MXPA00009930A

MXPA00009930A - Compuestos de espisulosina que tienen actividad antitumoral.

Info

Publication number: MXPA00009930A
Application number: MXPA00009930A
Authority: MX
Inventors: Kenneth Lloyd Rinehart
Original assignee: Univ Illinois
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2002-04-24
Also published as: AU763981B2; DE69927007D1; EP1069894B1; JP2002511410A; KR100568964B1; PL343381A1; CN1335770A; TR200002955T2; ES2248995T3; BG104935A; SK15082000A3; EP1069894A1; DK1069894T3; BR9910120A; ATE303139T1; BG64970B1; UA72208C2; KR20010074483A; HK1042048A1; DE69927007T2

Abstract

La investigacion de la actividad de los extractos de Spisula polynyma ha conducido a compuestos de alcano o alqueno de cadena larga, de cadena recta, antitumorales, los cuales tienen un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi.

Description

COMPUESTOS DE ESPISULOSINA QUE TIENEN ACTIVIDAD ANTITUMORAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de compuestos de espisulosina. Además se refiere al tratamiento de tumores y proporciona nuevos compuestos citotóxicos y composiciones farmacéuticas para utilizarse contra tumores. En un aspecto, la invención se refiere a compuestos antitumorales de organismos marinos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ha existido un gran interés para aislar compuestos bioactivos de organismos marinos. Los procedimientos típicos implican programas de clasificación in vitro para probar extractos crudos para actividades antimicrobianas, antivirales y citotóxicas. Ejemplos ilustrativos de compuestos bioactivos conocidos de fuentes marinas incluyen biostatinas, ecteinascidinas y otras didemninas, en donde didemnina B, también conocida como aplidina, es el primer producto natural marino en la prueba clínica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas que contienen un grupo alcano o alqueno de cadena larga, de cadena recta, el cual tiene un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Típicamente, el compuesto es un 2-amino-3-hidroxialqueno o un 2-amino-1 ,3-dihidroxialqueno. Preferiblemente, el compuesto es un alcano o alqueno de 16 a 24 átomos de carbono substituido. El compuesto preferiblemente es un alcano substituido, preferiblemente un alcano substituido de 18 a 20 átomos de carbono, y muy preferiblemente un 2-amino-3-hidroxialcano de 18 átomos de carbono. El alqueno substituido preferiblemente es un mono o dialqueno substituido, muy preferiblemente un alqueno substituido de 18 a 20 átomos de carbono. En una modalidad, los compuestos tienen la estereoquímica parcial: En particular, la presente invención proporciona composiciones que contienen bases de tipo esfingoide bioactivas, espisulosinas 285, 299 y 313 (1-3), esfingosina (también denominada como 4-esfingenina u octadeca-4-esfingenina, 4 y dos compuestos relacionados, nonadeca-4-esfingenina (un homólogo más largo de carbono, 5) un esfinga-4-10-dieno (un derivado de deshidroesfingosina, 6). De esta manera, las composiciones preferidas contienen uno o más de los siguientes compuestos preferidos: espisulosina 285 (1), n = 12; espisulosina 299 (2), n = 13; espisulosina 313 (3), n = 14; así como: esfingosina (4), n = 12 y nonadeca-4-esfingenina (5), n = 13; y esfinga-4,10-dieno (6).

El compuesto preferido, espisulosina 285, es conocido en la literatura. El compuesto 1 y el diaestereómero syn, primero fueron sintetizados por investigadores croatas en la determinación de configuraciones absolutas de bases de lípido con dos o más átomos de carbono asimétricos, ver Prostenik, M., Alaupovic, P. Croat. Chem. Acta. 1957, 29, 393. Se cree que los otros compuestos en las composiciones de esta invención son compuestos nuevos. Los compuestos 1-3 muestran una citotoxicidad única contra células de leucemia linfocítica de murino L1210. En un número de los ensayos L1210, se observó una alteración distinta morfológica. Este efecto también fue descrito en la solicitud de patente provisional de E.U.A. anterior 60/043,326. No se ha hecho ningún reclamo de patente en esta solicitud de patente al efecto de la misma en L1210, y en realidad ahora algunos datos preliminares que sugieren que los compuestos tales como espisulosina 285 pueden carecer de actividad contra tumores de leucemia. Una muestra sintética de 1 fue analizada contra células de leucemia L1210 y mostró tanto citotoxicidad como alteración morfológica, señalando actividad de célula.

Inhibición de L1210 y actividad de célula señalada. Concentración % de citotoxicidad % de células señaladas8 0.5 µg/ml 100 97 0.25 µg/ml 99 100 0.1 µg/ml 99 62 0.05 µg/ml 96 71 0.025 µg/ml 90 21 0.01 µg/ml 45 1 * Porcentaje de células señaladas es un porcentaje de las células vivientes.

La espisulosina 285 (1) también es activa contra otras líneas de célula tumorales in vitro, incluyendo P-388)0.01 µg/ml); A-549 (0.05 µg/ml); HT-29 (0.05 µg/ml) y MEL-28 (0.05 µg/ml). En una modalidad particularmente preferida, la presente invención se refiere al uso de espisulosina 285, y compuestos relacionados, en el tratamiento de todos los tipos de cáncer, tales como cáncer de pecho, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, esófago, laringe, hígado, colon, tiroides, melanoma riñon, cáncer testicular, leucemia, cáncer ovárico, gastrointestinal, carcinoma hepatocelular y cáncer endotelial vascular. Otras formas de cáncer son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se prefiere que el uso de espisulosina 285, y compuestos relacionados, sea contra tumores sólidos, con uso contra tumores de lenta proliferación tales como próstata, pulmón, hígado, riñon, glándula endocrina y cáncer endotelial vascular, particularmente preferido. En un aspecto, las composiciones son para utilizarse en la terapia dirigida al endotelio vascular para el control de vascularización de tejido y de tumor. La presente invención está dirigida a compuestos bioactivos que se ha encontrado que poseen actividades específicas antitumorales y como tales serán útiles como agentes medicinales en mamíferos, particularmente en seres humanos. De esta manera, otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos activos identificados aquí y métodos de tratamiento empleando dichas composiciones farmacéuticas. Los compuestos activos de la presente invención exhiben actividad antitumoral. De esta manera, la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de cualquier mamífero afectado por un tumor maligno sensible a estos compuestos, que comprende administrar al individuo afectado una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo o mezclas de compuestos, o composiciones farmacéuticas de los mismos. La presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas, las cuales contienen como ingrediente activo uno o más de los compuestos de esta invención, así como los procesos para su preparación. Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (tabletas, pildoras, cápsulas, granulos, etc.) o líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con composición adecuada o administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier vehículo u otros compuestos farmacológicamente activos. Estas composiciones pueden necesitar ser estériles cuando se administran en forma parenteral. La administración de la composición de la presente invención puede ser a través de cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales, administración intraperitoneal e intravenosa. El suministro intravenoso puede ser realizado durante un período de tiempo adecuado, tal como de 1 a 4 horas o aún más tiempo si se requiere, a intervalos adecuados de 2 a 4 semanas. Las composiciones farmacéuticas que contienen espisulosina pueden ser suministradas a través de encapsulación de liposoma o nanoesfera, en formulaciones de liberación sostenida o a través de otros medios de suministro estándares. La dosis correcta de una composición farmacéutica que comprende los compuestos de esta invención variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, huésped y bacteria del tumor que se está tratando. Otros factores como la edad, el peso del cuerpo, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la condición del huésped, las combinaciones de fármaco, las sensibilidades de reacción y la severidad de la enfermedad deben ser tomadas en cuenta. La administración puede realizarse continua o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada. Los compuestos pueden ser provistos en las composiciones farmacéuticas de esta invención en la forma de un profármaco o precursor, el cual después de la administración se convierte o es metabolizado al compuesto activo.

Las composiciones de esta invención pueden ser utilizadas con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o ser provistos como una composición separada para administrarse al mismo tiempo o en un momento diferente. La identidad del otro fármaco no es particularmente limitada, y los candidatos adecuados incluyen: a) fármacos con efectos antimitóticos, especialmente aquellos que activan elementos citoesqueléticos, incluyendo moduladores de microtúbulo tales como fármacos de taxano (tales como taxol, paclitaxel, taxoero, docetaxel), podofilotoxinas o vinca alcaloides (vincristina, vinblastina); b) fármacos antimetabolito tales como 5-fluorouracilo, citarrabina, gencitabina, análogos de purina tales como pentostatina, metotrexato; c) agentes de alquilación tales como mostazas de nitrógeno (tales como ciclofosfamida o ifosfamida); d) fármacos que activan el ADN tales como los fármacos de antraciclina, adriamicina, doxorubicina, farmorubicina o epirrubicina; e) fármacos que activan topoisomerasas tales como etoposida; f) hormonas y agonistas o antagonistas de hormona tales como estrógenos, antiestrógenos (tamoxifen y compuestos relacionados) y andrógenos, flutamida, leuprorelina, goserelina, ciprotona u octreotida; g) fármacos que activan la transducción de señal en células tumorales incluyendo derivados de anticuerpo tales como herceptina; h) fármacos de alquilación tales como fármacos de platino (cis- platina, carboplatina, oxaliplatina, paraplatina) o nitrosoureas; i) fármacos que potencialmente afectan mestástasis de tumores tales como inhibidores de metaloproteinasa de matriz; j) terapia de gen y agentes antisentido; k) terapéuticos de anticuerpo; y I) otros compuestos bioactivos de origen marino, notablemente las ecteinascidinas tales como ET-743, o las didemninas tales como aplidina. La presente invención también se extiende a los compuestos para utilizarse en un método de tratamiento, y al uso de los compuestos en la preparación de una composición para el tratamiento de cáncer. La espisulosina 285 tiene un efecto sobre la morfología de células. Las células Vero tratadas con espisulosina tuvieron una estructura microfilamentosa reducida, según analizado a través de tinción de las células tratadas con espisulosina con faloidina, que tiñe la actina en los microfilamentos. La espisulosina también afecta la distribución de la proteína de unión GTP pequeña Rho, aunque este efecto puede ser reducido o eliminado a través del pretratamiento con LPA el activador Rho (Mackay y Hall, J. Biol. Chem., 273, 20685-29688, 1998).

Sin desear que esté restringido por teoría, se cree que el mecanismo de acción de la espisulosina puede involucrar la modulación de la acción de la proteína de unión a GTP pequeña, Rho, posiblemente a través de un efecto sobre la activación de LPA. Rho se sabe que está involucrada en la formación de fibras de tensión (Hall, A., Science 279, 509-514, 1998), y tiene el papel de controlar ia adhesión de célula y la movilidad a través de la reorganización del citoesqueleto de actina (Itoh, y otros, Nature Medicine, Vol. 5, No. 2, 1999). La adhesión de células tumorales a capas de célula huésped y subsecuente migración transcelular son pasos clave en la invasión y metástasis de cáncer. Al afectar (reducir) los niveles de microfilamentos en la célula, a través de un efecto (inhibidor) sobre Rho, la espisulos?na puede servir para limitar el desarrollo de cáncer a través de un efecto sobre el citoesqueleto de células. También se sabe que Rho activa la progresión de la fase G1 del ciclo de célula. Como tal, la modulación de Rho también puede evitar la transformación celular deteniendo la progresión del ciclo de célula. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de espisulosina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en donde la espisulosina actúa para alterar la actividad de la proteína Rho. LPA, un activador de Rho puede ayudar a prevenir el efecto de espisulosina en la formación de microfilamentos. Aunque el objetivo específico de espisulosina no es conocido, la reducción observada de microfilamentos de actina en células tratadas con espisulosina y la estructura de lípido de la espisulosina sugiere que la espisulosina puede servir' cómo un antagonista para el receptor LPA evitando que LPA interactúe con su receptor para activar Rho para producir los microfilamentos. Los compuestos preferidos de esta invención inicialmente fueron aislados de Spisula polynyma. Spisula polynyma es una almeja comestible, la cual también se conoce como la almeja de resaca de Stimpson o la almeja de resaca del Atlántico. Pertenece a la subfamioia de Mactrinae familia Mactridae, superfamilia Mactroidea, orden Veneroida, subclase Heterodonta, clase Bivalvia, phylum Mollusca. Spisula polynyma originalmente se encontró en la costa de Japón, en donde se denominó hokkigai y se procesó para sushi. Ahora ha emigrado a través del Estrecho de Bering, más allá de Groenlandia y Terranova, hacia el océano Atlántico. La almeja tiene una concha de color gris-blanco, una longitud de 7-10 cm. Es principalmente blanquecina, excepto en la lengua la cual es púrpura en la almeja viva, pero se hace de color rojo brillante después del cocido. De esta manera, la presente invención proporciona extractos activos de la almeja Spisula polynyma. Una modalidad de la presente invención está dirigida a compuestos novedosos aislados de la almeja Spisula polynyma, y el uso de todos los compuestos citotóxicos aislados de la misma como compuestos antitumorales. Para probar la actividad biológica, una almeja se homogeneizó en 3:1 de metanol/tolueno. Se agregó una solución de cloruro de sodio a este extracto crudo, haciendo que se separara en tolueno y una capa acuosa. Esta última además se extrajo con tolueno, diclorometano, acetato de etilo y 1-butanol. Estos extractos fueron todos analizados contra células L1210, en donde se observó una toxicidad importante para los extractos de tolueno y diclorometano crudos iniciales y menos actividad en las otras tres fracciones.

