CZ20003706A3 - Spisulosinové sloučeniny s protinádorovou aktivitou - Google Patents

Abstract

Testování aktivity extraktů škeble Spisula polynyma vedlo k nalezení protinádorových alkanových nebo alkenových sloučenin s dlouhým přímým řetězcem, které obsahují 2- aminoskupinu a 3-hydroxyskupinu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických přípravků na bázi spisulosinových sloučenin. Dále se týká léčby nádorů a nových cytotoxických sloučenin a farmaceutických přípravků pro použití proti nádorům. Jeden aspekt vynálezu se týká protinádorových sloučenin z mořských organismů.

Dosavadní stav techniky

Izolace bioaktivních sloučenin z mořských organismů byla vždy předmětem zájmu.

Typické postupy zahrnují screening in vitro pro testování hrubých extraktů ke zjištění antimikrobiální, antivirální a cytotoxické aktivity. Ilustrativní příklady známých bioaktivních sloučenin z mořských zdrojů zahrnují bryostatiny, ekteinascidiny a dále didemniny; didemnin B, též známý jako aplidin, je prvním klinicky testovaným přírodním produktem z mořských zdrojů.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nových farmaceutických přípravků obsahujících alkan nebo alken s dlouhým přímým řetězcem a 2-aminoskupinou a 3-hydroxyskupinou ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem. Typickou sloučeninou tohoto druhu je 2-amino-3-hydroxyalkan nebo 2-amino-l,3-dihydroxyalken. Tyto sloučeniny jsou s výhodou substituované alkany nebo alkeny C16-C24, s výhodou substituované alkany, výhodněji substituované alkany C18-C20 a nejvýhodněji 2-amino-3-hydroxyalkan C₁₈. Substituované alkeny jsou s výhodou substituované mono- nebo dialkeny, s výhodou substituované alkeny C18-C20. V jednom provedení podle vynálezu mají sloučeniny v části řetězce následující stereochemii:

OH

NH₂ • · φ · φ φ φ φ

Vynález se týká zvláště přípravků obsahujících bioaktivní základ sfíngoidního typu, základ na bázi spisulosinu 285, 299 a 313 (obecný vzorec I), sfíngosinu, zvaného též 4-sfingenin nebo oktadeka-4-sfingenin (obecný vzorec H) a dvou příbuzných sloučenin: nonadeka-4-sfíngeninu (homolog s řetězcem delším o jeden uhlík, obecný vzorec Π) a sfinga-4,10-dienu (dehydrosfíngosin, obecný vzorec IU).

Sloučeniny podle vynálezu tedy zahrnují jednu nebo více následujících výhodných sloučenin: sloučeniny obecného vzorce I

CH3(CH2)n kde spisulosin 285 (1) má n = 12, spisulosin 299 (2) má n = 13 a spisulosin 313 (3) má n = 14; dále sloučeniny obecného vzorce Π

OH

CHjťCHdň^^^Y^OH ^(Π)

ŇHz kde sfingosin (4) má n = 12 a nonadeka-4-sfingenin (5) má n - 14 a dále sfinga-l,4-dien (6) obecného vzorce III

NHo (I)

Výhodná sloučenina spisulosin 285 je známa z literatury. Poprvé byl spolu se svým syn diastereoizomerem syntetizován chorvatskými vědci při určování absolutních konfigurací lipidových bází s dvěma a více asymetrickými uhlíky - viz Proštenik, M.; Alaupovic, P.: Croat. Chem. Acta. 1957, 29. 393.

Sloučeniny v přípravcích podle vynálezu jsou novými sloučeninami.

• · • · »··· · ·

Spisulosin 285, spisulosin 299 a spisulosin 313 vykazují unikátní cytotoxicitu proti myším lymfocytním leukemickým buňkám L1210. V množství pokusů s L1210 byla pozorována výrazná morfologická alterace. Tento efekt byl popsán již v dřívější prozatímní americké patentové přihlášce č. 60/043,326. Tato patentová přihláška nezahrnuje žádný nárok na tento efekt na L1210 jako takový; mimoto některé předběžné výsledky ukazují, že sloučeniny jako spisulosin 285 mohou být vůči leukemickým nádorům neaktivní.

Syntetický vzorek spisulosinu 285 byl použit proti leukemickým buňkám L1210 a vykazoval cytotoxicitu i schopnost morfologické alterace těchto buněk.

Tabulka I. Inhibice a morfologická alterace buněk L1210

Koncentrace (pg/l)*	% cytotoxicity	% alterovaných buněk
0,5	100	97
0,25	99	100
0,1	99	62
0,05	96	71
0,025	90	21
0,01	45	1

* % alterováných buněk je podíl živých buněk

Spisulosin 285 je in vitro aktivní i vůči dalším liniím nádorových buněk včetně P-388 (0,01 pg/l), A-549 (0,05 pg/l), HT-29 (0,05 pg/l) a MEL-28 (0,05 pg/l).

Ve zvláště výhodném provedení se vynález týká použití spisulosinu 285 a příbuzných sloučenin při léčbě všech typů rakoviny, např. rakoviny prsu, prostaty, močového měchýře, pankreatu, plic, jícnu, hlasivek, jater, tlustého střeva, štítné žlázy, melanomů, rakoviny ledvin, varlat, leukémie, vaječníků, gastrointestinálního traktu, hepatocelulámích karcinomů a vaskulámě endoteliálního systému. Další typy rakoviny jsou dobře známy odborníkům. Použití spisulosinu 285 a příbuzných sloučenin je výhodné při léčbě kompaktních a pomalu proliferujících nádorů; zvláště výhodné je použití proti nádorům prostaty, plic, jater, ledvin, endokrinních žláz a vaskulámě endoteliálního systému. V jednom aspektu jsou přípravky orientovány na léčbu vaskulámě endoteliálního systému pro kontrolu tkání a vaskularizace nádorů.

Vynález se týká bioaktivních sloučenin se zvláštními protinádorovými účinky, které lze proto využít jako léčebné přípravky pro savce, zvláště člověka. Další aspekt vynálezu ·· fe· · fefe fefe fefe • · · · · · · fe fe ·· fe • · · fe · fefefefe • fefefe fe fefefe·*· • fefe fefe fefefefe zahrnuje farmaceutické přípravky s obsahem zde definovaných aktivních sloučenin a způsob použití těchto přípravků.

Aktivní sloučeniny podle vynálezu vykazují protinádorovou aktivitu. Vynález se tedy týká i způsobu léčby savců postižených zhoubným nádorem citlivým k těmto sloučeninám, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství aktivní sloučeniny, jejich směsi nebo z nich vyrobených farmaceutických přípravků postiženému jednotlivci. Vynález se též týká farmaceutických přípravků obsahujících jako aktivní složku jednu nebo více sloučenin podle vynálezu a způsobů jejich přípravy.

Příklady farmaceutických přípravků zahrnují jakékoliv pevné (tablety, pilulky, kapsle, granule atd.) nebo kapalné (roztoky, suspenze nebo emulze) přípravky vhodné pro orální, místní nebo parenterální podání. Tyto přípravky obsahují čistou sloučeniny nebo sloučeninu ve směsi s jakýmkoliv nosičem nebo farmaceuticky přijatelnou sloučeninou. Tyto přípravky musí být při parenterálním podání sterilní.

Přípravky podle vynálezu lze podávat jakýmkoliv vhodným způsobem, např. intravenózní infúzí, orálně, intraperitoneálně nebo intravenózně. Intravenózní podání lze provést během libovolně dlouhého časového intervalu, tj. 1 až 4 hodiny, v případě potřeby I déle ve vhodných intervalech jako 2 až 4 týdny. Farmaceutické přípravky s obsahem spisulosinu lze podávat v liposomové nebo nanosferální enkapsulaci, jako přípravky s kontinuálním uvolňováním nebo jakýmkoliv jiným obvyklým způsobem. Správné dávkování farmaceutických přípravků podle vynálezu se liší v závislosti na konkrétním přípravku, způsobu podání a konkrétním místu, hostiteli a cílové bakterii nebo typu nádoru. Je třeba zohlednit i další faktory jako věk, tělesná hmotnost, pohlaví, strava, doba podání, rychlost vylučování, stav hostitele, směs léků, citlivost a vážnost onemocnění. Podávání lze provádět kontinuálně nebo periodicky v rámci maximální tolerované dávky.

Sloučeniny ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu lze dodat ve formě prekursoru léčiva, který se po podání přemění neboje metabolizován na aktivní látku.

Přípravky podle vynálezu lze podávat s jinými léky při aplikaci kombinované terapie. Tyto jiné léky tvoří buď součást téhož přípravku, nebo jsou dodávány odděleně pro podávání ve stejné chvíli, nebo v různých dobách. Povaha těchto léků není zvlášť omezena; vhodné příklady zahrnují následující látky:

« · • ·

a) Léky s antimyotickým účinkem, zvláště léky mající za cíl cytoskeletální prvky včetně mikrotubulových modulátorů jako taxanové léky (taxol, paklitaxel, taxoter, docetaxel), podofylotoxiny nebo barvínkové alkaloidy (vinkristin, vinblastin)

b) Antimetabolitové léky, např. 5-fluoracyl, cytarabin, gemcitabin, purinové analogy jako pentostatin, methotrexat

c) Alkylační Činidla jako dusíkaté yperity (cyklofosfamid nebo ifosfamid)

d) Léky mající za cíl DNA jako antracyklinové léky adriamycin, doxorubicin, farmorubicin nebo epirubicin

e) Léky mající za cíl topoisomerasy jako etoposid

f) Hormony a antagonisti hormonů jako estrogeny, antiestrogeny (tamoxifen a příbuzné sloučeniny) a androgeny, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyprotron nebo oktreotid

g) Léky mající za cíl signální transdukcí v nádorových buňkách včetně derivátů protilátek jako herceptin

h) Alkylační činidla jako léky na bázi platiny (cis-platina, carboplatina, paraplatina) nebo nitrosoureasy

i) Léky potenciálně ovlivňující metastázu nádorů jako inhibitory matrixových metaloproteas

j) Genová terapie a činidla měnící smysl otáčení

k) Protilátková terapeutika

l) Další bioaktivní sloučeniny mořského původu, např. ekteinascidiny jako ET-743 nebo didemniny jako aplidine

Vynález se týká i sloučenin vhodných pro použití ve způsobu léčby podle vynálezu a použití sloučenin v přípravcích podle vynálezu při léčbě rakoviny.

Spisulosin 285 má vliv na morfologii buňky. Věro buňky, na něž byl aplikován spisulosin, měly redukovanou mikrofilamentální strukturu, jak bylo zjištěno barvením buněk ošetřených spisulosinem faloidinem, který barví aktin v mikrofilamentech. Spisulosin ovlivňuje též distribuci malého GTP vázajícího proteinu Rho, tento účinek lze však snížit nebo eliminovat předběžným ošetřením aktivátorem Rho s názvem LPA (Mackay a Halí, J. Biol. Chem., 273, 20685-20688, 1998).

Bez přílišného teoretizování lze předpokládat, že mechanismus účinku spisulosinu zahrnuje ovlivnění funkce malého GTP vázajícího proteinu Rho, možná mechanismem aktivace LPA. Rho se účastní tvorby stresových vláken (Halí, A., Science 279, 509-514, • · • · · · » tftf • tftf · · · · · · tftf tf • tftf · · tftftftf tftftftf · tftftf tftftf • tftf tftf tftftftf • tftftf ·» ······· tftf tftf

1998) a má funkci při kontrole buněčné adhese a pohyblivosti reorganizaci aktinového cytoskeletonu (Itoh a kol., Nátuře Medicine, sv. 5, č. 2, 1999). Adhese nádorových buněk k vrstvám hostitelských buněk a následná transcelulámí migrace jsou klíčovými kroky v invazi a metastáze nádorů. Spisulosin snižuje rozvoj rakoviny účinkem na buněčný cytoskeleton, a to tak, že ovlivňuje (snižuje) množství mikrofilament v buňce inhibičním účinkem na protein Rho. Rho též spouští G1 fázi buněčného cyklu. Ovlivnění Rho tedy zabraňuje i transformaci buňky zastavením buněčného cyklu. Vynález se týká tedy použití spisulosinu ve výrobě přípravků pro léčbu rakoviny, kde spisulosin ovlivňuje aktivitu Rho proteinu.

LP A, aktivátor Rho, zabraňuje účinku spisulosinu na tvorbu mikrofilament. Specifický cíl působení spisulosinu sice není znám, pozorované snížení aktinových mikrofilament v buňkách ošetřených spisulosinem a lipidová struktura spisulosinu naznačují, že spisulosin by mohl být antagonistou receptoru pro LPA a zabraňovat interakci LPA se svým receptorem za současné aktivace proteinu Rho a produkce mikrofilament.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu byly původně izolovány ze Spisula polynyma, což je jedlá škeble známá též jako Stimpsonova příbojová škeble nebo atlantická příbojová škeble. Patří do podČeledi Mactrinae, čeledi Mactridae, nadčeledi Mactroidea, řádu Veneroida, podtřídy Heterodonta, třídy Bivalvia, kmen Mollusca. Spisula polynyma byla původně nalezena u pobřeží Japonska, kde se nazývá hokkigai a používá se pro přípravu sushi. Nyní migrovala přes Beringův průliv podél Grónska a Newfondlandských ostrovů do Atlantického oceánu. Spisula polynyma má šedobílou škebli dlouhou 7-10 cm. Živočich je špinavě bílý kromě jazyka, který je v živé škebli purpurový, ale po uvaření je zářivě červený.

Vynález se týká aktivních extraktů ze škeble Spisula polynyma. Jedno provedení podle vynálezu se týká nových sloučenin izolovaných ze škeble Spisula polynyma a použití cytotoxických sloučenin izolovaných z nijako protinádorové sloučeniny.

Pro stanovení biologické aktivity byla jedna škeble homogenizována ve směsi methanolu a toluenu v poměru 3:1. K hrubému extraktu byl přidán roztok chloridu sodného, takže došlo k rozdělení extraktu mezi vodnou a toluenovou vrstvu. Vodná vrstva byla dále extrahována toluenem, dichlormethanem, ethylacetátem a 1-butanolem. Všechny tyto extrakty byly použity proti buňkám L1210; byla pozorována významná cytotoxicita u výchozího hrubého extraktu, toluenových a dichlormethanových extraktů a nižší aktivita ve zbývajících třech frakcích.

• · · ·

Tabulka II. Cytotoxicita hrubého extraktu Spisula polynyma na buňkách L1210^a,b

Koncentrace (pg/ml)
Extrakt	250	125	50	25	12,5	5
Hrubý extrakt	98*	98*	92	25	0	0
Toluen	100*	100*	100*	25	13	13
CH2C12	100*	100*	100*	91	20	13
EtOAc	98*	98*	92*	0	0	0
1-BuOH	83	33	0	0	0	0
Vodná fáze	94	75	0	0	0	0

(a) cytotoxicita vyjádřena jako % inhibice růstu (b) případy označené * vykazovaly aktivitu buňky s výrůstkem (c) vodný extrakt byl stanovován při koncentraci 700, 350,140, 70, 35 a 14 pg/ml

Tyto extrakty byly aplikovány proti viru Herpes simplex typu I (HSV-1) a buňkám opičích ledvin CV-1 (100 pg/6,35 mm disk), nebyla však pozorována žádná aktivita. Tyto extrakty nevykazovaly též žádnou mikrobiální aktivitu proti Penicillium melinii (dříve P. atrovenetum) a Micrococcus luteus (dříve Sarcina lutea, oba při 500 pg/12,7 mm disk). Později byly purifikovanější extrakty použity proti Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae a Escherichia coli - žádná aktivita nebyla pozorována.

