DE69927007T2

DE69927007T2 - Spisulosin-verbindungen mit antitumor-aktivität

Info

Publication number: DE69927007T2
Application number: DE69927007T
Authority: DE
Inventors: Lloyd-University of Illinois Kenneth RINEHART; Louise-University of Illinois Nancy FREGEAU; Arthur-University of Illinois Robert WARWICK; S.A. Dolores-Pharma Mar GARCIA GRAVALOS; Jesus-Universidad Autonoma De Madrid Avila; Thomas Glynn FAIRCLOTH
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-04-10
Also published as: AU763981B2; DE69927007D1; EP1069894B1; JP2002511410A; KR100568964B1; PL343381A1; CN1335770A; TR200002955T2; ES2248995T3; BG104935A; SK15082000A3; EP1069894A1; DK1069894T3; BR9910120A; ATE303139T1; BG64970B1; UA72208C2; KR20010074483A; HK1042048A1; NO20005052L

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen aus Spisulosin-Verbindungen. Sie betrifft weiter die Behandlung von Tumoren und stellt neue cytotoxische Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Anwendung gegen Tumoren bereit. Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft Antitumor-Verbindungen aus marinen Organismen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es bestand erhebliches Interesse an der Isolation bioaktiver Verbindungen aus marinen Organismen. Typische Verfahren beinhalten in vitro-Screening-Programme zum Testen von Rohextrakten auf antimikrobielle, antivirale und cytotoxische Aktivitäten. Erläuternde Beispiele bekannter bioaktiver Verbindungen aus marinen Quellen schließen Bryostatine, Ecteinascidine und auch Didemnine ein, wobei es sich bei Didemnin B, das inzwischen auch als Aplidin bekannt ist, um das erste natürliche marine Produkt in der klinischen Prüfung handelt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung sind neue pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine langkettige, geradkettige Alkan- oder Alken-Verbindung mit einer 2-Aminogruppe und einer 3-Hydroxygruppe zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Verbindung stellt ein 2-Amino-3-hydroxyalkan dar. Die Verbindung stellt bevorzugt ein substituiertes C₁₆- bis C₂₄-Alkan oder -Alken dar. Die Verbindung stellt bevorzugt ein substituiertes Alkan, bevorzugter ein substituiertes C₁₈- bis C₂₀-Alkan dar. Das substituierte Alken stellt bevorzugt ein substituiertes Mono- oder Dialken, bevorzugter ein substituiertes C₁₈- bis C₂₀-Alken dar. In einer Ausführungsform weisen die Verbindungen die partiale Stereochemie wie folgt auf:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Zusammensetzungen, die bioaktive Basen des Sphingoid-Typs, Spisulosine 285, 299 und 313 (1–3), Sphingosin (auf das auch als auf 4-Sphingenin oder Octadeca-4-sphingenin verwiesen wird) (4) und zwei verwandte Verbindungen, Nonadeca-4-sphingenin (ein um einen Kohlenstoff verlängertes Homologon (5) und Sphinga-4,10-dien (ein Dehydrosphingosin-Derivat (6) enthalten.
Die bevorzugten Zusammensetzungen enthalten folglich eine oder mehr der folgenden bevorzugten Verbindungen:
Spisulosin 285 (1), n = 12; Spisulosin 299 (2), n = 13; Spisulosin 313 (3), n = 14; ebenso wie:
Sphingosin (4), n = 12 und Nonadeca-4-sphingenin (5), n = 13; und
Sphinga-4,10-dien (6).
Spisulosin 285 ist in der Literatur bekannt. Verbindung 1 und das syn-Diastereoisomer wurden erstmals von kroatischen Forschern bei der Bestimmung der absoluten Konfigurationen der Lipidbasen mit zwei oder mehr asymmetrischen Kohlenstoffatomen synthetisiert, siehe Proštenik, M., Alaupovic, P. Croat. Chem. Acta. 1957, 29, 393.
Es wird angenommen, dass die anderen Verbindungen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen neue Verbindungen darstellen.
Verbindungen 1–3 zeigen eine einzigartige Cytotoxixität gegen marine lymphozytäre Leukämiezellen L1210. In einer Anzahl der L1210-Assays wurde eine distinkte morphologische Veränderung beobachtet. Diese Wirkung wurde auch in unserer früheren vorläufigen US-Patentanmeldung, Eingangsnummer 60/043326, beobachtet. Wir machen in dieser Patentanmeldung keinen Patentanspruch hinsichtlich der Wirkung auf L1210 selbst geltend, und es liegen nun in der Tat einige vorläufige Daten vor, die zu erkennen geben, dass es den Verbindungen, wie zum Beispiel Spisulosin 285, an Aktivität gegen Leukämie-Tumoren mangeln könnte.
Es wurde eine synthetische Probe von 1 gegen L1210-Leukämiezellen untersucht. die sowohl Cytotoxizität als auch eine morphologische Veränderung, eine Aktivität zugespitzter Zellen aufweisen.
Spisulosin 285 (1) ist auch aktiv gegen andere Tumorzelllinien in vitro, einschließlich P-388 (0,01 μg/ml); A-549 (0,05 μg/ml); HT 29 (0,05 μg/ml) und MEL-28 (0,05 μg/ml).
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird auf die Verwendung von Spisulosin 285 und verwandten Verbindungen in der Behandlung aller Krebstypen, wie zum Beispiel der folgenden verwiesen: Mamma-, Prostata-, Blasen-, Pankreas-, Lungen, Ösophagus-, Larynx-, Leber-, Kolon-, Schilddrüsen-, Nieren-, Hoden- und Ovarialkarzinomen, gastroninstestinalen, hepatozellulären und vaskulären Endothelialkarzinomen und Leukämien und Melanomen. Andere Krebsformen sind dem Fachmann weithin bekannt. Es wird bevorzugt, dass die Anwendung von Spisulosin 285 und verwandten Verbindungen gegen solide Tumoren gerichtet ist, wobei die Anwendung gegen langsam proliferierende Tumoren, wie zum Beispiel, Prostata-, Lungen-, Leber- und Nierenkarzinome und Karzinome der endokrinen Drüsen und des vaskulären Endothels insbesondere bevorzugt sind. In einem Aspekt sind die Zusammensetzungen zur Anwendung in der Therapie an das Gefäßendothel zur Kontrolle der Gewebs- und Tumorvaskularisation gerichtet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind bioaktive Verbindungen, von denen gefunden wurde, dass sie spezifische Antitumoraktivitäten besitzen und als solches als Arzneimittel bei Säugern, insbesondere bei Menschen nützlich sein werden. Folglich ist ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen, die die hierin identifizierten aktiven Verbindungen und Behandlungsverfahren, die derartige pharmazeutische Zusammensetzungen einsetzen, enthalten.
Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen weisen Antitumoraktivität auf. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich auch ein Verfahren zur Behandlung eines jedweden an einem malignen Tumor erkrankten Säugers, der gegen diese Verbindungen, die die Verabreichung an dem erkrankten Wesen einer therapeutisch wirksamen Menge einer aktiven Verbindung oder eines Verbindungsgemischs oder von pharmazeutischen Zusammensetzungen davon umfassen, empfindlich ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Pharmazeutika, die als Wirkstoff eine oder mehr erfindungsgemäße Verbindung(en) enthalten, ebenso wie die Verfahren für ihre Zubereitung.
Beispiele pharmazeutischer Zusammensetzungen schließen jedwede Feststoffe (Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulat usw.) oder Flüssigkeiten (Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) mit geeigneter Zusammensetzung oder die orale, topische oder parenterale Verabreichung ein, und sie können die reine Verbindung oder in Kombination mit jedwedem Träger oder anderen pharmakologisch aktiven Verbindungen enthalten. Diese Zusammensetzungen müssen – wenn sie parenteral verabreicht werden – gegebenenfalls steril sein.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann durch jedwedes geeignete Verfahren, wie zum Beispiel intravenöse Infusion, orale Präparationen, intraperitoneale und intravenöse Verabreichung erfolgen. Die intravenöse Abgabe kann über jedwede geeignete Zeitdauer, wie zum Beispiel 1 bis 4 Stunde(n) oder gegebenenfalls selbst länger, in geeigneten Intervallen von ca. 2 bis 4 Wochen durchgeführt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend Spisulosin, können durch Einkapselung in Liposomen oder Nanosphären, in Formulierungen mit hinhaltender Wirkstofffreigabe oder mittels anderer Standardabgabemittel durchgeführt werden.
Die korrekte Dosierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die erfindungsgemäßen Verbindungen wird gemäß der entsprechenden Formulierung, der Anwendungsweise und dem entsprechenden Situs, dem Wirt und den zu behandelnden Bakterien oder dem Tumor variieren. Andere Faktoren wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeit, Exkretionsraten, Zustand des Wirts, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schweregrad der Erkrankung müssen auch Berücksichtigung finden. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch im Rahmen der maximal tolerierten Dosis erfolgen.
Die Verbindungen können in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in der Form einer Prodrug oder eines Präkursors, die/der nach Verabreichung umgewandelt oder in die aktive Verbindung metabolisiert wird, bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können mit anderen Arzneimitteln zur Bereitstellung einer Kombinationstherapie angewendet werden. Die anderen Arzneimittel können einen Teil der gleichen Zusammensetzung bilden oder als eine getrennte Zusammensetzung zur gleichzeitigen Verabreichung oder zu einer anderen Zeit bereitgestellt werden. Die Identität des anderen Arzneimittels ist nicht besonders eingeschränkt und zu geeigneten Kandidaten zählen die folgenden:

a) Arzneimittel mit antimitotischen Wirkungen, insbesondere die, die auf cytoskeletale Elemente gerichtet sind, einschließlich Mikrotubulus-Modulatoren, wie zum Beispiel Taxan-Arzneimittel (wie zum Beispiel Taxol, Paclitaxel, Taxoter, Docetaxel), Podophylotoxine oder Vincaalkaloide (Vincristin, Vinblastin);
b) Antimetaboliten, wie zum Beispiel 5-Fluorouracil, Cytarabin, Gemcitabin, Purinanaloga, wie zum Beispiel Pentostatin, Methotrexat);
c) alkylierende Mittel, wie zum Beispiel Loste (wie zum Beispiel Cyclophosphamid oder Ifosphamid);
d) Arzneimittel, wie zum Beispiel die Antracyclin-Arzneimittel Adriamycin, Doxorubicin, Pharmorubicin oder Epirubicin, welche die DNA targetieren;
e) Arzneimittel, wie zum Beispiel Etoposid, welche Topoisomerasen targetieren;
f) Hormone und Hormonagonisten oder -antagonisten, wie zum Beispiel Estrogene, Antiestrogene (Tamoxifen und verwandte Verbindungen) und Androgene, Flutamid, Leuprorelin, Goserelin, Cyprotron oder Octreotid;
g) Arzneimittel, einschließlich Antikörper-Derivaten, wie zum Beispiel Herceptin, welche auf die Signaltransduktion in Tumorzellen abgezielt sind;
h) alkylierende Arzneimittel, wie zum Beispiel Platin-Arzneimittel (Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Paraplatin) oder Nitrosoharnstoffe;
i) Arzneimittel, wie zum Beispiel die Matrixmetalloproteinase-Inhibitoren, die sich potenziell auf die Metastasen von Tumoren, auswirken;
j) Gentherapie und Antisense-Mittel;
k) Antikörper-Therapeutika; und
l) andere bioaktive Verbindungen von mariner Herkunft, insbesondere die Ecteinascidine, wie zum Beispiel ET-743 oder die Didemnine, wie zum Beispiel Aplidin.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Verbindungen zur Anwendung in einem Behandlungsverfahren und die Verwendung der Verbindungen bei der Zubereitung einer Zusammensetzung zur Krebsbehandlung.
Spisulosin 285 verfügt über eine Wirkung auf die Zellmorphologie. Mit Spisulosin behandelte Verozellen wiesen eine reduzierte Mikofilamentstruktur auf, wie anhand des Färbens der mit Spisulosin behandelten Zellen mit Phalloidin, das Aktin in den Mikrofilamenten färbt, beurteilt wurde. Spisulosin wirkt sich auch auf die Verteilung des kleinen GTP-bindenden Proteins Rho aus, obwohl diese Wirkung durch Vorbehandlung mit dem Rho-Aktivator LPA reduziert oder eliminiert werden kann (Mackay und Hall, J. Biol. Chem., 273, 20685–20688, 1998).
Ohne durch Theorie eingeschränkt sein zu wollen, besteht die Annahme, dass der Wirkmechanismus von Spisulosin die Modulation der Wirkung des kleinen GTP-bindenden Proteins Rho, möglicherweise über eine Wirkung auf die LPA-Aktivierung, beinhaltet. Von Rho ist bekannt, das es an der Bildung von Stressfasern beteiligt ist (Hall, A., Science 279, 509–514, 1998) und eine Rolle bei der Kontrolle der Zelladhäsion und -motilität durch Reorganisation des Aktin-Cytoskeletts spielt (Itoh, et al., Nature Medicine, Vol 5, Nr. 2, 1999). Die Adhäsion von Tumorzellen an Wirtszellschichten und die sich anschließende transzelluläre Migration stellen bei der Krebsinvasion und der Metastasierung wichtige Schritte dar. Durch Einwirkung auf die Mikrofilamentspiegel in der Zelle (Reduktion) über eine (inhibitorische) Wirkung auf Rho kann Spisulosin bei der Begrenzung der Krebsentwicklung über eine Wirkung auf das Cytoskelett der Zelle dienen. Es ist auch bekannt, dass Rho die Progression der G1-Phase des Zellzyklus triggert. Als solches kann die Modulation von Rho auch die Zelltransformation durch Aufhalten der Progression des Zellzyklus verhindern. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von Spisulosin bei der Zubereitung eines Arzneimittels zur Krebsbehandlung, worin das Spisulosin zur Veränderung der Aktivität des Rho-Proteins wirkt.
LPA, ein Rho-Aktivator, kann bei der Verhinderung der Wirkung von Spisulosin auf die Bildung von Mikrofilamenten helfen. Während das spezifische Target von Spisulosin nicht bekannt ist, deuten die beobachtete Reduktion der Aktin-Mikrofilamente in mit Spisulosin behandelten Zellen und die Lipidstruktur von Spisulosin darauf hin, dass Spisulosin als ein Antagonist für den LPA-Rezeptor dienen kann, wobei verhindert wird, dass LPA mit seinem Rezeptor zur Aktivierung von Rho zur Bildung der Mikrofilamente interagiert.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen wurden initial aus Spisula polynyma isoliert. Spisula polynyma stellt eine genießbare Muschel dar, die auch als Stimpsons oder Atlantische Trogmuschel bekannt ist. Sie gehört zur Subfamilie der Mactrinae, der Familie der Mactridae, der Superfamilie der Mactroidea, der Ordnung Veneroida, der Unterklasse Heterodonta, der Klasse Bivalvia, Phylum Mollusca. Spisula polynyma wurde ursprünglich in der Nähe der japanischen Küste gefunden, wo sie als Hokkigai bezeichnet und zu Sushi verarbeitet wird. Sie ist nunmehr durch die Bering Straße, hinunter an Grönland und Neufundland vorbei in den Atlantik migriert. Die Muschel weist eine 7–10 cm lange grauweiße Schale auf. Sie ist überwiegend weißlich, mit Ausnahme der Zunge, die bei der lebenden Muschel purpurrot ist, nach dem Kochen aber in ein leuchtendes Rot übergeht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind folglich aktive Extrakte der Muschel Spisula polynyma. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform richtet sich an neue Verbindungen, die aus der Muschel Spisula polynyma isoliert wurden, und die Verwendung aller der daraus als Antitumorverbindungen isolierten cytotoxischen Verbindungen.
Zum Testen auf biologische Aktivität wurde eine Muschel in Methanol/Toluen 3:1 homogenisiert. Diesem Rohextrakt wurde eine Lösung aus Natriumchlorid zugefügt, wodurch seine Trennung in eine Toluen- und eine wässrige Schicht veranlasst wurde. Letzteres wurde weiter mit Toluen, Dichlormethan, Ethylacetat und 1-Butanol extrahiert. Diese Extrakte wurden alle gegen L1210-Zellen untersucht, wobei eine signifikante Cytotoxizität für die initialen Roh-, Toluen- und Dichlormethanextrakte und weniger Aktivität in den anderen drei Fraktionen beobachtet wurde.
Fußnoten:

^a Cytotoxizität, angegeben als Wachstumsinhibition (%);
^b Mit * gekennzeichnete Einträge zeigten eine Aktivität der zugespitzten Zellen;
^c der wässrige Extrakt wurde bei 700, 350, 140, 70, 35 und 14 μg/ml bestimmt.

Diese Extrakte wurden auch gegen Herpes simplex-Virus Typ I (HSV-1) und CV-1-Affennierenzellen (bei 100 μg/6,35-mm-Disk) bestimmt, es wurde jedoch keine Aktivität beobachtet. Keine antimikrobielle Aktivität wurde für diese Extrakte gegen Penicillium melinii (früher P. atrovenetum) und Micrococcus luteus (früher Sarcina lutea, beide bei 500 μg/12,7-mm-Disk) beobachtet. Später wurden andere besser gereinigte Extrakte gegen Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli mit keiner beobachteten Bioaktivität bestimmt.
Synthetische Verfahren stehen zur Präparation der Spisulosin-Verbindungen, insbesondere der Spisulosine 285 (1), 299 (2) und 313 (3) auch zur Verfügung.
Die bevorzugte Syntheseroute basiert auf der vorherigen Zugabe von Organometallen zu N,N-Dibenzylamino-Aldehyden, um β-Aminoalkohole mit hoher Stereoselektivität zu ergeben. Siehe Andres et al., Org. Chem. 1996, 61, 4210 und Reetz et al., Angew Chem. Int. Ed Engl., 1987, 26, 1141. Die Nichtchelation-kontrollierte Zugabe von Grignard-Reagenzien oder Organolithium-Verbindungen bildet das anti-Diastereomer und die Chelation-kontrollierte Zugabe von Organozink, was bevorzugt das syn-Diastereomer ergibt.
Schema I erläutert dieses bevorzugte synthetische Verfahren zur Bildung von Verbindung 1:
SCHEMA 1
Wie in Schema I beschrieben, kann der β-Aminoaldehyd 50 aus L-Alaninmethylester durch zuerst Dibenzylierung der Aminogruppe mit Benzylbromid und Kaliumcarbonat, gefolgt von Lithiumaluminiumhydrid-Reduktion zum N,N-Dibenzylaminoalkohol 40 hergestellt werden. Die Swern-Oxidation von 40 ergibt 50 in hoher Ausbeute und kann ohne weitere Reinigung zur Vermeidung der Zersetzung verwendet werden. Die Zugabe des Grignard-Reagenzes zu 50 ergibt das anti-Diastereomer 60 mit hoher Selektivität. Die Verbindung 60 kann zum Beispiel mittels Flash-Chromatographie und HPLC leicht gereinigt werden. Die Entschützung von 60 durch Hydrogenolyse auf einem Pearlman-Katalysator ergibt 1 in hoher Ausbeute und eine gute Ausbeute insgesamt. Verbindungen 2 und 3 können einfach durch Verlängerung der Kettenlänge des Grignard-Reagenzes hergestellt werden, und die übrigen erfindungsgemäßen Verbindungen können auch durch eine geeignete Wahl des Grignard-Reagenzes hergestellt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A, 1B, 1C, 1D, 1E und 1F stellen Erläuterungen der in den L1210-Assays von Spisula polynyma-Extrakten beobachteten Zellmorphologien dar. 1A stellt eine normale Zelle dar; 1B stellt eine typische zugespitzte Zelle dar; 1C stellt eine atypische zugespitzte Zelle dar; 1D stellt eine Zelle mit mehr als zwei Spitzen dar; 1E stellt eine ausgebauchte Zelle dar; und 1F stellt eine Kombination aus ausgebauchter und zugespitzter Zelle dar.
2 erläutert das zur Trennung der hierin beschriebenen Verbindungen aus Extrakten der Muschel Spisula polynyma verwendete Schema.
3 stellt eine Mikrofotografie für die Ergebnisse in Beispiel A dar.
4 stellt eine Mikrofotografie für die Ergebnisse in Beispiel B dar.
5 stellt ein Elektropherogramm von Beispiel C dar.
6 stellt eine Mikrofotografie für die Ergebnisse in Beispiel D dar.
Unter Bezugnahme auf 1 gingen einige der Zellen im L1210-Assay von einer sphärischen (1A) in eine ovoide Form mit langen, um ca. 180° auseinander liegenden Spitzen über (1B). In den Assays dieser Extrakte wurden auch mehrere andere Formen beobachtet, einschließlich Zellen mit Spitzen, die nicht um 180° auseinander lagen (1C), Zellen mit mehr als zwei Spitzen (1D), Zellen mit einer Ausbauchung (1E) und Zellen mit einer Ausbauchung, die eine der Spitzen ersetzt (1F). Die Form mit zwei scharfen gegenüberliegenden Spitzen stellte unter den beobachteten jedoch bei weitem die ausgeprägteste und charakteristischste dar. Dieser Typ der morphologischen Veränderung war bisher noch niemals zuvor während des Screenings von über 1000 marinen Extrakten beobachtet worden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
ISOLATION VON SPISULOSINEN 285, 299 UND 313
Spisula polynyma wurden erfindungsgemäß bei einer Tiefe von 110 ft, aus einem Muschelbett am östlichen Rand von Stellwagon Bank, das sich vor der Küste von Neuengland befindet und sich von der Umgebung von Gloucester, Massachusetts, nach Norden bis Maine erstreckt. Sie wurden von der New England Clam Corporation (früher New Dawn Seafoods, Inc.) lebend verschifft und dann sofort eingefroren.
Für die Reinigung wurde ein Schema ähnlich dem vorstehend für die Originaltests auf die Bioaktivität beschriebenen Extraktionsverfahren eingesetzt. Zuerst wurden 35 Muscheln aufgetaut und die Schalen entfernt, um 1,9 kg (Feuchtgewicht) zu ergeben. Diese wurden in Methanol/Toluen 3:1 stehen lassen und nach mehreren Stunden abfiltriert. Dieser Schritt wurde wiederholt, gefolgt von Homogenisierung und gründlicher Extraktion mit dem gleichen Lösungsmittel, um einen Rohextrakt zu ergeben. Diesem wurde eine 1 M Natriumchlorid-Lösung zugefügt, wodurch sich der Extrakt in zwei Schichten trennte. Die untere wässrige Schicht wurde weiter mit Toluen extrahiert und die Toluenschichten wurden kombiniert. Die sich ergebende wässrige Schicht wurde dann wie in 2 gezeigt mit Dichlormethan extrahiert.
Der Toluenextrakt wurde zwischen Methanol und Hexan verteilt. Die Cytotoxizität und Zellveränderung wurde fast ausschließlich in der Methanolfraktion beobachtet. Der auf diese Weise erhaltene Methanolextrakt wurde auf eine Silikagel-Flash-Säule aufgebracht und mit einer Chloroform/Methanol-Stufeneluierung (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100) eluiert. Die cytotoxische und die die zugespitzten Zellen bildende Hauptaktivität eluierte sehr spät von der Säule, obwohl frühere Fraktionen etwas Cytotoxizität, aber keine zugespitzten Zellen zu erkennen gaben. Dieses späte Eluat wurde mittels der Flash-Silikagel-Chromatographie unter Verwendung von 8:12:1:1 Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser weiter gereinigt. Die Fraktionen wurden vor Entfernung des Lösungsmittels zur Verhinderung einer möglichen Zersetzung, wenn sie in Säure konzentriert wurden, mit Natriumbicarbonat neutralisiert. Dies führte zu einer Reihe aus drei bioaktiven Fraktionen.
Es wurde bei früheren Isolationsansätzen beobachtet, dass die Bioaktivität mit Methanol nicht aus einer Cyano-Festphasenextraktionssäule (SPE-Säule) ausgewaschen wurde, es wurde jedoch gefunden, dass die Cytotoxizität mit Methanol/0,01 M Ammoniumformiat 3:1 (0,5 ml/min) eluierte. Dies wurde anhand der Chromatographie einer kleinen Menge einer bioaktiven Fraktion auf einer Cyano-HPLC-Säule mit dem gleichen Lösungsmittelsystem und dann Wiederholen der Injektion unter den gleichen Bedingungen, mit Ausnahme des Austauschens der Ammoniumformiat-Lösung mit Wasser, bestätigt. Die Chromatogramme schienen identisch zu sein, außer dass ein Peak, der bei 15,6 min eluierte, nur im ersten beobachtet wurde.
Die drei bioaktiven Fraktionen aus der zweiten Silikagel-Säule wurden anhand der Cyano-HPLC unter den vorstehend verwendeten gleichen Bedingungen (außer 1 ml/min) jeweils weiter gereinigt, um drei Reihen bioaktiver Fraktionen zu ergeben. Das Ammoniumformiat wurde entfernt, indem man die Probe durch eine C-18-SPE-Säule laufen ließ, wobei man zuerst mit Wasser spülte und mit Methanol eluierte. Es wurde ermittelt, dass die Hauptcytotoxizität und Morphologie-ändernde Aktivität von jeder Reihe (Fraktionen A, B, und C) in einem Peak gefunden wurde, der mit dem vorstehend besprochenen vergleichbar war. Die Aktivität breitete sich jedoch durch die meisten Fraktionen aus. Die Silikagel-DC (Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:12:2:2) deutete darauf hin, dass Fraktion A (0,4 mg) einen Fleck (R_f 0,47) enthielt, der sich mit Ninhydrin rosa anfärbte. Fraktion B (1,3 mg) wies diesen gleichen Fleck ebenso wie einen geringgradig weniger ausgeprägten (R_f 0,44, der sich mit Ninhydrin rot anfärbte) auf, während Fraktion C (0,2 mg) beide diese Flecke und einen dritten enthielt (R_f 0,34, der sich mit Ninhydrin purpurrot anfärbte). Alle drei ließen eine gute Cytotoxizität und eine Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen erkennen, wobei A etwas mehr Aktivität als B und signifikant mehr als C aufwies. Dies deutete darauf hin, dass der oberste DC-Fleck von der/den Verbindung(en) herrühren musste, welche die morphologische Veränderung in den L1210-Zellen veranlasste(n). Diese Fraktionen wurden nicht weiter gereinigt, sondern als Gemische analysiert. Die Ergebnisse vom quantitativen Bioassay werden nachstehend besprochen.
Es wurde ein Versuch zur Bestimmung unternommen, ob ein bestimmtes Organ von Spisula polynyma die meiste oder die gesamte Bioaktivität enthielt. Eine lebende Muschel wurde mit Diethylether anästhesiert und dann in neun Teile präpariert: Fuß, Verdauungssystem, Gonaden, Siphon, Kiemen, Herz, Mantel, Adduktionsmuskeln und den Rest der Viszeralmasse (mit entferntem Fuß, Verdauungssystem und Gonaden). Diese wurden anhand des Vergleichs mit Abbildungen von anderen Muscheln identifiziert. Jedes Organ wurde in Methanol/Toluen 3:1 homogenisiert und der sich ergebende Extrakt wurde dann mit Dichlormethan und Methanol zur Entfernung von Salzen trituriert. Während alle Extrakte Cytotoxizität aufwiesen (Tabelle), wies nur die aus den Kiemen und Gonaden eine starke die Morphologie-ändernde Aktivität auf. Die aus dem Verdauungssystem und dem Rest der Viszeralmasse wies auch eine schwache Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen auf, möglicherweise aufgrund der inkompletten Trennung aus den Gonaden. Die mangelnde Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen in anderen Organen kann entweder aus einem Mangel an 1–3 oder aus einer viel niedrigeren Konzentration heraus entstanden sein.
In einem anderen Experiment, wurde ein Fuß, der für eine kurze Zeit gekocht wurde auf analoge Weise extrahiert. Dieser wies auch Cytotoxizität, aber keine Morphologie verändernde Aktivität auf. Wenn jedoch eine größere Probe aus gekochtem Material gründlicher extrahiert wurde, wurden im L1210-Assay einige zugespitzte Zellen beobachtet. Die Silikagel-DC (Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:12:2:2, 100 μg) der Extrakte vom Verdauungssystem und den Gonaden gab einen schwachen Ninhydrin-positiven Fleck bei R_f 0,49 zu erkennen.
Fußnoten:

^a Der prozentuale Anteil zugespitzter Zellen wurde 58 bis 82 h nach Beginn des Assays gemessen.
^b a.t. = alle tot.
^c na= nicht abgelesen, aufgrund des präzipitierten Materials im Assay, das die Zellen verdeckte.
^d Prozentualer Anteil zugespitzter Zellen, die 72 h nach Beginn des Assays gemessen wurden.
^e Diese Probe wurde auf ähnliche Weise extrahiert wie die, die zum Erhalt des Rohextrakts von der Isolation der Fraktionen A–C verwendet wurde. Prozentualer Anteil der zugespitzten Zellen, die 76 h nach Beginn des Assays gemessen wurden.