Citotoxicidad de L1210 de Extractos Crudos de Spisula polynyma3 b Concentración (µg/ml) Extracto 250 125 50 25 12.5 5 Crudo 98* 98* 92 25 0 0 Tolueno 100* 100' 100* 25 13 13 CH2C l2 100* 100^ 100* 91 20 13 EtOAc 98* 98* 92* 0 0 0 1-BuOH 83 33 0 0 0 0 Acuoso0 94 75 0 0 0 0 Notas: (a) citotoxicidad reportada como % de inhibición de crecimiento; (b) entradas marcadas con asterisco mostraron actividad de célula señalada; (c) el extracto acuoso se analizó a 700, 350, 140 70, 35 y 15 µg/ml.

Estos extractos también fueron analizados contra el virus de herpes simple Tipo l (HSV-1) y células de riñon de mono CV-1 (a 100 µg/disco de 6.35 mm), pero no se observó ninguna actividad. No se observó ninguna actividad antimicrobiana para estos extractos contra Penicillium melinii (antiguamente P. atrovenetum) y Micrococcus huteus (antiguamente Sarcina hutea, ambos a 500 µg/disco de 12.7 mm). Después, otros extractos más purificados fueron analizados contra Bacillus subilitis, Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli sin ninguna bioactividad observada. También están disponibles métodos sintéticos para la preparación de compuestos de espisuloslna, particularmente espisulosinas 285 (1), 299 (2) y 313 (3). La ruta sintética preferida se basa en la adición previa de organometálicos a N,N-dibenci!amino aldehidos para producir ß-aminoalcoholes con una alta estéreoselectividad. Ver, Andrés y otros, Org. Chem. 1996, 61, 4210 y Hertz y otros, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1987, 26, 1141. La adición controlada sin quelatación de reactivos de Grignard o compuestos de organolitio produce el anti-diaestereómero y la adición controlada de quelatación de zinc orgánico preferencialmente da el syn-diastereómero. El Esquema I ilustra este proceso sintético preferido para la formación del Compuesto 1: Esquema I 20 30 4O SO «SO Como se describe en el Esquema I, el ß-aminoaldehído 50 puede ser preparado a partir de éster metílico de L-alanina a través de la desbencilación del grupo amino con bromuro de bencilo y carbonato de potasio seguido por la reducción de hidruro de litio-aluminio al N,N-dibencilamino alcohol 40. La oxidación de Swern de 40 da 50 en un alto rendimiento y puede ser utilizado sin purificación adicional para evitar la descomposición. La adición del reactivo de Grignard a 50 proporciona el anti-diaestereómero 60 con alta selectividad. El compuesto 60 puede ser fácilmente purificado, por ejemplo, a través de cromatografía de vaporización instantánea y HPLC. La desprotección de 60 a través de hidrogenólisis en el catalizador de Pealman proporciona 1 en un alto rendimiento y un buen rendimiento total. Los Compuestos 2 y 3 pueden ser preparados simplemente incrementando la longitud de cadena del reactivo de Grignard y los compuestos restantes de la presente invención también pueden ser preparados a través de la elección apropiada del reactivo de Grignard.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F son ilustraciones de las morfologías de célula observadas en los ensayos L1210 de extractos de Spisula polynyma. La Figura 1A representa una célula normal; la Figura 1B representa una célula señalada típica; la Figura 1C representa una célula señalada atípica; la Figura 1D representa una célula con más de dos puntos; la Figura 1E representa una célula pandeada; y la Figura 1F representa una célula pandeada y señalada combinada. La Figura 2 ilustra el esquema utilizado para separar los compuestos aquí descritos de los extractos de la almeja Spisula polynyma. La Figura 3 es una microfotografía de los resultados en el Ejemplo A. La Figura 4 es una microfotografía de los resultados en el Ejemplo B. La Figura 5 es un electroforetograma del Ejemplo C. La Figura 6 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo D. Haciendo referencia a la Figura 1, en el ensayo L1210 algunas de las células cambiaron de ser esféricas (Figura 1A) a ovoides con puntos largos separados a aproximadamente 180°C (Figura 1B). También se observaron varias otras formas en ensayos de estos extractos, incluyendo células con puntos sin separación de 180°C (Figura 1C), células con más de dos puntos (Figura 1D), células con un pandeo (Figura 1E) y células con un pandeo reemplazando uno de los puntos (Figura 1F). Sin embargo, la forma con dos puntos opuestos afilados fue más allá del predominante y característico observado. Este tipo de cambio morfológico no fue previamente observado durante la clasificación de más de 1000 extractos marinos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aislamiento de Espisulosinas 285, 299, y 313. Para esta invención, se recolectaron Spisula polynyma, a una profundidad de 3350.8 metros, de un lecho de almejas en el borde occidental del banco de Stellwagon, el está ubicado en la costa de Nueva Inglaterra, estiramiento de Gloucester, Massachussets cercano, norte de Maine. Se embarcaron vivas por la New England Clam Corporation (antiguamente New Dawn Seafoods, Inc.) y después se congelaron inmediatamente. Un esquema de purificación similar al procedimiento de extracción descrito anteriormente para la prueba original de la bioactividad, se empleó. Las primeras 35 almejas fueron descongeladas y las conchas se removieron para dar 1.9 kg (peso en húmedo). Estas se dejaron reposar en 3:1 de metal/tolueno y se filtraron después de varias horas. Este paso se repitió seguido por homogeneización y extracción extensa con este mismo solvente para dar un extracto crudo. A este se le agregó una solución de 1 M de cloruro de sodio, el cual hizo que el extracto se separara en dos capas. La capa acuosa inferior además se extrajo con tolueno y las capas de tolueno se combinaron. La capa acuosa resultante después se extrajo con diciorometano como se muestra en la Figura 2. El extracto de tolueno se dividió entre metanol y hexano. Las citotoxicidad y la alteración celular fueron observadas casi exclusivamente en la fracción de metanol. El extracto de metanol así obtenido se aplicó a una columna de vaporización instantánea de sílice, eluyendo con un gradiente de paso de cloroformo/metanol (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100). La actividad citotóxica principal y la formación de célula señalada se eluyeron de la columna muy posteriormente, aunque las fracciones primarias mostraron algo de citotoxicidad, pero no ninguna célula señalada. Esta elución tardía además fue purificada a través de cromatografía de sílice de vaporización instantánea, utilizando 8:12:1:1 de cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua. Las fracciones fueron neutralizadas con bicarbonato de sodio antes de remover el solvente para evitar una posible descomposición cuando se concentrarán en ácido. Esto dio como resultado una serie de tres reacciones bioactivas. Se observó en intentos anteriores en aislamiento que la bioactividad no limpió una columna de extracción de fase sólida de ciano (SPE) con metanol, pero se encontró que la citotoxicidad se eluyó con 3:1 de metanol/0.01 M de formiato de amonio (0.5 ml/minuto). Esto fue confirmado a través de cromatografía de una pequeña fracción bioactiva sobre una columna de HPLC de ciano con este mismo sistema de solvente y después repitiendo la inyección bajo las mismas condiciones, excepto que reemplazando la solución de formiato de amonio con agua. Los cromatogramas fueron idénticos, excepto que un pico eluyéndose a 15.6 minutos solamente se observó en el primero. Las tres fracciones bioactivas de la segunda columna de sílice cada una además fueron purificadas a través de HPLC de ciano con las mismas condiciones utilizadas anteriormente (excepto 1 ml/minuto) para dar 3 series de fracciones bioactivas. El formiato de amonio fue removido haciendo pasar la muestra a través de una columna de SPE de C-18, lavando primero con agua y después eluyendo con metanol. La actividad principal de citotoxicidad y cambio de morfología de cada serie (fracciones A, B y C) se encontró en un pico comparable con aquella discutida anteriormente. Sin embargo, la actividad se diseminó a través de la mayoría de las fracciones. La TLC de sílice (3:12:2:2 de cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua) indicó que la fracción A (0.4 mg) contuvo una macha (Rf 0.47), la cual fue de color rosa por ninhidrina. La fracción B (1.3 mg) mostró esta misma mancha así como una ligeramente más baja (Rf 0.44, roja por ninhidrina), mientras que la fracción C (0.2 mg) contuvo ambas y una tercera (Rf 0.34, púrpura por ninhidrina). Las tres mostraron buena citotoxicidad y actividad formadora de célula señalada, con A exhibiendo ligeramente mayor actividad que B y significativamente mayor que C. Esto indicó que la mancha de TLC más superior debe ser de compuesto que ocasionaron el cambio morfológico en células L1210. Estas fracciones no fueron purificadas adicionalmente, sino que más bien analizadas como mezclas. Los resultados del bioensayo cuantitativo se discuten más adelante. Se hizo un intento para determinar si un órgano particular de Spisula polynyma contuvo la mayoría o toda la bioactividad. Una almeja viva fue anestesiada con éter dietílico y después disectada en 9 partes: patas, sistema digestivo, gónadas, sifón, branquias, corazón, manto, músculos aductores, y el resto de la masa visceral (con patas, sistema digestivo y gónadas removidos). Estos fueron identificados por comparación con ilustraciones de las otras almejas. Cada órgano fue homogeneizado en 3:1 de metanol/tolueno y el extracto resultante después fue titulado con diclorometano y metanol para remover las sales. Mientras todos los extractos mostraron citotoxicidad (Cuadro), solamente aquellos de las branquias y las gónadas exhibieron una fuerte actividad de cambio de morfología. Aquella del sistema digestivo y el resto de la masa visceral también mostró actividad formadora de célula señalada débil, posiblemente debido a la separación incompleta de las gónadas. La falta de actividad de formación de célula señalada en otros órganos pudo ser resultado ya sea de una falta de 1-3 o de una concentración mucho menos. En otro experimento, una para que había sido cocinada durante un breve período se extrajo en una forma análoga. Esta también mostró citotoxicidad, pero ninguna actividad de alteración de morfología. Sin embargo, cuando una muestra mayor de material cocinado fue extraído más extensamente, se observaron algunas células señaladas en el ensayo L1210. La TLC de sílice (3:12:2:2 de cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua, 100 µg) de los extractos del sistema digestivo y gónadas mostró una débil mancha positiva a ninhidrina en Rf 0.49. 250 µg/ml 125 µg/ml 50 µg/ml Órgano %de % %de % %de % Inhibición Señalado8 Inhibición Señadado3 Inhibición Señada* Pata 100 0, adb 100 0, ad 93 0,0 Sistema digestivo 96 0, 18 62 0,0 0 0,0 Gónadas nrc nr 99 56, 100 90 32, 100 Sifón 100 ad, ad 50 0,0 0 0,0 Branquias 100 ad, ad 100 50, ad 98 100,93 Corazón 100 ad, ad nr 0,0 38 0,0 Manto 100 0,0 99 0,0 95 0,0 Músculos aductores 100 añadido 100 0,0 95 0,0 Masa visceral 100 10, ad 100 2, ad 94 0,0 Pata cocinada 100 0 100 0 97 0 Pata cocinada8 91 21 25 0 0 0 Notas: a El porcentaje de las células señaladas fue medido de 58 a 82 horas después del inicio del ensayo. bad = todas muertas cnr = no leído debido al material precipitado en el ensayo que obscureció las células. d El porcentaje de las células señaladas se midió 72 horas después del inicio del ensayo. e Esta muestra se extrajo en una forma similar a aquella utilizada para obtener el extracto crudo del aislamiento de las fracciones A-C. El porcentaje de célula señalada se midió 76 horas después del inicio del ensayo. Varias pistas para la estructura de los compuestos bioactivos pudieron ser encontradas en el procedimiento de aislamiento. La mancha de TLC, la cual se correlacionó con la actividad visualizada como rosa o roja por ninhidrina, sugirió que todos los compuestos contuvieron aminas primarias. También, exhibieron un carácter anfifílico. Originalmente fueron extraídas en tolueno de metanol acuoso, pero después se dividieron en metanol contra hexano. Aunque son solubles en solventes no polares, requieren de un solvente muy polar (3:12:2:2 de cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua) para ser eluídas a partir de sílice. Solamente las fracciones A y B fueron razonablemente puras a partir de los contaminantes inactivos como se muestra a través de TLC. La mayoría de los estudios de determinación de estructura fueron realizados en la fracción B, debido a su tamaño con relación a los otros. Las Figuras 3 y 4 muestran espectros de 1H NMR de la fracción en CDCI3 y CD3OD, respectivamente. Lo que fue inmediatamente obvio en estos espectros fue un pico que corresponde a una cadena de metileno larga (1.25 ppm) y varios grupos metilo terminales traslapantes. 0.87 ppm). Otros picos no fueron muy bien definidos. Ningún pico que corresponde a protones aromáticos fue observado, pero varios picos aparecieron en la región de protón de alqueno. Varios otros parecieron corresponder a protones unidos a carbonos substituidos con átomos heterogéneos. La diferencia principal entre los espectros en los dos diferentes solventes que, en CD3OD, una banda doble de metilo (1.21 ppm) campo debajo de los grupos metilo terminales fue claramente observada, mientras que en CDCI3 esta resonancia apareció solamente como un espaldón campo arriba en el pico de cadena de metileno. Una muestra auténtica de T-frans-erfr o-esfingosina (4) se obtuvo de Sigma para compararse con el material aislado. El espectro de H NMR de la misma fue similar en muchos aspectos a aquella de la fracción B. Según se esperaba, 4 exhibió un pico mayor debido a la cadena de metileno larga (1.25 ppm), un grupo metilo terminal (0.87 ppm) y dos protones de vinilo (5.75 y 5.46 ppm). De observación particular fue la amplitud de las resonancias correspondiendo a protones en los carbonos substituidos con átomos heterogéneos (4.40, 3.66, 2.85 y 2.18 ppm). También, en la TLC de sílice (3:12:2:2 de cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua), 4 tuvo Rf 0.43 y apareció rojo por ninhidrina, como la mancha inferior en la fracción B y la mancha media en C. Palmeta y Prostenik reportaron que el 2-amino-3-octadecanol y 4 exhibieron valores de Rf muy similares (o.32 y 0.20, respectivamente) cuando se eluyeron sobre papel impregnado con ácido silícico con el sistema de solvente di-isobutilcetona/ácido acético/agua (40:25:5). Las fracciones A-C también fueron estudiadas a través de varios métodos espectrométricos de masa. El ion más grandes en todos los espectros fue de m/z 286. La medición de alta resolución de este pico (m/z 286.3109) permitió la asignación de la fórmula molecular C18H40NO (0.1 mmu) a espisulosina 285 (1). Este compuesto derivó su nombre, en parte, de su peso molecular. Esta fórmula molecular indicó que la molécula está totalmente saturada. Un pico fuerte correspondiendo a la pérdida de agua de este ion M + H fue observado a 268.3019 (?-1.5 mmu). De esta manera, 1 debe contener un grupo hidroxilo. Los iones que corresponden a aductos de matriz de m/z 286 fueron observados en m/z 438.3078 (C22H48NO3S2, ?-0.2 mmu), 590, y 592. Un metabolito primario bien conocido que, como 1, consiste de una cadena de 18 carbonos substituida con funcionalidades hidroxilo y amina es esfingosina (4). Este compuesto tiene un oxígeno más y dos hidrógenos menos que 1. La analogía pareció válida debido a la alta medición de resolución de m/z 300 para las espisulosinas indicó que fue una banda doble correspondiendo a M + H de un homólogo superior (2) de m/z 286 (300.3270, C19H42NO, -0.4 mmu), junto con la misma esfingosina (4) (300.2914, C?8H38NO2, ?-1.1 mmu). Esto también ayudó a explicar la presencia de protones de alqueno en el espectro de H NMR. Varios otros picos fueron evidentes en todos los otros tres espectros. El ion en m/z 314 también fue una banda doble correspondiendo a C20H44NO (314.3439, ?-1.6 mmu), lo cual fue el ion molecular de otro homólogo de 1, espisulosina 313 (3), y C?gH40NO2 (314.3075, ?-1.6 mmu), que fue un homólogo de esfingosina (5). El Compuesto 4 mostró aductos de matriz del ion M + H a m/z 452.2885 (C22H46NO4S2, ?-1.7 mmu), 604.2831 (C26H5 NO6S4, ? 0.3 mmu) y 606.2995 (C26H56NO6S4, ? 3.6 mmu), 5 exhibió aductos de matriz del ion M + H a m/z 464.2888 (C23H46NO4S2, ?-2.0 mmu) y 618.2940 (C27H56NO6S4, ? 5.1 mmu). Se debe observar que, mientras m/z 300 y 314 fueron bandas dobles de intensidad absolutamente igual en la fracción B, solamente un pico fue medible para los aductos de matriz listados aquí de la fracción B. Esto sugirió que estas dos series de compuestos, aunque muy similares en estructura general, se comportaran en forma diferente en FABMS. La serie de espisulosina (saturada) proporcionó fuertes iones moleculares y aductos de matriz más débiles, mientras que la parte inversa se observó para la serie de esfingosina (insaturada). Para establecer mejor las estructuras identificadas por los datos discutidos anteriormente, se prepararon varios derivados. El más informativo fue derivado de diacetilo de espisulosina 285 (8). Ya que la fracción B fue la más grande, una porción de la misma fue acetilada con anhídrido acético en piridina. Esta mezcla de derivado de acetilo será denominada en la presente como AcB. A través de TLC de sílice (3:12:2:2 de cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua), la reacción pareció cuantitativa, con una nueva mancha apareciendo a Rf0.86. Para comparación, el derivado de triacetilo del 4 auténtico (9) también fue sintetizado por el mismo método. Previamente se aislaron dos series de compuestos relacionados con las espisulosinas. Gulavita y Scheuer reportaron que una esponja Xestospongia sp. de Papua-Nueva Guinea contuvo dos aminoalxoholes de 14 átomos de carbono epiméricos, 134 y 135. Estos no fueron aislados como las aminas libres, sino que más bien la mezcla fue acetilada para dar tanto los compuestos mono(136, 137) y diacetilo (138-139), los cuales después fueron separados. Jiménez y Crews aislaron varios iones moleculares del 1 no derivatizado a m/z 286. Este ion de M + H (m/z 370) se fragmentó para dar m/z 310 y 268, presumiblemente a través de la pérdida de ácido acético y después en segundo grupo acetilo, respectivamente. Los iones comparables para las otras espisulosinas fueron pequeños, pero estuvieron presentes: m/z 384, 324 y 282 para el derivado de diacetilo de 2 (144), y m/z 398, 338 y 296 para el derivado de diacetilo de 3 (145). Los iones de la esfingosina en la muestra fueron demasiado pequeños para establecer definitivamente que estuvieron presentes. Esto otra vez mostró que las dos series de compuestos tuvieron potenciales de ionización muy diferentes. El espectro de CIMS mostró fuertes iones de m/z 370 y 310, pero aquí el ion de m/z 268 fue muy débil. Los homólogos superiores otra vez se vieron a m/z 384 y 324 para 144, y m/z 398 y 338 para 145. Los iones débiles a m/z 426 y 366 fueron indicativos de 133. 140 R. H 141 143 R: Ac Síntesis de Espisulosina 285 Para confirmar la estructura y determinar la estereoquímica de espisulosina 285, se sintetizó el compuesto. Ninguno de los isómeros de 2-amino-3-octadecanol fueron previamente conocidos como productos naturales, sino que más bien tanto los isómeros 2S, 3S y 2S, 3R fueron previamente sintetizados. Los homólogos superiores son compuestos novedosos. Una versión modificada de la síntesis de Prostenik y Alaupovic se utilizó para obtener el material auténtico para comparación.