Pro přípravu spisulosinových sloučenin lze použít i syntetické metody, zvláště pro spisulosin 285, 299 a 313 (obecný vzorec I).

Výhodné syntetické postupy jsou založené na přidání organometalických sloučenin k N,N-dibenzylaminoaldehydům za vzniku β-aminoalkoholů s vysokou stereoselektivitou, viz Andres a kol.: Org. Chem. 1996, 61, 4210 a Reetz a kol.: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1987, 26, 1141. Kontrolovaný přídavek nechelatačních Grignardových činidel nebo organolithných sloučenin dává vznik anti-diastereomerům, kontrolovaný přídavek chelatačních organozinečnatých činidel dává přednostně vznik syn-diastereomerům.

Tento výhodný syntetický postup pro vznik sloučenin obecného vzorce I je ilustrován schématem I:

O

ΜβΟ^γ^

NBnj

O

MeCT^Y^'

NHaCI

BnBr. K2CO₃, ch₃cn

80-/.

LAH, THF

3h. 65 'C, 12h rt •90%

NBnj (COCI)₂,

DMSO, -73 Č

98%

ANBnj

Schéma I

SO

CH₃(CH₂),₄MgBř_t et₂o

49%

NBnj

Hj/Pd(OH)i

MeOH

92%

Jak je popsáno ve schématu I, β-aminoaldehyd 50 lze připravit z methylesteru L-alaninu dibenzylací aminoskupiny benzylbromidem a uhličitanem draselným a následnou redukcí lithiumaluminiumhydridem na N,N-dibenzylaminoalkohol 40. Swernova oxidace látky 40 dává vznik látce 50 ve vysokém výtěžku. Látku 50 lze použít bez dalšího čištění, a vyhnout se tak rozkladu. Přídavkem Grignardova činidla 50 vznikne s vysokou selektivitou anti-diastereomer 60. Sloučeninu 60 lze snadno purifikovat, např. flashovou chromatografií a HPLC. Odchránění látky 60 hydrogenolýzou na Pearlmanově katalyzátoru dává ve vysokém výtěžku a v dobrém celkovém výtěžku sloučeninu 1. Sloučeniny 2 a 3 lze snadno připravit prodloužením řetězce Grignardova činidla; ostatní sloučeniny podle vynálezu lze též připravit vhodným výběrem Grignardova činidla.

Stručný popis výkresů

Výkresy IA, IB, 1C, ID, IE a ÍF ilustrují morfologie buněk pozorované v pokusech s extrakty Spisula polynyma. Výkres IA představuje normální buňku; výkres IB představuje typickou buňku s výrůstkem; výkres 1C představuje netypickou buňku s výrůstkem; výkres φφ ·· • · φ φ *

φφ φφ

ID představuje buňku s více než dvěma výrůstky; výkres IE představuje typickou zduřelou buňku; výkres IF představuje zduřelou buňku s výrůstkem.

Výkres 2 znázorňuje schéma pro přípravu sloučenin podle vynálezu z extraktů škeble Spisula polynyma.

Výkres 3 je mikrofotografie výsledků z příkladu A.

Výkres 4 je mikrofotografie výsledků z příkladu B.

Výkres 5 je elektroforeogram příkladu C.

Výkres 6 je mikrofotografie výsledků z příkladu D.

Co se týče výkresu 1, při testování buněk L1210 se některé buňky změnily z kulovitých na vejcovité s dlouhými výrůstky svírajícími úhel asi 180° (viz výkres IB). Při testování těchto extraktů bylo pozorováno i několik dalších forem včetně buněk s výrůstky svírajícími jiný úhel než 180° (viz výkres IB), buněk s více než dvěma výběžky (viz výkres ID), zduřelých buněk (viz výkres IE) a buněk, jejichž zduřelé místo nahrazuje jeden z výběžků (viz výkres IF). Tvar se dvěma ostrými výběžky proti sobě byl však převažující a charakteristický. Tento typ morfologické změny nebyl dříve během screeningu více než 1000 mořských extraktů pozorován.

Detailní popis vynálezu

Izolace spisulosinů 285, 299 a 313

Pro účely tohoto vynálezu byly sbírány škeble Spisula polynyma v hloubce -110 stop ze škeblového dna na východním okraji Stell wagonového prahu u pobřeží Nové Anglie od blízkosti Gloucesteru a Massachussets k Maine. Byly uloveny živé společností New England Clam Corporation (dříve New Dawn Seafoods, Inc.) a hned zmraženy.

Bylo postupováno podle purifikačního schémata podobného extrakčnímu postupu popsanému výše pro původní testování bioaktivity. Prvních 35 škeblí bylo rozmraženo, skořápky škeblí byly odstraněny a bylo získáno 1,9 g (mokrá hmotnost). Tento materiál byl ponechán stát ve směsi methanol:toluen 3:1 a po několika hodinách byl zfiltrován. Tento krok byl opakován a následovala homogenizace a extensivní extrakce tímtéž rozpouštědlem za vzniku hrubého extraktu. K hrubému extraktu byl přidán IM roztok chloridu sodného, což způsobilo rozdělení extraktu do dvou vrstev. Nižší vodná vrstva byla dále extrahována φφ

φ • φ toluenem a toluenové extraktu byly spojeny. Výsledná vodná vrstva byla pak extrahována dichlormethanem, jak popisuje výkres 2.

Toluenový extrakt se rozdělil mezi methanol a hexan. Cytotoxicita a alterace buněk byly pozorovány výlučně v methanolové frakci. Takto získané methanolové extrakty byly naneseny na sloupec silikagelu pro flashovou chromatografii a eluovány stupňovým gradientem chloroform/ methanol (100:1, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100). Hlavní cytotoxická aktivita a schopnost alterace buněk vykazovaly později eluované frakce, i když i dříve získané frakce vykazovaly určitou cytotoxicitu, nevytvářely však buňky s výběžky. Později eluované frakce byly purifikovány flashovou chromatografii na silikagelu za použití směsi chloroform :1-butanol .-kyselina octová:voda v poměru 8:12:1:1. Před odstraněním rozpouštědla byly frakce neutralizovány hydrogenuhličitanem sodným, aby se zabránilo případnému rozkladu při zkoncentrování v kyselině. Tento postup dal vznik třem bioaktivním frakcím.

Při dřívějších pokusech o izolaci bylo pozorováno, že bioaktivita se nevymyje při extrakci na pevné fázi (SPE) na sloupci kyanidu methanolem, ale cytotoxicita se vymyje směsí methanol:0,01M amoniumformiat v poměru 3:1 (0,5 ml/min). To bylo potvrzeno chromatografii malého množství bioaktivní frakce na kyanidovém sloupci HPLC tímtéž systémem rozpouštědel a pak opakováním injekce za stejných podmínek při nahrazení roztoku amoniumformiatu vodou. Chromatogramy vypadaly identicky až na pík eluovaný po

15,6 minutách, který byl pozorován v prvním případě.

Každá ze tří bioaktivních frakcí získaných z druhé flashové chromatografie byla purifikována na kyanidovém sloupci HPLC za týchž podmínek (ale eluční rychlost 1 ml/min) za vzniku 3 sérií bioaktivních frakcí. Amoniumformiat byl odstraněn na sloupci C-l8 SPE promytím vodou a následnou elucí methanolem. Hlavní cytotoxicita a schopnost morfologické alterace každé série (frakce A, B a C) byly detekovány v píku popsaném výše. Aktivita se však rozložila do většiny frakcí. Pomocí TLC na silikagelu (chloroform: l-butanol:kyselina octová:voda v poměru 3:12:2:2) bylo stanoveno, že frakce A (0,4 mg) obsahovala skvrnu (Rf=0,47) růžovějící působením ninhydrinu. Frakce B (1,3 mg) obsahovala touž skvrnu a ještě jednu poněkud níž (Rf=0,44, červenající působením ninhydrinu) a frakce C (0,2 mg) obsahovala obě tyto skvrny a ještě třetí skvrnu (Rf=0,34, rudou působením ninhydrinu). Všechny tyto skvrny vykazovaly dobrou cytotoxicitu a schopnost tvořit buňky s výběžky. Frakce A byla přitom poněkud aktivnější než frakce B a výrazně aktivnější než • · · · · · frakce C. Z toho vyplývá, že skvrna migrující nejvýš na TLC přísluší sloučenině (sloučeninám) způsobujícím morfologickou alteraci L1210 buněk. Tyto frakce nebyly dále purifikovány, ale analyzovány jako směsi. Kvantitativní výsledky biostanovení jsou popsány níže.

Jiný pokus měl stanovit, zda některý orgán Spisula polynyma obsahuje všechnu v

bioaktivitu nebo její většinu. Zívá škeble byla znecitlivěna diethyletherem a rozdělena na 9 částí: noha, trávicí systém, gonády, nálevka, žábry, srdce, plášť, přídatné svaly a zbytek viscerální hmoty (s odstraněnou nohou, trávicím systémem a gonádami). Tyto orgány byly identifikovány porovnáním s ilustracemi jiných škeblí. Každý orgán byl homogenizován ve směsi methanol toluen 3:1 a výsledný extrakt byl rozmělněn v dichlormethanu a methanolu pro odstranění solí. Všechny extrakty vykazovaly cytotoxicitu (viz tabulka), jenom extrakty žáber a gonád vykazovaly silnou schopnost morfologické alterace. Podobně i extrakty z trávicího systému a zbytku viscerální hmoty vykazovaly slabou schopnost tvořit alterované buňky s výběžky, patrně z důvodu nedokonalé separace od gonád. Nedostatek schopnosti tvořit alterované buňky s výběžky byl patrně způsoben buď nedostatkem spisulosinů 285, 299 a 313, nebo z jejich mnohem nižší koncentrace.

V dalším pokusu byla noha škeble Spisula polynyma krátce vařena a pak podobným způsobem extrahována. Pak vykazovala cytotoxicitu, ale ne schopnost morfologické alterace. Když byl větší vzorek vařeného materiálu intenzivněji extrahován, v pokusu s buňkami L1210 bylo pozorováno určité množství buněk s výběžky. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) extraktů z trávicího systému a gonád na silikagelu ve směsi chloroform: 1-butanol:kyselina octová:voda v poměru 3:12:2:2 (100 gg) vykazovala skvrnu pozitivně reagující na ninhydrin s Rf-0,49.

Tabulka III. Bioaktivita jednotlivých orgánů Spisula polynyma

	250 gg/ml	125 gg/ml	50 gg/ml
%	%	%	%	%	%
Orgán	Inhibice3	Alterace	Inhibice3	Alterace	Inhibice3	Alterace
Noha	100	0, vm.b	100	0, mort.	93	0,0
Trávicí systém	96	0,18	62	0,0	0	0,0
Gonády	prec.c	přec.	99	56,100	90	32,100
Nálevka	100	vm.,vm.	50	0,0	0	0,0
Žábry	100	vm.,vm.	100	50, vm.	98	100,93
Srdce	100	vm.,vm.	přec.	0,0	38	0,0

• · • · • ·

Plášť	100	0,0	99	0,0	95	0,0
Přídatné svaly	100	vm.,vm.	100	0,0	95	0,0
Viscerální hmota	100	0, vm.	100	2,vm.	94	0,0
Uvařená nohad	100	0	100	0	97	0
Uvařená noha®	91	21	25	0	0	0

Vysvětlivky:

^a Podíl alterovaných buněk naměřený po 58 až 82 hodinách po začátku pokusu ^b vm. = všechny buňky mrtvé ^c přec. = precipitace materiálu vytvořila zákal, který znemožnil kvantitativní stanovení ^d Podíl alterovaných buněk naměřený po 72 hodinách od začátku pokusu ^e Tento vzorek byl extrahován podobným způsobem, jímž byl získán hrubý extrakt při izolaci frakcí A-C. Podíl alterovaných buněk byl naměřen po 76 hodinách od začátku pokusu.

Strukturu bioaktivních sloučenin lze odhadnout i z izolační procedury. Skvrna na TLC korelující s aktivitou vizualizovaná ninhydrinem jako růžová nebo červená signalizuje, že sloučeniny obsahují primární aminy. Sloučeniny vykazovaly též amfifilní charakter původně byly extrahovány z vodného methanolu do toluenu, ale pak se přešly do methanolu při dělení mezi methanol a hexan. Jsou rozpustné v nepolárních rozpouštědlech, pro eluci na silikagelu při TLC vyžadují však velmi polární směs rozpouštědel (chloroform: 1-butanol:kyselina octová:voda v poměru 3:12:2:2).

Pouze frakce A a B byly podle TLC přiměřeně čisté od neaktivních kontaminant. Většina studií pro určení struktury byla provedena na frakci B, z důvodu její velikosti vzhledem k ostatním. Výkresy 3 a 4 ukazují ’H NMR spektra této frakce v CDC1₃ a CD₃OD (v tomto pořadí). V těchto spektrech byl okamžitě zřejmý pík odpovídající dlouhému methylenovému řetězci (1,25 ppm) a několika překrývajícím se terminálním methylovým skupinám (0,87 ppm). Další píky nebyly tak dobře definované. Nebyly pozorovány žádné píky odpovídající aromatickým protonům, několik píků se ale objevilo v oblasti alkenových protonů. Některé další odpovídaly pravděpodobně protonům připojeným k uhlíkům substituovaným heteroatomy. Hlavní rozdíl mezi spektry v těchto dvou odlišných rozpouštědlech byl ten, že v CD₃OD byl dublet methylu (1,21 ppm) doleva od terminálních methylových skupin zřetelně pozorován, zatímco v CDCI3 se tato rezonance projevila jen jako doprava raménko píku methylenového řetězce.

ΦΦ φφ φ φ* φφ φφ

Pro srovnání s izolovaným materiálem byl od společnosti Sigma získán autentický vzorek D-trans-erythro-sfingosinu (obecný vzorec II), jehož ’H NMR spektrum bylo v mnoha ohledech podobné spektru frakce B. Spektrum D-trans-erythro-sfingosinu vykazovalo výrazný pík odpovídající dlouhému methylenovému řetězci (1,25 ppm), terminální methylové skupině a dvěma vinylovým protonům (5,75 a 5,45 ppm). Zvláštní byla šířka rezonancí odpovídající protonům na uhlících substituovaných heteroatomy (4,40, 3,66, 2,85 a 2,18 ppm). D-trans-erythro-sfingosin měl na TLC (silikagel, směs chloroform: 1-butanol :kyselina octová-.voda v poměru 3:12:2:2) R_f = 0,43 a červenal v reakci na ninhydrin stejně jako nižší skvrna ve frakci B a střední skvrna ve frakci C. Podle Palmety a Proštenika vykazuje 2-amino-3-oktadekanol a D-trans-erythro-sfingosin velmi podobný Rf (0,32 a 0,29, v tomto pořadí) při eluci na papíru impregnovaném kyselinou orthokřemičitou v systému rozpouštědel diisobutylketon:kyselina octová:voda v poměru 40:25:5.