Mehrere Hinweise auf die Struktur der bioaktiven Verbindungen konnten im Isolationsverfahren gefunden werden. Der DC-Fleck, der mit der mit Ninhydrin als rosa oder rot sichtbar gemachten Aktivität korrelierte, deutete darauf hin, dass die Verbindungen primäre Amine enthalten. Sie wiesen auch einen amphiphilen Charakter auf. Sie wurden original aus wässrigem Methanol in Toluen extrahiert, sie verteilten sich aber dann in Methanol versus Hexan. Während sie in nicht polaren Lösungsmitteln löslich sind, erfordern sie zur Eluation aus Silikagel ein sehr polares Lösungsmittel (Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:12:2:2).
Nur die Fraktionen A und B waren, wie anhand der DC gezeigt, einigermaßen frei von inaktiven Kontaminanten. Die meisten Studien zur Bestimmung der Struktur wurden aufgrund ihrer Größe im Vergleich zu den anderen an Fraktion B durchgeführt. 3 und 4 zeigen die ¹H-NMR-Spektren dieser Fraktion in CDCl₃ bzw. CD₃OD. Ein Peak, der einer langen Methylenkette (1,25 ppm) und mehreren überlappenden terminalen Methylgruppen (0,87 ppm) entsprach, war in diesen Spektren sofort offensichtlich. Andere Peaks waren nicht so gut definiert. Es wurden keine Peaks beobachtet, die aromatischen Protonen entsprachen, in der Alken-Protonenregion traten jedoch mehrere Peaks in Erscheinung. Mehrere andere schienen den an die Heteroatom-substituierten Kohlenstoffe angelagerten Protonen zu entsprechen. Der Hauptunterschied zwischen den Spektren in den beiden verschiedenen Lösungsmitteln bestand darin, dass in CD₃OD ein Methyldublett (1,21 ppm) nach den tieferen Feldern der terminalen Methylgruppen verschoben deutlich beobachtet wurde, während in CDCl₃ diese Resonanz nur als ein nach der oberen Bandenschulter verschobener Methylenketten-Peak in Erscheinung trat.
Eine authentische Probe von D-trans-erythro-Sphingosin (4) wurde von Sigma zum Vergleich mit dem isolierten Material bezogen. Das ¹H-NMR-Spektrum davon war in vielerlei Hinsicht dem von Fraktion B ähnlich. Wie erwartet, wies 4 aufgrund der langen Methylenkette (1,25 ppm) einen großen Peak, eine terminale Methylgruppe (0,87 ppm) und zwei Vinylprotonen (5,75 und 5,46 ppm) auf. Besonders beachtenswert war die Breite der Resonanzen, die den Protonen an den Heteroatom-substituierten Kohlenstoffen (4,40, 3,66, 2,85 und 2,18 ppm) entsprach. Auch auf der Silikagel-DC (Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:12:2:2) wies 4 einen R_f 0,43 auf und schien sich, wie der untere Fleck in Fraktion B und der mittlere Fleck in C, mit Ninhydrin rot anzufärben. Palmeta und Proštenik haben mitgeteilt, dass 2-Amino-3-octadecanol und 4 sehr ähnliche R_f-Werte (0,32 bzw. 0,29) aufwiesen, wenn sie auf mit Kieselsäure imprägniertem Papier mit dem Lösungsmittelsystem Diisobutylketon/Essigsäure/Wasser (40:25:5) eluiert wurden.
Fraktionen A–C wurden auch anhand mehrerer massenspektrometrischer Verfahren untersucht. Das größte Ion in allen Spektren war m/z 286. Eine Messung von hoher Auflösung von diesem Peak (m/z 286,3109) ermöglichte die Zuordnung der Molekularformel C₁₈H₄₀NO (0,1 mmu; „milli mass unit") zu Spisulosin 285 (1). Diese Verbindung leitete ihre Bezeichnung teilweise von ihrem Molekulargewicht her. Diese Molekularformel zeigte an, dass das Molekül vollkommen gesättigt ist. Ein starker Peak, der dem Wasserverlust aus diesem M + H-Ion entspricht, wurde bei 268,3019 (Δ –1,5 mmu) beobachtet. Folglich muss 1 eine Hydroxylgruppe enthalten. Ionen, die den Matrix-Addukten von m/z 286 entsprachen, wurden bei m/z 438,3078 (G₂₂H₄₈NO₃S₂, Δ –0,2 mmu), 590 und 592 beobachtet.
Ein überall bekannter primärer Metabolit, der, wie 1, aus einer Kette aus 18 Kohlenstoffen substituiert mit Hydroxyl- und Aminfunktionalitäten besteht, stellt Sphingosin (4) dar. Diese Verbindung weist einen Sauerstoff mehr und zwei Wasserstoffe weniger als 1 auf. Die Analogie schien gültig zu sein, weil Messungen von hoher Auflösung von m/z 300 für die Spisulosine darauf hindeuteten, dass es sich um ein Dublett handelte, das dem M + H eines höheren Homologons (2) von m/z 286 (300,3270, C₁₉H₄₂NO, Δ –0,4 mmu), zusammen mit Sphingosin (4) selbst (300,2914, C₁₈H₃₈NO₂, Δ –1,1 mmu) entsprach. Dies unterstützte auch die Erklärung des Vorliegens von Alken-Protonen im ¹H-NMR-Spektrum.
In allen drei Spektren waren mehrere andere Peaks evident. Das Ion bei m/z 314 stellte auch ein Dublett dar, das C₂₀H₄₄NO (314,3439, Δ –1,6 mmu) entsprach, bei dem es sich um das Molekülion eines anderen Homologons von 1, Spisulosin 313 (3) handelte und C₁₉H₄₀NO₂ (314,3075, Δ –1,6 mmu), bei dem es sich um ein Homologon von Sphingosin (5) handelte. Verbindung 4 zeigte Matrix-Addukte des M + H-Ions bei m/z 452,2885 (C₂₂H₄₆NO₄S₂, Δ –1,7 mmu), 604,2831 (C₂₆H₅₄NO₆S₄, Δ 0,3 mmu) und 606,2995 (C₂₆H₅₆NO₆S₄, Δ 3,6 mmu), 5 wies Matrix-Addukte des M + H-Ions bei m/z 464,2888 (C₂₃H₄₆NO₄S₂, Δ –2,0 mmu) und 618,2940 (C₂₇H₅₆NO₆S₄, Δ 5,1 mmu) auf. Man sollte zur Kenntnis nehmen dass, während es sich bei m/z 300 und 314 um Dubletts von nahezu gleicher Intensität in Fraktion B handelte, nur ein Peak für die hier aus Fraktion B aufgelisteten Matrix-Addukte messbar war. Dies deutete darauf hin, dass diese beiden Verbindungsreihen, obwohl hinsichtlich der allgemeinen Struktur sehr ähnlich, sich in der FAB-MS unterschiedlich verhielten. Die Spisulosin-Reihe (gesättigt) ergab starke Molekülionen und schwächere Matrix-Addukte, während Umgekehrtes für die Sphingosin-Reihe (ungesättigt) beobachtet wurde.
Zur besseren Etablierung der durch die vorstehend besprochenen Daten identifizierten Strukturen wurden mehrere Derivate hergestellt. Bei den informativsten handelte es sich um das Diacetylderivat von Spisulosin 285 (8). Da die Fraktion B die größte darstellte, wurde ein Anteil davon mit Essigsäureanhydrid in Pyridin acetyliert. Dieses Gemisch aus Acetylderivaten wird hier als AcB bezeichnet. Anhand der Silikagel-DC (Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:12:2:2) schien die Reaktion quantitativ zu sein, wobei ein neuer Fleck bei R_f 0,86 auftrat. Zum Vergleich wurde auch das Triacetylderivat von dem authentischen 4 (9) anhand des gleichen Verfahrens synthetisiert.
Zwei mit den Spisulosinen verwandte Verbindungsreihen wurden zuvor isoliert. Gulavita und Scheuer teilten mit, dass ein Schwamm von Xestospongia sp. aus Papua-Neuguinea zwei epimere aus 14 Kohlenstoffen bestehende Aminoalkohole 134 und 135 enthielt. Diese wurden nicht als die freien Amine isoliert, sondern das Gemisch wurde vielmehr acetyliert, um sowohl die Mono- (136, 137) als auch die Diacetyl-Verbindungen (138, 139) zu ergeben, die dann getrennt wurden. Jimenez und Crews haben mehrere Molekülionen von dem nicht derivatisierten 1 bei m/z 286 isoliert. Dieses M + H-Ion (m/z 370) wurde fragmentiert, um m/z 310 und 268, vermutlich durch Verlust der Essigsäure bzw. dann der zweiten Acetylgruppe, zu ergeben. Die vergleichbaren Ionen für die anderen Spisulosine waren klein, aber anwesend: m/z 384, 324 und 282 für das Diacetylderivat von 2 (144) und m/z 398, 338 und 296 für das Diacetylderivat von 3 (145). Die Ionen aus dem Sphingosin in der Probe waren zu klein, um ihre Anwesenheit definitiv bestätigen zu können. Dies zeigte wiederum, dass die beiden Verbindungsreihen über sehr verschiedene Ionisationspotenziale verfügten. Das CIMS-Spektrum wies starke m/z 370 und 310 Ionen auf, aber hier war das m/z 268 Ion sehr schwach. Die höheren Homologa wurden wiederum bei m/z 384 und 324 für 144 und m/z 398 und 338 für 145 gesehen. Schwache Ionen bei m/z 426 und 366 waren für 133 indikativ.
SYNTHESE VON SPISULOSIN 285
Zur Bestätigung der Struktur und der Bestimmung der Stereochemie von Spisulosin 285 wurde die Verbindung synthetisiert. Keine der Isomere von 2-Amino-3-octadecanol waren zuvor als natürliche Produkte bekannt gewesen, aber sowohl 2S,3S- als auch 2S,3R-Isomere sind zuvor synthetisiert worden. Die höheren Homologa stellen neue Verbindungen dar.
Eine modifizierte Version der Synthese von Proštenik und Alaupovic wurde zum Erhalt des authentischen Materials zum Vergleich verwendet.
SCHEMA IX
Zuerst wurde Dibenzylmalonat (147) mit Tetradecylbromid (148) alkyliert. Das sich ergebende Dibenzyl-tetradecyl-malonat (149) wurde dann mit N-Phthaloyl-L-alanylchlorid (150) kondensiert, um nach Entfernung der Benzylgruppen und der Decarboxylierung 2-Phthalimido-3-octadecanon (151) zu ergeben. Dieses Keton wurde mit überschüssigem Natriumborhydrid behandelt, was zur Reduktion von einem der Phthalimidocarbonyle auf das Keton führte, wobei sowohl 152, das ein reduziertes Phthalimidocarbonyl am Carbinolamin aufwies, als auch 153, das weiter reduziert wurde, gebildet wurde. Diese beiden Produkte konnten ohne weiteres mittels der Silikagel-Flash-Chromatographie voneinander getrennt werden.
Die Reduktion von 151 zu 152 führte aufgrund der Bildung von zwei neuen chiralen Zentren ein Gemisch aus vier Diastereomeren herbei. An diesem Punkt wurden die Diastereomere mittels der Cyano-HPLC getrennt. Die Schutzgruppe wurde dann von jedem durch weitere Reduktion mit Natriumborhydrid, gefolgt von Essigsäure, entfernt. Da ein Stereozentrum mit der Schutzgruppe entfernt wurde, führte dies zur Bildung von zwei Diastereomeren. Da diese Synthese mit L-Alanin begann, handelte es sich bei den beiden Produkten um (2S,3S)-2-Amino-3-octadecanol (154) und (2S,3R)-2-Amino-3-octadecanol (155).
BIOLOGISCHE AKTIVITÄT
Während die Spisulosine, wie in 1A–1F erläutert, recht einfache Verbindungen waren, wiesen sie einen sehr ungewöhnlichen Bioaktivitätstyp auf. Die Spisulosine führten, wie vorstehend besprochen wurde, zusätzlich zur Cytotoxizität auch zu einer distinkten morphologischen Veränderung in L1210-Leukämiezellen. Diese Bioaktivität, die als der prozentuale Anteil an Lebendzellen aufgezeichnet wurde, in dem eine veränderte Morphologie beobachtet wurde, konnte manchmal so früh wie 13 h nach Beginn des Assays beobachtet werden und erreichte nach 50–60 h ein Maximum, wonach sie absank. Im Allgemeinen wurden zur Bestimmung dieser Anzahl 60 Zellen beobachtet, außer in Assays, in denen weniger als diese Anzahl von Zellen am Leben blieb. Die morphologische Wirkung wurde im Allgemeinen 30–35 h nach Beginn des Assays und wieder ca. 24 h später gemessen, während die Cytotoxizität bestimmt wurde, wenn die Anzahl der Zellen in den Kontrollen, gewöhnlich 3 Tage nach Beginn des Assays, ca. 8000 erreichte. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass die zugespitzten Zellen Lebendzellen waren und sie für die Ablesung der Cytotoxizität als solches gezählt wurden. Auch in Assays, in denen eine 100%ige Cytotoxizität aufgezeichnet wurde, können Lebendzellen enthalten sein (< 0,5%), die gegebenenfalls zugespitzt gewesen sein können. Alle morphologisch veränderten Zellen wurden in dem prozentualen Anteil der zugespitzten Zellen gezählt.
Diese Änderung der Morphologie wurde immer in Fraktionen mit einer ziemlich hohen Cytotoxizität beobachtet. In Assays mit weniger als einer 70%igen Wachstumsinhibition wurde im Allgemeinen keine signifikante Anzahl zugespitzter Zellen beobachtet. Assays, in denen sich die Cytotoxizität 100% annäherte, wiesen jedoch häufig niedrigere prozentuale Anteile an Zellen mit veränderter Morphologie auf als die, mit einer 90–98%igen Wachstumsinhibition. Dies deutete darauf hin, dass die veränderten Zellen leichter abgetötet werden könnten. Es ist unbekannt, ob sich die Cytotoxizität und die Veränderung der Morphologie aus dem gleichen Wirkmechanismus ergab. In einem Fall wurden zugespitzte Zellen aus einem Assay rekultiviert, und es wurde gefunden, dass sie in den normalen Zustand revertierten. Dies deutete darauf hin, dass die Wirkung reversibel war, nachdem die Verbindung metabolisiert wurde. Die Acetylierung reduziert drastisch die Bioaktivität.
Zur Bestimmung, ob die Veränderung der Morphologie von L1210-Zellen durch Sphingosin (4) oder verwandte Verbindungen herbeigeführt wurde, wurden mehrere authentische Verbindungen erhalten und gegen L1210-Zellen bestimmt. Sowohl Sphingosin als auch Stearylamin (131) wiesen eine moderate Cytotoxizität, aber keine morphologische Wirkung auf. Sphingomyeline sind gut bekannte Derivate von 4, worin dem primären Alkohol eine Phosphorylcholin-Einheit zugefügt wurde und das Amin durch eine Fettsäure acyliert wird. Ein Gemisch aus Sphingomyelinen, die aus dem Rinderhirn (Sigma) isoliert wurden, die hauptsächlich aus Stearoyl- und Nervonoyl-sphingomyelinen (161, 162) bestanden, ließen eine minimale Cytotoxizität und keine zugespitzten Zellen erkennen. Die Cytotoxizität des Phosphorylcholin-Derivativs aus 4 (163, Sigma) kann zumindest teilweise auf die Hydrolyse von 163 zu 4 zurückzuführen sein.
Von Sphingosin und anderen langkettigen Aminen, einschließlich Stearylamin, ist bekannt, dass sie cytotoxisch sind. Es wurde gezeigt, dass diese Bioaktivität, wie gegen die Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) gemessen, für Homologa aus 18 Kohlenstoffen maximal ist. Es wurde ermittelt, dass alle vier Sphingosin-Stereoisomere nahezu gleich aktiv sind. Die Reduktion der Doppelbindung von 4 zur Herstellung von Dihydrosphingosin (164) wirkte sich nicht auf die Cytotoxizität aus. Die Additiom einer N-Methylgruppe an 164 führte auch keine signifikante Änderung der Bioaktivität herbei, während die Acylierung des Amins zu einer großen Abnahme der Cytotoxizität führte.
Keine Cytotoxizität wurde für die verwandten Verbindungen (134, 135, 140-142) berichtet, die aus anderen marinen Quellen isoliert wurden, sie könnten jedoch in diesem Assay-Typ nicht getestet worden sein. Ein Gemisch aus 134 und 135 war aktiv gegen C. albicans (Hemmzone von 8 mm für 19 μg eines Gemischs aus den beiden). Es wurde berichtet, dass Xestaminol A eine schwache Aktivität gegen mehrere Gram-positive und Gram-negative Bakterien und Pilze aufweist. Es zeigte auch eine antihelminthische Aktivität gegen Nippostrongylus brasiliensis. Sowohl 140 als auch 142 zeigten etwas Aktivität gegen die reverse Transkriptase.
Die Aktivität von Fraktionen A–C, das Acetylderivat der Fraktion B und Verbindungen 154 und 155 sind in der Tabelle zusammengefasst ersichtlich. Die Assay-Ergebnisse bestätigten eindeutig die NMR-Analyse, welche 155, nicht 154, als die mit 125 identische etablierte. Die Acetylierung reduziert auch drastisch die Bioaktivität.
TABELLE IX
Fußnote:

^a Sofern nicht anderweitig angezeigt, wurde der prozentuale Anteil der zugespitzten Zellen zweimal abgelesen. Die Anzahl der Stunden nach Beginn des Assays, bei denen diese Messungen vorgenommen wurden, ist in der Spalte für die Zeit angegeben.
^b a.t. = alle tot.
^c Der prozentuale Anteil der Wachstumsinhibition, der als der prozentuale Anteil an Lebendzellen in den behandelten Wells im Vergleich zu den Kontroll-Wells aufgezeichnet wurde.

MÖGLICHER WIRKMECHANISMUS
Die Bioaktivität der Spisulosine kann auf ihre Ähnlichkeit mit dem Sphingosin zurückzuführen sein. In der Nomenklatur der Sphingolipide, würde Spisulosin 285 als 1-Desoxysphinganin angesehen. Die Spisulosine können mit Sphingosin um die Bindungsorte konkurrieren oder in Sphingolipide, wie zum Beispiel Sphingomyeline, Ceramide oder Ganglioside inkorporiert werden. In jedem Fall könnten die Spisulosine die durch diese Verbindungen kontrollierten Zellfunktionen unterbrechen. Sphingosin und seine Derivate sind an der Regulation des Zellwachstums und der -differenzierung beteiligt. Sphingosin ist ein potenter Inhibitor der Proteinkinase C, das mit Diacylglycerol um den Bindungsort konkurriert, wodurch sich seine Cytotoxizität erklären lassen könnte. Studien zur Struktur-Aktivität haben gezeigt, dass diese Inhibition ein positiv geladenes Amin benötigt und folglich die N-Acyl-Derivate inaktiv waren. Wenn die Spisulosine durch Wettbewerb mit Sphingosin wirken, so würde dies den relativen Aktivitätsmangel der acetylierten Verbindungen (AcB) erklären. Es liegen zunehmend Hinweise vor, dass Sphingosin durch Regulation der Aktivität der Proteinkinase C als ein zweiter Messenger wirken kann. Es wurde auch gezeigt, dass es die Differenzierung von mit Phorbol-12-myristat-13-acetat, einem bekannten Proteinkinase C-Aktivator, behandelten HL-60-Zellen, inhibieren kann. Die Spisulosine sollten auf Inhibition der Proteinkinase C getestet werden. Es ist unbekannt, ob die Inhibition dieses Enzyms die für die Spisulosine beobachteten morphologischen Effekte herbeiführen könnte, die Proteinkinase C ist jedoch an der Kontrolle des Zellwachstums und der -differenzierung beteiligt.
EXPERIMENTELL
Die NMR-Spektren wurden an den Spektrometern von General Electric GN 500 und QE 300 und Varian U400 erfasst. Die Proben für die NMR-Analyse wurden in CDCl₃ oder CD₃OD aufgelöst. Chemische Verschiebungen (Δ) werden in ppm nach tieferen Feldern von Tetramethylsilan (TMS) verschoben angegeben und auf den Peak des restlichen Lösungsmittels oder TMS bezogen. FAB-MS-Spektren mit geringer und hoher Auflösung wurden entweder an einem VG ZAB-SE- oder einem VG 70-SE4F-Spektrometer unter Verwendung eines Gemischs aus Dithiothreitol-Dithioerythritol 3:1 („Magic Bullet") als die Matrix aufgezeichnet. Die FAB-MS/MS-Spektren wurden an einem VG 70-SE4F mit der gleichen Matrix unter Verwendung von Helium als das Stoßgas aufgezeichnet. Die CI-Massenspektren wurden an einem VG VSE-Spektrometer, das im alternierenden CI/EI-Mode mit Methan als das Reagenzgas betrieben wird, aufgezeichnet. Die IR-Spektren wurden an einem IBM IR/32 FTIR-Spektrometer erfasst. die optischen Drehungen wurden an einem JASCO DIP-370-Digitalpolarimeter gemessen.
CHROMATOGRAPHIE
Die HPLC wurde unter Verwendung einer Alltech Econosphere-Cyano-Säule (4,6 × 250 mm, 5 μm Partikelgröße) durchgeführt. Das verwendete HPLC-System bestand aus einer Beckman Pumpe, Modell 114M, einem Rheodyn 71-Injektor und entweder einem Isco V⁴- oder Beckman 165 Detektor für variable Wellenlängen oder einem Waters 990 Photodioden-Array-Detektor.
Die analytische Dünnschichtchromatographie (DC) wurde an einem vorbeschichteten Silikagel (Merck 60 F-254) und Platten mit Cyano gebundener Phase (EM Science CN F_254S HPTLC) durchgeführt. Die Flecke wurden mittels UV (254 nm), Ninhydrin (5% in Ethanol), Phosphomolybdänsäure (5% in Ethanol) und/oder Iod sichtbar gemacht. Die Silikagel-Säulenchromatographie wurde an entweder 50–200 μm oder 40–63 μm Silikagel (Merck) durchgeführt. Bei anderen Säulenchromatographie wurden Chromatorex ODS (Fuji-Division 100–200 Mesh) und Sephadex LH-20 (Pharmacia) verwendet. Die „Highspeed"-Gegenstromverteilungschromatographie (HSCCC) wurde an einem Ito Multilayer Coil Separator-Extractor (P. C., Inc.) mit einer Nr. 10 Coil und einer Milton-Roy Minipumpe durchgeführt. Die Festphasen-Extraktion (SPE) wurde an Säulen für die normale Phase durchgeführt (Silikagel, Alltech Maxi-Clean), Umkehrphase (C-18, Waters Sep-Pak) und Säule zur Chromatographie an gebundenen Phasen (CN, Fisher PrepSep) durchgeführt.
BIOLOGISCHE ASSAYS
Cytotoxizitäts-Assays gegen murine lymphozytäre Leukämiezellen L1210 wurden durch Auflösen der Proben in Methanol und/oder Hexan durch Auftragen auf die trockenen Assay-Wells und Verdampfenlassen des Lösungsmittels durchgeführt. Die Zellen (1000) wurden dem Minimum Essential Medium (MEM, 1 ml) zugefügt und bei 37°C inkubiert. Die Wachstumsinhibition wurde als der bestimmte prozentuale Anteil an Lebendzellen in Proben-Wells im Vergleich zu den Kontroll-Wells aufgezeichnet. Dies wurde gemessen, wenn die Kontroll-Wells 8000 Zellen erreichten, im Allgemeinen drei Tage nach Beginn des Assays.
Morphologisch veränderte Zellen (1A–1F) wurden als Lebendzellen gezählt, wenn die prozentuale Wachstumsinhibition bestimmt wurde. Die morphologischen Veränderungen wurden die gesamte Assay-Dauer über beurteilt. Der prozentuale Anteil zugespitzter Zellen wurde durch Zählen der Anzahl der veränderten Zellen in ca. 60 Lebendzellen bestimmt. Dieser prozentuale Anteil variierte mit der Länge der Zeit, in der der Assay lief. Er erreichte im Allgemeinen ca. 50 Stunden nach Beginn des Assays sein Maximum, zugespitzte Zellen konnten jedoch bereits 13 Stunden nach Beginn des Assays beobachtet werden und konnten gewöhnlich noch gesehen werden, wenn die prozentuale Wachstumsinhibition gemessen wurde. Der prozentuale Anteil der zugespitzten Zellen wurde häufig sowohl nach ca. 35 h als auch nach 55 Stunden gezählt. Der Zeitpunkt, an dem diese Messung angestellt wurde, wird mit den Daten angegeben.
Antimikrobielle Assays wurden unter Verwendung des Diffusionsverfahrens mit Filterblättchen vorgenommen. Papierblättchen (6,35 oder 12,7 mm, Schleicher & Schüll) wurden mit Proben in Lösung durchtränkt (50–500 μg) und trocknen lassen. Diese Blättchen wurden dann auf Agar gelegt, der entweder mit Bacillus subtilis, Penicillium melinii (früher P. atrovenetum), Micrococcus luteus (früher Sarcina lutea), Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae beimpft war. Diese Platten wurden 12–24 h (32–35°C, außer P. melinii, 25–27°C) inkubiert.
EXTRAKTION VON SPISULA POLYNYMA FÜR INITIALE BIOLOGISCHE TESTS
Eine Muschel (Spisula polynyma) wurde aufgetaut und die Schale entfernt (35,32 g, Feuchtgewicht). Diese wurde mit 350 ml Methanol/Toluen (3:1) in einen Blender gegeben und homogenisiert. Der gelbbraune Extrakt wurde filtriert und einer 1 M Natriumchlorid-Lösung (100 ml) zugefügt. Die obere Toluenschicht wurde entfernt und die wässrige Schicht mit Toluen (75 ml) extrahiert. Die beiden Toluenschichten wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde entfernt, um einen braunen öligen Rückstand (333,9 mg) zu ergeben. Die wässrige Schicht wurde weiter mit Dichlormethan (2 × 75 ml) extrahiert, die nach Entfernung des Lösungsmittels einen gelbbraunen Rückstand (18,6 mg) ergab. Die wässrige Schicht wurde dann mit Ethylacetat (75 ml) extrahiert. Die untere Phase stellte die organische Schicht dar, die auf das Vorliegen von etwas nach dem letzten Schritt in der wässrigen Phase zurückgebliebem Dichlormethan zurückzuführen war. Die obere Schicht wurde mit dem Ethylacetat (245 ml) weiter extrahiert, die obere organische Schicht mit Wasser (100 ml) zurückextrahiert, und die beiden Ethylacetatextrakte wurden kombiniert, um nach Entfernung des Lösungsmittels einen gelben Rückstand zu ergeben (36,8 mg). Die kombinierten wässrigen Schichten wurden um die Hälfte konzentriert und zweimal mit 1-Butanol (150 ml, 75 ml) extrahiert. Die kombinierten Butanolschichten wurden mit Wasser (75 ml) zurückextrahiert, was nach Entfernung des Butanols einen gelben Rückstand (132,8 mg) ergab. Die kombinierten wässrigen Schichten wurden konzentriert, um einen öligen hellgelben Rückstand (946,1 mg) zu ergeben. Jeder Extrakt wurde zum Erhalt von Toluen (302,2 mg), Dichlormethan (18,6 mg), Ethylacetat (36,7 mg), Butanol (120,9 mg) und wässrigen Extrakten (590,4 mg), die bestimmt wurden, mit Dichlormethan und Methanol zur Entfernung von Salzen trituriert.
FRAKTIONEN A, B UND C
35 Muscheln wurden aufgetaut und die Schalen entfernt, um eine Probe von Spisula polynyma (1,9 kg) zu ergeben, die in Methanol/Toluen 3:1, 2 × 1,5 l) eingeweicht wurde. Die Feststoffe wurden dann im gleichen Lösungsmittel (6 × 1,5 l) zermahlen und die sich ergebenden Extrakten filtriert. Diesem Rohextrakt (12 l) wurde eine 1 M Natriumchlorid-Lösung (3 l) zugefügt und die sich ergebende obere Toluenschicht entfernt. Die wässrige Schicht wurde weiter mit Toluen (2 × 2,5 l) extrahiert, gefolgt von Dichlormethan (4 × 2,5 l), wie in 1 ersichtlich ist.
Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Toluenextrakt (21,55 g) zwischen Methanol und Hexan (je 1,5 l) verteilt. Die Methanolschicht wurde weiter mit Hexan (4× 1 l) extrahiert. Die kombinierten Hexanschichten wurden auf ca. 1,8 l konzentriert und beide Extrakte gekühlt (–10°C). Die beiden sich in jedem Fall ergebenden Schichten wurden getrennt. Die kombinierten Hexanschichten wurden dann mit Methanol (0,5 l) extrahiert. Dieser Vorgang führte zu einem Hexan- und drei Methanolextrakten, von denen der erste Methanolextrakt (6,8 g) die meiste Bioaktivität enthielt.
Diese bioaktive Methanol-Fraktion wurde mittels Flash-Silikagel-Chromatographie unter Einsatz von einer Chloroform/Methanol-Stufeneluierung (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100) getrennt, um 12 Fraktionen zu ergeben. Während die dritten, vierten, siebten und achten Fraktionen etwas Cytotoxizität besaßen, wiesen sie keine Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen auf. Diese Aktivität wurde in den letzten beiden Fraktionen zusammen mit der meisten Cytotoxizität gefunden.
Diese beiden Fraktionen wurden kombiniert (370 mg) und weiter mittels einer anderen Flash-Silikagel-Säule unter Verwendung von Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser (8:12:1:1) gereinigt. Zur Entfernung der Essigsäure wurde jede der auf diese Weise erhaltenen 12 Fraktionen durch (a) Zufügen von Chloroform (¼ Volumen), (b) Waschen mit 5% Natriumbicarbonat, bis der pH der wässrigen Schicht über 7 lag (2–3 × ½ Volumen) und dann (c) Waschen der organischen Schicht mit Wasser (½ Volumen) neutralisiert. Die dritten und vierten und führten Fraktionen besaßen alle die Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen und weitgehend die gesamte Cytotoxizität. Jede dieser Fraktionen wurde mittels HPLC auf einer Cyano-Säule mit Methanol/0,01 M Ammoniumformiat 3:1 (1 ml/min) getrennt gereinigt. Sechs Fraktionen, von denen die fünfte am bioaktivsten war, wurden aus jeder Silikagel-Fraktion gesammelt. Das Ammoniumformiat wurde aus jeder Fraktion durch Zufügen von Wasser (2–8 ml) entfernt, die Probe auf eine SPE-Säule (C-18) gegeben, mit Wasser gewaschen (5–10 ml) und dann mit Methanol (5 ml) eluiert. Dies ergab Fraktionen A (0,4 mg, 2 × 10^–5% Ausbeute), B (1,3 mg, 7 × 10^–5% Ausbeute) und C (0,2 mg, 1 × 10^–5% Ausbeute), aus den dritten, vierten bzw. fünften Silikagel-Fraktionen, die alle bei t_r 7,9 min eluierten.
FRAKTION A