Esquema II 1. NaH -coa 8fi^8fr * OWH¿ 1-» ctycH,H,— i (UO) COJBn 3. H2.M-aS04 152 153 Ofi OR 1. D-stßrß?m-os separados IB ??^??^ CH,W¿U N--V2--0H y- 3. AcOH,pH4S NHR tM. U4R-.H xlSSR.H AßjOpyr/ AcjCVpyt-í lMR.Ac lB7R>Ac Primero, se alquiló malonato de dibencilo (147) con bromuro de tetradecilo (148). El tetradecilamalonato de dibencilo resultante (149) después se condensó con cloruro de N-ftaloil-L-alanilo (150) para dar 2-ftalimido-3-octadecanona (151) después de la remoción de los grupos bencilo y la descarboxilación. Esta cetona fue tratada con un exceso de borohidruro de sodio, lo cual dio como resultado la reducción de uno de los ftalimido carbonilos además de la cetona, produciendo tanto 152, el cual tuvo un ftalimido carbonilo reducido a la carbinolamina, como 153, el cual fue reducido adicionalmente.

Estos dos productos pueden ser fácilmente separados uno del otro a través de cromatografía de vaporización instantánea de gel de sílice. La reducción de 151 a 152 produjo una mezcla de 4 diaestereómeros debido a la formación de dos nuevos centros quirales. En este punto, los diaestereómeros fueron separados a través de HPLC de ciano. El grupo protector después fue removido de cada uno a través de reducción adicional con borohidruro de sodio seguido por ácido acético. Ya que un estereocentro fue removido con el grupo protector, esto dio como resultado la producción de dos diaestereómeros. Ya que esta síntesis empezó con L-alanina, los dos productos fueron (2S, 3S)-2-amino-3-octadecanol (154) y (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155).

Actividad Biológica Aunque las espisulosinas fueron compuestos absolutamente simples, como se ilustra en las Figuras 1A-1F, exhibieron un tipo muy inusual de bioactividad. Como se discutió anteriormente, las espisulosinas causaron un cambio distinto morfológico en células de leucemia L1210, además de citotoxicidad. La bioactividad, la cual se registró como el porcentaje de células vivas en donde se observó una morfología alterada, pudo ser observada algunas veces tanto como 13 horas después del inicio del ensayo y llegaron a un máximo de 50-60 horas, después de lo cual redujo. Generalmente, se observaron 60 células para determinar este número, excepto en ensayos en donde menos de este número de células permanecieron vivas. El efecto morfológico fue usualmente medido 30-35 horas después del inicio del ensayo y otra vez aproximadamente 24 horas después, mientras que la citotoxicidad se determinó cuando el número de células en los controles llegó a aproximadamente 8000, usualmente en 3 días después de que se iniciara el ensayo. Se debe observar que las células señaladas fueron células vivas y que fueron contadas como tales para la lectura de citotoxicidad. También, los ensayos en donde se registró un 100% de citotoxicidad siguen teniendo células vivas contenidas (<0.5%), las cuales pueden ser o no pueden haber sido señaladas. Todas las células morfológicamente cambiadas fueron contadas en el porcentaje de célula señalada. Este cambio en morfología siempre fue observado en fracciones con citotoxicidad absolutamente alta. En general, no se observó ningún número importante de células señaladas en los ensayos con menos de 70% de inhibición de crecimiento. Sin embargo, los ensayos en donde la citotoxicidad llegó a 100% por lo general tuvieron porcentajes más bajos de células con morfología alterada que aquellos con un 90-98% de inhibición de crecimiento. Esto sugirió que las células alteradas pueden ser más fácilmente aniquiladas. Es desconocido su la citotoxicidad y el cambio de morfología resultan del mismo mecanismo de acción. En un caso, las células señaladas de un ensayo se volvieron a cultivar y se encontró que se invirtieron al estado normal. Esto sugirió que el efecto fue reversible después de que el compuesto ha sido metabolizado. La acetilación drásticamente reduce la bioactividad.