Frakce A-C byly studovány též několika metodami hmotnostní spektroskopie. Největší ion ve spektru měl poměr m/z 286. Vysoce rozlišovací měření tohoto píku (m/z = 286,3109) umožnilo přiřadit sumární vzorec molekuly CisFLoNO (0,1 mmu) spisulosinu 285 (obecný vzorec I). Název této sloučeniny je částečně odvozen z její molekulové hmotnosti. Sumární vzorec ukazuje, že molekula je totálně saturovaná. V oblasti m/z = 268,3019 (Δ = -1,5 mmu) byl pozorován výrazný pík odpovídající ztrátě vody z tohoto iontu M+H. Spisulosin 285 musí tedy obsahovat hydroxylovou skupinu. Ionty odpovídající mateřským aduktům m/z = 286 byly pozorovány při m/z = 438,3078 (C22H48NO3S2, Δ = -0,2 mmu), 590 a 592.

Jedním dobře známým primárním metabolitem sestávajícím podobně jako spisulosin 285 z řetězce o 18 uhlících substituovaného hydroxylovými a aminovými skupinami je sfingosin (obecný vzorec II). Tato sloučenina má o jeden kyslík více a o dva vodíky méně než spisulosin 285. Analogie těchto sloučenin spočívá v tom, že vysoce rozlišovací měření při m/z = 300 pro spisulosiny indikovalo, že šlo o dublet odpovídající M+H vyššího homologu s m/z = 286 (spisulosin 299, obecný vzorec I; 300,3270, C19H42NO, Δ = -1,1 mmu) a spisulosinu samotného (300,2914, C18H38NO2, Δ = -1,1 mmu). To vysvětlilo též přítomnost alkenových protonů v ’H NMR spektru.

Ve všech třech spektrech bylo vidět několik dalších píků. Ion v oblasti m/z = 314 byl také dublet odpovídající C20H44NO (314,3439, Δ = -1,6 mmu) tvořený molekulárním iontem jiného homologu spisulosinu 285 - spisulosinu 313 a nonadeka-4-sfingeninu, což je homolog ·· · · · · · sfingosinu C19H40NO2 (314,3075, Δ = -1,6 mmu). Ve spektru sfingosinu byly mateřské adukty M+H iontu v oblasti m/z = 452,2885 (C22H46NO4S2; Δ = -1,7 mmu), 604,2831(C26H₅4NO₆S4; Δ = 0,3 mmu) a 606,2995 (C26H56NO6S4; Δ = 3,6 mmu); mateřské adukty M+H iontu nonadeka-4-sfíngeninu byly v oblasti m/z = 464,2888 (C23H46NO4S2; Δ = -2,0 mmu) a 618,2940 (C27H₅6NO6S₄; Δ = 5,1 mmu). Je třeba zdůraznit, že zatímco ve frakci B byly m/z300 a314 dublety téměř shodné intenzity, u zde uvedených mateřských aduktů z frakce byl měřitelný pouze jeden pík. To je dokladem toho, že tyto dvě řady sloučenin, ačkoliv mají velmi podobnou obecnou strukturu, se chovají odlišně ve FABMS. Řada spisulosinových sloučenin (nasycených) měla silné molekulární ionty a slabší mateřské adukty, zatímco u sfingosinové řady (nenasycené) byl pozorován přesný opak.

Pro lepší stanovení struktur identifikovaných podle výše uvedených údajů bylo připraveno několik derivátů. Nejinformativnější byl diacetylderivát spisulosinu 285. Protože frakce B byla nej objemnější, její část byla acetylována acetanhydridem v pyridinu. Tato směs acetylderivátů bude dále označována jako AcB. Podle TLC (chloroform: 1-butanol.-kyselina octová:voda v poměru 3:12:2:2) se tato reakce jevila kvantitativní, kde vzniklý produkt migroval s Rf = 0,86. Pro srovnání byl stejným způsobem syntetizován i triacetylderivát autentického sfingosinu.

Dříve byly izolovány dvě řady sloučenin příbuzné spisulosinům. Podle Gulavity a Scheuera obsahuje houba Xestospongia sp. z Papuy-Nové Guiney dva epimemí aminoalkoholy o 14 uhlících 134 a 135. Tyto sloučeniny nebyly izolovány jako volné aminy, ale jejich směs byla acetylována za vzniku monoacetylovaných (136, 137) a diacetylovaných (138, 139) sloučenin, které byly potom rozděleny. Jimenez a Crews izolovali několik molekulových iontů nederivatizovaného spisulosinu 285 v oblasti m/z = 286. Tento ion M+H (m/z = 370) se rozdělil na dva fragmenty m/z = 310 a m/z = 268, patrně postupnou ztrátou kyseliny octové a druhého acetylu. Bylo přítomno malé množství srovnatelných iontů pro další spisulosiny v oblastech m/z = 384, 324 a 282 pro diacetylderivát spisulosinu 299 (144) a v oblastech m/z = 398, 338 a 296 pro diacetylderivát spisulosinu 313 (145). Iontů sfingosinu bylo ve vzorku příliš málo, než aby byla definitivně potvrzena jejich přítomnost. To ukazuje, že tyto dvě řady sloučenin mají velmi odlišné ionizační potenciály. Spektrum CIMS vykazovalo přítomnost velkého množství iontů v oblasti m/z = 370 a 310, ale iontu m/z = 268 bylo velmi málo. Nejvyšší homology byly nalezeny při m/z = 384 a 324 pro sloučeninu 144 a • · ·· fe fefe • fefe fe • · při m/z = 398 a 338 pro sloučeninu 145. Přítomnost malého množství iontů s m/z = 426 a 366 ukazovala na přítomnost sloučeniny 133.

Strukturu sloučenin 134, 136 a 138 znázorňuje obecný vzorec IV, strukturu sloučenin 135,

OR,

NHR,

134 R|=RjxH

13« R₁ = H.R₂ = Ac 138 Rj = Rj = Ac

OR

ŇHR

140 H = H

143 R = Ac fe • fefefe fe · • fefe fefefefe no

135 Rj « Rj * H

137 Rj = H, R? s Ac

138 R| = Rj a Ac

NHRj

OH

ŇH,

141

OH

Sh, • fe fefe • fefe fe • · · · fefe fefe · • fefe · (IV, V) (VI, VII)

137 a 139 znázorňuje obecný vzorec V, strukturu sloučenin 140 a 143 znázorňuje obecný vzorec VI, strukturu sloučeniny 141 znázorňuje obecný vzorec VH.

Syntéza spisulosinu 285

Pro potvrzení struktury a určení stereochemie byl spisulosin 285 syntetizován. Žádný z izomerů 2-amino-3-oktadekanoIu nebyl předtím známý jako přírodní produkt, ale izomery 2S, 3S a 2S,3R byly předtím syntetizovány. Vyšší homology jsou nové sloučeniny.

Pro získání autentického materiálu pro srovnání byla použita modifikovaná verze syntézy podle ProŠtenika a Alaupovice.

φφ ·· • · φ φ • φ · * φ φ φ • · · φφφ· >· φ» φφ φφ « φ « φ · · φ φφφφ < φ φ * φ φ < φ φ · φ φ φφφφ «< φφ ♦ CJ^oy.jSr Ϊ^·^Α. ogcx,^“^ * Υ «“>

W _{w Ιβ} «*—aat.. »

1. NaH oyow

Az

1*1-.

Fr7W ta

1S1

1. Separ. (tattreoRier i!

Ž.Hae»W>iOH 3. AcCH.pH«

OH

Na8H«

Ofi

CH.iayZ^y'

Srn

1MR.H

ΑβίΟφΤ·^

Hs.WBaSO.

OR

Τ' evm»'

HW)

155 R.H

Ae/>pyr/

WR.Ae ^XlS7R=Ac

Schéma Π

Jak je znázorněno ve schématu II, dibenzoylmalonat (147) byl alkylován tetradecylbromidem (148). Výsledný dibenzyltetradecylmalonat (149) byl kondenzován s Nftaloyl-L-alanylchloridem (150) a po odstranění benzylových skupin a dekarboxylaci vznikl 2-ftaIimido-3-oktadekanon (151). Tento keton reagoval s nadbytkem tetrahydroboritanu sodného, přičemž došlo k redukci jednoho z ftalimidových karbonylů kromě již přítomné ketonové skupiny za vzniku sloučeniny 152 sjednám ftalimidovým karbonylem redukovaným na karbinolamin a sloučeniny 153, která byla dále redukována. Tyto dva produkty byly bezprostředně odděleny flashovou chromatografii na silikagelu.

Z důvodu vzniku dvou nových chirálních center dala redukce sloučeniny 151 na sloučeninu 152 vznik směsi čtyř diastereoizomerů. V tomto stadiu byly diastereoizomery separovány na kyanidovém sloupci HPLC. Chrániči skupina byla pak z každého diastereoizomerů odstraněna redukcí tetrahydridoboritanem sodným a následně kyselinou octovou. Protože odstraněním jedné stereoizomemí skupiny bylo odstraněno jedno stereoizomemí centrum, výsledkem reakce byly dva diastereoizomery. Výchozí sloučeninou syntézy byl L-alanin a dva výsledné produkty byly (2S, 2S)-2-amino-3-oktadekanol (154) a (2S, 2R)-2-amino-3-oktadekanol (155).

·· ·· ······· • ·· · · · · · · ·· · ··· · · · · · · • · · · · ······ • * · ·· · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ··

Biologická aktivita

Protože spisulosiny jsou poměrně jednoduché sloučeniny, jak je ilustrováno ve výkresech 1A-1F, vykazují velmi neobvyklý typ bioaktivity. Jak je uvedeno výše, spisulosiny způsobují výraznou morfologickou změnu v leukemických buňkách L1210 a navíc i cytotoxicitu. Tato bioaktivita zaznamenaná jako podíl žijících buněk, na nichž byla pozorována morfologická alterace, se projevila někdy již za 13 hodin po začátku pokusu a dostala se do maxima po 50 až 60 hodinách, potom začala klesat. Pro určení tohoto podílu žijících alterovaných buněk bylo obecně pozorováno 60 buněk kromě pokusů, kde zůstalo naživu méně než 60 buněk. Morfologický účinek byl obvykle měřen 30 až 35 hodin po začátku pokusu a znovu asi o 24 hodin později, zatímco cytotoxicita byla stanovena, když počet buněk v kontrole dosáhl asi 8000, obvykle po třech dnech od začátku pokusu. Je třeba uvést, že buňky s výběžky byly žijící buňky a že byly jako takové započítány při zaznamenávání cytotoxicity. Pokusy, kde byla zaznamenána 100% cytotoxicita, mohly stále obsahovat žijící buňky v množství menším než 0,5 %, které měly či neměly výběžky. Všechny morfologický změněné buňky byly započítány v podílu buněk s výběžky.

Morfologické změny byly vždy pozorovány ve frakcích s poměrně vysokou cytotoxicitou. Obecně nebyl pozorován vznik významného množství buněk s výběžky v pokusech s menší než 70% inhibici růstu. V pokusech, v nichž cytotoxicita dosáhla 100 %, byl často nižší podíl buněk se změněnou morfologií než v pokusech s 90% - 98% inhibici růstu. To naznačuje, že alterované buňky se patrně snáze zabíjejí. Není známo, zda cytotoxicita a morfologická změna mají stejný mechanismus účinku. V jednom případě byly buňky s výběžky získané v jednom pokusu přeoČkovány a vrátily se do normálního stavu. To znamená, že morfologický účinek byl vratný, potom co byla sloučenina metabolizována. Acetylace drasticky snížila bioaktivitu.

Pro určení, zda byla morfologická změna buněk L1210 způsobena sfingosinem nebo příbuznými sloučeninami, bylo v pokusu proti buňkám L1210 použito několik autentických sloučenin. Sfingosin i stearylamin (131) vykazovaly jistou cytotoxicitu, ale žádný morfologický účinek. Sfingomyeliny jsou dobře známé deriváty sfingosinů, v nichž byla k primárnímu alkoholu připojena fosforylcholinová jednotka a amin byl acylován mastnou kyselinou. Směs sfíngomyelinů izolovaná z hovězího mozku (Sigma) sestávající hlavně ze stearoyl- a nervonoylsfingomyelinů (161, 162) vykazovala minimální cytotoxicitu a žádné • · ·· buňky s výběžky. Cytotoxicita fosforylcholinového derivátu sfingosinu (163, Sigma) byla zřejmě alespoň částečně způsobena hydrolýzou sloučeniny 163 na sfingosin.

Strukturu sloučenin 161 a 162 znázorňuje obecný vzorec VIII, strukturu sloučeniny 163 znázorňuje obecný vzorec IX

OH o

NH, °n (VIII, IX)

163

161 R, 182 R = = OH NHCOR

-ÍCHa)_MCH_s

-(CHj^ruCHCCHa^CH, CZ)

• »

Tabulka IV. Cytotoxicita modelových sloučenin

Sloučenina	Koncentrace (pg/ml)	% inhibice	% buněk s výběžky
128	5	100	0
	2,5	100	0
	1	75	0
	0,5	31	0
	0,25	13	0
	0,1	0	0
161+162	50	7	0
	25	0	0
	10	0	0
131	5	99	0
	2,5	96	0
	1	19	0
	0,5	0	0
	0,25	0	0
	0,1	0	0
163	50	88	0
	25	50	0
	10	38	0

O sfingosinu a dalších aminech s dlouhým řetězcem včetně stearylaminu je známo, že jsou cytotoxické. Tato aktivita, měřená proti vaječníkovým buňkám čínského křečka (CHO), byla prokázána pro homology s maximálně 18 uhlíky. Bylo zjištěno, že všechny čtyři stereoizomery sfingosinu jsou přibližně stejně aktivní. Redukce na dvojné vazbě sfingosinu za vzniku dihydrosfingosinu (164) neovlivnila cytotoxicitu. Ani připojení N-methylové skupiny na sloučeninu 164 nezpůsobilo významnou změnu v cytotoxicitě, zatímco acylace aminu způsobila výrazný pokles cytotoxicity.

U příbuzných sloučenin (134, 135, 140 - 142) izolovaných z dalších přírodních zdrojů, nebyla síanovena žádná cytotoxiciía, je však možné, že nebyly testovány v tomto typu pokusu. Sloučeniny 134 a 135 byly aktivní proti C. albicans (8 mm zóna inhibice na 19 pg směsi těchto dvou sloučenin). Xestaminol A vykazoval slabou aktivitu proti několika grampozitivním a gramnegativním bakteriím a houbám. Vykazoval též aktivitu proti Nippostrongylus brasiliensis. Sloučeniny 140 a 142 vykazovaly určitou aktivitu proti reverzní transkriptase.

Aktivita frakcí A-C, acetylderivátu frakce B a sloučenin 154 a 155 je shrnuta v následující tabulce. Výsledky pokusu byly jasně potvrzeny NMR analýzou, která stanovila, že sloučenina 155, nikoliv 154, je totožná se sloučeninou 125. Acetylace tedy drasticky snižuje bioaktivitu.