Weißer Feststoff Silikagel-DC (3:12:2:2 CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O) R_f 0,47 (Ninhydrin-positiv, rosa);
IR (NaCl) 2922, 2853, 1734, 1593, 1462, 1377, 1061 cm^–1;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 5,38, 5,15, 3,82, 3,67, 3,44, 3,24, 2,31, 2,03, 1,67, 1,60, 1,55, 1,25, 1,10, 0,86;
FAB-MS m/z 606, 604, 592, 590, 466, 452, 438, 314, 300, 286, 268;
CIMS m/z 354, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 268, 266, 149, 139, 137, 1, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.
Anal. berechnet für C₁₈H₄₀NO: 286,3110 (M + H). Gefunden: 286,3115 (HR-FAB-MS).

FRAKTION B

Weißer Feststoff; Silikagel-DC (3:12:2:2 CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O) R_f 0,47 (Ninhydrin-positiv, rosa), 0,44 (Ninhydrin-positiv, rot);
IR (NaCl) 3273, 2953, 2918, 2851, 1639, 1591, 1510, 1466, 1379, 1344, 1059, 970 cm^–1;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 5,98, 5,78, 5,55, 5,44, 5,32, 4,43, 3,78, 3,65,3,24, 2,15, 2,08, 2,00, 1,95, 1,70, 1,44, 1,25, 1,19, 0,87;
FAB-MS m/z 6,18,2940, 616, 606,2955, 604,2831, 592, 590, 480, 466, 464,2888, 452,2885, 438, 314,3439, 314,3075, 300,3273, 300,2914, 286, 268;
CIMS m/z 354, 352, 342, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 282, 280, 268, 266, 219, 193, 179, 165, 149, 137, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.

FRAKTION C

Weißer Feststoff; Silikagel-DC (CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2) R_f 0,47 (Ninhydrin-positiv, rosa), 0,44 (Ninhydrin-positiv, rot), 0,34 (Ninhydrin-positiv, purpurrot);
IR (NaCl) 2924, 2853, 1593, 1456, 1352, 1063, 972 cm^–1;
FAB-MS m/z 620, 618, 616, 606, 604, 602, 466, 464, 452, 438, 314, 300, 298.2741, 296, 286, 280, 268; CIMS m/z 354, 352, 340, 338, 336, 328, 326, 324, 322, 314, 312, 310, 308, 300, 298, 296, 294, 292, 286, 284, 282, 280, 278, 268, 179, 165, 149, 137, 135,1, 123, 121, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 81, 71, 69, 60, 59, 57, 55.