Para determinar si el cambio en morfología de células L1210 fue ocasionado por esfingosina (4) o compuestos relacionados, se obtuvieron varios compuestos auténticos y se analizaron contra células L1210. Tanto la esfingosina como la estearilamina (131) exhibieron citotoxicidad moderada, pero ningún efecto morfológico. Las esfigomielinas son derivados bien conocidos de (4), en donde una unidad de fosforilcolina ha sido agregada al alcohol primario y la amina es acetilada por un ácido graso. Una mezcla de esfigomielinas aislada de cerebro de bovino (Sigma) la cual consistió principalmente de estearoil y nervonoil esfigomielinas (161, 162), mostró una citotoxicidad mínima y ninguna célula señalada. La citotoxicidad del derivado de fosforilcolina de 4 (163, Sigma) puede ser, por lo menos, parcialmente debido a la hidrólisis de 163 a 4. -ßl R»-ÍCH2)MCH, 163 162 R--{CH3)lsCH-.OT(CHa>7CH-(2-.

Citotoxicidad de Compuestos Modelo Compuesto Concentración % % dde Inhibición % de Célula (µg/m I) señalada 128 5 100 0 2.5 100 0 1 75 0 0.5 31 0 0.25 13 0 0.1 0 0 161 + 162 50 7 0 25 0 0 10 0 0 131 5 99 0 2.5 96 0 1 19 0 0.5 0 0 0.25 0 0 0.1 0 0 163 50 88 0 25 50 0 10 38 0 La esfingosina y otras aminas de cadena larga, incluyendo estearilamina, se sabe que son citotóxicas. Esta bioactividad, según medida contra células de ovario de hámster Chino (CHO), ha sido mostrada como máxima para homólogos de 18 carbonos. Los cuatro estereoisómeros de la esfingosina se encontraron casi igualmente activos. La reducción del doble enlace de 4 para producir dihidroesfingosina (164) no afectó la citotoxicidad. La adición de un grupo N-metilo a 164 tampoco ocasionó ningún cambio importante en la bioactividad, aunque la acilación de la amina ocasionó una gran reducción en la citotoxicidad. No se reportó ninguna citotoxicidad para los compuestos relacionados (134, 135, 140-142), los cuales habían sido aislados de otras fuentes marinas, sin embargo, no pudieron ser probados en este tipo de ensayo. Una mezcla de 134 y 135 fue activa contra C. albicans (zona de inhibición de 8 mm para 19 µg de una mezcla de los dos). Se reportó que xestaminol A exhibe una actividad débil contra varias bacterias y hongos Gram positivos y Gram negativos. También mostró actividad antihelmíntica contra Nippostrongylus brasilensis. Tanto 140 como 142 mostraron alguna actividad contra transcriptasa inversa. La actividad de las fracciones A-C, el derivado acetilo de la fracción B y los compuestos 154 y 155 se resume en el cuadro. Los resultados del ensayo claramente confirmaron el análisis de NMR asignando 155, no 154, así como el 125. También, la acetilación reduce drásticamente la bioactividad.

Cuadro IX Bioactividad de las Fracciones A-C, AcB, y 154 y 155 % de Cél u las S eña ladas Muestra Concentración % de Tiempo 1o. 2o. (µg/ml) Inhibición0 Fracción A 2.5 100 35,59 ad ad 1.25 100 25 ad 0.5 90 42 45 0.25 85 45 55 0.125 75 8 35 0.005 19 0 0 Fracción B 2.5 100 35,59 0 7 1.25 93 3 21 0.5 90 2 43 0.25 80 7 37 0.125 75 5 21 0.05 7 0 0 Fracción C 2.5 90 55 0 1.25 88 0 0.5 63 0 AcB 10 31 27 0 5 38 0 2 13 0 1 0 0 0.5 0 0 0.2 0 0 154 5 100 27 0 2.5 100 O 1 63 0 0.5 0 0 0.25 0 0 0.1 0 0 155 5 100 27 ad 2.5 100 22 1 100 64 0.5 99 56 0.25 96 40 0.1 93 33 Notas: a A menos que se indique otra cosa, el porcentaje de células señaladas fue leído dos veces. El número de horas después del inicio del ensayo en donde se hicieron estas mediciones está indicado en la columna de tiempo. ad = todas muertas c El porcentaje de inhibición de crecimiento, el cual fue registrado como el porcentaje de células vivas en las cavidades tratadas, se comparó con aquel de cavidades de control.

Posible Modo de Acción La bioactividad de las espisulosinas puede deberse a su similitud con la esfingosina. En la nomenclatura de los esfingolípidos, la espisulosina 285 podría ser considerada como 1- desoxiesfiganina. Las espisulosinas pueden competir con esfingosina para sitios de unión o ser incorporadas en esfíngolípidos tales como esfingomielinas, ceramidas o gangliosidas. En cualquier caso, las espisulosínas pueden interrumpir las funciones celulares controladas por estos compuestos. La esfingosina y sus derivados están implicados en la regulación del crecimiento y diferenciación de célula. La esfingosina es un potente inhibidor de la proteína de cinasa C, compitiendo con diacilglicerol para el sitio de unión, lo cual puede explicar su citotoxicidad. Los estudios de actividad de estructura han mostrado que esta inhibición requiere de una amina positivamente cargada y de esta manera los derivados N-acilo fueron inactivos. Si las espisulosinas actúan compitiendo con esfingosina, esto podría explicar la falta relativa de actividad de los compuestos acetilados (AcB). Existe una evidencia creciente de que la esfingosina puede actuar como un segundo mensajero regulando la actividad de la proteína cinasa C. También se ha mostrado que inhibe la diferenciación de células HL-60 tratadas con 12-miristato-13-acetato de forbol, un activador conocido de la proteína de cinasa C. Las espisulosinas deben ser probadas para la inhibición de la proteína de cinasa C. Es desconocido si la inhibición de esta enzima podría ocasionar los efectos morfológicos observados para las espisulosinas, pero la proteína cinasa C está involucrada en el control del crecimiento y diferenciación de célula.

Parte Experimental Los espectros de NMR se obtuvieron de los espectrómetros General Electric GN 500 y QE 300 y Varian U400. Las muestras para el análisis NMR se disolvieron en CDCI3 o CD3OD. Los desplazamientos químicos (?) se reportaron en ppm campo abajo tetrametilsilano (TMS) y se refirieron al pico solvente residual o TMS. Los espectros de FABMS de alta y baja resolución fueron registrados ya sea en un espectrómetro de VG ZAB-SE o VG 70-SE4F, utilizando una mezcla de 3:1 de ditiotreitol-ditioeritritol (folleto mágico) como la matriz. Los espectros de FABMS/MS fueron registrados en un aparato VG 70-SE4F con la misma matriz, utilizando helio como el gas de colisión. Los espectros de masa Cl fueron registrados en un espectrómetro IBM IR/32 FTIR, operando en el modo alternante de CI/EI con metano como el gas reactivo. Los espectros IR fueron obtenidos en un espectrómetro IBM IR/32 FTIR. Las rotaciones ópticas fueron medidas en un polarímetro digital JASCO DIP-370.

Cromatografía La HPLC se realizó utilizando una columna de ciano Alltech Econosphere (4.6 x 250 mm, tamaño de partícula 5 µm). El sistema de HPLC utilizado consistió de una bomba Beckman Modelo 114M, un inyector Rheodyne 71 y ya sea un detector de longitud de onda variable Isco4 o Beckman 165 o un detector de disposición de fotodiodo Waters 990.

La cromatografía de capa delgada analítica (TLC) se realizó sobre un gel de sílice pre-revestido (Merck 60 F-254) y placas de fase unida de ciano (EmScience CN F25.SHPTLC). Se visualizaron manchas a través de UV (254 nm), ninhidrina (5% en etanol), ácido fosfomolibdico (5% en etanol) y/o yodo. La cromatografía de columna de sílice se realizó ya sea 50-200 µm o 40-63 µm (Merck). Otra cromatografía de columna utilizó Chromatorex ODS (Fuji-Division 100-200 mallas) y Sephadex LH-20 (Pharmacia). La cromatografía contra corriente a alta velocidad (HSCCC) se realizó en un separador-extractor de capas múltiples Ito (P.C., Inc.) con una bovina #10 y una mini bomba Milton-Roy. La extracción de fase sólida (SPE) se realizó en columnas de fase normal (sílice, Alltech Maxi-Clean), de fase inversa (C-18, Waters Sep-Pak), y de fase unida (CN, Fisher PrepSep).

Ensayos Biológicos Los ensayos de citotoxicidad contra células de leucemia linfocíticas de murino L1210 se realizaron disolviendo las mezclas en metanol y/o hexano y fueron aplicadas a cavidades de ensayo secas y el solvente se dejó evaporar. Se agregaron células (1000) en el medio esencial mínimo (MEM, 1 ml) y se incubaron a 37°C. Se registró la inhibición de crecimiento como el porcentaje estimado de células vivas en las cavidades de muestra contra aquellas en las cavidades de control. Esto se midió cuando las cavidades de control alcanzaron 8000 células, generalmente 3 días después del inicio del ensayo. Las células morfológicamente cambiadas (Figuras 1A-1F) se contaron como células vivas cuando determinaron el porcentaje de inhibición de crecimiento. Los cambios morfológicos se analizaron a través del período de ensayo. El porcentaje de células señaladas se determinó contando el número de células alteradas en aproximadamente 60 células vivas. Este porcentaje varió con la duración del ensayo en operación. Generalmente alcanzó su máximo aproximadamente 50 horas después del inicio del ensayo, pero se pudieron observar células señaladas 13 horas después del inicio del ensayo y usualmente se pudieron seguir viendo cuando se midió el porcentaje de inhibición de crecimiento. Los porcentajes de células señaladas por lo general fueron contados después de aproximadamente 35 y 55 horas. El tiempo en el que esta medición se hizo se indica con los datos. Se realizaron ensayos antimicrobianos utilizando el método de difusión de disco de filtro. Se impregnaron discos de papel (6.35 o 12.7 mm, Schleicher & Schuell) con muestras (50-500 µg) en solución y se dejaron secar. Estos discos después se colocaron sobre agar sembrado ya sea con Bacillus subtilis, Penicillium melinii (antiguamente P. atrovenetum), Micrococcus luteus (antiguamente Sarcina lútea), Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Estas placas se incubaron durante 12-24 horas (32-35°C, excepto P. melinii, 25-27°C).

Extracción de Spisula polynyma para la prueba biológica inicial Una almeja (Spisula polynyma) fue descongelada y la concha removida (peso húmedo 35.32 g). Esta se colocó en un mezclador con 350 ml de 3:1 de metanol y/tolueno y se homogeneizó. El extracto de color amarillo-café se filtró y se agregó a una solución de cloruro de sodio 1M (100 ml). La capa de tolueno superior se removió y la capa acuosa se extrajo con 75 ml de tolueno. Las dos capas de tolueno fueron combinadas y el solvente se removió para dar un residuo oleoso de color café (333.9 mg). La capa acuosa además se extrajo con diclorometano (2 x 75 ml), el cual dio un residuo de color amarillo-café (18.6 mg) después de la remoción del solvente. La capa acuosa después se extrajo con 75 ml de acetato de etilo. La fase inferior fue la capa orgánica debido a la presencia de algo de diclorometano, el cual había permanecido en la fase acuosa después del último paso. La capa superior además se extrajo con 245 ml de acetato de etilo, la capa orgánica superior se extrajo con 100 ml de agua, y los dos extractos de acetato de etilo se combinaron para dar un residuo amarillo (36.8 mg) después de la remoción del solvente. Las capas acuosas combinadas se concentraron a la mitad y se extrajeron dos veces con 1-butanol (150 ml, 75 ml). Las capas de butanol combinadas se volvieron a extraer con 75 ml de agua, dando como resultado 132.8 mg de un residuo amarillo después de la remoción del butanol. Las capas acuosas combinadas se concentraron para dar un residuo amarillo claro oleoso (946.1 mg). Cada extracto se tituló con diclorometano y metanol para remover sales para dar 302.2 mg de tolueno, 18.6 mg de diclorometano, 36.7 mg de acetato de etilo, 120.9 mg de butanol y 590,4 mg de extractos acuosos, los cuales fueron analizados.