Tabulka V. Bioaktivita frakcí A-C, AcB a sloučenin 154 a 155

Vzorek	Koncentrace (pg/ml)	% inhibicec	Čas	% buněk s první	výběžky370 druhý
Frakce A	2,5	100	35,59	vm.	vm.
	1,25	100		25	vm.
	0,5	90		42	45
	0,25	85		45	55
	0,125	75		8	35
	0,05	19		0	0
Frakce B	2,5	100	35,59	0	7
	1,25	93		3	21
	0,5	90		2	43
	0,25	80		7	37
	0,125	75		5	21
	0,05	7		0	0
Frakce C	2,5	90	55	0
	1,25	88		0
	0,5	63		0
AcB	10	31	27	0
	5	38		0
	2	13		0
	1	0		0
	0,5	0		0
	0,2	0		0
154	5	100	27	0
	2,5	100		0
	1	63		0
	0,5	0		0
	0,25	0		0
	0,1	0		0

• · »· • · · · • · · ·

155	5	100	27	vm.
	2,5	100		22
	1	100		64
	0,5	99		56
	0,25	96		40
	0,1	63		33

Vysvětlivky:

^a Pokud není uvedeno jinak, podíl buněk s výběžky byl stanovován dvakrát. Počet hodin po začátku pokusu, za nějž byla tato měření provedena, je udán ve sloupci „čas“. ^b vm. - všechny buňky mrtvé ^c Podíl inhibice růstu udaný jako podíl žijících buněk ve zkoumaném vzorku ve srovnání s počtem buněk v kontrolním vzorku

Navržený způsob účinku

Bioaktivita spisulosinů je patrně dána jejich podobností se sfingosinem. V nomenklatuře sfingolipidů je spisulosin 285 1-deoxysfinganin. Spisulosiny soutěží se sfingosinem o vazebná místa nebo jsou včleněny do sfingolipidů jako sfingomyeliny, ceramidy nebo gangliosidy. V každém případě mohou spisulosiny přerušit buněčné funkce kontrolované těmito sloučeninami. Sfingosin a jeho deriváty mají funkci v regulaci buněčného růstu a diferenciace. Sfingosin je účinný inhibitor proteinkinasy C, neboť soutěží s diacylglycerolem o vazebné místo, což může vysvětlovat jeho cytotoxicitu. Studie vztahu mezí strukturou a aktivitou ukazují, že schopnost inhibice vyžaduje kladně nabitý amin, a proto jsou N-acylované deriváty inaktivní. Pokud spisulosiny účinkují tak, že soutěží se sfingosinem, lze tím vysvětlit relativně nízkou aktivitu acetylovaných sloučenin (AcB). Podle dosavadních znalostí účinkuje sfingosin jako druhý posel a reguluje aktivitu proteinkinasy C. Také inhibuje diferenciaci buněk HL-60 ošetřených forbol-12-myristat-13-acetatem, známým aktivátorem proteinkinasy C. Spisulosiny mají být testovány na inhibici proteinkinasy C. Není známo, zda inhibice tohoto enzymu může mít morfologické účinky pozorované u spisulosinů, ale proteinkinasa C má funkci v buněčném růstu a diferenciaci.

• · • · • · • · • · 4 β · 4 • · « • · · · · ·

Příklady provedení vynálezu

NMR spektra byla měřena na spektrometru General Electric GN 500 a QE 300 a Varian U400. Vzorky pro NMR analýzu byly rozpuštěny v CDCI3 nebo CD3OD. Chemický posun (Δ) udává vzdálenost v ppm vlevo od signálu tetramethylsilanu (TMS) a je vztažen k zbytkovému píku rozpouštědla nebo TMS. Spektra FABMS s nízkým nebo vysokým rozlišením byla naměřena na spektrofotometru VG ZAB-SE nebo VG 70-SE4F za použití směsi dithiothreitolu a ditjioerythritolu (MAGIC BULLET) jako matrice. Spektra FABMS/MS byla naměřena na spektrometru VG 70-SE4F s touž matricí za použití helia jako kolizního plynu. Hmotová spektra CI byla naměřena na spektrometru VG VSE operujícím v modu CI/EI s methanem jako reakčním plynem. IR spektra byla naměřena na spektrometru IBM IR/32 FTIR. Optická rotace byla naměřena na digitálním polarimetru JASCO DIP-370.

Chromatografie

HPLC bylo provedeno na kyanidovém sloupci Albech Econosphere (4,6 x 250 mm, velikost částic 5 gm). Použitý systém HPLC sestává z modelu pumpy 114M podle Beckmana, vstřikovače Rheodyne 71 a z detektoru s proměnnou vlnovou délkou Isco V⁴ nebo Beckman 165 nebo fotodiodového mřížkového detektoru Waters 990.

Analytická tenkovrstevná chromatografie (TLC) byla provedena na destičkách potažených silikagelem (Merck 60 F-254) a na destičkách s fází vázanou kyanidem (EM Science CN F2548 HPTLC). Skvrny byly vizualizovány UV (254 nm), ninhydrinem (5% roztok v ethanolu), kyselinou fosfomolybdenovou (5% roztok v ethanolu) a/ nebo jodem. Chromatografie na sloupci silikagelu byla prováděna na 50-200 gm nebo na 40-63 gm silikagelu (Merck). Další sloupcová chromatografie byla prováděna na sloupcích Chromatorex ODS (Fuji-Division 100-200 ok síta na délkový palec) a Sephadex LH-20 (Pharmacia). Vysokorychlostní protiproudá chromatografie (HSCCC) byla provedena na vícevrstevném spirálním separátoruextraktoru Ito (P.C. Inc.) se spirálou #10 a s minipumpou Milton-Roy. Extrakce na pevné fázi (SPE) byla provedena na normální fázi (silikagel, Alltech Maxi-Clean), obrácené fázi (C-18, Waters Sep-Pak) a vázané fázi (CN, Fischer PrepSep).

Biologická stanovení

Měření cytotoxicity proti myším lymfocytním leukemickým buňkám L1210 byla provedena rozpuštěním vzorků v methanolu a/ nebo v hexanu, přenesením do suchých testovacích důlků a odpařením rozpouštědla. Buňky (1000) byly přidány v minimálním základním médiu (MEM, 1 ml) a následovala inkubace při 37 °C. Inhibice růstu byla zaznamenána jako odhad podílu žijících buněk ve vzorku vůči kontrolním důlkům a byla měřena, když počet buněk v kontrolních důlcích dosáhl 8000, obecně po třech dnech od začátku pokusu.

Morfologicky alterované buňky (výkresy 1A-1F) byly stanoveny jako žijící buňky po stanovení procentuelní inhibice růstu. Morfologické změny byly stanoveny během doby pokusu. Podíl buněk s výběžky byl určen spočítáním alterovaných buněk v asi 60 žijících buňkách. Tento podíl se lišil s dobou uplynuvší od začátku pokusu. Obecně dosahoval maxima po 50 hodinách od začátku pokusu, ale buňky s výběžky byly pozorovatelné již po 13 hodinách od začátku pokusu a byly obvykle stále viditelné, když byla měřena procentuelní inhibice růstu. Podíl buněk s výběžky byl často stanoven po 35 i 55 hodinách od začátku pokusu. Doba, po jejímž uplynutí byla tato měření provedena, je udána spolu s těmito údaji.

Antimikrobiální pokusy byly provedeny za použití metody filtrační diskové difuse. Papírové disky (6,35 nebo 12,7 mm, Schleicher & Schuell) byly impregnovány roztoky vzorků (50 - 500 pg) a odpařeny. Disky byly umístěny na agarové plotny s naočkovanými mikroorganismy Bacillus subtilis, Penicillium melinii (dříve P. atrovenetum), Micrococcus luteus (dříve Sarcina lutea), Escherichia coli nebo Saccharomyces cerevisiae. Tyto plotny byly inkubovány 12 - 24 hodin (32 - 35 °C s výjimkou P. melinii, 25 - 27 °C).

Extrakce Spisula polynyma pro původní biologické testy

Jedna škeble Spisula polynyma byla rozmražena, skořápka škeble byla odstraněna (35,32 g mokré hmotnosti). Škeble byla umístěna do homogenizátoru s 350 ml směsi methanol:toluen 3:1 a homogenizována. Žlutohnědý extrakt byl zfiltrován a přidán k 1M roztoku chloridu sodného (lOOml). Horní toluenová vrstva byla odstraněna a vodná vrstva byla extrahována toluenem (75 ml). Dva toluenové extrakty byly spojeny a rozpouštědlo bylo odstraněno za vzniku hnědého olejovitého rezidua (333,9 mg). Vodná vrstva byla dále extrahována • · • · · · · · · · · • · · · · ······ • · · · · ΦΦΦ· ···· ·· ··· ···· ·Φ ·· dichlormethanem (2 χ 75 ml) za vzniku žlutohnědého rezidua (18,6 mg) po odstranění rozpouštědla. Vodná vrstva byla pak extrahována ethylacetátem (75 ml) Spodní fáze byla organická vrstva díky přítomnosti dichlormethanu, který zůstal ve vodné fázi po posledním kroku. Horní vrstva byla dále extrahována ethylacetátem (245 ml) a horní vrstva byla zpětně extrahována vodou (100 ml). Oba ethylacetátové extrakty byly spojeny za vzniku žlutého rezidua (36,8 mg) po odstranění rozpouštědla. Spojené vodné extrakty byly zkoncentrovány na polovinu a extrahovány dvakrát 1-butanolem (150 ml, 70 ml). Spojené butanolové extrakty byly zpětně extrahovány vodou (75 ml)za vzniku žlutého rezidua (132,8 mg) po odstranění butanolu. Spojené vodné extrakty byly zkoncentrovány za vzniku olej ovitého světle žlutého rezidua (946,1 mg). Každý extrakt byl triturován dichlormethanem a methanolem, aby byly odstraněny sole, za vzniku toluenových (302,2 mg), dichlormethanových (18,6 mg), ethylacetátových (36,7 mg), butanolových (120,9 mg) a vodných extraktů pro další pokusy.

Frakce A, B a C škeblí Spisula polynyma bylo rozmraženo a skořápky škeblí byly odstraněny za vzniku vzorku o hmotnosti 1,9 kg, který byl máčen ve směsi methanol/toluen (3:1, 2 x 1,5 1). Pevné části byly pomlety v témž rozpouštědle (6 x 1,5 1) a výsledné extrakty zfiltrovány. K tomuto hrubému extraktu (12 1) byl přidán IM roztok chloridu sodného (3 1) a horní toluenová vrstva byla odstraněna. Vodná vrstva byla dále extrahována toluenem (2 x 2,5 1) a dichlormethanem (4 x 2,5 1), jak znázorňuje výkres 1.

Po odstranění rozpouštědla byl toluenový extrakt (21,55 g) rozdělen mezi methanol a hexan (každý o objemu 1,5 1). Methanolová vrstva byla dále extrahována hexanem (4 x 1 1). Spojené hexanové extrakty byly zkoncentrovány na 1,8 1 a oba extrakty byly vychlazeny (-10 °C). Dvě vrstvy, které v obou případech vznikly, byly separovány. Spojené hexanové vrstvy byly extrahovány methanolem (0,5 1). Tímto postupem byly získány jeden hexanový a tři methanolové extrakty, z nichž první methanolový extrakt (6,8 g) vykazoval největší bioaktivitu.

Bioaktivní methanolová frakce byla separována flashovou chromatografii na silikagelu za použití stupňového gradientu methanol/chloroform (100:1, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20,

70:30, 50:50, 0:100) za vzniku 12 frakcí. Třetí, čtvrtá, sedmá a osmá frakce vykazovaly • · · • · · ► * ·· určitou cytotoxicitu, ale žádnou schopnost morfologické alterace. Tato aktivita byla nalezena v posledních dvou frakcích spolu s většinou cytotoxicity.

Tyto dvě frakce byly spojeny (370 mg) a dále purifikovány další flashovou chromatografii na silikagelu za použití mobilní fáze chloroform/ 1-butanol/kyselina octová/voda (8:12:1:1). 12 takto získaných frakcí bylo pro odstranění kyseliny octové neutralizováno (a) přidáním chloroformu, (b) promýváním hydrogenuhličitanem sodným, dokud nebylo pH vodné vrstvy rovno 7 (2-3 x poloviční objem). Třetí, čtvrtá a pátá frakce obsahovaly všechnu schopnost morfologické alterace a v podstatě všechnu cytotoxicitu. Každá z těchto frakcí byla zvlášť purifikována na kyanidovém sloupci HPLC ve fázi methanol:0,01M amoniumformiat v poměru 3:1 rychlostí 1 ml/min. Z každé ze tří frakcí získaných na silikagelu bylo získáno 6 frakcí, z nichž byla nejbioaktivnější frakce 5. Amoniumformiat byl z každé frakce odstraněn přidáním vody (2 až 8 ml), nanesením vzorku na sloupec SPE (C-l 8), promytím vodou (5-10 ml) a následným eluováním methanolem. Tento postup dal vznik frakcím A (0,4 mg, 2.10 ’⁵% výtěžek), B (0,2 mg, 1.10'⁵% výtěžek) a C (0,2 mg, 1.10⁵% výtěžek) ze třetí, čtvrté a páté frakce získané na silikagelu (v tomto pořadí), Které byly všechny eluovány v t_r=7,9 min.

Frakce A

Bílá pevná látka, TLC na silikagelu (CHCL/l-BuOH/AcOHTLO 3:12:2:2); Rf = 0,47. Pozitivní reakce na ninhydrin, růžová.

IR (NaCl) 2922, 2853, 1734, 1593,1462,1377,1061 cm'¹;

’H NMR (CDC1₃) δ 5,38; 5,15; 3,82; 3,67; 3,44; 3,24; 2,31; 2,03; 1,67; 1,60; 1,55; 1,25;

1,10; 0,86;

FABMS m/z 606, 604, 592, 59, 466, 452, 438, 314, 300, 286, 268;)

CIMS m/z 354, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 268, 266,

149, 139,137,1, 123,111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.

Vypočtený sumární vzorec pro CigíLoNO 286,3110 (M+H); nalezeno 286,3115 (HRFABMS).

Frakce B

Bílá pevná látka, TLC na silikagelu (CHCI3/I-BUOH/ACOH/H2O 3:12:2:2); Rf = 0,47, pozitivní reakce na ninhydrin (růžová); Rf = 0,44, pozitivní reakce na ninhydrin (červená).

·· ·♦ · ·· 4· ·· • · · · ·*·· ···· • · · · · ···· • · · · · ······ • · · · · ···« ···· · * ··· ···· ·· ··

IR (NaCl) 3273, 2953, 2918, 2851, 1639, 1591, 1510, 1466, 1379, 1344, 1059, 970 cm’¹;

*H NMR (CDC1₃) δ 5,98; 5,78; 5,55; 5,44; 5,32; 4,43; 3,78; 3,65; 3,24; 2,13; 2,08; 2,00; 1,95; 1,70; 1,44; 1,25; 1,19; 0,87;

FABMS m/z 6,18,2940; 616; 606,2955; 604,2831; 592; 590; 480; 466; 464,2888; 452,2885; 438; 314,3439; 314,3075; 300,3273; 300,2914; 286; 268;

CIMS m/z 354, 352, 342, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 282,280, 268, 266,219, 193, 179, 165,149, 137, 123,111,109, 97, 95, 85,83,71,69, 59, 57, 55.

