₃임을 확인하였다. IR 스펙트럼에서는 3340cm^-1에서 수산기의 흡수대 및 1648cm^-1에서 아미드기의 흡수대를 관찰할 수 있었다.¹H-NMR 스펙트럼에서 δ3.70 (1H, br.d,J=10.5 Hz), 3.89∼3.96 (2H, m) 및 4.39(1H, br.s)의 피크들과¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ55.16, 63.21 및 75.26의 피크들은 탄화수소 사슬(hydrocarbon chain)에서 2-amino-1,3-diol 그룹의 전형적인 피크로서 이를 통하여 화합물은 스핑고신(sphingosine) 유도체와 유사한 구조를 가지는 것으로 추정할 수 있었다.¹⁰⁾상기한 피크를 제외하고¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ 0.88 (6H, t,J=7.0 Hz), 1.20-1.39 (42H, m), 1.61 (2H, br. sep,J≒7.5 Hz), 2.06 (2H, m) 및 2.22 (2H, t,J=7.5 Hz)에서 지방족 탄화수소 사슬의 피크를, δ 5.61 (1H, dd,J=15.0, 6.0 Hz), 5.73 (1H, dt,J=15.0, 7.5 Hz), 6.03 (1H, dd,J=15.0, 10.5 Hz), 6.29 (1H, dd,J=15.0, 10.5 Hz)에서 서로 접합된 4개의 불포화 수소들의 피크를 관찰할 수 있었다.¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ14.78 및 14.81에서 두 개의 말단 메틸 피크를, δ 129.62, 129.64, 133.46 및 137.50에서 이중결합탄소 피크를, 174.60에서 아미드탄소 피크를 관찰할 수 있었다. 이중결합의 위치 및 기하학적 배열(geometry)은 짝지음상수 및¹H-¹H COSY 자료를 통하여 확정할 수 있었다. 화합물의 산 메탄올화(acid methanolysis)를 통하여 얻어진 지방산 에스테르는 GC-MS 분석결과 아이코사노일 메틸 에스테르(eicosanoyl methyl ester)로 확인되었다. FAB-MS에서 화합물의 [M+Na]⁺이온의 CID(Collision-induced dissociation) 스펙트럼은 m/z 318 (296+Na-H)에서 주이온 피크를 나타내었다. 이를 통하여 화합물이 C₁₄아미노 알코올의 지방산 아미드 유도체임을 추정할 수 있었다.¹¹⁾화합물의광회전(optical rotation)을 (+3.2°) 스핑고신 유도체들과^12),13)비교한 결과 화합물의 입체구조는 2S, 3R임을 확인할 수 있었다. 이상의 자료를 통하여 화합물의 구조는 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌으로 결정하였으며 이 물질은 천연에서 처음 분리 보고되는 물질이다.

[시험예 1]

<세포 배양>

100mm 배양접시(TPP, Switzerland)에 3X10⁴PC12 cells을 접종한 후, 2 g/L 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 5% 말 혈청(Horse serum), 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) (10000U/㎖) 1%가 포함된 RPMI1640 배지 하에서 배양하였다. 이때 사용한 FBS는 사용하기 전 56℃에서 30분간 열비활성화(heat-inactivation)시켜 사용하였다. 또한 5% CO₂와 O₂95% 배양기에서 70% 습도와 37℃ 온도 조건이 유지되게 한 후 배양하였다. 배지는 10㎖씩 매일 새로운 배지로 교체하였고, 세포 배양에 사용한 모든 시약은 GIBCO BRL 제품을 사용하였다.

<시료의 처리>

100mm 배양용기에서 세포들이 1x10⁷cells/well이 되면 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA(Gobco BRL, USA)용액을 500㎕ 처리함으로써 세포들을 배양용기로부터 이탈시킨 후 10㎖의 신선한 배지로 트립신-EDTA용액을 중화시키고 세포현탁액을 얻었다. 세포현탁액 20㎕에 0.4% 트리판 블루(Tryphan blue)(in PBS buffer) 10㎕을 가하여 염색한 후 혈구계(Hemocytometer)를 이용하여 살아있는 세포수를 계산하였다. Poly-D-리신(Sigma, USA, 50 ug/㎖)을 DPBS로 희석한 다음, 6 well 배양기에 2㎖씩 가하여 37℃에서 1시간 이상 방치하였다. 1시간 후 DPBS(pH.4)로 세척한 다음 건조된 6well에 1x10⁵cells/well의 농도로 배양용기에 접종하여 배양하였다. 시료는 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma, USA)에 녹여 이의 최종농도가 0.1% 이하가 되도록 한 후 0.22μM 멸균용 필터를 이용하여 여과하였다. 접종한 지 24시간 후에 화합물의 최종농도는 각각 10 μM, NGF는 50 ng/ml의 농도로 처리하였다. 5% CO₂와 95% O₂혼합공기 하에서 온도와 습도가 일정하게 유지되는 배양기에서 6일동안 배양하면서 신경돌기 성장 정도를 관찰하였고 2일에 한번씩 새로운 배지로 가해주었다.