Fracciones A, B, y C Se descongelaron 35 almejas y las conchas se removieron para dar una muestra de Spisula polynyma (1.9 kg), la cual se remojó en metanol/tolueno (3:1, 2 x 1.51). Los sólidos después se molieron en el mismo solvente (6 x 1.51) y los extractos resultantes se filtraron. Se agregó una solución de 1M de cloruro de sodio (3 litros) a este extracto crudo (12 litros) y la capa de tolueno superior resultante se removió. La capa acuosa se extrajo adicionalmente con tolueno (2 x 2.51), seguido por diclorometano (4 x 2.51) como se muestra en la Figura 1. Después de la remoción del solvente, el extracto de tolueno (21.55 g) se dividió entre metanol y hexano (1.5 litros cada uno). La capa de metanol se extrajo adicionalmente con hexano (4 x 11). Las capas de hexano combinadas se concentraron a aproximadamente 1.8 litros y ambos extractos se congelaron (-10°C). Las dos capas que resultaron en cada caso, fueron separadas. Las capas de hexano combinadas después se extrajeron con 0.5 litros de metanol. Este proceso dio como resultado un hexano y 3 extractos de metanol de los cuales el primer extracto de metanol (6.8 g) contuvo la bioactividad mayor. Esta fracción de metanol bioactiva se separó a través de cromatografía de sílice de vaporización instantánea empleando un gradiente de paso de cloroformo/metanol (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100) para dar 12 fracciones. Mientras que la tercera, cuartas, séptima y octava fracciones poseyeron algo de citotoxicidad, no mostraron ninguna actividad formadora de célula señalada. Esta actividad se encontró en las dos últimas fracciones junto con la mayor parte de la citotoxicidad. Estas dos fracciones fueron combinadas (370 mg) y además se purificaron por otra columna de sílice de vaporización instantánea, utilizando cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua (8:12:1:1). Para remover el ácido acético, cada una de las 12 fracciones así obtenidas fueron neutralizadas, (a) agregando cloroformo (volumen de un cuarto), (b) lavando con 5% de bicarbonato de sodio hasta que el pH de la capa acuosa estuvo por arriba de 7 (2-3 x volumen medio), y después (c) lavando la capa orgánica con agua (volumen medio). Las tercera, cuarta y quinta fracciones poseyeron todas la actividad de formación de célula señalada y esencialmente toda la citotoxicidad. Cada una de estas fracciones se purificaron en forma separada a través de HPLC en una columna de ciano con 3:1 de metanol/0.01 M de formiato de amonio (1 ml/min). Seis fracciones, de las cuales la más bioactiva fue la quinta, se recogieron de cada fracción de sílice. El formiato de amonio se removió de cada fracción agregando 2-8 ml de agua, aplicando la muestra a una columna de SPE (C-18), lavando con 5-10 ml de agua y después eluyendo con 5 ml de metanol. Esto dio como resultado las fracciones A (0.4 mg, 2 x 10"5% de rendimiento), B (1.3 mg, 7 x 10"5% de rendimiento) y C (0.2 mg, 1 x 10"5% de rendimiento), de las tercera, cuarta y quinta fracciones de sílice, respectivamente, las cuales todas fueron eluídas a t, 7.9 min.

Fracción A Sólido blanco; TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1- BuOH/AcOH/H2O)Rf 0.47 (ninhidrina-positiva, rosa); IR (NaCI) 2922, 2853, 1734, 1593, 1462, 1377, 1061 CITG1; 1H NMR (CDCI3) d 5.38, 5.15, 3.82, 3.67, 3.44, 3.24, 2.31, 2.03, 1.67, 1.60, 1.55, 1.25, 1.10, 0.86; FABMS m/z 606, 604, 592, 590, 466, 452, 438, 314, 300, 286, 268; CIMS m/z 354, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 268, 266, 149, 139, 137, 1, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55. Anal. Cale, para C18H4oNO: 286.3110 (M + H).

Se encontró: 286.3115 (HRFABMS).

Fracción B Sólido blanco; TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1-BuOH/AcOH/H2O)Rf 0.47 (ninhidrina-positiva, rosa), 0.44 (ninhidrina-positiva, roja); IR (NaCI) 3273, 2953, 2918, 2851, 1639, 1591, 1510, 1466, 1379, 1344, 1059, 970 cm"1; 1H NMR (CDCI3) d 5.98, 5.78, 5.55, 5.44, 5.32, 4.43, 3.78, 3.65,3.24, 2.15, 2.08, 2.00, 1.95, 1.70, 1.44, 1.25, 1.19, 0.87; FABMS m/z 6.18.2940, 616, 606.2955, 604.2831, 592, 590, 480, 466, 464.2888, 452.2885, 438, 314.3439, 314.3075, 300.3273. 300.2914, 286, 268; CIMS m/z 354, 352, 342, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 282, 280, 268, 266, 219, 193, 179, 165, 149, 137, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.

Fracción C Sólido blanco; TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1- BuOH/AcOH/H2O)Rf 0.47 (ninhidrina-positiva, rosa), 0.44 (ninhidrina-positiva, roja), 0.34 (ninhidrina-positiva, púrpura); IR (NaCI) 2924, 2853, 1593, 1456, 1352, 1063, 972 crtT1; FABMS m/z 620, 618, 616, 606, 604, 602, 466, 464, 452, 438, 314, 300, 298.2741, 296, 286, 280, 268; CIMS m/z 354, 352, 340, 338, 336, 328, 326, 324, 322, 314, 312, 310, 308, 300, 298, 296, 294, 292, 286, 284, 282, 280, 278, 268, 179, 165, 149, 137, 135, 1, 123, 121, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 81, 71, 69, 60, 59, 57, 55.

División Inicial Se descongelaron 22 almejas S. polynyma y las conchas se removieron para dar 1.3 kg del organismo (peso húmedo). Esto se colocó en un mezclador de Waring con 3:1 de metanol/tolueno (1.5 litros) y se molió a una lechada delgada, la cual se filtró a través de una capa de Celite. El residuo sólido se extrajo adicionalmente (4x1.51) y se filtró en una forma similar. Los sólidos restantes después se colocaron en 5:1 de metanol/tolueno (750 ml) y se dejaron remojar durante 36 horas, antes de la filtración. A los extractos combinados (7.8 litros) se les agregó cloruro de sodio 1M (2 litros). Después de la remoción de la capa de tolueno superior, la fase acuosa se extrajo con tolueno (2 x 1.5 I) y diclorometano (3 x 1.5 I). La fase acuosa restante se concentró a la mitad y se extrajo con acetato de etilo (2 x 1 I). La capa acuosa resultante se diluyó con 2 ml de agua y se extrajo dos veces con 1-butanol (1. 5 I, 1 I). La remoción de los solventes y la titulación con diclorometano y metanol dio como resultado 14.1 g de tolueno, 0.75 g de diclorometano, 1.3 g de acetato de etilo, 0.2 g de 1-butanol y 1.9 g de extractos acuosos, los cuales se analizaron. El extracto de tolueno se dividió entre hexano y metanol (750 ml cada uno). La capa de metanol resultante además se extrajo con hexano (2 x 750 ml, 2 x 500 ml). Las capas de hexano se combinaron y se concentraron a aproximadamente 3 litros y después ambos extractos se enfriaron (-10°C), lo cual ocasionó que cada uno se separara en dos capas. Las capas de metanol combinadas se concentraron al vacío para dar un residuo de color café (extracto de metanol 1,536 g). Las capas de hexano además se concentraron a aproximadamente 1 litro y se volvieron a extraer con 500 ml de metanol. El solvente se removió de cada uno de éstos para dar el extracto de metanol 2 (4.26 g) y el extracto de hexano (4.52 g).

Fracción D Una porción del primer extracto de metanol (594 mg) se separó a través de HSCCC, utilizando hexano/acetato de etilo/metanol/agua (4:7:4:3, MP = UP) a 4 ml/min. Esto proporcionó 12 fracciones de las cuales la tercera, la cuarta y la quinta contuvieron la mayoría de la bioactividad. Estas tres fracciones se combinaron (158 mg) y se cromatografiaron sobre Sephadex LH-20, eluyendo con metanol. Esto dio como resultado 8 fracciones de las cuales la cuarta (8.4 mg) poseyó la mayor parte de la actividad biológica. Esta fracción bioactiva se purificó adicionalmente a través de HPLC sobre una columna de ciano con 3:1 de metanol/0.01 M de formiato de amonio (0.5 ml/minuto). Ocho fracciones se recogieron y el formiato de amonio se removió de cada una agregando 2-8 ml de agua, aplicando la muestra a una columna de SPE (C-18), lavando con 5-10 ml de agua y después eluyendo con 5 ml de metanol. La séptima fracción (tt 15.8 mín, sólido amorfo de color blanco, 0.3 mg, 2x10% rendimiento) probó contener los compuestos bioactivos y se denominó aquí como la fracción D. La TLC de sílice (1-BuOH/ AcOH/H2O, 4:1:5, capa superior) mostró 4 manchas a través de visualización de ácido fosfomolíbdico: Rf 0.53 (mayor), 0.35 (mayor), 0.31 (menor), y 0.19 (menor). La sexta fracción inactiva mostró ¡as mismas manchas, excepto para Rf 0.53. El espectro de FABMS de la fracción D mostró picos intensos a m/z 286.3019, 300.3270 y 268.3019, y picos más débiles a 314, 438, 452, 464, 590, 592, 669, 797, 809 y 825. Los últimos tres iones listados también fueron observados en la mayor parte de las otras fracciones de HPLC y parecieron corresponder a la mancha de TLC a Rf 0.35. Análisis calculado para C18H40NO:286.3110 (M + H). Se encontró: 286.3109 (HRFABMS).

Fracción E Una segunda porción del primer extracto de metanol descrito anteriormente (633 mg) se sometió a HSCCC. El sistema de solvente empleado fue hexano/metanol/agua (5:4:1, UP = MP, 5 ml/min), el cual dio una pobre retención de fase fija. Esto dio como resultado 10 fracciones con la bioactividad diseminada a través de la mayor parte de ellas. Las primeras tres fracciones (310 mg) fueron combinadas y purificadas adicionalmente a través de HSCCC utilizando hexano/acetato de etilo/metanol/agua (4:7:4:3, LP = MP, 2 ml/min) para dar 12 fracciones. Las segunda a quinta fracciones (85 mg), conteniendo la mayoría de la bioactividad, fueron cromatogrfiadas sobre una columna de vaporización instantánea C-18, eluyendo con un gradiente de paso de metanol/agua/cloroformo (90:10:0, 95:5:0, 100:0:0, 95:0:5, 90:0:10, 50:0:50). Esto proporcionó 10 fracciones las cuales fueron bioactivas. Las cuarta a sexta fracciones de la primera operación de HSCCC fueron combinadas con una fracción lateral de la columna de Sephadex LH-20 discutida sobre la fracción D (270 mg). Este material se sometió a HSCCC, utilizando las mismas condiciones como la segunda operación justamente descrita, excepto que la velocidad de flujo fue de 3 ml/minuto. Esto dio como resultado 9 fracciones de las cuales la segunda y la tercera contuvieron la mayor parte de la citotoxícidad y actividad de alteración de célula. Estas dos fracciones fueron combinadas (42 mg) y separadas sobre una columna de vaporización instantánea C-18, utilizando un gradiente de paso de metanol/agua (80:20, 90:10, 95:5, 100:0). Esto dio como resultado 12 fracciones, de las cuales de la octava a la onceava mostraron actividad de alteración de morfología y citotoxicidad. Todas, pero las primera y quinta fracciones de la columna C-18 fueron combinadas con la octava a onceava fracciones de la segunda (50.4 mg) separadas a través de TLC de sílice de preparación con cloroformo/1 -butanol/ácido acético/agua (3:12:2:2). La placa se dividió en 8 fracciones, las cuales se rasparon y se eluyeron con metanol. El residuo de cada fracción después de la remoción del solvente, se tituló con diclorometano y se filtró. La segunda fracción de la parte superior de la placa (Rf 0.80-0.42) contuvo el materia bioactivo y es denominada como la fracción E (5.7 mg). La TLC de sílice analítica de la fracción E, eluyéndose con el mismo sistema de solvente, mostró una sola mancha a través de visualización de ninhidrina (Rf 0.44), pero el reactivo de ácido fosfomolíbdico mostró otro material que rayó a través de la tercera mitad de la placa. El espectro de FABMS de la fracción B mostró m/z 286 como el pico mayor, con picos mayores a m/z 268, 300, 438, 452 y 592.