Frakce C

Bílá pevná látka, TLC na silikagelu (CHCb/l-BuOH/AcOH/FbO 3:12:2:2); R_f = 0,47, pozitivní reakce na ninhydrin (růžová); Rf = 0,44, pozitivní reakce na ninhydrin (červená); Rf = 0,34, pozitivní reakce na ninhydrin (rudá)..

IR (NaCl) 2924, 2853, 1593, 1456, 1352, 1063, 972 cm'¹;

FABMS m/z 620, 618, 616, 606, 604, 602, 466, 464, 452, 438, 314, 300, 298,2741, 296, 286, 280, 268;

CIMS m/z 354, 352, 340, 338, 336, 328, 326, 324, 322, 314, 312, 310, 308, 300, 298, 296, 294, 292, 286, 284, 282, 280, 278, 268, 179, 165,149, 137,135,1,123, 121,111, 109, 97, 95, 85,83,81,71,69, 60, 59,57,55.

Původní dělení škeblí Spisula polynyma bylo rozmraženo a skořápky škeblí byly odstraněny za vzniku vzorku o hmotnosti 1,3 kg (mokrá hmotnost). Tento materiál byl umístěn do mísiče Waring se směsí methanol/toluen (3:1, 1,5 1) a rozemlet na hustou kaši, která byla zfiltrována na vrstvě celitu. Pevné reziduum bylo dále extrahováno (4 x 1,5 1) a podobným způsobem zfiltrováno. Zbývající pevný podíl byl 36 hodin máčen ve směsi methanol/toluen 5:1 (750 ml) a pak zfiltrován. Ke spojeným filtrátům (7,8 1) byl přidán 1M chlorid sodný (2 1). Po odstranění vrchní toluenové vrstvy byla vodná fáze extrahována toluenem (2 x 1,5 1) a dichlormethanem (3 x 1,5 1). Zbývající vodná fáze byla zkoncentrována na ‘A a extrahována ethylacetátem (2 χ 1 1). Výsledná vodná vrstva byla zředěna vodou a (2 1) a dvakrát extrahována tftf tftf · ·· tftf ·· • tftf · tftftf · tf tftf · • tftf tf · tftftftf • tftftf · ······ • tftf tftf tftftftf • tftftf tftf tftftf tftftftf tftf tftf

1-butanolem (1,5 1, 1 1). Odstranění rozpouštědel a triturace dichlormethanem a methanolem daly vznik toluenovému (14,1 g), dichlormethanovému (0,75 g), ethylacetátovému (1,3 g) 1-butanolovému (0,2 g) a vodnému (1,9 g) extraktu, které byly dále testovány.

Toluenový extrakt se rozdělil mezi hexan a methanol (objem každého byl 750 ml). Výsledná methanolová vrstva byla dále extrahována hexanem (2 x 750 ml, 2 x 500 ml). Hexanové vrstvy byly spojeny a zkoncentrovány na asi 3 1. Oba extrakty byly následně vychlazeny (-10 °C), což způsobilo jejich rozdělení do dvou vrstev. Spojené methanolové extrakty byly zkoncentrovány ve vakuu za vzniku hnědého rezidua (methanolový extrakt,

1,536 g). Hexanové vrstvy byly dále zkoncentrovány na asi 1 1 a zpětně extrahovány methanolem (500 ml). Z těchto vrstev bylo odstraněno rozpouštědlo za vzniku methanolového extraktu 2 (4,26 g) a hexanového extraktu (4,52 g).

Frakce D

Část prvního methanolového extraktu (594 mg) byla separována HSCCC za použití mobilní fáze hexan/ethylacetat/methanol/voda (4:7:4:3, mobilní fáze MF = UF) rychlostí 4 ml/min. Vzniklo tak 12 frakcí, z nichž třetí, čtvrtá a pátá obsahovaly nejvíc bioaktivity. Tyto tři frakce byly spojeny (158 mg) a chromatografovány na Sephadexu LH-20 za eluce methanolem. Vzniklo tak 8 frakcí, z nichž čtvrtá frakce obsahovala většinu biologické aktivity. Bioaktivní frakce byla dále purifikována na kyanidovém sloupci HPLC s mobilní fází methanol/ 0,01M amoniumformiat (0,5 ml/min). Bylo získáno 8 frakcí, z nichž frakce 4 obsahovala většinu biologické aktivity. Amoniumformiat byl z každé frakce odstraněn přidáním vody (2 až 8 ml), nanesením vzorku na sloupec SPE (C-18), promytím vodou (5-10 ml) a následným eluováním methanolem (5 ml). Sedmá frakce (t_r = 15,8 minut, bílá amorfní pevná látka, 0,3 mg, 2.10’⁴% výtěžek) prokazatelně obsahovala bioaktivní sloučeniny a je zde označována jako frakce D. TLC na silikagelu (1-BuOH/AcOH/H2O, 4:1:5, horní vrstva) ukázala vizualizací fosfomolybdenovou kyselinou čtyři skvrny: Rf = 0,53 (majoritní), 0,35 (majoritní), 0,31 (minoritní) a 0,19 (minoritní). Inaktivní šestá frakce vykazovala tytéž skvrny kromě skvrny s Rf = 0,53. FABMS spektrum frakce D ukázalo intenzivní píky v oblasti m/z 286,3019; 300,3270 a 268,3019 a slabší píky v oblasti m/z 314; 438; 452; 464; 590; 592; 669; 797; 809 a 825. Tři naposled uvedené ionty byly pozorovány při HPLC většiny ostatních frakcí a zřejmě korespondovaly se skvrnou na TLC o Rf = 0,35.

• ·4 4 44 44 44 • 44 44 4 4 4 4 4 4 ··· · 4 4 4 4 4

4 4 4 · 44444 4

44 4444

44 4444444 44 44

Vypočtený sumární vzorec pro CigFUoNO 286,3110 (M+H); nalezeno 286,3109 (HRFABMS).

Frakce E

Druhý podíl výše uvedeného prvního methanolového extraktu (633 mg) byl analyzován na HSCCC. Byla použita mobilní fáze hexan/methanol/voda (5:4:1, UP = MP, 5 ml/min), což umožnilo dobou retenci na stacionární fázi. Analýza dala vznik 10 frakcím, které byly téměř všechny bioaktivní. První tři frakce (310 mg) byly spojeny a dále purifikovány pomocí HSCCC za použití směsi hexan/ethylacetat/methanol/voda (4:7:4:3, LP = MP, 2 ml/min) za vzniku 12 frakcí. Druhá až pátá frakce s maximálním obsahem bioaktivity byly chromatografovány na sloupci C-18 flashovou chromatografii a eluovány stupňovým gradientem methanol/voda/chloroform (90:10:0, 95:5:0, 100:0:0, 95:0:5, 90:0:10, 50:0:50). Všech 10 získaných frakcí bylo bioaktivních.

Čtvrtá až šestá frakce z prvního HSCCC byly spojeny s vedlejší frakcí ze sloupce Sephadexu LH-20 označovanou jako frakce D (270 mg). Tento materiál byl nanesen na HSCCC za stejných podmínek jako druhá právě popsaná analýza na HSCCC s tím, že eluční rychlost byla 3 ml/min. Bylo získáno 9 frakcí, z nichž druhá a třetí obsahovaly většinu cytotoxicity a alterační schopnosti. Tyto dvě frakce byly spojeny (42 mg) a separovány na sloupci C-18 flashovou chromatografii za použití stupňového gradientu methanol/voda (80:20, 90:10, 95:5, 100:0). Bylo získáno 12 frakcí, z nichž osmá a jedenáctá obsahovaly většinu cytotoxicity a alterační schopnosti, všechny frakce z prvního sloupce C-18 kromě první a páté byly spojeny s první až jedenáctou frakcí (50,4 mg) z druhého sloupce a směs byla separována preparativní TLC na silikagelu s mobilní fází chloroform/1-butanol/kyselina octová/voda (3:12:2:2). Destička byla rozdělena do devíti frakcí, které byly seškrábnuty a eluovány methanolem. Po odstranění rozpouštědla z každé frakce bylo reziduum triturováno dichlormethanem a zfíltrováno. Druhá frakce odshora na destičce (Rf = 0,80 - 0,42) obsahovala bioaktivní materiál a bude dále označována jako frakce E (5,7 mg). Analytická TLC frakce E na silikagelu se stejnou mobilní fází vykazovala ninhydrinovou vizualizací jednu skvrnu (Rf = 0,44), ale postříkání fosfomolybdenovou kyselinou ukázalo další skvrny táhnoucí se přes druhou třetinu destičky. FABMS spektrum frakce B vykazovalo hlavní pík v oblasti m/z 286 a menší píky v oblasti m/z 268, 300, 438, 452 a 592.

ΦΦ φφ · φφ φφ φφ • φφφ φφφφ φφφφ • · · · φ φφφφ φφφφ φ Φ····· φφφ · φ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ

Frakce F

Třetí část prvního methanolového extraktu (468 mg) byla separována flashovou chromatografii na silikagelu za použití mobilní fáze chloroform/1-butanol/kyselina octová/voda (8:12:1:1). Pro odstranění kyseliny octové byla každá z takto získaných 9 frakcí neutralizována (a) přidáním vody (poloviční objem než byl objem frakce) a separací obou fází, (b) extrakcí vodné vrstvy chloroformem (2 x polovičním objemem než byl objem frakce), (c) promýváním spojených organických extraktů 5% hydrogenuhličitanem sodným, dokud nebylo pH vodné vrstvy vyšší než 7 (2 až 3 x polovičním objem než byl objem frakce) a pak (d) promýváním organické vrstvy vodou (polovičním objemem). Třetí frakce (24 mg) obsahující největší podíl bioaktivity byla chromatografována na Sephadexu LH-20 eluci methanolem za vzniku 8 frakcí. Šestá frakce (2,3 mg) byla separována opakovanou HPLC za stejných podmínek jako při separaci frakcí A-C. Amoniumformiat byl odstraněn stejně jako ve frakcích A-C. Biologicky nejaktivnější byla frakce eluovaná při t_r = 8,1 minut. Tato frakce je dále označována jako frakce F. Její množství bylo tak malé. že nebylo možné zjistit přesnou hmotnost, asi 100 až 200 pg (výtěžek 1-2.10’⁴ hmotn. %). Frakce eluovaná o něco později vykazovala též cytotoxickou i morfologicky alterační aktivitu, ačkoliv méně intenzivní. Z toho vyplývá, že buď se aktivní látka (látky) neeluovala(y) jako dobře definovaný pík, nebo že se různé homology eluovaly v různých časech a nebyly dobře rozděleny. TLC na silikagelu (CHCL/l-BuOH/AcOH/^O 3:12:2:2) ukázala jednu skvrnu pozitivní na ninhydrin při Rf = 0,44. Později eluované frakce vykazovaly tutéž skvrnu, ale menší intenzity. FABMS spektrum frakce F ukazuje tyto píky v pořadí klesající intenzity: m/s 286,268, 300, 314, 344,438,452, 592, 669.

Pitva

Živá škeble byla umístěna do nádoby s 10 ml diethyletheru a chlazena (4 °C) 20 hodin. Byla rozpitvána na 9 orgánů: noha, trávicí systém (včetně žaludku, střev a váčku s krystalickými trny), gonády, nálevka, žábry, srdce, plášť, přídatné svaly a zbytek viscerální hmoty. Každý orgán byl máčen ve směsi methanol/toluen (3:1, 10 ml/g vzorku) a pak homogenizován v homogenizátoru Virtis. Extrakty byly zfíltrovány a rozpouštědlo bylo

• · • · • · ··· · ·· odstraněno. Reziduum bylo triturováno dichlormethanem a methanolem za vzniku 155 mg (noha), 60 mg (trávicí systém), 147 mg (gonády), 101 mg (nálevka), 65 mg (žábry), 2,5 mg (srdce), 168 mg (plášť), 101 mg (přídatné svaly) a 252 mg (viscerální hmota).

Ve zvláštním pokusu byla jedna noha škeble uvařena a extrahována podobným způsobem (189 mg). Větší vzorek vařených škeblí (483 g) byl intenzivněji extrahován prvním máčením ve směsi methanol/toluen 3:1 (3 x 500 ml) a pak homogenizován v těchže rozpouštědlech (5 x 500 ml). Malý vzorek spojených extraktů byl odpařen a znovu rozpuštěn v methanolu pro testování.

Obecné postupy

Optická rotace byla měřena na digitálním polarimetru Jasco DIP-370 v komůrce 3,5 x 50 mm o objemu 1 ml. Body tání byly naměřeny na kapilárním přístroji pro měření bodu tání podle Thomase Hoovera. Ha C NMR spektra byla naměřena na spektrofotometru Varian Unity -400 nebo Unity -500. Chemický posun byl udáván v ppm vzhledem k rozpouštědlu (7,26, CDCI3 a 3,30, CD3OD). Hmotová spektra HRPAB a FAB byla naměřena na hmotovém spektrometru VG ZAB-SE nebo 70 SE4F. Pro TLC byly použity tenkovrstvé destičky (silikagel 60, Merck). Chromatografické separace byly provedeny flashovou chromatografií se silikagelem (230-400 ok na délkový palec, Merck). Všechny reakce citlivé na vzdušnou vlhkost byly provedeny pod dusíkem ve skleněném nádobí vysušeném v sušárně. Rozpouštědla byla před použitím destilována: THF z benzofenonketylu, CH2CI2 z CaH2, ostatní použitá rozpouštědla měla kvalitu odpovídající reagenciím.

Methylester kyseliny (S)-2-(N,N-dibenzylamino)propionové

V 300ml baňce s kulatým dnem byla smíchána sloučenina 20 (viz Schéma 1; 10,0 g,

71,6 mmol) s benzylbromidem (25,73 g, 150,4 mmol), K₂CO₃ (9,90 g, 71,6 mmol) a CH₃CN (172 ml). Směs byla míchána při 60 °C až do úplné konverze podle TLC. Reakce byla ochlazena na teplotu místnosti a pevná látka byla odfiltrována. Filtrát byl zkoncentrován ve vakuu za vzniku oleje, který byl purifikován flashovou chromatografií na silikagelu (hexan/EtOAc 9:1) za vzniku bezbarvého oleje.

[ct]²⁵D = 113,6 (c 1,2, CHCI3);

ΦΦ • φ φ ·· φφ ·· • φφφ φφφφ φφφφ φφφ φ φ φφφφ φφφφ φ φφφφφφ φφφ φφ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ

Ή NMR (400 MHz, CDC1₃), δ 1,35 (d, 3Η, J = 7,1 Hz), 3,53 (q, IH, J = 7,0 Hz), 3,65 (d, 2H,

J = 1,38 Hz), 3,75 (s, 3H), 3,85 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 7,22-7,42 (m, 10H);

¹³C NMR (100 MHz) δ 14,9, 51,1, 54,3, 56,0, 2,8, 4,1,4,5, 139,1, 175,1;

FABMS m/z 284,1 (M+H), 282,1 (M-H), 224,2 (M-COOCH₃);

podle HRFABMS vypočítáno CisH₂₂NO₂ M_r 284,165,1 (M+H); nalezeno M_r 284,1650.

(S)-2-(N,N-dibenzylamino)l-propanol (40)

K suspenzi L1AIH4 (550 mg, 14,5 mmol) v THF (20 ml)byl po kapkách přidán roztok sloučeniny 30 (viz Schéma 1; 910 mg, 3,21 mmol) v THF (2 ml). Roztok byl míchán 15 minut a pak zahříván na 65 °C 3 hodiny. Reakce byla ochlazena na 0 °C a zchlazena 0,lM HCI. Reakční směs byla zfiltrována na celitu, celit byl promyt THF (2x15 ml) a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Flashovou chromatografií (hexan/EtOAc 4:1; R_f = 0,30) na silikagelu bylo získáno 750 mg (výtěžek 92 hmotn. %) bezbarvé pevné látky: bod tání 40-41 °C (z hexanu), podle literatury 40-41 °C (z hexanu) - viz Stanfield a kol., J. Org. Chem., 1981,49, 4799-4800;

[cc]²⁵d ⁼ +86,6 (c 1, CHCI3), podle literatury [oc]²³D = +88,6 (c 1, CHC1₃);

*H NMR (500 MHz, CDC1₃), δ 0,98 (m, 3H), 2,98 (m, IH), 3,13 (m, IH), 3,35 (m, 3H), 3,45 (m, IH), 3,81 (m, 2H), 7,19-7,41 (m, 10H);

¹³C NMR (1 MHz) δ 8,6, 52,9, 54,1, 62,7, 3,2, 4,5, 5,0, 5,3;

FABMS m/z 256,2 (M+H), 224,2 (M-CH₂OH);

podle HRFABMS vypočítáno Ci₇H₂₂NO M_r 256,1701 (M+H); nalezeno M_r 256,1702.

(S)-2-(N,N-dibenzylamino)propionaldehyd (50)

K roztoku oxalylchloridu (0,31 ml, 3,6 mmol) v CH₂C1₂ (7,5 ml) byl za teploty -78 °C přidán suchý DMSO (viz Schéma 1; 0,53 ml, 7,43 mmol). Roztok byl míchán 15 minut a pak byla přidána sloučenina 40 (740 mg, 2,90 mmol) v CH₂C1₂ (7,5 ml). Po 30 minutách byl přidán Et₃N (1,0 ml, 7,2 mmol) a směs se ohřála na teplotu místnosti. Roztok byl extrahován nasyceným NaHCO3 (20 ml) a vodná vrstva byla extrahována CH₂C1₂ (2x15 ml). Organická vrstva byla promyta nasyceným roztokem chloridu sodného, usušena na MgSO₄ a zkoncentrována ve vakuu za teploty místnosti za vzniku 720 mg (výtěžek 98 hmotn. %) ♦ · ·· • · · • · • «

9

9999 99 • 99 99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 • «··«·· • · 9 9 9 9

999 9999 99 99 žlutého oleje, který při ochlazení na -20 °C ztuhnul. Aldehyd byl použit bez další purifikace: bod tání 52-54 °C, podle literatury 55,5 °C - viz Dix a kol., Arch. Pharm. (Weinheim), 1995, 328, 203-205;

[cc]²⁶d = 36,0 (c 1, CHCI3), podle literatury [α]²% = -35,1 (c 1, EtOAc);

‘H NMR (400 MHz, CDC1₃), δ 1,19 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 3,34 (q, 1H, J = 7,0 Hz), 3,58 (d, 2H, J = 13,7 Hz), 3,74 (d, 2H, J = 13,7 Hz), 7,26 (m, 2H), 7,33 (m, H), 7,42 (m, 4H), 9,74 (s, 1H);

¹³C NMR (100 MHz) δ 6,7, 54,9, 62,8, 3,3,4,4, 4,8,139,1,204,6;

FABMS m/z 408,2 (M+MB), 254,2 (M+H), 22,2 (M-CHO);

podle HRFABMS vypočítáno C17H20NO M_r 254,1545 (M+H); nalezeno M_r 254,1545.

(2S, 2R)-2-(N,N-dibenzylamino)3-oktadekanol (60)

V dvouhrdlé baňce s refluxovým kondenzátorem byla smíchána páska hořčíku (viz Schéma 1; 237 mg, 9,75 mmol) s dibromethanem (16 μΐ, 0,189 mmol) v THF. Bylo přidáno 0,5 ml roztoku 1-brompentadekanu (970 mg, 3,33 mmol, 3,25 ml THF). Potom, co reakce začala, byl po kapkách přidán zbytek. Do našedivělého roztoku byla po kapkách přidána sloučenina 50 (105 mg, 0,413 mmol) v THF (0,5 ml). Směs byla míchána přes noc a pak byla přidána voda (5 ml) a 0,lM HCI, až se roztok vyčeřil. Směs byla extrahována EtOAc (3x10 ml). Organická vrstva byla promyta 5% NaHCO3, pak nasyceným roztokem chloridu sodného a usušena na MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za vzniku 750 mg směsi oleje a pevné látky. Surový materiál byl purifikován flashovou chromatografií na silikagelu (hexan/EtOAc 8:1, Rf - 0,34) za vzniku 120 mg pevné látky. Tato pevná látka byla dále purifikována HPLC na silikagelu (hexan/EtOAc 93:7) za vzniku bezbarvé voskovité pevné látky (94,7 mg, výtěžek 49 hmotn. %).

[cc]²⁵d = +16,3 (c 1,CHC1₃);

’H NMR (500 MHz, CDC1₃), δ 0,88 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,10 (d, 3H, J = 6,7 Hz), 1,16-1,41 (bm, 26H), 1,56 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 2,72 (quin, 1H, J = 6,7 Hz), 3.47 (d,

2H, J = 13.8 Hz), 3.60 (m, 1H), 3.76 (d, 2H, J = 13.8 Hz), 7.22 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.34 (m, 4H);

^I3C NMR (1 MHz) δ 8,67, 14,11, 22,68, 25,90, 29,35, 29,61, 29,64, 29,68, 29,69, 31,91,

34,27, 54,79, 57,26, 73,65, 2,89, 4,25,4,77, 140,17;

• · • ·

FABMS m/z 465 (M+H), 488 (M-H₂O), 464 (M-H), 388 (M-Ph), 224 (M-C₁₆H₃₃O);

podle HRFABMS vypočítáno C₃₂H5₂NO M_r 466,4049 (M+H); nalezeno M_r 466,4037.

Stanovení konfigurace 2S, 2R je založeno na srovnání chemických posunů benzylových protonů ve sloučenině 60 vzhledem k hodnotám pro syn a anti-diastereoizomery 2-(N,N-dibenzylamino)-3-pentanolu uvedeným v literatuře. Izomer anti má rozdíl v chemickém posunu 0,29 ppm a syn 0,52 ppm. Porovnání dalších syn-anti párů dává rozsah pro syn izomer 0,44-0,54 ppm a pro anti izomer 0,05-0,29 ppm. Hodnota pro sloučeninu 60 je 0,29 ppm.

(2S, 2R)-2-amino-3-oktadekanol (1)

V 15ml baňce s kulatým dnem byla smíchána sloučenina 60 (viz Schéma 1; 88,2 mg, 0,189 mmol) v MeOH (2 ml) s 20% Pd(OH)₂-C (11 mg). Směs byla atmosférického tlaku míchána pod vodíkem přes noc. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes 25mm filtr v injekční stříkačce (nylonová membrána 0,2 pm) a filtr byl promyt 4 ml MeOH. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za vzniku 51,50 mg bílé pevné látky. Produkt byl chromatograficky purifikován na 6ml trubici LC-Si SPE (CH₂Cl₂/MeOH 90:10, pak 100% MeOH) za vzniku 49,47 mg bílé pevné látky (výtěžek 92 hmotn. %). 49 hmotn. %).

Bod tání 66-67 °C [ot]²⁶D =+24,9 (c 1,CHC1₃);

‘Η NMR (500 MHz, CDOD), δ 0,89 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,05 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 1,20-1,56 (bm, 31H), 2,81 (qd, IH, J, = 6,6 Hz, J₂= 3,8 Hz), 3,42 (dt, IH, J, - 8,8 Hz, J₂= 3,8 Hz); ¹³C NMR (1 MHz) δ 14,60, 16,82, 23,90, 27,40, 30,65, 30,90, 30,95, 30,96, 33,23, 34,13,

52,33, 76,16;

FABMS m/z 286,3 (M+H), 268,3 (M-OH);

podle HRFABMS vypočítáno CigEUoNO M_r 286,3110 (M+H); nalezeno M_r 286,3109.

Směs diastereoizomerů 3-hydroxy-2-( 1 -methyl-2,2-hydroxyheptadecyl)isoindolin-1 -onu (152, 22 mg) byla separována HPLC na kyanidu ve směsi hexan/ 2-propanol (98:2,1 ml/min) za vzniku 4 sloučenin (152a-152d). Čistota každého píku byla dána reinjekcí na HPLC.

Analytický výpočet pro Q26H44NO3: 418,3321 (M+H); nalezeno 418,3321 (HRFABMS).

Sloučenina 152a (4 mg; t_r = 13,3 min) *H NMR (CDCb), δ 7,77 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,58 (m, 2H), 7,50 (m, 1H), 5,91 (s, 2H), 4,51 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,40 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,24 (m, 26H), 0,87 (t, 3H,

J = 6,5 Hz);

FABMS m/z 418,400;

relativní poměr diastereoizomerů 17:1:0:0 (152a:152b:152c:152d)

Sloučenina 152b (13,7 mg; t_r = 13,9 min) *H NMR (CDCb), δ 7,70 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,54 (m, 2H), 7,47 (m, 1H), 5,88 (s, 2H), 4,37 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 1,52 (m, 2H), 1,27 (d, 3H, J = 7 Hz), 1,25 (m, 26H), 0,87 (t, 3H, J = 6,5 Hz);

FABMS m/z 41,400;

relativní poměr diastereoizomerů 1:6:8:0:0 (152a:152b:152c:152d)

Sloučenina 152c (1,4 mg; t_r = 20,0 min) ^]H NMR (CDCb), δ 7,78 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,59 (m, 2H), 7,51 (m, 1H), 5,93 (s, 2H), 4,12 (m, 1H), 3,99 (m, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,37 (d, 3H, J - 7,0 Hz), 1,25 (m, 26H), 0,87 (t, 3H, J = 6,5 Hz);

FABMS m/z 418, 400;

relativní poměr diastereoizomerů 0:2,5:45:1 (152a:152b:152c:152d)

Sloučenina 152d (1,5 mg; t_r = 21,7 min) ’H NMR (CDCb), δ 7,77 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,59 (m, 2H), 7,51 (m, 1H), 5,86 (s, 2H), 4,12 (m, 1H), 3,90 (m, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,45 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 1,24 (m, 26H), 0,87 (t, 3H, J = 6,5 Hz);

FABMS m/z 418, 400;

relativní poměr diastereoizomerů 0:1:2:21 (152a:152b:152c:152d) ·· • · · · *

Každý diastereoizomer byl zvlášť deprotektován způsobem podle Osbyho a kol. Každý izomer byl rozpuštěn ve směsi 2-propanol/voda (6:1, O,1M pro 152a a 152b; 0,7M pro 152c a 152d). K roztoku byl přidán tetrahydridoboritan sodný (5-10 ekvivalentů) a směs byla míchána 24 hodin při 25 °C. Každý roztok byl pak adjustován na pH 4,5 kyselinou octovou a míchán při 80 °C dalších 24 hodin. Byl přidán amoniumformiat pro zvýšení pH nad 7 a rozpouštědlo bylo odstraněno proudem dusíku. Reziduum z každé reakční směsi bylo naneseno na sloupec silikagelu SPE, který byl napřed promyt směsí hexan/ 2-propanol (9:1) a produkt byl eluován 2-propanolem. Pomocí ^!H NMR bylo zjištěno, že sloučeniny 152a a 152d daly vznik sloučenině 154 (1,15 mg, 40 hmotn. % a 0,48 mg, 47 hmotn. %; v tomto pořadí), zatímco sloučeniny 152b a 152c daly vznik sloučenině 155 (3,35 mg, 42 hmotn. % a 0,38 mg, 40 hmotn. %; v tomto pořadí).

Sloučenina 154

Bílá pevná látka; TLC na silikagelu (CHCh/l-BuOH/AcOH/ILO 3:12:2:2): Rf = 0,48, pozitivní na ninhydrin - růžová.

IR (NaCl) 2919, 2851, 1563, 1466, 1406, 758 cm’¹;

FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44;

podle HRFABMS vypočítáno CisKtoNO M_r 286,3110 (M+H); nalezeno M_r 286,3115.

Sloučenina 155

Bílá pevná látka; TLC na silikagelu (CHCb/l-BuOH/AcOH/HžO 3:12:2:2): Rf = 0,50, pozitivní na ninhydrin - růžová.

IR (NaCl) 3281, 2917, 2849, 1568, 1520, 1412 cm'¹;

FABMS m/z 438,286,268, 85, 70, 69, 57, 55, 44;

podle HRFABMS vypočítáno CigFUoNO M_r 286,3110 (M+H); nalezeno M_r 286,3109.

• ·

• · · · · · ·

Acetylace

Podíl frakce B (560 pg) byl rozpuštěn v acetanhydridu (200 μΐ) a pyridinu (400 μΐ) a směs byla míchána při 25 °C 4,5 hodiny. Po této době nebyl na TLC pozorovatelný žádný výchozí materiál. Rozpouštědlo bylo odstraněno proudem dusíku za vzniku AcB: špinavě bílé pevné látky;

TLC na silikagelu R_f = 0,86 (CHCl₃/l-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2; kyselina fosfomolybdenová), 0,65 (CHCl₃/MeOH 9:1; kyselina fosfomolybdenová);

IR (NaCl) 2922, 2853, 1741, 1651, 1547, 1460, 1371, 1234, 1022, 970 cm'¹;

FABMS m/z 370, 310, 268;

CIMS m/z 426, 424, 412, 410, 398, 384, 370, 368, 364, 338, 324, 310, 165, 149, 139, 1, 121,

111,97,86,61,57,55;

podle HRFABMS vypočítáno C22H44NO3 M_r 370,3321 (M+H); nalezeno M_r 370,3326.

Triacetylsfingosin (133)

Při postupu podobném postupu podle Groda a Cardelliny byla směs D-erythro-sfingosinu (4,2 mg, 6,7 pmol, Sigma) v acetanhydridu (1 ml) a pyridinu (2 ml) míchána při 25 °C 4,5 hodiny. Po této době nebyl na TLC pozorovatelný žádný výchozí materiál. Rozpouštědlo bylo odstraněno proudem dusíku za vzniku sloučeniny 133 jako bílé pevné látky;

TLC na silikagelu R_f = 0,86 (CHC1₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2; kyselina fosfomolybdenová), 0,65 (CHCl₃/MeOH 9:1; kyselina fosfomolybdenová);

FABMS m/z 580, 426, 366, 306, 264;

CIMS m/z 468, 454, 426, 424, 394, 366, 364, 306, 264, 144, 85, 84, 83, 61.

(2S, 2S)-2-acetamido-3-acetoxyoktadekan (156)

Směs (2S, 3R)-2-amino-3-oktadekanolu (155; 750 pg, 2,6 pmol) v acetanhydridu (200 pl) a pyridinu (400 pl) byla míchána při 25 °C 5 hodin. Po této době nebyl na TLC pozorovatelný žádný výchozí materiál. Rozpouštědlo bylo odstraněno proudem dusíku za vzniku sloučeniny

157 jako bílé pevné látky;

• ·

TLC na silikagelu R_f = 0,86 (CHC1₃/1-BuOH/AcOH/H₂O 3:12:2:2; kyselina fosfomolybdenová);

FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268;

podle HRFABMS vypočítáno C22H44NO3 M_r 370,3321 (M+H); nalezeno M_r 370,3319.

Acetonid spisulosinu 285 (146)

Podíl frakce A (40 pg) byl rozpuštěn v acetonu (200 pl) a ke směsi byla přidána 0,lM kyselina chlorovodíková (20 pl). Tato směs byla míchána při 25 °C 24 hodin. Po této době bylo rozpouštědlo odstraněno proudem dusíku. Z FABMS byl patrný vznik malého množství acetonidu 146;

FABMS m/z 592, 452, 438, 326.3430, 300, 286, 268;

podle HRFABMS vypočítáno C21H44NO M_r 326,3423 (M+H); nalezeno M_r 326,3430.

(4S, 5R)-4-methyl-5-(n-pentadecyl)oxazolidinon (158) (2S, 3R)-2-amino-3-oktadekanol (155; 750 pg, 2,6 pmol) byl rozpuštěn v dichlormethanu (100 pl) a ke směsi byl přidán l,l'-karbonyldiimidazol (0,85 mg, 5,3 pmol) a triethylamin (0,4 pl, 2,9 pmol). Roztok byl míchán 5 hodin. Po této době bylo rozpouštědlo odstraněno proudem dusíku. Surový produkt 158 byl analyzován bez další purifikace;

IR (NaCI) 36, 3919, 2851, 1742, 1713, 1551, 1470, 1395, 1321, 49, 1239, 1094, 1061, 1001,

768,743,664 cm'¹;

FABMS m/z 785, 623, 474, 406, 362, 328, 312, 286, 268;

podle HRFABMS vypočítáno CicTLgNCLMr 312,2903 (M+H); nalezeno M_r 312,2903.

Další výzkum změn v buněčné morfologii

Materiály

Kyselina lysofosfatidová (LPA), protilátky proti tubulinu a faloidin byly dodány společností Sigma. Fluoresceinové kozí protilátky proti myším a červeně značené kozí protilátky proti myším Texas byly dodány společností Amersham (Velká Británie). Protilátka proti proteinu Rho byla dodána společností Sta Cruz Biotechn.

• φ • · • · • · • φ φ φ « • · · · φ φ φ · φ

Buněčné kultury

Buňky vero byly pěstovány na Dulbeccově mediu Eagle obohaceným 10% fetálním hovězím sérem. K těmto kulturám byl přidáván spisulosin nebo LPA do koncentrace 0,2 - 1,0 pg a 50 - 10 μΜ (v tomto pořadí) od 4 do 24 hodin. Buňky byly počítány hemocytometrem s vyloučením léčiv za použití roztoku v 0,4% Trypan Blue v pufrované solance podle Hankse (Celis a Celis, „General Procedures for Tissue Culture in Cell Biology, a Laboratory Handbook“ Academie Press Inc, Vol 1, str.5-17).

Příklad 1

Spisulosin 285 způsobuje změny v buněčné morfologii

Vero buňky byly 4 hodiny inkubovány spisulosinem 285 (0,5 pM). Výkres 3 je mikrofotografie výsledků Příkladu A. Tvar buněk se změnil z polygonálního (neošetřené brníky, panel a) na vřeteno vitý (panel b). Panel c znázorňuje větší zvětšení kultury, k níž byl přidán spisulosin.

Příklad B

Změna v buněčné morfologii je způsobena účinkem na buněčná mikrofilamenta

Pro zjištění organizace mikrofilament a mikrotubulů v buňkách ošetřených spisulosinem byly buňky obarveny faloidinem pro detekci aktinových polymerů a antitubulinovou protilátkou pro detekci tubulinu.

Vero buňky byly inkubovány v přítomnosti (panel b, d) nebo v nepřítomnosti (panel a, c) 0,5 pM spisulosinu 4 hodiny. Buňky vyrostlé v COVERSLIPS byly fixovány methanolem při -20 °C (pro tubulinové protilátky) nebo 4 % (obj. %) paraformaldehydem v solance pufrované fosfátem (PBS) pro inkubaci faloidinu. V druhém případě byly buňky promyty 0,2% Tritonem XI00 v PBS. COVERSLIPS byly omyty PBS a inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti s tubulinovou protilátkou (zředěnou 1/1000 v PBS) nebo s faloidinem (1 mg/ml). Po omytí PBS byly COVERSLIPS inkubované s tubulinovou protilátkou převrstveny fluoresceinovými kozími protilátkami proti myším a červeně značenými kozími • · protilátkami proti myším Texas (zředěnými 1:50 v PBS). COVERSLIPS byly zality

Mowiolem a uchovány při 4 °C až do chvíle pozorování.

Výkres 4 je mikrofotografie výsledků Příkladu B. Panel a ukazuje buňky obarvené faloidinem (aktinová skvrna) a neošetřené spisulosinem. Panel b ukazuje buňky obarvené na faloidin a ošetřené spisulosinem. Panel c ukazuje buňky obarvené na tubulin a neošetřené spisulosinem. Panel d ukazuje buňky obarvené na faloidin a ošetřené spisulosinem. U buněk ošetřených spisulosinem je znatelný dramatický pokles v množství aktinu ve srovnání s neošetřenými buňkami. Za stejných podmínek zůstává mikrotubulová síť v polymerizované formě.

Příklad C

Účinek spisulosinu na protein Rho

Malý protein Rho vážící GTP má funkci při tvorbě aktinomyosinových „stresových vláken“ (Halí, A.: Science, 279, 1998, str. 509-514). Proto byly elektroforetická mobilita a rozložení buněk proteinu Rho v buňkách ošetřených spisulosinem analyzovány.

V panelu B byl pokus proveden tak, jak je popsáno výše, homogenát byl však frakcionován na částicovou (membrána, „M“) frakci a rozpustnou („S“) frakci.

Subcelulární frakcionace byla provedena umístěním buněk do hypotonického pufru (0,25M sacharosa, 20mM HEPES pH 7,4, 2mM EDTA, lmM PMSF, 10 pg/ml aprotinin, leupeptin a pestatin) a lysováním s Dounce. Homogenát byl napřed centrifiigován při 30 000 g 1 hodinu (4 °C) a byla izolována peletizovaná částicová frakce (předpokládaná membránová frakce) a supernatant. Různé frakce byly charakterizovány elektroforézou a Western blottingem za použití protilátky proti proteinu Rho.

Při ošetření buněk spisulosinem nebyla pozorována žádná změna v množství nebo mobilitě Rho. V částicové frakci byl však pozorován pokles podílu Rho.

Příklad D

Účinek kyseliny lysofosfatidinové (LPA) na činnost spisulosinu

LPA zvyšuje množství stresových vláken v buňkách aktivací proteinu Rho. Byl studován účinek LPA na buňky ošetřené spisulosinem a na neošetřené buňky.

• · φ φ φ · φ φ φ φ • · · φ φφ φφ

Věro buňky byly 2 hodiny inkubovány v nepřítomnosti (a) nebo v přítomnosti (b) ΙΟμΜ LPA nebo 20 hodin v přítomnosti 0,5μΜ spisulosinu nebo 2 hodiny v přítomnosti ΙΟμΜ LPA a následně 18 hodin v přítomnosti 0,5μΜ spisulosinu.

Výkres 6 je mikrofotografie výsledků Příkladu D. Panel b znázorňuje účinek LPA ve zvýšení množství aktinu. Inkubace vero buněk spisulosinem po 24 hodin vedla ke vzniku oblých buněk, viz panel c. Tyto buňky se oddělí od kultivační misky a zahynou. Přídavek LPA těsně před spisulosinem zabraňuje morfologické změně způsobené spisulosinem.

Údaje z pokusů in vivo

Příklad E

Účinek spisulosinu in vivo

Spisulosin byl testován v pokusech in vivo proti modelům štěpů rakovinných buněk lidské prostaty (PC-3) a lidských ledvin (MRI-H-121). V těchto modelech se používají subkutánně implantované kompaktní lidské nádory, které během doby rostou a zvětšují svůj objem. Jako základ pro srovnání slouží střední objem růstu nádoru v kontrolních zvířatech. Při aplikaci aktivních sloučenin je růst nádoru inhibován buď úplně ( % hodnoty T/C jsou menší než 1 % nebo negativní), nebo částečně (T/C v intervalu 1 % - 50 %). Aktivita, kde T/C je menší než 40 %, je statisticky signifikantní. Aplikované dávky spisulosinu byly maximální tolerovatelnou, nikoliv letální dávkou (MTD), % MTD a % MTD. Přípravek byl dodáván intraperitoneálně.

Tabulka VI. Rakovina lidské prostaty PC-3

Sloučenina	Celková dávka (mg/kg)	/»11	Den	Poznámky
Spisulosin 285	9,990	-21 %	11	stase (kompletní remise)
Spisulosin 285	5,010	-1 %	11	stase (kompletní remise)
Spisulosin 285 Kontrola	2,499	223 % 100%	15 15

4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4

Tabulka VII. Rakovina ledvin MRI-H-121

Sloučenina	Celková dávka (mg/kg)	: % T/C	Den	Poznámky
Spisulosin 285	9,990	28%	11	inhibice(kompletní remise)
Spisulosin 285	5,010	35 %	11	inhibice (kompletní remise)
Spisulosin 285 Kontrola	2,499	43% 100 %	15 15

Spisulosin 285 je účinný proti oběma typů nádorů a va větších dávkách značně snižuje velikost nádoru v případě rakoviny lidské prostaty model PC-3. Spisulosin snižuje růst rakovinných buněk lidské prostaty s účinkem trvajícím až několik týdnů po poslední dávce přípravku.

Příklad F

Byl proveden rozšířený screening účinků spisulosinu proti sériím různých buněčných linií in vitro. Byly získány následující údaje (viz Tab. VIII).

Tabulka VIII.

Kategorie	Linie	Nádor	IC50	CV-1 Terapeutický index
Kompaktní	SK-HEP-1	Játra	3,51 10-15	7863
	PANC-1	Pankreas	1,71.10-12	16
	HIT-29	Tlusté střevo	2,56.10-12	11
	786-0	Ledviny	2,75.10-12	10
	FADU	Hlasivky	4,99.10-12	6
	Hs 746T	Žaludek	7,89.10-12	3
	SK-OV-3	Vaječníky	1,40.10-11	2
	MX-1	Mléčná žláza	3,89.10-11	1
	RAMOS	Burkitts	4,82.10-11	1
	P3HR1	Burkitts	6,73.10-11	0
	SW684	Fibrosarkom	1,05 .10-9	0
Lymfom	U-937	Lymfom	1,96.10-11	1
	H9	Lymfom	3,10.10-11	1
Leukémie	HL60	Leukémie	8,50.10-12	3
	ARH77	Leukémie	1,36.10-12	2
	K562	Leukémie	1,57.10-11	2
	CCRF-SB	Leukémie	1,05.10-9	0
	CV-1	Fibroblasty ledvin	2,76.10-11	1

• · · 9 • ·

• ·

Rozsah dávek IC50 účinných proti liniím nádorových buněk je nanomolámí (l,05.10⁹; nM) až fentamolámí (3,51.10‘¹⁵; fM). Je jen málo přípravků s aktivitou mimo rámec nM až pM - v rámci fM.

Aktivity proti kompaktním nádorům byly obecně o 1 log větší než proti leukémiím a lymfomům. Mezi kompaktními nádory byly nejpomaleji rostoucí nádory nej citlivější, viz např. velmi pomalu rostoucí jatemí nádor SK-HEP-1.

Nej lepších terapeutických výsledků ve srovnání s normální buněčnou linií CV-1 bylo dosaženo u pomalu rostoucích kompaktních nádorů; potenciál IC50 (2,76.10'¹¹) byl srovnatelný s leukémiemi/ lymfomy. Terapeutické indexy pro kompaktní nádory se pohybovaly v rozmezí 1-20 jednotek a pro jatemí nádory byly tyto hodnoty větší než 3 log.

Linie nádorových buněk ledvin byla v nejaktivnější skupině, pM, která koreluje s údaji získanými ze štěpů in vivo.

Odkazy

Následující odkazy představují doplňující informace vztahující se k vynálezu.

Faulkner, D.J.: Nat. Prod. Rep. 1991, 8, 97-147

Munro, M.H.G.; Luibrand, R.T.; Blunt, J.W. In: Bioorganic Marině Chemistry

Scheuer, P.J., Ed.; Springer-Verlag: Berlin, 1987, sv. 1, str. 93-176

Bergmann, W.; Burke, D.C.: J. Org. Chem. 1955, 20, 1505-1507

Bergmann, W.; Burke, D.C.: J. Org. Chem. 1956, 21, 226-228

Bergmann, W.; Stempien, M.F., Jr.: J. Org. Chem. 1957, 22, 1575-1577

Rinehart, K.L., Jr.; Gloer, J.B.; Hughes, R.G., Jr.; Renis, H.E.; McGovren, J.P.; Swyenberg, E.B.; Stringfellow, D.A.; Kuentzel, S.L.; Li, L.H.: Science 1981,212, 933-935 Rinehart, K.L.; Kishore, V.; Bible, K.C.; Sakai, R.; Sullins, D.W.; Li, K.-M.: J. Nat. Prod., 1988, 51, 1-21

Rinehart, K.L.; Kishore, V.; Nagarajan, S.; Lake, R.J.; Gloer, J.B.; Bozích, F.A.; Li, K.-M.;

Maleczka, R.E., Jr.; Todsen, W.L.; Munro, M.H.G.; Sullins, D.W.; Sakai, R.: J. Am. Chem.

Soc. 1987, 109,6846-6846

Pettit, G.R.; Herald, C.L.; Doubek, D.L.; Herald, D.L.; Arnold, E.; Clardy, J.: J. Am. Chem.

Soc. 1982, 104, 6846-6848

·· ·· • ·

Kraft, A.S.; Smith, J.B.; Berkow, R.L.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1986, 83, 1334-1338 Kupchan, S.M.; Britton, R.W.; Ziegler, M.F.; Sigel, C.W.: J. Org. Chem. 1973, 38, 178-179 Still, W.C.; Kahn, M.; Mitra, A.J.: Org. Chem. 1978,43, 2923-2925

Blunt, J.W:; Calder, V.L.; Fenwick, G.D.; Lake, R.J.; McCombs, J.D.; Munro, M.H.G.; Perry, N.B.: J. Nat. Prod. 1987, 50, 290-292 Foucault, A.P.: Anal. Chem. 1991, 63, 569A-579A

McAlpine, J.B.; Hochlowski, J.E.: In Natural Products Isolation; Wagman, G.H.; Cooper, R., Eds.: J. Chromatogr. Lib. 43; Elsevier: New York, 1989, kap. 1

Countercourrent Chromatography: Theory and Prectice; Mandava, N.B.; Ito, Y., Eds: Chromatography Science 44; Dekker: New York, 1988

Conway, W.D. Countercurrent Chromatography: Apparatus, Theury and Applications; VCH: New York, 1990

Marston, A.; Slacanin, I.; Hostettmann, K.: Phytochem. Analysis 1990, 1,3-17

Schaufelberger, D.E.: J. Chromatogr. 1991, 538, 45-57

Ito, Y.J.: Chromatogr. 1981, 214, 122-1

Bruening, R.C.; Oltz, E.M.; Furukawa, J.; Nakaninshi, K.; Kustin, K.: J. Nat. Prod. 1986, 49, 193-204

Pettit, G.R.; Gao, F.; Sengupta, D.; Coli, J.C.; Herald, C.L.; Doubek, D.L.; Schmidt, J.M.;

Van Camp, J.R.; Rudloe, J.J.; Nieman, R.A.: Tetrahedron 1991, 47, 3601-3610

Kohmoto, S.; McConnel, O.J.; Wright, A.; Cross, S.: Chem. Lett. 1987,1687-1690

Martin, D.G.: In Countercurrent Chromatography: Theory and Practice; Mandava, N.B.; Ito,

Y., Eds.: Chromatography Science 44; Dekker: New York, 1988, kap. 9

Marayama, W.; Kobayashi, T.; Kosuge, Y.; Yano, H.; Nunogaki, Y.; Nunogake, K.J.:

Chromatogr. 1982, 239, 643-649

Schaufelberger, D.E.; Chmurný, G.N.; Beutler, J.A.; Kolek, M.P.; Alvarado, A.B.; Schaufelberger, B.W.; Muschik, G.M.: J. Org. Chem. 1991, 56, 1895-2900 Schaufelberger, D.E., Sandoz Pharma AG, personál communication, 1991 Pettit, G.R.; Gao, F.; Herald, D.L.; Blumberg, P.M.; Lewin, N.E.; Neiman, R.A.: J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6693-6695

Kernan, M.R.; Molinski, T.F.; Faulkner, D.J.: J. Org. Chem. 1988, 53, 5014-5020

Murata, M.; Legrand, A.M.; Iswhibashi, Y.; Fukani, M.; Yasumoto, T.: J. Am. Chem. Soc.

1990, 112, 4380-4386

• · · · • · · · • · · · * • · · · • · · · • » · • · ·

Sakemi, S.; Ichiba, T.; Kohomoto, S.; Saucy, G.; Higa, T.: J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 4851-4853

Sakemi, S.; Higa, T.; Anthoni, U.; Christophersen, C.: Tetrahedron 1987,43, 263-268 Sun, H.H.; Cross, S.S.; Gunasekera, M.; Koehn, F..E.: Tetrahedron 1991, 47, 1185-1190 Kohomoto, S.; McConnel, O.J.; Wright, A.; Koehn, F.; Thompson, W.; Lui, M.; Snader, K.M.; J. Nat. Prod. 1987, 50, 336

Ravi, B.N.; Perzanovski, H.P.; Ross, R.A.; Erdman, T.R.; Scheuer, P.J.; Finer, J.; Clardy, J.: Pure and Applied Chem. 1979, 51, 1893-1900 Clardy, J.: Pure and Appl. Chem., 1979, 51, 1893-1900

Rinehart, K.L., Jr.; Sakai, R.; Stroh, J.G.: americký patent 4,948,791, 1990; Chem. Abs. 1991, 114,214413h

Stierle, A.C.; Cardellina, J.H.; II; Singelton, F.L.: Experimentia 1988, 44, 1021

Schmitz, F.J.; Vanderah, D.J.; Hollenbeak, K.H.; Enwall, C.E.L.; Gopichard, Y.; SenGupta, P.K.; Hossain, Μ.Β.; van der Helm, D.: J. Org. Chem. 1983,48, 3941-3945 Dillman, R.L.; Cardellina, J.H.: II J. Nat. Prod. 1991, 54, 1159-1161

Stierle, A.C.; Cardellina, J.H. II; Strobel, G.A.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1988, 85, 80088011

Stierle, A.A.; Cardellina, J.H., II; Singelton, F.L.: Tetrahedron Lett. 1991, 32,4847-4848 Raub, M.F.; Cardellina, J.H., II; Choudhary, M.I.; Ni, C.-Z.; Clardy, J.; Alley, M.C.: J. Am. Chem. Soc. 1991, 113,3178-3180

Sakemi, S.; Totton, L.E.; Sun, H.H.: J. Nat. Prod. 1990, 53, 995-999

Stierle, D.B.; Faulkner, D.J.: J. Nat Prod. 1991, 1134-1136

Kohomoto, S.; McConnel, O.J.; Wright, A.: Experimentia 1988, 44, 85-86

Sun, H.H.; Sakemi, S.: J. Org. Chem. 1991, 56, 4307-4308

Dillman, R.L.; Cardellina, J.H. II: J. Nat. Prod. 1991, 54,1056-1061

Sakai, R.; Kohmoto, S.; Higa, T.; Jefford, C.W.; Bemardinelli, G.: Tetrahedron Lett. 1987, 28, 5493-5496

Bobzin, S.C.; Faulkner, D.J.: J. Org. Chem. 1991, 56, 4304-4307

Sakemi, S.; Sun, H.H.: J. Org. Chem. 1991, 56, 4304-4307

Keifer, P.A.; Schwartz, R.E.; Koker, M.E.S.; Hughes, R.G., Jr.; Rittschoff, D.; Rinehart,

K.L.: J. Org. Chem. 1991, 56, 2965-2975

Schaufelberger, D.E.; Pettit, G.R.: J. Liq. Chromatogr. 1989,12,1909-1917 • φ φφ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φφ φφ

Pettit, G.R.; Herald, C.L.; Leet, J.E.; Gupta, R; Schaufelberger, D.E. Bates, R.B.; Clelow, P.J.; Doubek, D.L.; Manfredi, K.P.; Rutzler, K.; Schmidt, J.M.; Tackett, L.P.; Ward, F.B.; Bruck, M.; Camou, F.: Can. J. Chem. 1990, 68, 1621-1624

Schmitz, F.J.; DeGuzman, F.S.; Choi, Y.-H-; Hossain, M.B.; Rizvi, S.K.; van der Helm, D.: Pure and Applied Chem. 1990, 62, 1393-1396

Schmitz, F.J.; DeGuzman, F.S.; Hossain, M.B.; van der Helm, D.: J. Org. Chem., 1991, 56, 804-808

Gunawardana, G.P.; Kohmoto, S.; Gunasekera, S.P.; McConnel, O.J.; Koehn, F.E.: J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 4856-4858

Gunawardana, G.P.; Koehn, F.E.; Lee, A.Y.; Clardy, J.; He, H.-y.; Faulkner, D.J.: J. Org. Chem. 1992, 57, 1523-1526

Gunawardana, F.P.; Kohmoto, S.; Burres, N.S.: Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4359-4362 Sakemi, S.; Sun, H.H.; Jefford, C.W.; Bemardinelli, G.: tetrahedron Lett. 1989, 30, 25172520

Sun, H.H.; Sakemi, S.; Burres, N.; McCarthy, P.: J. Org. Chem. 1990,4964-4966 Perry, N.B.; Blunt, J.W.; Munro, M.H.G.; Higa, T.; Sakai, R.: J. Org. Chem. 1988, 53,43-44 Jares-Erijman, E.A.; Sakai, R.; Rinehart, K.L.: J. Org. Chem. 1991, 56, 5712-5715 Berlinck, R.G.S.; Braekman, J.C.; Daloze, D.; Hallenga, K.; Ottinger, R.; Bruno, I.; Riccio, R.: Tetrahedron Lett. 1990, 31, 6531-6534

Kashman, Y.; Hirsh, S.; McConnel, O.J.; Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kakisawa, H.: J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,8925-8926

Rinehart, K.L.; Holt, T.G.; Fregeau, N.L.; Stroh, J.G.; Keifer, P.A.; Sun, F.; Li, L.H.; Martin, D.G.: J. Org. Chem. 1990, 55, 4512-4515

Wright, A.E.; Forleo, D.A.; Gunawardana, G.P.; Gunasekera, S.P.; Koehn, F.E.; McConnel, O.J.: J. Org. Chem. 1990, 55, 4508-4512

Vaught, K.C.A.: Classification of the Living Mollusca; Abbott, R.T.; Boss, K.J., Eds.; American Malacologists: Melboume, FL 1989, str. 113-6

Brusca, R.C.; Brusca, G.J.: Intervertebrates; Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1990, str. 706-709

Barnes, R.D.: Intervertebrate Zoology, 4. vydání, Saunders College: Philadelphia, 1980, str.

425 tf tftf • · • tftf • · · • · · tf tftf

Engemann, J.G.; Hegner, R.W.: Intervertebrate Zoology, 3. vydání, Macmillan, New York, 1981, str. 454-467

Palameta, B.; Proštenik, M.: Croat. Chem. Acta 1961, 33, 133-135

Kawano, Y.; Highchi, R; Isobe, R.; Komori, T.: Liebigs Ann. Chem. 1988, 19-24

Gulavita, N.K.; Scheuer, P.J.: J. Org.Chem. 1989, 54, 366-369

Jimenez, C.; Crews, P.: J. Nat. Prod. 1990, 53, 978-982

Moři, K.; Matsuda, H.: Liebigs Ann. Chem. 1992,131-137

Proštenik, M.; Alaupovic, P.: Croat. Chem. Acta 1957, 29, 393-402

Osby, J.O.; Martin, M.G.; Ganem, B.: Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096

Stoffel, W.: Ann. Rev. Biochem. 1971, 40, 57-82

Merrill, A.H., Jr.; Nimkar, S.; Menaldino, D.; Hannun, Y.A.; Loomis, C.; Bell, R.M.; Tyagi, S.R:; Lambeth, J.D.; Stevens, V.L.; Hunter, R.; Liotta, D.C.: Biochemistry 1989, 28, 31383145

Hannun, Y.A.; Bell, R.B.: Science 1989, 243, 500-507

Merrill, A.H., Jr.: J. Bioenerg. Biomem. 1991, 23, 83-104

Witten, J.L.; Schaffer, M.H.; O'Shea, M.; Cook, J.C.; Hemling, M.E.; Rinehart, K.L., Jr.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984, 124, 350-358

Shaw, P.D.; McClure, W.D.; Van Blaricom, F.; Sims, J.; Fenical, W.; Rudé, J.: In Food and Drugs from the Sea 1974; Webber, H.H.; Ruggieri, G.D., Eds; Marině Technological Society: Washington, DC, 1976, str. 429-433

Herrmann, E.C., Jr.: Progr. Med. Virol. 1961, 3, 158-192

Grode, S.H.; Cardellina, J.H., II Lipids, 1983, 18, 889-893

Mackay and Halí: J. Biol. Chem., 273,20685-20688,1998

Halí, A.: Science 179, 509-514, 1998

Itoh a kol.: Nátuře Medicine, sv. 5, č. 2, 1999

Celis and Celis: General Procedures for Tissue Culture in Cell Biology, a Laboratory Handbook, Academie Press lne., sv. 1, str. 5-17

Vynález byl zde detailně popsán včetně výhodných provedení. Odborník může s výhodou při uvážení uvedeného popisu provádět modifikace a/ nebo zlepšení vynálezu.

• Φ ·· • · · · • φ φ φ • · φ φ φ • · · φ ·· Φ·

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká nových farmaceutických přípravků obsahujících alkan nebo alken s dlouhým přímým řetězcem a 2-aminoskupinou a 3-hydroxyskupinou ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem s protinádorovým účinkem. Jeden aspekt vynálezu se týká protinádorových sloučenin z mořských organismů.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický přípravek, v y z n a č u j í c í se t i m, že obsahuje alkanovou nebo alkenovou sloučeninu s dlouhým přímým řetězcem, která má 2-aminoskupinu a 3hydroxyskupinu, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že tato sloučenina je substituovaný 2-amino-3-hydroxyalkan nebo 2-amino-l,3-dihydroxyalken.
3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 a 2, vyznačující se tím, že tato sloučenina je substituovaný alkan nebo alken C16-C24.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 až 3, vy z n a č uj í c í se tím, že tato sloučenina je substituovaný alkan C18-C20.
5. 5. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že tato sloučenina je 2-amino-3-hydroxyalkan Cis.
6. 6. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že tato sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující sloučeniny obecného vzorce I kde spisulosin 285 má n = 12, spisulosin 299 má n = 13 a spisulosin 313 má n = 14, dále sloučeniny obecného vzorce Π

   CHrfCřtín' kde sfingosin má n = 12 a nonadeka-4-sfingenin má n = 14 a dále sfmga-l,4-dien obecného vzorce III

   OH

   NHo (II)

   OH ·· ··

   I 9 9 « • · <

   • ·
7. 7. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že je použitelný při léčbě rakoviny.
8. 8. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že je použitelný při léčbě rakoviny vybrané ze skupiny obsahující rakovinu prsu, hlavy a krku, prostaty, močového měchýře, pankreatu, plic, jícnu, jater, tlustého střeva, štítné žlázy, melanomy, rakovinu ledvin, varlat, leukémii, rakovinu vaječníků, gastrointestinálního traktu a lymfomy.
9. 9. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že je použitelný při léčbě zaměřené na kontrolu tkáně vaskulámě endoteliálního systému a vaskularizaci nádorů.
10. 10. Farmaceutický přípravek podle nároku 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že tato sloučenina je spisulosin 285 a tento přípravek je použitelný při léčbě kompaktních nádorů.
11. 11. Farmaceutický přípravek podle nároku 6, v y z n a ě u j í c í se t í m, že tato sloučenina je spisulosin 285 a tento přípravek je použitelný při léčbě pomalu proliferujících nádorů.
12. 12. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 11, v y z n a č u j í c í se tím, že tato sloučenina mění aktivitu proteinu Rho.
13. 13. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 12, v y z n a ě u j í c í setím, že je použitelný v kombinační terapii s jiným léčivem.
14. 14. Alkanová nebo alkenová sloučenina s dlouhým přímým řetězcem, vyznačující se t í m, že má 2-aminoskupinu a 3-hydroxyskupinu a je použitelná ve způsobu léčby.
15. 15. Použití alkanové nebo alkenové sloučeniny s dlouhým přímým řetězcem, kde tato sloučenina má 2-aminoskupinu a 3-hydroxyskupinu, v přípravě přípravků použitelných při léčbě rakoviny.
16. 16. Použití spisulosinů v přípravě léčiva pro léčbu rakoviny.
17. 17. Způsob léčby savce postiženého zhoubným nádorem, vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství aktivní sloučeniny postiženému ·» ·· • 9 · · • · · • · · • 9 · ··«· ·· ·· • · · 9 · • · · • · ··»· • »« • · · • · 9

    9 9 9

    9 9 · • ·· jednotlivci, kde touto sloučeninou je alkanová nebo aíkenová sloučenina s dlouhým přímým řetězcem obsahující 2-aminoskupinu a 3-hydroxyskupinu.
18. 18. Bioaktivní extrakt škeble Spisula polynyma.