<신경돌기 성장 측정>

접종한지 24시간 후에 1% FBS, 2% HS이 첨가된 신선한 배지로 교체하였다. 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경을 이용하여 cell body로부터 성장한 신경돌기의 정도를 관찰하였고 위상차 현미경을 이용하여 현미경 사진을 찍은 후에 인화된 사진을 이용하여 그 길이를 측정하였다. 신경돌기 성장에 미치는 효과는, 신경돌기 길이가 보이지 않으면 0으로, 신경세포체(cell body)의 직경과 그 길이가 같으면 +로, 신경세포체 직경의 2배 길이로 성장하였으면 ++로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 +++으로 수치화 하였다. 각 well당 10개의 세포를 선정하여 세포의 신경돌기 성장 정도를 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.

본 발명에 따른 백강잠 101A의 메탄올 추출물과 이를 극성에 따라 분획한 소분획물, 즉 헥산 분획물을 PC12 세포에 처리한 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

PC12 세포주에 백강잠 101A 추출물을 처리한 후 신경세포 성장에 미치는 효과를 측정한 결과

시료		신경세포성장정도
백강잠 101A B. corpus 101A	NGF(50ng.ml)	+++
	메탄올(10μg/ml)	+
	헥산분획	++
	클로르포름	+
	부탄올분획	++

PC12 cells in 6 well plates were treated with subfraction and NGF, and neurite outgrowth was measured under a microscope at 6 days post treatment. Fresh medium with compounds or NGF was changed every 2 days. Randomly selected fields were taken by the camera attached to light microscope. +; Processes with lengths equivalent to one diameters of the cell body, ++; Processes with lengths equivalent to two diameters of the cell body, +++; Processes with lengths equivalent to three diameters of the cell body

상기 표 1의 결과로 본 발명의 백강잠 101A 메탄올 추출물이 신경세포 성장 촉진 효과를 가짐을 알 수 있었다.

도 1에서는 신경영양적(neurotrophic) 활성이 우수한 헥산 분획물로부터 활성성분연구를 수행하여 1종의 스핑고신 유도체을 분리하여 구조를 규명한 화합물인(4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌에 대하여 신경세포성장 촉진효과를 검색한 결과를 보여주는 것으로, 본 발명에 따른 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀그닌이 신경세포 성장 촉진효과 가지는 것을 보여준다.

RNA 분리

Total cellular RNA는 트리졸(Trizol) 용액(Gibco BRL)을 이용하여 분리하였다. 1㎖의 트리졸 용액을 처리하여 세포를 용해시킨 후 세포 스크랩퍼(scraper) (TPP, switzerland)로 스크랩하여 얻은 세포 용해물을 1.5㎖ 마이크로 튜브(microtube)에 모아 21G 주입기(syringe)로 균질화하였다. 세포 균질액을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상층액에 클로로포름을 동량으로 첨가한 다음 15분 동안 상온에 방치한 후 다시 4℃, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 하였다. 상층액 즉 RNA층만 취하여 새로운 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 이행시키고 동량의 100% 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 가하여 혼합한 뒤 4℃, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 RNA 펠렛(pellet)을 1.5 ㎖ 75% 에탄올로 세척하고 4℃에서 12,000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 10분간 상온에서 완전히 건조시킨 후, 100㎕의 DEPC(diethylpyrocarbonate) 용액에 RNA를 녹인 다음 분광광도계(Hewlett Packard, U.S.A.)를 사용하여 UV 260 nm와 240 nm에서 측정하였다.

[시험예 2] 급성독성 실험

상기 실시예에서 제조한 백강잠 101A를 사용하기 전에 뜨거운 냄비에서 밀기울을 넣어 누렇게 될 때까지 초한다음 꺼내어 체로 쳐서 밀기울을 제거하고 이용하는 경우에는 쥐를 대상으로 경구투여 및 복강투여하여 독성을 나타내는지 여부를 알아보았다.

1. 경구투여

ICR 마우스와 SD rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠 101A 추출물을 100, 250, 500 및 1000 mg/kg의 용량으로 경구투여 하였다. 경구투여 후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 모든 군에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

2. 복강투여

경구투여 ICR 마우스와 SD rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠 101A 추출물을 25, 100, 250 및 500mg/kg의 용량으로 복강투여 하였다. 복강투여 후 24시간 독성 여부를 관찰한 결과 500mg/kg에서 2마리가 사망하였고 살아남은 동물의 경우 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

상기에서 전술한 결과를 통하여 확인된 것과 같이 백강잠 101A의 추출물 및 그 성분의 신경세포 성장 촉진 효과는 매우 뛰어난 것이었다.

본 발명에 의한 신규화합물인 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌 및 그 약제학적 제제는 퇴행성 뇌질환에 중요하게 관여하는 신경세포 축색돌기 성장촉진 및 신경영양인자 단백질 증강효과를 가지면서 세포독성은 없어 알쯔하이머, 파킨슨 및 중풍과 같은 퇴행성 뇌질환에 의하여 유발되는 신경세포 위축 및 손상을 경감시켰으며, 아울러 국민건강 증진과 양잠농가의 새로운 소득원으로의 역할이 기대된다.

참 고 문 헌

1) 김창민, 신민교, 안덕균, 이경순 : 중약대사전, 완역판, 도서출판 정담, p. 2015 (1997)

2) Kwon, H.C., Moon, H.I., Choi, S.H., Lee, J.O., Cho, S.Y., Jung, I.Y., Kim, S.Y. and Lee, K.R. : Cytotoxic constituents ofBombycis corpus.Yakhak Hoeji,43, 169 (1999)

3) Kwon, H.C., Bang, E.J., Choi, S.U., Lee, W.C., Cho, S.Y., Jung, I.Y., Kim, S.Y. and Lee, K.R. : Cytotoxic cyclodepsipeptides ofBombycis corpus101A.Yakhak Hoeji,44, 115 (2000)

4) Fischer, W., Wictorin, K., Gage, F. H. : Ameliaoration of cholingergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factors,Nature,329, 65 (1987)

5) Hefti, F : Neurotrophic factor therapy for nerve system degenerative diseases,J. Neurobiol.,25, 1418 (1994)

6) Jonhagen, M. E., Nordberg, A., Amberla, K. : Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease.Dementia Geriatr. Cognit. Disord., 9, 246 (1998)

7) Lindavall, O., Kokaia, Z., Bengzon, J., Elmer, E., Kokaia, M. : Neurotrophins and brain insults.Trends Neurosci.,17, 490 (1994)

8) Li P, Matsunaga K, Ohizumi Y. : Enhancement of the nerve growth factor-mediated neurite outgrowth from PC12D cells by Chinese and Paraguayan medicinal plants.Biol Pharm Bull.22, 752 (1999)

9) Krivit, W., Hammarstrom, S., Identification and quantitation of free ceramides in human platelets.Journal of Lipid Research13, 525-530 (1972)

10) Mori, K., Fumaki, Y., Synthesis of (4E, 8E, 2S, 3R, 2'R)-N-2'-hydroxyhexadecanoyl-9-methyl-4,8-sphingadienine. The ceramide portion of the fruiting-inducing cerebroside in a basidiomycete Schizophyllum commune and its (2R, 3S)-isomer.Tetrahedron41, 2369-2377 (1985)

11) Isobe R., Inagaki M., Harano, Y., Sakiyama H., Higuchi R., Structural elucidation of glycosphingolipids by collision-induced dissociation of sodium ion complex.Chemical & Pharmaceutical Bulletin45, 1611-1614 (1997)

12) Higuchi R., Harano, Y., Mitsuyuki, M., Isobe, R., Yamada, K., Miyamoto, T., Komori, T., Isolation and structure of cerebrosides from the starfish Stellaster equestris.Liebigs Annalen, 593-599 (1996)

13) Jiang, H., Huang, X., Nakanishi, K., Berova, N., Nanogram scale absolute configurational assignment of ceramides by circular dichroism.Tetrahedron Letters40, 7645-7649 (1999)

14) Edsall, J.T. : Raman spectra of amino acids and related compounds.VI. Sarcosine, ethanolamine, choline, betaine and betaine derivatives.J. Am. Chem. Soc.,65, 1767 (1943)

15) Leifer, A. and Lippincott, E.R. : The infrared spectra of some amino acids.J. Am. Chem. Soc.,79, 5098 (1957)

16) Motohashi, N., Mori, I. and Sugiura, Y. :¹³C-Nuclear magnetic resonance and raman spectroscopic studies on ionization and mercury complex of ergothioneine.Chem. Pharm. Bull.,24, 1737 (1976)

17) Mizuta, I., Ohta, M., Ohta, K., Nishimura, M., Mizuta, E., Hayashi, K. and Kuno, S. : Selegiline and Desmethylselegiline Stimulate NGF, BDNF, and GDNF Synthesis in Cultured Mouse Astrocytes.Biochemi Biophys Res Commu.,751, 279 (2000)

Claims

백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물로부터 분리, 정제한 뇌신경성장 촉진물질인 신규화합물로, 하기 화학식 1로 표현되는 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌.

[화학식 1]
제 1항에 있어서, 상기 (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N -아이코사노일-4,6-테트라데카스핀게닌을 유효성분으로 하는 뇌졸중, 뇌허혈, 파킨슨, 노인성 치매 및 헌팅턴 질환을 포함하는 뇌질환 치료를 위한 약제학적 제제.