Fracción F Una tercera porción del primer extracto de metanol (468 mg) se separó a través de cromatografía de sílice de vaporización instantánea, utilizando el sistema de solvente de cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua (8:12:1:1). Para remover el ácido acético, cada una de las 10 fracciones así obtenidas se neutralizaron, (a) agregando agua (la mitad del volumen de la fracción) y separando las dos fases, (b) extrayendo la capa acuosa con cloroformo (la mitad del volumen x 2), (c) lavando las capas orgánicas combinadas con bicarbonato de sodio al 5% hasta que el pH de la capa acuosa estuvo por arriba de 7 (de 2 a 3 x la mitad del volumen), y después (d) lavando la capa orgánica con agua (la mitad del volumen). La tercera fracción (24 mg), la cual poseyó la mayoría de la bioactividad, se cromatografío sobre Sephadex LH-20, eluyendo con metanol, para dar 8 fracciones. La sexta fracción (2.3 mg) se separó a través de HPLC de repetición, utilizando ¡as mismas condiciones como para la separación de la fracción A-C. El formiato de amonio se removió como para la fracción A-C. La fracción eluyéndose a tt 8.1 min. fue la más biológicamente activa y se denomina como una fracción F. Fue tan pequeña que no se pudo obtener un peso exacto, pero probablemente fue de 100-200 µg (aproximadamente 1 a 2 x 10"4% de rendimiento). Las fracciones que se eluyeron después que esta también mostraron tanto citotoxicidad como actividad de formación de célula señalada, aunque menos potente. Esto sugirió que cualquiera de los compuestos bioactivos no se eluye como un pico bien definido o que diferentes homólogos se eluyeron en diferentes momentos, pero no todos se separaron bien. La TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1 -BuOH/AcOH/H2O) mostró una mancha de ninhidrina-positiva a Rf 0.44. Las últimas fracciones de elusión también mostraron esta misma mancha, pero menos intensa. El espectro de FABMS de la fracción F muestra (en orden decreciente de intensidad) m/z 286, 268, 300, 314, 344, 438, 452, 592, 669.

Disección Una almeja viva se colocó en un recipiente con aproximadamente 10 ml de éter dietílico y se enfrió (4°C) durante 20 horas. Esta fue disectada en 9 órganos: patas, sistema digestivo (incluyendo el estómago, intestinos y el saco de estilo cristalino), gónadas, sifón, branquias, corazón, manto, músculos aductores, y el resto de la masa visceral. Cada órgano primero fue sumergido en metanol/tolueno (3:1, 10 ml/g de muestra) y después se homogeneizó en un mezclador de Virtis. Los extractos se filtraron y el solvente se removió. El residuo se tituló con diclorometano y metanol para dar 155 mg (patas), 60 mg (sistema digestivo), 145 mg (gónada), 101 mg (sifón), 65 mg (branquias), 2.5 mg (corazón), 168 mg (manto), 101 mg (músculos aductores), y 252 mg (masa visceral). En un experimento separado, una pata que había sido cocinada se extrajo en una forma análoga (189 mg). Una muestra más grande de almejas cocinadas (483 g) fue extensamente extraída sumergiéndola primero en 3:1 de metanol/tolueno (3 x 500 ml) y después homogeneizando la muestra en los mismos solventes (5 x 500 ml). Una pequeña muestra de los extractos combinados se evaporó y se volvió a disolver en metanol para análisis.

Procedimientos Generales Se midieron las rotaciones ópticas en un polarímetro digital DIP-370, con una célula, 3.5 x 50 mm, 1 ml. Se tomaron puntos de fusión en un aparato de punto de fusión capilar Thomas Hoover. 1H y 13C NMR fueron registrados en un espectrofotómetro Varian Unity-400 o Unity-500. Los desplazamientos químicos se reportan en ppm con relación al solvente (7.26, CDCI3 y 3.30, CD3OD). Los espectros de masa de alta resolución (HRF AB) y de bombardeo rápido de átomos (FAB) se registraron en un espectrómetro de masa VG ZAB-SE o a 70 SE4F. La TLC se realizó en 60 placas de capa delgada de gel de sílice de Merck. Las separaciones cromatográficas se realizaron a través de cromatografía de vaporización instantánea utilizando gel de sílice de Merck de 230-400 mallas. Todas las reacciones sensibles a la humedad fueron corridas en cristalería secada al horno bajo una atmósfera de N2. Los solventes se destilaron antes de uso: THF de cetil benzofenona CH2CI2 de CaH2, los otros solventes utilizados fueron de grado reactivo.

Ester metílico de ácido (S)-2-(N,N-dibencilamino)propiónico (30). A un matraz de fondo redondo de 300 ml se le agregó 20 (10.0 g, 71.6 mmoles), bromuro de bencilo (25.73 g, 150.4 mmoles), K2CO3 (9.90 g, 716 mmoles) y CH2CN (172 ml). La mezcla se agitó a 60°C hasta que la reacción se completó a través de TLC. La reacción estuvo más fría que temperatura ambiente y el sólido se separó a través de filtración. El filtrado se concentró al vacío para dar un aceite, el cual se purificó a través de cromatografía de vaporización instantánea sobre gel de sílice (9:1 hexano/EtOAc) para dar un aceite incoloro: [a]25D = 113.6 (c 1.2, CHCI3); *H NMR (400 MHz, CDCI3) d 1.35 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 3.53 (q, 1H, J = 7.0 Hz), 3.65 (d, 2H, J = 1.38 Hz), 3.75 (s, 3H), 3.85 (d, 2H, J = 13.8 Hz), 7.22-7.42 (m, 10H); 3C NMR (100 MHz) d 14.9, 51.1, 54.3, 56.0,2.8,4.1, 4.5, 139.1, 175.1; FABMS m/z 284.1 (M + H), 282.1 (M-H), 224.2 (M-COOCH3); HRFABMS cale, para C18H22NO2Mr 284.165.1 (M + H), Se encontró Mr 284.1650.

(S)-2-(N,N-dibencilamino)-1 -pro panol (40): A una suspensión de LiAIH4 (550 mg, 14.5 mmoles) en 20 ml de THF, se agregó gota a gota una solución de 30 (910 mg, 3.21 mmoles) en 2 ml de THF. La solución se agitó durante 15 minutos y después se calentó a 65°C durante 3 horas. La reacción se enfrió a 0°C y se extinguió con 0.1 N HCl. La reacción se filtró a través de Celite y la Celite se lavó con THF (2 x 15 ml) y el solvente se removió al vacío. La cromatografía de vaporización instantánea sobre gel de sílice (4:1 hexano/EtOAc, Rf = 0.30) dio 750 mg (rendimiento del 92%) de un sólido incoloro: p. f. 40-41°C (a partir de hexano) literatura de p. f.40-21°C (de hexano). Ver, Stanfield y otros, J. Org. Chem. 1981, 40, 4799-4800; [a]25D +86.6 (c 1, CHCI3) Literatura [a]23D + 88.2 (c 1, CHCI3); 1H NMR (500 MHz CDCI3) d 0.98 (m, 3H), 2.98 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.35 (m, 3H), 3.45 (m, 1H), 3.81 (m, 2H), 7.19-7.41 (m, 10H); 13C NMR (1 MHz) d 8.6, 52.9, 54.1, 62.7, 3.2, 4.5, 5.0, 5.3; FABMS m/z 256.2 (M + H), 224.2 (M-CH2OH); HRFABMS cale, para C17H22NOMr 256.1701 (M + H), Se encontró Mr 256.1702.

(S)-2-(N,N-dibencilamino)propionaldehído (50): Se agregó DMSO seco (0.53 ml, 7.43 mmoles) a una solución agitada de cloruro de oxalilo (0.31 ml, 3.6 mmoles) en 7.5 ml de CH2CI a -78°C. La solución se dejó agitar durante 15 minutos, seguido por la adición de 40 (740 mg, 2.90 mmoles) en 7.5 ml de CH CI2. Después de 30 minutos, se agregó Et3N (1.0 ml, 7.2 mmoles) y se dejó calentar a temperatura ambiente. La solución se extrajo con 20 ml de NaHCO3 y la capa acuosa de extrajo con CH2CI2 (2 x 15 ml). La capa orgánica se lavó con una solución de NaCI saturado, se secó con MgSO4 y se concentró al vacío a temperatura ambiente para dar 720 mg (rendimiento del 98%) de un aceite de color amarillo, el cual se hizo un sólido cuando se enfrió a -20°C. El aldehido se utilizó sin purificación adicional: p. f. 52-54°C, literatura p. f. 55.5°C. Ver, Dix y otros, Arch Pharm (Weinheim) 1995, 328, 203-205; [a]26D -36.0 (c 1, CHCI3 Literatura [a]20D = -35.1 (c 1, EtOAc); 'H NMR (400 MHz, CDCI3) d 1.19 (d, 2H, J= 7.0 Hz), 3.34 (q, 11 J = 7.0 Hz), 3.58 (d, 21 J= 13.7 Hz), 3.74 (d, 2H, J= 13.7 Hz), 7.26 (m, 2H), 7.33 (m, H), 7.42 (m, 4H), 9.74 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz) d 6.7, 54.9, 62.8, 3.3, 4.4, 4.8, 139.1, 204.6; FABMS m/z 408.2 (M + MB), 254.2 (M + H), 22.2 (M-CHO); HRFABMS cale, para C?7H20NOMr 254.1545 (M + H), Se encontró Mr 254.1545. (2S, 3R)-2-(N,N-dibencilamino)-3-octadecanol (60): Se agregaron listones de Mg (237 mg, 9.75 mmoles), dicloroetano (16 µl, 0.189 mmoles) en 160 µl de THF a un matraz de dos cuellos equipado con un condensador de reflujo. 1/2 ml de una solución de 1 -bromopentadecano (970 mg, 3.33 mmoles, 3.25 ml THF) se agregó. Después de que la reacción se inició, el resto se agregó gota a gota. A la solución grisácea 50 (105 mg, 0.413 mmoles) en 0.5 ml de THF, se agregó gota a gota. La reacción se dejó agitar durante la noche seguido por la adición de 5 ml de H2O y 0.1 N HCl hasta que la solución quedó transparente. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml). La capa orgánica se lavó con NaHCO3 al 5%, después con soluciones de NaCI saturado y se secó con MgSO4. El solvente se removió al vacío para dar una mezcla de aceite-sólido (750 mg). El material crudo se purificó a través de cromatografía de vaporización instantánea sobre sílice (8:1 hexano/EtOAc, Rf = 0.34) para dar 120 mg de un sólido. Este sólido se purificó adicionalmente a través de HPLC sobre sílice (93:7 hexano/EtOAc) para dar un sólido ceroso incoloro (95.3 mg, rendimiento del 49%): [a]25D +16.3 (c 1, CHCI3); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) d 0.88 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.10 (d, 3H, J = 6.7 Hz), 1.161.41 (bm, 26H), 1.56 (m, 1H), 1.69 (m, 1H), 1.79 (m, 1H), 2.72 (quin, 1H, J= 6.7 Hz), 3.47 (d, 2H, J= 13.8 Hz), 3.60 (m, 1H), 3.76 (d, 2H, J = 13.8 Hz), 7.22 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.34 (m, 4H); 13C NMR (1 MHz) d 8.67, 14.11, 22.68, 25.90, 29.35, 29.61, 29.64, 29.68, 29.69,31.91, 34.27, 54.79, 57.26, 73.65, 2.89, 4.25, 4.77, 140.17; FABMS m/z 465 (M + H), 448 (M-H2O), 464 (M-H), 388 (M-Ph), 224 (M-C16H33O); HRFABMS cale, para C32H52NOMr 466.4049 (M + H), Se encontró Mr 466.4037.