INITIALE VERTEILUNG
22 Muscheln von S. polynyma wurden aufgetaut und die Schalen entfernt, um 1,3 kg des Organismus (Feuchtgewicht) zu ergeben. Dieser wurde in einen Waring-Blender mit Methanol/Toluen 3:1 (1,5 l) gegeben und in einen dicken Brei zermahlen, der durch eine Celite-Schicht filtriert wurde. Der feste Rückstand wurde weiter extrahiert (4 × 1,5 l) und auf ähnliche Weise filtriert. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden dann in Methanol/Toluen 5:1 (750 ml) gegeben und vor dem Filtrieren 36 h durchtränken lassen. Den kombinierten Filtraten (7,8 l) wurde 1 M Natriumchlorid (2 l) zugefügt. Nach Entfernung der oberen Toluenschicht wurde die wässrige Phase mit Toluen (2 × 1,5 l) und Dichlormethan (3 × 1,5 l) extrahiert. Die zurückbleibende wässrige Phase wurde um die Hälfte konzentriert und mit Ethylacetat (2 × 1 l) extrahiert. Die sich ergebende wässrige Schicht wurde mit Wasser (2 l) verdünnt und zweimal mit 1-Butanol (1,5 l, 1 l) extrahiert. Die Entfernung der Lösungsmittel und die Trituration mit Dichlormethan und Methanol führte zum Toluen (14,1 g), Dichlormethan (0,75 g), Ethylacetat (1,3 g), 1-Butanol (0,2 g) und wässrigen Extrakten (1,9 g), die bestimmt wurden.
Der Toluenextrakt wurde zwischen Hexan und Methanol (je 750 ml) verteilt. Die sich ergebende Methanolschicht wurde mit Hexan (2 × 750 ml, 2 × 500 ml) weiter extrahiert. Die Hexanschichten wurden kombiniert und auf ca. 3 l konzentriert, und dann wurden beide Extrakte gekühlt (–10°C), wodurch veranlasst wurde, dass sich jeder in zwei Schichten trennte. Die kombinierten Methanolschichten wurden im Vakuum konzentriert, um einen braunen Rückstand zu ergeben (Methanolextrakt 1,536 g). Die Hexanschichten wurden weiter auf ca. 1 l konzentriert und mit Methanol (500 ml) zurückextrahiert. Das Lösungsmittel wurde aus jedem dieser Schichten entfernt, um den Methanolextrakt 2 (4,26 g) und den Hexanextrakt (4,52 g) zu ergeben.
FRAKTION D
Ein Anteil des ersten Methanolextrakts (594 mg) wurde mittels HSCCC unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol/Wasser (4:7:4:3, MP = UP) bei 4 ml/min getrennt. Dies ergab 12 Fraktionen, von denen die dritte, vierte und fünfte die meiste Bioaktivität enthielt. Diese drei Fraktionen wurden kombiniert (158 mg) und auf Sephadex LH-20 chromatographiert, wobei mit Methanol eluiert wurde. Dies führte zu acht Fraktionen, von denen die vierte (8,4 mg) die überwiegende biologische Aktivität besaß. Diese bioaktive Fraktion wurde mittels HPLC auf einer Cyano-Säule mit Methanol/0,01 M Ammoniumformiat (0,5 ml/min) 3:1 weiter gereinigt. Acht Fraktionen wurden gesammelt, und das Ammoniumformiat wurde aus jeder durch Zufügen von Wasser (2–8 ml), Aufbringen der Probe auf eine SPE-Säule (C-18), Waschen mit Wasser (5–10 ml) und dann Eluieren mit Methanol (5 ml) entfernt. Es erwies sich, dass die siebte Fraktion (t_r 15,8 min, ein weißer amorpher Feststoff, 0,3 mg, 2 × 10^–4% Ausbeute) die bioaktiven Verbindungen enthielt und hierin als Fraktion D bezeichnet wird. Die Silikagel-DC (1-BuOH/AcOH/H₂O, 4:1:5, obere Schicht) wies mittels Sichtbarmachung mit Phosphomolybdänsäure vier Flecke auf R_f 0,53 (bedeutend), 0,35 (bedeutend), 0,31 (unbedeutend) und 0,19 (unbedeutend). Die inaktive sechste Fraktion wies, außer Rf 0,53, die gleichen Flecke auf. Das FAB-MS-Spektrum von Fraktion D zeigte intensive Peaks bei m/z 286,3019, 300,3270 und 268,3019 und schwächere Peaks bei m/z 314, 438, 452, 464, 590, 592, 669, 797, 809 und 825. Die letzten drei aufgelisteten Ionen wurden auch in den meisten anderen HPLC-Fraktionen beobachtet und schienen dem DC-Fleck bei R_f 0,35 zu entsprechen.
Anal. berechnet für C₁₈H₄₀NO: 286,3110 (M + H). Gefunden: 286,3109 (HR-FAB-MS).
FRAKTION E
Ein zweiter Anteil des vorstehend beschriebenen ersten Methanolextrakts (633 mg) wurde der HSCCC unterzogen. Bei dem eingesetzten Lösungsmittelsystem handelte es sich um Hexan/Methanol/Wasser (5:4:1, UP = MP, 5 ml/min), was eine schlechte stationäre Phasenretention ergab. Dies ergab 10 Fraktionen, wobei sich die Bioaktivität über die meisten von ihnen ausbreitete. Die ersten drei Fraktionen (310 mg) wurden kombiniert und mittels HSCCC unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol/Wasser (4:7:4:3, LP = MP, 2 ml/min) weiter gereinigt, um 12 Fraktionen zu ergeben. Die zweiten bis fünften Fraktionen (85 mg), die die meiste der Bioaktivität enthielten, wurden auf einer C-18-Flash-Säule chromatographiert, mit einer Methanol/Wasser/Chloroform-Stufeneluierung (90:10:0, 95:5:0, 100:0:0, 95:0:5, 90:0:10, 50:0:50) eluiert. Dies ergab 10 Fraktionen, die alle bioaktiv waren.
Die vierten bis sechsten Fraktionen aus dem ersten HSCCC-Lauf wurden mit einer Seitenfraktion aus der Sephadex-LH-20-Säule, die unter Fraktion D (270 mg) besprochen wird, kombiniert. Dieses Material wurde der HSCCC unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie der gerade beschriebene zweite Lauf unterzogen, außer dass die Fließrate 3 ml/min betrug. Dies ergab neun Fraktionen, von denen die zweite und dritte die meiste Cytotoxizität und zellverändernde Aktivität enthielt. Diese beiden Fraktionen wurden kombiniert (42 mg) und auf einer Flash-C-18-Säule unter Verwendung einer Methanol/Wasser-Schritteluierung (80:20, 90:10, 95:5, 100:0) getrennt. Dies ergab 12 Fraktionen, von denen die achten bis elften eine Morphologie-verändernde Aktivität und Cytotoxizität aufwiesen. Alle außer den ersten und fünften Fraktionen aus der ersten C-18-Säule wurden mit den achten bis elften Fraktionen aus der zweiten (50,4 mg) kombiniert und mittels präparativer Silikagel-DC mit Chloroformn/1-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:12:2:2) getrennt. Die Platte wurde in acht Fraktionen aufgeteilt, die abgekratzt und mit Methanol eluiert wurden. Der Rückstand von jeder Fraktion wurde nach Entfernung des Lösungsmittels mit Dichlormethan trituriert und filtriert. Die zweite Fraktion vom oberen Ende der Platte (Rf 0,80–0,42) enthielt das bioaktive Material und wird als Fraktion E (5,7 mg) bezeichnet. Die analytische Silikagel-DC von Fraktion E, die mit dem gleichen Lösungsmittelsystem eluierte, wies einen einzelnen mit Ninhydrin sichtbar gemachten Fleck auf (R_f 0,44), das Phosphomolybdänsäure-Sprühreagenz zeigte jedoch ein anderes Material, das durch das gesamte mittlere Drittel der Platte Schlieren bildete. Das FAB-MS-Spektrum von Fraktion B zeigte m/z 286 als den bedeutendsten Peak, wobei weniger bedeutende Peaks bei m/z 268, 300, 438, 452 und 592 auftraten.
FRAKTION F
Ein dritter Anteil des ersten Methanolextrakts (468 mg) wurde mittels der Flash-Silikagel-Chromatographie, unter Verwendung des Lösungsmittelssystems Chloroform/1-Butanol/Essigsäure/Wasser (8:12:1:1) getrennt. Zur Entfernung der Essigsäure wurde jede der auf diese Weise erhaltenen 10 Fraktion neutralisiert durch: (a) Zufügen von Wasser (Hälfte des Volumens der Fraktionen) und Trennen der beiden Phasen, (b) Extrahieren der wässrigen Schicht mit Chloroform (Hälfte des Volumens × 2), (c) Waschen der kombinierten organischen Schichten mit 5% Natriumbicarbonat, bis der pH der wässrigen Schicht über 7 (2 bis 3 × die Hälfte des Volumens) lag und dann (d) Waschen der organischen Schicht mit Wasser (Hälfte des Volumens). Die dritte Fraktion (24 mg), die den größten Teil der Bioaktivität besaß, wurde auf Sephadex LH-20 chromatographiert, wobei mit Methanol eluiert wurde, um acht Fraktionen zu ergeben. Die sechste Fraktion (2,3 mg) wurde durch wiederholte HPLC unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie für die Trennung von Fraktion A–C getrennt. Das Ammoniumformiat wurde wie für Fraktion A–C entfernt. Die Fraktion, die bei t_r 8,1 min eluierte, war die biologisch aktivste und wird als eine Fraktion F bezeichnet. Sie war so klein, dass ein genaues Gewicht nicht erhalten werden konnte, es betrug jedoch wahrscheinlich 100–200 μg (ca. 1 bis 2 × 10^–4% Ausbeute). Die Fraktionen, die später als diese eine eluierten, wiesen sowohl cytotoxische Aktivität als auch Aktivität zur Bildung zugespitzter Zellen auf, obwohl diese weniger potent waren. Dies deutete darauf hin, dass entweder die bioaktive(n) Verbindung(en) nicht so gut wie ein gut definierter Peak eluierte(n) oder dass unterschiedliche Homologa zu verschiedenen Zeitpunkten eluierten, aber nicht gut getrennt werden. Die Silikagel-DC (3:12:2:2 CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O) wies einen Ninhydrin-positiven Fleck bei R_f 0,44 auf. Die später eluierenden Fraktionen wiesen auch diesen gleichen Fleck auf, jedoch weniger intensiv. Das FAB-MS-Spektrum von Fraktion F zeigt (in abnehmender Reihenfolge der Intensität) Folgendes: m/z 286, 268, 300, 314, 344, 438, 452, 592, 669.
PRÄPARATION
Eine lebende Muschel wurde in einen Behälter mit ca. 10 ml Diethylether gegeben und 20 h gekühlt (4°C). Sie wurde in neun Organe präpariert: Fuß, Verdaungssystem (einschließlich Magen, Darm und des Kristallstiels im Eingeweidesack), Gonaden, Siphon, Kiemen, Herz, Mantel, Adduktionsmuskeln und den Rest der viszeralen Masse. Jedes Organ wurde zuerst in Methanol/Toluen (3:1, 10 ml/g Probe) eingeweicht und dann in einem Virtis-Blender homogenisiert. Die Extrakte wurden filtriert und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Methanol trituriert, um 155 mg (Fuß), 60 mg (Verdauungssystem), 147 mg (Gonaden), 101 mg (Siphon) 65 mg (Kiemen), 2,5 mg (Herz), 168 mg (Mantel), 101 mg (Adduktionsmuskeln) und 252 mg (viszerale Masse) zu ergeben.
In einem separaten Experiment wurde ein gekochter Fuß auf analoge Weise (189 mg) extrahiert. Eine größere Probe von gekochten Muscheln (483 g) wurde gründlicher extrahiert, indem sie zuerst in Methanol/Toluen 3:1 (3 × 500 ml) eingeweicht wurde und die Probe dann in den gleichen Lösungsmitteln (5 × 500 ml) homogenisiert wurde. Eine kleine Probe der kombinierten Extrakte wurde verdampft und zur Bestimmung erneut in Methanol aufgelöst.
ALLGEMEINE VERFAHREN
Die optischen Drehungen wurden an einem Jasco DIP-370 Digitalpolarimeter mit einer 1-ml-Küvette (3,5 × 50 mm) durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden an einem Thomas Hoover Kapillar-Schmelzpunkt-Gerät erfasst. Die ¹H- und ¹³C-NMR wurden an einem Varian Unity-400- oder Unity-500 Spektrophotometer registriert. Chemische Verschiebungen werden in ppm in Bezug auf das Lösungsmittel (7,26, CDCl₃ und 3,30, CD₃OD) angegeben. Hochauflösende (HR-FAB) Massenspektren und Massenspektren durch Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB) wurden an einem VG ZAB-SE- oder einem 70 SE4F-Massenspektrometer erfasst. Die DC wurde auf Merck Silikagel 60 Dünnschichtplatten durchgeführt. Chromatographische Trennungen wurden mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von 230–400 Mesh Merck Silikagel durchgeführt. Alle feuchtigkeitsempfindlichen Reaktionen wurden in ofengetrocknete Glaswaren unter einer N₂-Atmosphäre laufen lassen. Die Lösungsmittel wurden vor Gebrauch destilliert: THF aus Benzophenonketyl; CH₂Cl₂ aus CaH₂, andere verwendete Lösungsmittel waren analysenrein.
(S)-2-(N,N-DIBENZYLAMINO)PROPIONSÄURE-METHYLESTER (30):
Einem 300 ml fassenden Rundkolben wurden 20 (10,0 g, 71,6 mmol), Benzylbromid (25,73 g, 150,4 mmol), K₂CO₃ (9,90 g, 71,6 mmol) und CH₃CN (172 ml) zugefügt. Das Gemisch wurde bei 60°C gerührt, bis die Reaktion mittels DC abgeschlossen war. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Feststoff wurde durch Filtration getrennt. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um ein Öl zu ergeben, das mittels Flash-Chromatographie auf Silikagel (Hexan/EtOAc 9:1) gereinigt wurde, um ein farbloses Öl zu ergeben:
[α]²⁵ _D = 113,6 (c 1,2, CHCl₃);
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1,35 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 3,53 (q, 1H, J = 7,0 Hz), 3,65 (d, 2H, J = 1,38 Hz), 3,75 (s, 3H), 3,85 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 7.22–7.42 (m, 10H);
¹³C-NMR (100 MHz): δ 14,9, 51,1, 54,3, 56,0, 2,8, 4,1, 4,5, 139,1, 175,1;
FAB-MS m/z 284,1 (M + H), 282,1 (M – H), 224,2 (M – COOCH₃);
HR-FAB-MS berechnet für C₁₈H₂₂NO₂M_r: 284,1651 (M + H), gefunden: M_r 284,1650.
(S)-2-(N,N-DIBENZYLAMINO)-1-PROPANOL (40):
Einer Suspension aus LiAlH₄ (550 mg, 14,5 mmol) in THF (20 ml) wurde eine Lösung aus 30 (910 mg, 3,21 mmol) in THF (2 ml) tropfenweise zugefügt. Die Lösung wurde 15 Minuten gerührt und dann 3 Stunden auf 65°C erhitzt. Die Reaktion wurde auf 0°C abgekühlt und mit 0,1 N HCl gequencht. Die Reaktion wurde durch Celite filtriert und das Celite mit THF (2 × 15 ml) gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Flash-Chromatographie auf Silikagel (Hexan/EtOAc 4:1, R_f = 0,30) ergab 750 mg (92% Ausbeute) eines farblosen Feststoffs:
Schmp. 40–41°C (aus Hexan); Schmp. in der Literatur 40–41°C (aus Hexan) Siehe, Stanfield et al., J. Org. Chem. 1981, 49, 4799–4800;
[α]²⁵ _D = +86,6 (c 1, CHCl₃) Literatur [α]²³ _D = +88,2 (c 1, CHCl₃);
¹H-NMR (500 MHz CDCl₃): δ 0,98 (m, 3H), 2,98 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 3,35 (m, 3H), 3,45 (m, 1H), 3,81 (m, 2H), 7,19–7,41 (m, 10H);
¹³C-NMR (1 MHz): δ 8,6, 52,9, 54,1, 62,7, 3,2, 4,5, 5,0, 5,3;
FAB-MS m/z 256,2 (M + H), 224,2 (M – CH₂OH);
HR-FAB-MS berechnet für: C₁₇H₂₂NOM_r 256,1701 (M + H), gefunden M_r 256,1702.
(S)-2-(N,N-DIBENZYLAMINO)PROPIONALDEHYD (50):
Trockenes DMSO (0,53 ml, 7,43 mmol) wurde einer gerührten Lösung aus Oxalylchlorid (0,31 ml, 3,6 mmol) in CH₂Cl₂ (7,5 ml) bei –78°C zugefügt. Die Lösung wurde 15 Minuten rühren lassen, gefolgt vom Zufügen von 40 (740 mg, 2,90 mmol) in CH₂Cl₂ (7,5 ml). Nach 30 Minuten wurde Et₃N (1,0 ml, 7,2 mmol) zugefügt und auf Raumtemperatur anwärmen lassen. Die Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (20 ml) extrahiert, und die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ (2 × 15 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum bei Raumtemperatur konzentriert, um 720 mg (98% Ausbeute) eines gelben Öls zu ergeben, das bei Abkühlung auf –20°C zu einem Feststoff wurde. Der Aldehyd wurde ohne weitere Reinigung verwendet:
Schmp 52–54°C, Schmp. in der Literatur 55,5°C. Siehe Dix et al., Arch Pharm (Weinheim) 1995, 328, 203–205;
[α]²⁶ _D = –36,0 (c 1, CHCl₃ Literatur [α]²⁰ _D = –35,1 (c 1, EtOAc);
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1,19 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 3,34 (q, 1H, J = 7,0 Hz), 3,58 (d, 2H, J = 13,7 Hz), 3,74 (d, 2H, J = 13,7 Hz), 7,26 (m, 2H), 7,33 (m, H), 7,42 (m, 4H), 9,74 (s, 1H);
¹³C-NMR (100 MHz): δ 6,7, 54,9, 62,8, 3,3, 4,4, 4,8, 139,1, 204,6;
FAB-MS m/z 408,2 (M + MB), 254,2 (M + H), 22,2 (M – CHO);
HR-FAB-MS berechnet für: C₁₇H₂₀NOM_r 254,1545 (M + H), gefunden: M_r 254,1545.
(2S,3R)-2-(N,N-DIBENZYLAMINO)-3-OCTADECANOL (60):
Mg-Band (237 mg, 9,75 mmol), Dibromethan (16 μl, 0,189 mmol) in THF (160 μl) wurden einem mit einem Rückflusskondensator ausgerüsteten Zweihalskolben zugefügt. Danach wurde 0,5 ml einer 1-Brompentadecan-Lösung (970 mg, 3,33 mmol, 3,25 ml THF) zugefügt. Nachdem die Reaktion begonnen hatte, wurde der Rest tropfenweise zugefügt. Zur gräulichen Lösung, wurde 50 (105 mg, 0,413 mmol) in THF (0,5 ml) tropfenweise zugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht rühren lassen, gefolgt vom Zufügen von H₂O (5 ml) und 0,1 N HCl, bis die Lösung klar wurde. Das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 10 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit 5% NaHCO₃, dann gesättigten NaCl-Lösungen gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Öl-Feststoff-Gemisch (750 mg) zu ergeben. Das Rohmaterial wurde mittels Flash-Chromatographie auf Silikagel (8:1 Hexan/EtOAc, R_f = 0,34) gereinigt, um 120 mg eines Feststoffs zu ergeben. Dieser Feststoff wurde mittels HPLC auf Silikagel (Hexan/EtOAc 93:7) weiter gereinigt, um einen farblosen wachsigen Feststoff (94,3 mg, 49% Ausbeute zu ergeben):
[α]²⁵ _D = +16,3 (c 1, CHCl₃);
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 0,88 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,10 (d, 3H, J = 6,7 Hz), 1,16–1,41 (bm, 26H), 1,56 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 2,72 (quin, 1H, J = 6,7 Hz), 3,47 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 3,60 (m, 1H), 3,76 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 7,22 (m, 2H), 7,30 (m, 4H), 7,34 (m, 4H); ¹³C-NMR (1 MHz): δ 8,67, 14,11, 22,68, 25,90, 29,35, 29,61, 29,64, 29,68, 29,69,31,91, 34,27, 54,79, 57,26, 73,65, 2,89, 4,25, 4,77, 140,17;
FAB-MS m/z 465 (M + H), 448 (M – H₂O), 464 (M – H), 388 (M – Ph), 224 (M – C₁₆H₃₃O);
HR-FAB-MS berechnet für: C₃₂H₅₂NOM_r 466,4049 (M + H), gefunden: M_r 466,4037.
Die Zuordnung der 2S,3R-Konfiguration basiert auf dem Vergleich der chemischen Verschiebungen der Benzyl-Protonen in 60 mit den Werten für die syn- und anti-Diastereomere von 2-(N,N-Dibenzylamino)-3-pentanol in der Literatur. Das anti-Isomer weist einen Unterschied der chemischen Verschiebung von 0,29 ppm auf, und das syn beträgt 0,52 ppm. Der Vergleich anderer syn-anti-Paare zeigt dass der Bereich für das syn-Isomer bei 0,44 bis 0,54 ppm und das anti bei 0,05 bis 0,29 ppm liegt. Der Wert für 60 beträgt 0,29 ppm.
(2S,3R)-2-AMINO-3-OCTADECANOL (1):
Einem 15 ml fassenden Rundkolben wurde 60 (88,2 mg, 0,189 mmol) in MeOH (2 ml) und 20 Pd(OH)₂-C (11 mg) zugefügt. Das Gemisch wurde unter 1 Atmosphäre Wasserstoff über Nacht gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch ein Spritzenfilter (25 mm; 0,2 μm Nylon-Membran) entfernt, und das Filter wurde mit 4 ml MeOH gewaschen. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt, um 51,50 mg eines weißen Feststoffs zu ergeben. Das Produkt wurde mittels Chromatographie über eine 6 ml fassende LC-Si-SPE-Röhre (90:10 CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, gefolgt von 100% MeOH, um 49,47 mg (92% Ausbeute) eines weißen Feststoffs zu ergeben:
Schmp.: 66–67°C;
[α]²⁶ _D = +24,9 (c 1, CHCl₃);
¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 0,89 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,05 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 1,20–1,56 (bm, 31H), 2,81 (qd, 1H, J₁ = 6,6 Hz, J₂ = 3,8 Hz), 3,42 (dt, 1H, J₁ = 8,8 Hz, J₂ = 3,8 Hz);
¹³C-NMR (1 MHz): δ 14,60, 16,82, 23,90, 27,40, 30,65, 30,90, 30,95, 30,96, 33,23, 34,13, 52,33, 76,16;
FAB-MS m/z 286,3 (M + H), 268,3 (M – OH),
HR-FAB-MS berechnet für: C₁₈H₄₀NOM_r 286,3110 (M + H), gefunden: M_r 286,3109.
Ein Gemisch aus Diastereomeren von 3-Hydroxy-2-(1-methyl-2-2-hydroxy-heptadecyl)-isoindolin-1-on (152, 22 mg) wurde mittels Cyano-HPLC mit Hexan/2-Propanol (98:2, 1 ml/min) getrennt, um vier Verbindungen (152a–152d) zu ergeben. Von jedem Peak wurde die Reinheit durch Reinjektion am HPLC bestimmt. Anal. berechnet für C₂₆H₄₄NO₃: 418,3321 (M + H). Gefunden: 418,3321 HR-FAB-MS).
152a: 4,2 mg; t_r 13,3 min;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,77 (1H, d, 7,3), 7,58 (2H, m), 7,50 (1H, m), 5,91 (2H, s), 4,51 (1H, m), 3,78 (1H, m), 1,58 (2H, m), 1,40 (3H, d, 7,1), 1,24 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FAB-MS m/z 418, 400;
Relatives Verhältnis der Diastereomeren 17:1:0:0 (152a:152b:152c:152d).
152b: 13,7 mg; t_r 13,9 min;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,70 (1H, d, 7,3), 7,54 (2H, m), 7,47 (1H, m), 5,88 (2H, s), 4,37 (1H, m), 3,85 (1H, m), 1,52 (2H, m), 1,27 (3H, d, 7), 1,25 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FAB-MS m/z 41, 400;
relatives Verhältnis der Diastereomeren 1:6,8:0:0 (152a:152b:152c:152d).
152c: 1,4 mg; t_r 20,0 min;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,78 (1H, d, 7,3), 7,59 (2H, m), 7,51 (1H, m), 5,93 (2H, s), 4,12 (1H, m), 3,99 (1H, m), 1,58 (2H, m) 1,37 (3H, d, 7,0, 1,25 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FAB-MS m/z 418, 400;
relatives Verhältnis der Diastereomeren 0:2,5:45:1 (152a:152b:152c:152d).
152d: 1,5 mg; t_τ 21,7 min;
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,77 (1H, d, 7,3), 7,59 (2H, m), 7,51 (1H, m), 5,86 (2H, s), 4,12 (1H, m), 3,90 (1H, m), 1,58 (2H, m), 1,45 (3H, d, 6,6), 1,24 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FAB-MS m/z 418, 400;
relatives Verhältnis der Diastereomeren 0:1:2:21 (152a:152b:152c:152d).
Jedes Diastereomer wurde nach dem Verfahren von Osby et al. getrennt entschützt. Jedes Isomer wurde in 2-Propanol/Wasser (6:1, 0,1 M für 152a und 152b, 0,7 M für 152c and 152d) aufgelöst. Jeder Lösung wurde Natriumborhydrid (5–10 Äquivalente) zugefügt, die dann 24 h bei 25°C gerührt wurde. Jede Lösung wurde dann mit Essigsäure auf pH 4,5 eingestellt und weitere 24 h bei 80°C gerührt. Ammoniumformiat wurde zugefügt, um den pH jeder Lösung auf über 7 zu bringen, und danach wurde das Lösungsmittel mittels eines Stickstoffstroms aus jeder entfernt. Der Rückstand aus jeder wurde auf eine Silikagel-SPE-Säule gegeben, die zuerst mit Hexan:2-Propanol (9:1) gewaschen und das Produkt dann mit 2-Propanol eluiert wurde. Die ¹H-NMR deutet darauf hin, dass 152a und 152d 154 (1,15 mg, 40% bzw. 0,48 mg, 47%) produzierte, während 152b und 152c 155 (3,35 mg, 42%, bzw. 0,38 mg, 40%,) produzierte.
154: Weißer Feststoff; Silikagel-DC (3:12:2:2 CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O) R_f 0,48 (Ninhydrin-positiv, rosa);
IR (NaCl) 2919, 2851, 1563, 1466, 1406, 758 cm^–1;
FAB-MS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44.
Anal. berechnet für: C₁₈H₄₀NO: 286,3110 (M + H). Gefunden: 286,3115 (HR-FAB-MS).
155: Weißer Feststoff; Silikagel-DC (3:12:2:2 CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O) R_f 0,50 (Ninhydrin-positiv, rosa);
IR (NaCl) 3281, 2917, 2849, 1568, 1520, 1470, 1412 cm^–1;
FAB-MS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44,
Anal. berechnet für: C₁₈H₄₀NO: 286,3110 (M + H). Gefunden: 286,3109 (HR-FAB-MS).
ACETYLIERUNG
Ein Anteil von Fraktion B (560 μg) wurde in Essigsäureanhydrid (200 μl) und Pyridin (400 μl) aufgelöst und wurde 4,5 h bei 25°C gerührt, zu welchem Zeitpunkt kein Ausgangsmaterial mittels der DC beobachtet werden konnte. Das Lösungsmittel wurde durch einen Stickstoffstrom entfernt, um AcB: einen weißlichen Feststoff, zu ergeben;
Silikagel-DC: R_f 0,86 (CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2, Phosphomolybdänsäure), 0,65 (CHCl₃/MeOH 9:1, Phosphomolybdänsäure);
IR (NaCl) 2922, 2853, 1741, 1651, 1547, 1460 1371, 1234, 1022, 970 cm^–1;
FAB-MS m/z 370, 310, 268;
CIMS m/z 426, 424, 412, 410, 398, 384, 370, 368, 364, 338, 324, 310, 165, 149, 139, 1, 121, 111, 97, 86, 61, 57, 55.
Anal. berechnet für: C₂₂H₄₄NO₃: 370,3321 (M + H). Gefunden: 370,3326 (HR-FAB-MS).
TRIACETYLSPHINGOSIN (133)
In einem Verfahren, ähnlich dem nach Grode und Cardellina wurde D-erythro-Sphingosin (4, 2 mg, 6,7 μmol, Sigma) in Essigsäureanhydrid (1 ml) und Pyridin (2 ml) 4,5 h bei 25°C gerührt, zu welchem Zeitpunkt mittels der DC kein Ausgangsmaterial beobachtet werden konnte. Das Lösungsmittel wurde mittels eines Stickstoffstroms entfernt, um 133: einen weißen Feststoff, zu ergeben;
Silikagel-DC: R_f 0,86 (CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2, Phosphomolybdänsäure), 0,65 (CHCl₃/MeOH, Phosphomolybdänsäure 9:1);
FAB-MS m/z 580, 426, 366, 306, 264;
CIMS m/z 468, 454, 426, 424, 394, 366, 364, 306, 264, 144, 85, 84, 83, 61.
(2S,3S)-2-ACETAMIDO-3-ACETOXYOCTADECAN (156)
(2S,3S)-2-Amino-3-octadecanol (154, 150 μg, 0,5 μmol) in Essigsäureanhydrid (50 μl) und Pyridin (100 μl) wurde 5 h bei 25°C gerührt, zu welchem Zeitpunkt mittels DC kein Ausgangsmaterial beobachtet werden konnte. Das Lösungsmittel wurde mittels eines Stickstoffstroms entfernt, um 156: einen weißen Feststoff, zu ergeben;
Silikagel-DC: R_f 0,86 (CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2, Phosphomolybdänsäure);
IR (NaCl): 3286, 2924, 2853, 1740, 1653, 1541, 1456, 1371, 1238 cm^–1;
FAB-MS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268.
Anal. berechnet für: C₂₂H₄₄NO₃: 370,3321 (M + H). Gefunden: 370,3326 (HR-FAB-MS).
(2S,3R)-2-ACETAMIDO-3-ACETOXYOCTADECAN (157)
(2S,3R)-2-Amino-3-octadecanol (155, 750 μg, 2,6 μmol) wurde in Essigsäureanhydrid (200 μl) und Pyridin (400 μl) 5 h bei 25°C gerührt, zu welchem Zeitpunkt mittels der DC kein Ausgangsmaterial beobachtet werden konnte. Das Lösungsmittel wurde mittels eines Stickstoffstroms entfernt, um 157: einen weißen Feststoff, zu ergeben;
Silikagel-DC: R_f 0,86 (CHCl₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2, Phosphomolybdänsäure);
IR (NaCl): 3289, 2917, 2849, 1728, 1637, 1545, 1464, 1369, 1240 cm^–1;
FAB-MS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268.
Anal. berechnet für: C₂₂H₄₄NO₃: 370,3321 (M + H). Gefunden: 370,3319 (HR-FAB-MS).
SPISULOSIN 285-ACETONID (146)
Ein Anteil von Fraktion A (40 μg) wurde in Aceton (200 μl) aufgelöst, dem 0,1 N Salzsäure (20 μl) zugefügt wurde. Diese Lösung wurde 24 h bei 25°C gerührt, wonach das Lösungsmittel mittels eines Stickstoffstroms entfernt wurde. Die FAB-MS deutete darauf hin, dass eine kleine Acetonidmenge 146 gebildet wurde:
m/z 592, 452, 438, 326.3430, 300, 286, 268.
Anal. berechnet für: C₂₁H₄₄NO: 326,3423 (M + H). Gefunden: 326,3430 (HR-FAB-MS).
(4S,5R)-4-METHYL-5-(N-PENTADECYL)-OXAZOLIDINON (158)
(2S,3R)-2-Amino-3-octadecanol (155, 750 μg, 2,6 μmol) wurde in Dichlormethan (100 μl) aufgelöst, dem 1,1'-Carbonyldiimidazol (0,85 mg, 5,3 μmol) und Triethylamin (0,4 μl, 2,9 μmol) zugefügt wurde. Die Lösung wurde 5 h gerührt, und das Lösungsmittel wurde dann mittels eines Stickstoffstroms entfernt. Das Rohprodukt 158 wurde ohne Reinigung analysiert:
IR (NaCl) 36, 2919, 2851, 1742, 1713, 1551, 1470, 1395, 1321, 49, 1239, 1094, 1061, 1001, 768, 743, 664 cm^–1;
FAB-MS m/z 785, 623, 474, 406, 362, 328, 312, 286, 268.
Anal. berechnet für C₁₉H₃₈NO₂: 312,2903 (M + H). Gefunden: 312,2903 (HR-FAB-MS).
WEITERE UNTERSUCHUNG DER VERÄNDERUNGEN DER ZELLMORPHOLOGIE
MATERIALIEN
Lysophosphatidsäure (LPA), Antikörper gegen Tubulin und Phalloidin wurden alle von Sigma bezogen. Fluorescein- und der Texas-Rot-markierte Ziegen-Antimaus-Antikörper wurden von Amersham (UK) bezogen. Gegen das Rho-Protein gebildete Antikörper wurden von Sta Cruz Biotechn. bezogen.
ZELLKULTUR
Verozellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, supplementiert mit 10% fetalem Rinderserum, gezüchtet. Diesen Kulturen wurde von 4 bis 24 Stunden Spisulosin oder LPA in einer Konzentration von 0,2–1,0 μg bzw. 50–10 μM zugefügt. Die Zellen wurden mit dem Hämocytometer-Verfahren durch Arzneimittel-Ausschluss unter Verwendung einer Lösung aus 0,4 Trypanblau in Hanks gepufferter Kochsalzlösung gezählt (Celis und Celis, „General Procedures for Tissue Culture in Cell Biology, a Laboratory Handbook", Academic Press Inc., Vol 1, S. 5–17.)
BEISPIEL A Durch Spisulosin 285 verursachte Veränderungen der Zellmorphologie
Verozellen wurden mit Spisulosin 285 (0,5 μM) 4 Stunden inkubiert. 3 stellt eine Mikrofotografie der Ergebnisse in Beispiel A dar. Die Zellform war verändert von polygonal (unbehandelte Zellen, Panel a) in eine fusiforme Form (Panel b). Panel c stellt eine höhere Vergrößerung der Kultur dar, der Spisulosin zugefügt wurde.
BEISPIEL B Veränderung der Zellmorphologie aufgrund einer Wirkung auf die Zellmikrofilamente
Zur Identifikation der Organisation der Mikrofilament- und Mikrotubuli-Organisation in mit Spisulosin behandelten Zellen, wurden die Zellen zum Nachweis von Aktivpolymeren und einem Antitubulin-Antiköper zum Nachweis von Tubulin mit Phalloidin gefärbt.
Verozellen wurden bei An- (Panel b, d) oder Abwesenheit (a, c) von 0,5 μM Spisulosin 4 Stunden inkubiert. Auf Deckgläsern gewachsene Zellen wurden mit Methanol bei –20°C (für die Tubulin-Antikörper) oder mit 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; (w/v)) zur Phalloidin-Inkubation fixiert. Im zweiten Fall wurden die Zellen mit 0,2% Triton X100 in PBS gewaschen. Die Deckgläser wurden mit PBS gewaschen und mit dem Tubulin-Antikörper (verdünnt 1/1000 in PBS) oder mit Phalloidin (1 mg/ml) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die mit Tubulin-Antikörper inkubierten Deckgläser mit Fluorescein oder Texas-Rot-markierten Ziegen-Antimaus-Antikörpern (verdünnt 1:50 in PBS) überschichtet. Mowiol wurde auf die Deckgläser aufgezogen und diese bis zur Beobachtung bei 4°C im Dunkeln gelagert.
4 stellt eine Mikrofotografie der Ergebnisse in Beispiel B dar. Panel ,a' stellt mit Phalloidin (Aktinfärbung) und nicht mit Spisulosine behandelte gefärbte Zellen dar. Panel ,b' stellt auf Phalloidin gefärbte und mit Spisulosin behandelte Zellen dar. Panel ,c' stellt auf Tubulin gefärbte und nicht mit Spisulosin behandelte Zellen dar. Panel ,d' stellt auf Phalloidin gefärbte und mit Spisulosin behandelte Zellen dar. Es besteht im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine dramatische Abnahme des Aktins in mit Spisulosin behandelten Zellen. Unter den gleichen Bedingungen bleibt das Netz aus Mikrotubuli in polymerisierter Form.
BEISPIEL C Wirkung von Spisulosin auf das Rho-Protein
Das kleine GTP-bindende Protein Rho ist an der Bildung von Aktin-Myosin-„Stressfasern" beteiligt (Hall, A., Science, 279, 1998, S. 509–514). Deshalb wurde die elektrophoretische Mobilität und Zellverteilung von Rho in mit Spisulosin behandelten Zellen analysiert.
5 stellt ein Elektropherogramm von Beispiel C dar. In Panel A wurden äquivalente Proteinmengen aus einem Zellextrakt aus unbehandelten (a) oder mit 0,5 μM Spisulosin behandelten (20 Stunden) Zellen (b) mittels Gelelektrophorese fraktioniert und zur Analyse der Rho-Proteinmenge auf Nitrocellulose-Papier geblottet.
In Panel B wurde das Experiment wie vorstehend ausgeführt, außer dass das Homogenat in eine partikuläre (Membran, „M") Fraktion und eine lösliche („S") Fraktion fraktioniert wurde.
Die subzelluläre Fraktionierung wurde durchgeführt, indem die Zellen in einen hypotonen Puffer (0,25 M Saccharose, 20 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, Leupeptin und Pestatin) gegeben wurden und sie mit Dounce lysiert wurden. Das Homogenat wurde zur Entfernung der Nuklei und nicht aufgeschlossenen Zellen zuerst 5 Minuten bei 750 g zentrifugiert, und der Überstand wurde zur Isolation einer pelletierten partikulären Fraktion (putative Membran-Fraktion) und eines Überstandes 1 Stunde (4°C) bei 30 000 g weiter zentrifugiert. Die verschiedenen Fraktionen wurden mittels Elektrophorese und Western Blotting unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Rho-Protein charakterisiert.
Nach der Behandlung der Zellen mit Spisulosin wurde keine signifikante Veränderung der Rho-Menge oder -Mobilität beobachtet. Es wurde jedoch eine Abnahme der mit der partikulären Fraktion im Zusammenhang stehenden Proportion von Rho beobachtet.
BEISPIEL D Wirkung von Lysophosphatidsäure (LPA) auf die Wirkung von Spisulosin
Es ist bekannt, dass LPA den Umfang der Stressfasern in Zellen durch Aktivierung des Rho-Proteins steigert. Die Wirkung von LPA auf mit Spisulosin behandelte Zellen und nicht behandelte Zellen wurde untersucht.
Die Verozellen wurden in Ab- (a) oder Anwesenheit (b) von 10 μM LPA 2 Stunden oder in Anwesenheit (c) von 0,5 μM Spisulosin 20 Stunden oder in Anwesenheit von (d) zuerst 10 μM LPA (2 Stunden) und danach weitere 18 Stunden mit 0,5 μM Spisulosin inkubiert.
6 stellt eine Mikrofotografie der Ergebnisse in Beispiel D dar. Panel b zeigt die Wirkung von LPA durch Erhöhung des Aktin-Spiegels an. Die 24-stündige Inkubation von Verozellen mit Spisulosin führte zum Auftreten gerundeter Zellen, siehe Panel c. Diese Zellen lösen sich von der Kulturschale und sterben. Das Zufügen von LPA vor dem Spisulosin verhindert die von Spisulosin geförderte morphologische Veränderung.
IN VIVO-DATA
BEISPIEL E DIE WIRKUNG VON SPISULOSINE 285 IN VIVO
Spisulosin 285 wurde in in vivo-Studien gegen Xenotransplantat-Modelle des humanen Prostata-Karzinoms (PC-3) und des humanen Nierenkarzinoms MRI-H-121) getestet. Diese Modelle verwenden subkutan implantierte humane solide Tumoren, die im Lauf der Zeit wachsen und mit einer Volumenzunahme einhergehen. Das mittlere Volumen des Tumorwachstums in Kontrolltieren stellt die Vergleichsgrundlage bereit. Für aktive Verbindungen wird das Tumorwachstum entweder vollkommen (% T/C-Werte < 1% oder negativ) oder partial inhibiert (> 1% T/C–50% T/C). Ein Aktivitätsgrad von weniger als 40% T/C wird für statistisch signifikant erachtet. Die angewendeten Spisulosin-Dosen wurden in einer maximal tolerierten, nicht letalen Dosis (MTD), 1/2 MTD und 1/4 MTD verabreicht. Die Verabreichung des Arzneimittels erfolgte über die intraperitoneale Route.
Spisulosin 285 ist gegen beide Tumortypen wirksam, wobei es im Fall des humanen Prostatakarzinom-Modells PC-3 in höheren Dosen die Tumorgröße signifikant reduziert. Spisulosin 285 reduziert das Wachstum des humanen Nierenkarzinoms, wobei die Wirkungen bis zu einigen Wochen nach Gabe der letzten Arzneimitteldosis anhielten.
BEISPIEL F
Ein erweitertes in vitro-Screening wurde mit Spisulosin 285 gegen eine Reihe verschiedener Zelllinien durchgeführt. Die folgenden Daten wurden erhalten:
Der Bereich der IC₅₀-Potenzen gegen die Tumorzelllinien erstreckt sich von nanomolar, 1,05 E-09 nM, bis fentomolar, 3,51 E-15 fM. Es ist außergewöhnlich, wenn man über den nM- und pM-Bereich hinausgeht, dass man ein Arzneimittel findet, das Aktivität im fM-Bereich aufweist.
Die Aktivitäten gegen die soliden Tumoren waren im Allgemeinen um 1 log potenter als gegen Leukämien und Lymphome. Unter den soliden Tumoren waren die am langsamsten wachsenden die empfindlichsten, wobei sie in den sehr langsam wachsenden Hepatomen SK-HEP-1 kulminierten.
Im Vergleich zur normalen Zelllinie CV-1 wurden die besten therapeutischen Indices mit den langsam wachsenden soliden Tumoren gesehen, da die IC₅₀-Potenz (2,76 E-11) mit den Leukämien/Lymphomen vergleichbar war. Die TIs für solide Tumoren lagen im Bereich von 1–20 Einheiten und der TI für die Hepatome betrug > 3 log.
Die Nierentumor-Zelllinie befand sich in der aktivsten Gruppe, pM-Potenzen, die gut mit den in vivo-Xenotransplantat-Daten korrelierten.
LITERATUR
Die folgenden Literaturhinweise stellen erfindungsgemäße Hintergrundinformationen bereit:

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Die vorliegende Erfindung wurde, einschließlich der bevorzugten Ausführungsformen davon, ausführlich beschrieben. Es wird jedoch erkannt werden, dass der Fachmann, nach Erwägung der vorliegenden Offenbarung, an dieser Erfindung gegebenenfalls Modifikationen und/oder Verbesserungen vornehmen könnte.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein langkettiges, geradkettiges 2-Amino-3-hydroxyalkan zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das 2-Amino-3-hydroxyalkan C₁₆-C₂₄ darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das 2-Amino-3-hydroxyalkan C₁₈-C₂₀ darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das 2-Amino-3-hydroxyalkan ein 2-Amino-3-hydroxy-C₁₈-alkan darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das 2-Amino-3-hydroxyalkan eine Verbindung der Formel
darstellt und aus Spisulosin 285 (1), n = 12; Spisulosin 299 (2), n = 13; und Spisulosin 313 (3), n = 14, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die zur Anwendung bei der Behandlung von einem Krebs bestimmt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die zur Anwendung bei der Behandlung von einem Krebs, ausgewählt aus einem Mamma-, Kopf-Hals-, Prostata-, Blasen-, Pankreas-, Lungen-, Ösophagus-, Leber-, Kolon-, Schilddrüsen-, Nieren-, Hoden-, Ovarial- und gastrointestinalem Karzinom und Melanom, bestimmt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die zur Anwendung bei der Behandlung von einem Krebs, ausgewählt aus Leukämie und einem Lymphom, bestimmt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die zur Anwendung in der Therapie bestimmt ist, die auf das vaskuläre Endothel zur Kontrolle der Gewebe- und Tumorvaskularisation gerichtet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Verbindung Spisulosin 285 darstellt und die Zusammensetzung zur Anwendung bei der Behandlung eines soliden Tumors bestimmt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Verbindung Spisulosin 285 darstellt und die Zusammensetzung zur Anwendung bei der Behandlung eines langsam proliferierenden Tumors bestimmt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Verbindung zur Veränderung der Rho-Proteinaktivität wirkt.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einem anderen Arzneimittel zur Anwendung in der Kombinationstherapie.
Langkettiges, geradkettiges 2-Amino-3-hydroxyalkan zur Anwendung in einem Therapieverfahren.
Verwendung eines langkettigen, geradkettigen 2-Amino-3-hydroxyalkans bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Anwendung bei der Behandlung von Krebs.
Verwendung von Spisulosin 285 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Langkettiges, geradkettiges 2-Amino-3-hydroxyalkan mit der Ausnahme von 2-Amino-3-hydroxy-C₁₈-alkan.