La asignación de la configuración 2S, 3R se basa en la comparación de los desplazamientos químicos de los protones de bencilo en 60 a los valores de literatura para los diestereómeros syn y anti de 2-(N,N-dibencilamino)-3-pentanol. El isómero anti tiene una diferencia de desplazamiento químico de 0.29 ppm y el syn es de 0.52 ppm. La comparación de otros pares de syn-anti muestra que la escala para el isómero syn es de 0.44 a 0.54 ppm y la de anti de 0.05 a 0.29 ppm. El valor para 60 es de 0.29 ppm. (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (1): A un matraz de fondo redondo de 15 ml se le agregó 60 (88.2 mg, 0.189 mmoles) en 2 ml de MeOH y Pd (OH)2-C al 20% (11 mg). La mezcla se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante la noche. El catalizador se removió a través de filtración mediante un filtro de jeringa de 25 mm (membrana de nylon de 0.2 µm) y el filtro se lavó con 4 ml de MeOH. El solvente después se removió al vacío para 51.50 mg de un sólido blanco. El producto se purificó a través de cromatografía sobre un tubo de 6 ml de LC-Si SPE (90:10 CH2CI2/MeOH seguido por MeOH al 100%) para dar 49.47 mg (rendimiento del 92%) de un sólido blanco: p. f. 66-67°C; [a]260 +24.9 (c 1, CHCI3); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 0.89 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.05 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 1.201.56 (bm, 31H), 2.81 (qd, 1H, J, = 6.6 Hz, J2= 3.8 Hz), 3.42 (dt, 1H, J, = 8.8 Hz, J2= 3.8 Hz); 13C NMR (1 MHz) d 14.60, 16.82, 23.90, 27.40, 30.65, 30.90, 30.95, 30.96, 33.23, 34.13, 52.33, 76.16,; FABMS m/z 286.3 (M + H), 268.3 (M-OH), HRFABMS cale, para C18H40NOMr 286.3110 (M + H), Se encontró Mr 286.3109.

Una mezcla de los diaestereómeros de 3-hidroxi-2-(1 -metil-2-2-hidroxi-heptadecil)-isoindolin-1-ona (152, 22 mg) se separó a través de HPLC de ciano con hexano/2-propanol (98:2, 1 ml/min) para dar cuatro compuestos (152a-152d). La pureza de cada pico fue determinada por reinyección den HPLC. Anal. Cale. Para C 6H4 NO3: 418.3321 (M + H). Se encontró: 418.3321 HRFABMS). 152a: 4.2 mg; tr 13.3 min: 1H NMR (CDCI3) d 7.77 (1 H, d, 7.3), 7.58 (2H, m), 7.50 (1H, m), 5.91 (2H, s), 4.51 (1H, m), 3.78 (1H, m), 1.58 (2H, m), 1.40 (3H, d, 7.1), 1.24 (26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; relación relativa de diaestereómeros: 17:1:0:0 (152a:152b:152c:152d). 152b: 13.7 mg; tr 13.9 min; 1H NMR (CDCI3) d 7.70 (1 H, d, 7.3), 7.54 (2H, m), 7.47 (1H, m), 5.88 (2H, s), 4.37 (1H, m), 3.85 (1H, m), 1.52 (2H, m), 1.27 (3H, d, 7), 1.25 (26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 41, 400; relación relativa de diaestereómeros: 1:6.8:0:0 (152a:152b:152c:152d). 152c: 1.4 mg; tr 20.0 min; 1H NMR (CDCI3) d 7.78 (1H, d, 7.3), 7.59 (21 m), 7.51 (1H, m), 5.93 (2H, s), 4.12 (1H, m), 3.99 (1H, m), 1.58 (2H, m) 1.37 (3H, d, 7.0), 1.25 (261 m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; relación relativa de diaestereómeros: 0:2.5:45: (152a:152b:152c:152d). 152: 1.5 mg; tr 21.7 min; H NMR (CDCI3) d 7.77 (1 H, d, 7.3), 7.59 (21 m), 7.51 (11 m), 5.86 (2H, s), 4.12 (1H, m), 3.90 (1H, m), 1.58 (2H, m), 1.45 (3H, d, 6.6), 1.24 (26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; relación relativa de diaestereómeros: 0:1:2:21 (152a:152b:152c:152d).

Cada diaestereómero fue separadamente desprotegido a través del método de Osby y otros. Cada isómero se disolvió en 2-propanol/agua (6:1, 0.1 M para 152a y 152b, 0.7 M para 152c y 152d). Se agregó a cada solución borohidruro de sodio (5-10 equivalentes), la cual se agitó después a 25°C a 24 horas. Cada solución después se ajustó a un pH de 4.5 con ácido acético y se agitó a 80°C durante 24 horas más. Se agregó formiato de amonio para llevar el pH de cada solución por arriba de 7 y después el solvente se removió de cada uno a través de una corriente de nitrógeno. El residuo de cada uno se aplicó a una columna de SPE de sílice, la cual primero se lavó con hexano: 2-propanol (9:1) y después el producto se eluyó con 2-propanol. La 1H NMR indicó que 152a y 152d produjo 154 (1.15 mg, 40%, y 0.48 mg, 47% respectivamente), mientras que 152b y 152c produjeron 155 (3.35 mg, 42%, y 0.38 mg, 40%, respectivamente). 154: sólido blanco; TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1-BuOH/AcOH/H2O)Rf 0.48 (ninhidrina-positiva-rosa); IR (NaCI) 2919, 2851, 1563, 1466, 1406, 758 crtT1; FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44. Anal. Cale, para C18H40NO: 286.3110 (M + H). Se encontró 286.3115 (HRFABMS). 155: sólido blanco; TLC de sílice (3:12:2:2 CHCI3/1-BuOH/AcOH/H2O)Rf 0.50 (ninhidrina-positiva-rosa); IR (NaCI) 3281, 2917, 2849, 1568, 1520, 1470, 1412 ern"1; FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44, Anal. Cale, para C18H40NO: 286.3110 (M + H). Se encontró: 286.3109 (HRFABMS).

Acetilación Una porción de la fracción B (560 µg) se disolvió en 200 µl de anhídrido acético y 400 µl de piridina y se agitó a 25°C durante 4.5 horas, en ese tiempo, no se pudo observar ningún material de partida a través de TLC. El solvente se removió a través de una corriente para dar AcB: sólido blanquecino; TLC de sílice Rf 0.86 (3.12:2:2 CHCI3/1 -BuOH/AcOH/H2O, ácido fosfomolíbdico), 0.65 (9:1 CHCI3/MeOH, ácido fosfomolíbdico); IR (NaCI) 2922, 2853, 1741, 1651, 1547, 1460 1371, 1234, 1022, 970 cm"; FABMS m/z 370, 310, 268; CIMS m/z 426, 424, 412, 410, 398, 384, 370, 368, 364, 338, 324, 310, 165, 149, 139, 1, 121, 111, 97, 86, 61, 57, 55. Anal. Cale, para C22H14NO3:370.3321 (M + H). Se encontró: 370. 3326 (HRFABMS).

Triacetilesfingosina (133) En un procedimiento similar a Crode y Cardelina D-eryhro-esfínfosina (4, 3 mg,, 6.7 µmol, Sigma) en 1 ml de anhídrido acético y 2 ml de piridina, se agitó a 25°C durante 4.5 horas, en ese tiempo, no se pudo observar ningún material de partida a través de TLC. El solvente se removió a través de una corriente de nitrógeno para dar 133: sólido blanco; TLC de sílice Rf 0.86 (3:12:2:2 CHCI3/1- BuOH/AcOH/H2O, ácido fosfomolíbdico), 065 (9:1 CHCI3/MeOH, ácido fosfomolíbdico); FABMS m/z 580, 426, 366, 306, 264; CIMS m/z 468, 454, 426, 424, 394, 366, 364, 306, 264, 144, 85, 84, 83, 61. (2S, 3S)-2-acetamido-3-acetoxioctadecano (156) Se agitó (2S, 3S)-2-amino-3-octadecanol (154, 150 µg, 0.5 µmoles) en 50 µl de anhídrido acético y 100 µl de piridina a 25°C durante 5 horas, en ese tiempo no se pudo observar ningún material de partida a través de TLC. El solvente se removió a través de una corriente de nitrógeno para dar 156: sólido blanco; TLC de sílice Rf 0.86 (3:12:2:2 CHCI3/1 -BuOH/AcOH/H2O, ácido fosfomolíbdico); IR (NaCI) 3286, 2924, 2853, 1740, 1653, 1541, 1456, 1371, 1238 cm -1.

FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268. Anal. Cale, para C22H44NO3: 370.3321 (M + H). Se encontró: 370.3326 (HRFABMS). (2S, 3R)-2-acetamido-3-acetoxioctadecano (1157) Se agitó (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155, 750 µg, 2.6 µmoles) en 200 µl de anhídrido acético y 400 µl de piridina a 25°C durante 5 horas, en ese tiempo no se pudo observar ningún material de partida a través de TLC. El solvente se removió a través de una corriente de nitrógeno para dar 157: sólido blanco; TLC de sílice R{ 0.86 (3:12:2:2 CHCI3/1 -BuOH/AcOH/H2O, ácido fosfomolíbdico); IR (NaCI) 3289, 2917, 2849, 1728, 1637, 1545, 1464, 1369, 1240 cm-1; FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268. Anal. Cale, para C22H44NO3: 370.3321 (M + H). Se encontró: 370.3319 (HRFABMS).

Acetonida de Espisulosina 285 (146) Una porción de la fracción A (40 µg) se disolvió en 200 µl de acetona al cual se agregaron 20 µl de 0.1 N de ácido clorhídrico. Esta solución se agitó a 25°C durante 24 horas, después de lo cual el solvente se removió a través de una corriente de nitrógeno. FABMS indicó que una pequeña cantidad de la acetonida 146 se formó: M/z 592, 452, 438, 326.3430, 300, 286, 268. Anal. Cale, para C21H44NO: 326.3423 (M + H). Se encontró 326.3430 (HRFABMS). (4S, 5R)-4-metil-5-(n-pentadecil)-oxazolidinona (158) Se disolvió (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155, 750 µg, 2.6 µmol) en 100 µl de diclorometano al cual se agregó 1,1'-carbonildiimidazol (0.85 mg, 5.3 µmoles) y trietilamina (0.4 µl, 2.9 µmoles). La solución se agitó durante 5 horas y después el solvente se removió a través de una corriente de nitrógeno. El producto crudo 158 se analizó sin purificación: IR (NaCI) 36, 2919, 2851, 1742, 1713, 1551, 1470, 1395, 1321, 49, 1239, 1094, 1061, 1001, 768, 743, 664 cm'1; FABMS m/z 785, 623, 474, 406, 362, 328, 312, 286, 268. Anal. Cale, para C19H3sNO2:312.2903 (M + H). Se encontró: 312.2903 (HRFABMS).

Investigación Adicional de Cambios en Morfología de Célula Materiales Ácido lisofosfatídico (LPA), anticuerpos contra tubulina y floidina todos se obtuvieron de Sigma. El anticuerpo de anti-ratón de cabra marcado con rojo Texas y fluoresceína se obtuvo de Amersham (U. K.). El anticuerpo surgido contra la proteína Rho fue obtenida de Santa Cruz Biotechn.

Cultivo de Célula Se desarrollaron células Vero en un medio Eagle modificado con Dulbecco suplementado con suero de bovino fetal al 10%. Se agregaron espisulosina o LPA a estos cultivos a una concentración de 0.2 - 1.0 µg y 50-10 µM, respectivamente, de 4 a 24 horas. Las células fueron contadas con el procedimiento de hemocitómetro de exclusión de fármaco utilizando una solución de azul de Tripano al 0.4% en salina regulada en su pH con Hanks (Celis and Celis, "General Procedures for Tissue Culture in Cell Biology, a Laboratory Handbook" Academic Press Inc, Vol. 1, pág. 5-17).

Ejemplo A Espisulosina 285 ocasiona cambios en la morfología de célula Se incubaron células Vero con espisulosina 285 (0.5 µM) durante 4 horas. La Figura 3 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo A. La célula configurada fue alterada de poligonal (células no tratadas, panel a) a una forma fusiforme (panel b). El panel c representa una modificación superior del cultivo al cual se agregó espisulosina.

Ejemplo B El cambio en la morfología de célula se debe a un efecto en los microfilamentos de célula Con el fin de identificar la organización del microfilamento y la organización de microtúbulo en células tratadas con espisulosina, las células fueron teñidas con faloidina para detectar polímeros de actina, y un anticuerpo de antitubulina para detectar tubulina. Las células vero fuero incubadas en presencia (panel b, d) o ausencia (a, c) de 0.5 µM de espisulosina durante 4 horas. Las células desarrolladas en cubreobjetos se fijaron con metanol a -20°C (para anticuerpo de tubulina) o con parafolmaldehído al 4% en salida regulada en su pH con fosfato, PBS (p/v) para incubación de faloidína. En el segundo caso, las células se lavaron con 0.2% Tritón X100 en PBS. Los cubreobjetos se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo de tubulina (diluido 1/1000 en PBS) o con faloidina (1 mg/ml). Después de lavar con PBS, los cubreobjetos incubados con el anticuerpo de tubulina fueron cubiertos con anticuerpos de antiratón de cabra marcados con rojo Texas o fluoresceína (diluido a 1:50 en PBS). Los cubreobjetos se removieron con Mowiol y se almacenaron en la oscuridad a 4°C hasta observación. La Figura 4 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo B. El panel "a" representa células teñidas con faloidina (tinción de actina) y no tratadas con espisulosinas. El panel "b" representa células teñidas con faloidina y tratadas con espisulosina. El panel "c" representa células teñidas para tubulina y no tratadas con espisulosina. El panel "d" representa células teñidas para faloidina y tratadas con espisulosina. Existe una reducción dramática en actina en células tratadas con espisulosina, en comparación con células no tratadas. Bajo las mismas condiciones, la red de microtúbulo permanece en una forma polimerizada.

Ejemplo C Efecto de espisulosina en la proteína Rho La proteína de unión GTP pequeña, Rho, está involucrada en la formación de "fibras de tensión" de actina-miocina (may, A., Science, 279, 1998, pág. 509-514). Por lo tanto, la movilidad electroforética y la distribución celular de Rho se analizaron en células tratadas con espisulosina. La Figura 5 es un electroforetograma del Ejemplo C. En el panel A, cantidades equivalentes de proteína de un extracto de célula de células (b) no tratadas (A) o de células tratadas con 0.5 µM de espisulosina (20 horas) se fraccionaron a través de electroforesis en gel y se tiñeron sobre papel de nitrocelulosa para analizar la cantidad de la proteína. En el panel B, el experimento se realizó como se hizo anteriormente, excepto que el homogenato fue fraccionado en una fracción en partículas (membrana, "M") y fracción soluble ("S").

Se realizó el fraccionamiento subcelular colocando a las células en un regulador de pH hipotónico (0.25 M sacarosa, 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 µg/ml de aprotinina, leupeptina y pestatina), y se Usaron con Douce. El homogenato primero se centrífugo a 750 g durante 5 minutos para remover los núcleos y células rotas, y el sobrenadante además se centrífugo a 30,000 g durante 1 hora (4°C) para aislar la fracción en partículas en pella (fracción de membrana putativa) y un sobrenadante. Las diferentes fracciones fueron caracterizadas a través de electroforesis y tinción Western utilizando un anticuerpo contra la proteína Rho. No se observó ningún cambio importante en la cantidad o movilidad de Rho en el tratamiento de células con espisulosina. Sin embargo, se observó una reducción en la proporción de Rho asociada con la fracción en partículas.

Ejemplo D Efecto de ácido lisofosfatídico (LPA) en la acción de espisulosina Se sabe que LPA incrementa el nivel de fibras de tensión en células a través de la activación de la proteína Rho. El efecto de LPA sobre células tratadas con espisulosina y células no tratadas, fue examinado. Se incubaron células Vero en ausencia (a) o presencia (b) de 10 µM LPA durante 2 horas, o en presencia (c) de 0.5 µM de espisulosina durante 20 horas, o en presencia (d) de primero 10 µM LPA (2 horas) y después con 0.5 µM de espisulosina durante 18 horas más. La Figura 6 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo D. el panel B indica el efecto de LPA para incrementar el nivel de actina. La incubación de células Vero con espisulosina durante 24 horas da como resultado la aparición de células redondas, ver panel c. Estas células se separaron del plato y dado de cultivo. La adición de LPA antes de espisulosina evita el cambio morfológico promovido por espisulosina.

Datos in vivo Ejemplo E Efecto de Espisulosina 285 in vivo Se probó espisulosina 285 en estudios in vivo contra modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humana (PC-3) y cáncer renal humano (MRI-H-121). Estos modelos utilizaron tumores humanos sólidos subcutáneamente implantados que crecieron y se incrementaron el volumen con el tiempo. El volumen medio del crecimiento de tumor en animales de control proporciona la base para comparación. Para compuestos activos, el desarrollo de tumor es inhibido ya sea completamente (%T/C valores <1%, o negativo), o parcialmente (>1% T/C - 50% T/C). Un nivel de actividad que es menor que 40% T/C se considera estadísticamente importante. Las dosis de espisulosina utilizadas se dieron a la dosis máxima tolerada, no letal (MTD), 1/2 MTD y 1/4 MTD. El suministro de fármaco fue a través de la ruta intraperitoneal.

Cáncer de próstata humano PC-3 Compuesto Dosis Total % T/C Día Comentario (mg/kg) Espisulosina 285 9.990 -21% 11 Estasis (remisión completa) Espisulosina 285 5.010 -1% 11 Estasis (remisión completa) Espisulosina 285 2.499 223% 15 Control 100% 15 Cáncer renal humano MRI-H-121 Compuesto Dosis Total % T/C Día Comentario (mg/kg) Espisulosina 285 9.990 28% 11 inhibición (remisión parcial) Espisulosina 285 5.010 35% 11 inhibición (remisión parcial) Espisulosina 285 2.499 43% 15 Control 100% 15 La espisulosina 285 es efectiva contra ambos tipos de tumores, reduciendo significativamente el tamaño de tumor en el caso de cáncer de próstata humana de modelo PC-3 a dosis más alta. La espisulosina 285 reduce el crecimiento del cáncer renal humano, con efectos que continúan hasta algunas semanas después de la última dosis del fármaco.

Ejemplo F Se realizó una clasificación in vitro expandida de espisulosina 285 contra una serie de diferentes líneas de célula. Se obtuvieron los siguientes datos: Categoría Línea Tumor IC50 índice Terapéutico CV-1 Sólido SK-HEP-1 Hígado 3.51 E-15 7863 PANC-1 Páncreas 1.71 E-12 16 HT-29 Colon 2.56 E-12 11 786-0 Renal 2.75 E-12 10 FADU Faringe 4.99 E-12 6 Hs 746t Estómago 7.89 E-12 3 SK-OV-3 Ovario 1.40 E-11 2 MX-1 Mamario 3.89 E-11 1 RAMOS Burkitts 4.82 E-11 1 P3HR1 Burkitts 6.73 E-11 0 SW684 Fibrosarcoma 1.05 E-09 0 Línfoma U-937 Linfoma 1.96 E-11 1 H9 Linfoma 3.10 E-11 1 Leucemia HL60 Leucemia 8.50 E-12 3 ARH77 Leucemia 1.36 E-12 2 K562 Leucemia 1.57 E-11 2 CCRF-SB Leucemia 1.05 E-11 0 Normal CV-1 Fibroblastos de riñon 2.76 E-11 1 La escala de potencias IC50 contra las líneas de célula de tumor son de nanomolares, 1.05 E-09 nM a fentamolares, 3.51 E-15 fM. Es excepcional ir más allá de la escala de nM y pM para encontrar un fármaco el cual tenga actividad en la escala fM. Las actividades contra los tumores sólidos generalmente fueron del registro de 1 más potentes que contra las leucemias y linfomas.

Entre los tumores sólidos, el crecimiento más lento fue el más sensible, culminando con el hepatoma SK-HEP-1 de desarrollo muy lento. Los mejores índices terapéuticos comparados son la línea de célula normal CV-1 fueron vistos con los tumores sólidos de crecimiento lento, ya que la potencia IC50 (2.76 E-11) fue comparable con leucemia/linfomas. El tumos sólido Tis varió de 1-20 unidades y TI para el hepatoma fue de un registro de >3. La línea de célula de tumor renal estuvo en el grupo más activo, potencias pM, que se correlaciona muy bien con los datos de xenoinjerto in vivo.

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La presente invención ha sido descrita con detalle, incluyendo sus modalidades preferidas. Sin embargo, se apreciará que aquellos expertos en la técnica, después de considerar la presente descripción, pueden hacer modificaciones y/o mejoras en esta invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica que contiene un compuesto de alcano o alqueno de cadena recta, de cadena larga, el cual tiene un grupo 2-amino y un grupo 3-hidrox¡, junto con vehículo farmacéuticamente aceptable.

2.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es un 2-amino-3-hidroalqueno substituido o un 2-amino-1,3-hidroxialqueno.

3.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el compuesto es un alcano o alqueno de 16 a 24 átomos de carbono, substituido.

4.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el compuesto es un alcano de 18 a 20 átomos de carbono, substituido.

5.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el compuesto es un 2-amino-3-hidroxialcano de 18 átomos de carbono.

6.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona de: espisulosina 285 (1), n = 12; y espísulosina 299 (2), n = 13; espisulosina 313 (3), n = 14; esfingosina (4), n = 12 y nonadeca-4-esfingenina (5), n = 13; y esfinga-4, 10-dieno (6).

7.- Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual es para utilizarse en el tratamiento de cáncer.

8.- Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual es para utilizarse en el tratamiento de cáncer seleccionado de cáncer de pecho, cabeza y cuello, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, esófago, hígado, colon, tiroides, melanoma riñon, testicular, leucemia, ovárico, gastrointestinal y linfoma.

9.- Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la cual es para utilizarse en terapia dirigida al endotelio vascular para el control de vascularización de tejido y tumor.

10.- Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 , en donde el compuesto es espisulosina 285 y la composición es para utilizarse en el tratamiento de un tumor sólido. 1 1 .- Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el compuesto es espisulosina 285 y la composición es para utilizarse en el tratamiento de un tumor de lenta proliferación . 12.- Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto actúa para alterar la actividad de la proteína Rho . 13.- Una com posición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con otro fármaco para utilizarse en terapia de combinación . 14.- Un compuesto de alcano o alqueno de cadena larga , de cadena recta, el cual tiene un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi, para utilizarse en un método de terapia. 15.- El uso de un com puesto de alcano o alqueno de cadena larga, de cadena recta, el cual tiene un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi en la preparación de una composición para utilizarse en el tratam iento de cáncer. 16.- El uso de espisulosina en la preparación de un medicamento para el tratam iento de cáncer. 17.- Un método para tratar un mam ífero afectado por un tumor maligno, el cual comprende adm inistrar al individuo afectado una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo, el cual es un compuesto alcano o alqueno de cadena larga , de cadena recta , el cual tiene un grupo 2-am ino y un grupo 3-hidroxi . 18.- Un extracto bioactivo de la almeja Spisula polynyma. R E S U E La investigación de la actividad de los extractos de Spisula polynyma ha conducido a compuestos de alcano o alqueno de cadena larga, de cadena recta, antitumorales, los cuales tienen un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi.