JP2002511410A - 抗腫瘍活性を有するスピスロシン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 二枚貝スピスラ・ポリニマの抽出物の活性を調べると、２−アミノ基と３−ヒドロキシ基を有する抗腫瘍性の長鎖の直鎖アルカンまたはアルケン化合物が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、スピスロシン（spisulosine）化合物の医薬組成物に関する。本発
明はさらに、腫瘍の治療に関し、腫瘍に対して使用するための新しい細胞障害活
性化合物および医薬組成物を提供する。１つの面において本発明は、海洋生物由
来の抗腫瘍化合物に関する。

【０００２】 （発明の背景） 海洋生物から生物活性化合物を単離することに、大きな関心が寄せられている
。典型的な方法では、インビトロスクリーニングプログラムを使用して、抗菌、
抗ウイルス、および細胞障害活性について粗抽出物を試験する。海洋由来の公知
の生物活性化合物の例には、ブリオスタチン（bryostatins）、エクテイナシジ
ン（ecteinascidins）、およびさらにジデムニン（didemnins）があり、ジデム
ニン（didemnin）Ｂ（アプリジン（aplidine）としても知られている）は、臨床
試験を受けている最初の海洋天然物である。

【０００３】 （発明の要約） 本発明は、２−アミノ基と３−ヒドロキシ基を有する長鎖の直鎖アルカンまた
はアルケン化合物を、薬剤学的に許容される担体とともに含有する医薬組成物を
提供する。典型的には本化合物は、２−アミノ−３−ヒドロキシアルカンまたは
２−アミノ−１，３−ジヒドロキシアルケンである。好ましくはこの化合物は、
置換Ｃ₁₆−Ｃ₂₄アルカンまたはアルケンである。この化合物は好ましくは、置換
アルカンであり、より好ましくは置換Ｃ₁₈−Ｃ₂₀アルカンであり、最も好ましく
は２−アミノ−３−ヒドロキシＣ₁₈アルカンである。置換アルケンは、好ましく
は置換モノまたはジ−アルケンであり、より好ましくは置換Ｃ₁₈−Ｃ₂₀アルケン
である。ある実施態様において、この化合物は、部分的立体構造： を有する。

【０００４】 特に本発明は、生物活性スフィンゴイド型の塩基であるスピスロシン２８５、
２９９および３１３（１〜３）、スフィンゴシン（４−スフィンゲニンまたはオ
クタデカ−４−スフィンゲニンとも呼ばれる、４）、および２つの関連化合物で
あるノナデカ−４−スフィンゲニン（炭素が１つ長い同族体、５）およびスフィ
ンガ−４，１０−ジエン（デヒドロスフィンゴシン誘導体、６）を含む組成物を
提供する。

【０００５】 すなわち好適な組成物は、以下の好適な化合物の１つまたはそれ以上を含有す
る： スピスロシン２８５（１）、ｎ＝１２；スピスロシン２９９（２）、ｎ＝１３；
スピスロシン３１３（３）、ｎ＝１４；ならびに スフィンゴシン（４），ｎ＝１２、およびノナデカ−４−スフィンゲニン（５）
、ｎ＝１３；および スフィンガ−４，１０−ジエン（６）。

【０００６】 好適な化合物であるスピスロシン２８５おは、文献で公知である。化合物１と
ｓｙｎジアステレオ異性体は、２つまたはそれ以上の不斉炭素原子を有する脂質
塩基の絶対配置の決定において、最初にクロアチアの研究者により合成された（
プロステニク・エム（Prostenik M.）、アラウポビック・ピー（Alupovic, P.）
、Croat. Chem. Acta. 1957, 29, 393 を参照）。

【０００７】 本発明の組成物における他の化合物は新しい化合物であると考えられる。

【０００８】 化合物１〜３は、Ｌ１２１０マウスリンパ球性白血病細胞に対するユニークな
細胞障害活性を示す。多くのＬ１２１０測定法において、顕著な形態学的変化が
観察された。この作用はまた、我々の先の米国仮特許出願第６０／０４３，３２
６号にも記載された。この特許出願のＬ１２１０に対して特許請求はせず，実際
、スピスロシン２８５のような化合物は白血病に対する活性が欠如していること
を示唆するいくつかの予備的データがある。

【０００９】 １の合成試料をＬ１２１０白血病細胞に対して測定し、細胞障害活性と、形態
変化（とがった細胞活性（pointed cell activity））の両方を示した。

【００１０】 Ｌ１２１０阻害ととがった細胞活性 濃度 細胞障害活性％ とがった細胞活性％^a 0.5 μg/ml 100 97 0.25 μg/ml 99 100 0.1 μg/ml 99 62 0.05 μg/ml 96 71 0.025 μg/ml 90 21 0.01 μg/ml 45 1 * とがった細胞のパーセントは、生きている細胞のパーセントである。

【００１１】 スピスロシン２８５（１）はまた、インビトロで他の腫瘍細胞株（Ｐ−３８８
（０．０１μg/ml）；Ａ−５４９（０．０５μg/ml）；ＨＴ−２９（０．０５μ
g/ml）およびＭＥＬ−２８（０．０５μg/ml）を含む）に対して活性である。

【００１２】 特に好適な実施態様において、本発明は、すべての型の癌（例えば、乳癌、前
立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、食道癌、喉頭癌、肝臓癌、大腸癌、甲状腺癌、
黒色腫、腎臓癌、睾丸癌、白血病、卵巣癌、消化器癌、肝細胞癌、および血管内
皮細胞癌）の治療における、スピスロシン２８５、および関連化合物の使用に関
する。他の型の癌も、当業者に公知である。スピスロシン２８５および関連化合
物は、固形腫瘍に対して使用することが好ましく、増殖の遅い癌（例えば、前立
腺癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌腺の癌、および血管内皮細胞癌にたいして
使用することが特に好ましい。１つの面において本組成物は、組織および腫瘍の
血管新生の調節のために、血管内皮細胞に対する治療法で使用される。

【００１３】 本発明は、特異的抗腫瘍活性を有することが知られている生物活性化合物に関
し、従ってこれらは、哺乳動物（特にヒト）における医薬として有用であろう。
従って本発明の別の面は、本明細書で同定される活性化合物を含有する医薬組成
物、およびそのような医薬組成物を用いる治療法に関する。

【００１４】 本発明の活性化合物は、抗腫瘍活性を示す。すなわち本発明はまた、これらの
化合物に対して感受性である悪性腫瘍に罹った哺乳動物の治療法を提供し、この
方法は、活性化合物または化合物の混合物、またはその医薬組成物の治療上有効
量を、罹患個体に投与することを特徴とする。本発明はまた、活性成分として本
発明の１つまたはそれ以上の化合物を含有する医薬調製物、ならびにその製造法
に関する。

【００１５】 医薬組成物の例には、経口、局所的または非経口投与のための適当な組成物と
一緒の、任意の固体（錠剤、癌剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体（溶液
剤、懸濁剤または乳剤）があり、およびこれらは、純粋な化合物を含有するか、
または任意の担体または他の薬剤活性のある化合物と組合せてもよい。これらの
化合物は、非経口的に投与される時は、無菌であることが必要なことがある。

【００１６】 本発明の組成物の投与は、例えば静脈内注入、経口、腹腔内投与および静脈内
投与などの任意の適当な方法でよい。静脈内への送達は、適当な期間（例えば、
１〜４時間または必要であればそれ以上）にわたって、適当な間隔（例えば２〜
４週間）で行われる。スピスロシンを含有する医薬組成物は、リポソームまたは
ナノスフェアカプセル化により、除放性製剤または他の標準的送達手段により送
達される。

【００１７】 本発明の化合物を含む医薬組成物の正しい用量は、具体的な製剤、投与様式、
および具体的な部位、宿主と細菌、または治療される腫瘍により変わる。年令、
体重、性、食事、投与の時間、排出速度、宿主の状態、薬剤併用、反応感受性お
よび疾患の重症度などの他の要因も考慮される。投与は、最大許容用量の範囲内
で、連続的でも周期的におこなってもよい。

【００１８】 化合物は、本発明の医薬組成物中でプロドラッグまたは前駆体の形で提供され
、これは投与されると活性化合物に変換されるかまたは代謝される。

【００１９】 本発明の組成物は、他の薬剤と一緒に使用して併用療法を行ってもよい。他の
薬剤は、同じ組成物の一部でも、同じ時期または異なる時期の投与のための別の
組成物として提供されてもよい。他の薬剤の本体は特に限定されず、適当な候補
には以下がある：

【００２０】 ａ）細胞分裂抑制作用を有する薬剤、特に細胞骨格筋成分を標的とするもの、例
えば、タキサン（taxane）薬剤（例えば、タキソール、パクリタキセル、タキソ
テート、ドセタキセル）のような微小管調節物質、ポドフィロトキシンまたはビ
ンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン）； ｂ）抗代謝剤、例えば５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲンシタビン（gemc
itabine）、プリン類似体（例えばペントスタチン、メトトレキサート）； ｃ）アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファ
ミドまたはイフォスファミド）； ｄ）ＤＮＡを標的とする薬剤、例えばアントラシクリン（antracycline）薬剤（
アドリアマイシン、ドキソルビシン、ファルモルビシンまたはエピルビシン）； ｅ）トポイソメラーゼを標的とする薬剤、例えばエトポシド； ｆ）ホルモンおよびホルモンアゴニスト、例えばエストロゲン、抗エストロゲン
剤（タモキシフェンおよび関連化合物）およびアンドロゲン、フルタミド、ロイ
プロレリン、ゴセレリン、シプロトロンまたはオクトレオチド； ｇ）腫瘍細胞のシグナル伝達を標的とする薬剤、例えば抗体誘導体（例えば、ヘ
ルセプチン（herceptin））； ｈ）アルキル化剤、例えばプラチナ薬剤（シスプラチン、カルボプラチン、オキ
サリプラチン、パラプラチン）またはニトロソ尿素； ｉ）腫瘍転移に影響を与える可能性のある薬剤、例えばマトリックスメタロプロ
テイナーゼインヒビター； ｊ）遺伝子治療とアンチセンス物質； ｋ）抗体治療薬；および ｌ）海洋起源の他の生物活性化合物、主にエクテイナシジン（ecteinascidin）
（例えば、ＥＴ−７４３）またはアプリジンのようなジデムニン。

【００２１】 本発明はまた、治療法で使用される化合物も包含し、癌の治療のための組成物
の製造における該化合物の使用に関する。

【００２２】 スピスロシン２８５は、細胞の形態に影響を与える。マイクロフィラメント中
のアクチンを染色するファロイジンで、スピスロシン処理細胞を染色して評価す
ると、スピスロシンで処理したベロ細胞は、マイクロフィラメント構造が減少し
ている。スピスロシンはまた、小さいＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏの分布に影響
を与えるが、この作用は、ＲｈｏアクチベーターＬＰＡで前処理することにより
低減または排除することができる（マッケイ（Mackay）とホール（Hall）、J. B
iol. Chem., 273, 20685-20688, 1998）。

【００２３】 理論に拘束されるつもりはないが、我々は、スピスロシンの作用機序は、おそ
らくＬＰＡ活性化への作用を介して、小さいＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏの作用
を調節すると考えている。Ｒｈｏは、ストレス繊維の形成に関与することが知ら
れており（エー・ホール（Hall, A.), Science 279, 509-514, 1998）、アクチ
ン細胞骨格の再構築を介して細胞接着と運動性を調節するのに関与している（イ
トー（Itoh）ら、Nature Medicine, Vol 5, No., 2, 1999）。宿主細胞層への腫
瘍細胞の接着および以後の経細胞移動は、癌浸潤と転移の重要な工程である。Ｒ
ｈｏへの（阻害）作用を介して、細胞のマイクロフィラメントのレベルに影響を
与える（低下させる）ことにより、スピスロシンは、細胞骨格への作用を介して
癌の進展を制限しているかも知れない。また、Ｒｈｏは、細胞サイクルのＧ１期
の進行を開始させることも知られている。従ってＲｈｏの調節はまた、細胞サイ
クルの進行を停止させることにより細胞形質転換を防止するかも知れない。従っ
て本発明はまた、癌治療のための薬剤の製造におけるスピスロシンの使用に関し
、ここでスピスロシンは、Ｒｈｏタンパク質活性を変化させるように作用する。

【００２４】 ＲｈｏのアクチベーターであるＬＰＡは、マイクロフィラメント形成に及ぼす
スピスロシンの作用の妨害を促進することができる。スピスロシンの特異的な標
的は不明であるが、スピスロシンで処理された細胞中のアクチンマイクロフィラ
メントとスピスロシンの脂質構造の観察された低下は、スピスロシンが、ＬＰＡ
受容体のアンタゴニストとして作用して、ＬＰＡがその受容体と相互作用してＲ
ｈｏを活性化しマイクロフィラメントを産生することを妨げるかも知れないこと
を示唆する。

【００２５】 本発明の好適な化合物は、まずスピスラ・ポリニマ（Spisula polynyma）から
単離された。スピスラ・ポリニマは、食用の二枚貝であり、スチンプソンサーフ
クラム（Stimpson surf clam）またはアトランティックサーフクラム（Atlantic
sur clam）としても知られている。これは、軟体動物類門、ニマイガイ綱、ハ
マグリ亜綱、ハマグリ目、マクトロイデア（Mactroidea）上科、マクトリジ（Ma
ctridae）科、マクトリニ（Mactrinae）亜科に属する。スピスラ・ポリニマは元
々、日本の海岸沖で見つかり、ホッキガイとよばれ、寿司用に加工される。これ
は現在、ベーリング海峡からグリーンランドおよびニュファンドランドを経由し
て大西洋に移動している。この二枚貝は、灰白色の殻を有し、７〜１０cmの長さ
である。これは、舌以外は主にオフホワイトであり、舌は生きている二枚貝では
紫色であるが、調理後は明るい赤色になる。

【００２６】 従って本発明は、二枚貝スピスラ・ポリニマの活性抽出物を提供する。本発明
の１つの実施態様は、二枚貝スピスラ・ポリニマから単離された新規化合物と、
そこから抗腫瘍化合物として単離されたすべての細胞障害活性化合物の使用とを
提供する。

【００２７】 生物活性について試験するために、１つの二枚貝を３：１メタノール／トルエ
ンでホモジナイズした。この粗抽出物に塩化ナトリウム溶液を加え、トルエン層
と水層に分離させた。水層をさらにトルエン、ジクロロメタン、酢酸エチル、お
よび１−ブタノールで抽出した。これらの抽出物をすべて、Ｌ１２１０細胞に対
して測定すると、最初の粗抽出物、トルエンおよびジクロロメタン抽出物に強い
細胞障害活性が、そして他の３つの画分では少し弱い活性が観察された。

【００２８】 スピスラ・ポリニマ粗抽出物のＬ１２１０細胞障害活性^a,b 濃度（μg/ml）^a,b 抽出物 250 125 50 25 12.5 5 粗物質 98* 98* 92 25 0 0 トルエン 100* 100* 100* 25 13 13 CH₂CH₂ 100* 100* 100* 91 20 13 EtOAc 98* 98* 92* 0 0 0 1-BuOH 83 33 0 0 0 0 水層^c 94 75 0 0 0 0

【００２９】 脚注： （ａ）細胞障害活性は、増殖阻害％として報告される； （ｂ）* で印をつけたものは、とがった細胞活性を示す； （ｃ）水性抽出物は、７００、３５０、１４０、７０、３５および１４μg/mlで
測定した。

【００３０】 これらの抽出物はまた、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）とＣＶ−Ｉ
サル腎細胞について測定（１００μg/６．３５mm ディスク）したが、活性は観
察されなかった。これらの抽出物についてはペニシリウム・メリニイ（Penicill
ium melinii）（以前はピー・アトロベネツム（P. atrovenetum））およびミク
ロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）（以前はサルシナ・ルテア（Sarc
ina lutea）、いずれも５００μg/１２．７mm ディスクで）に対して、抗菌活性
は観察されなかった。後に、他のさらに精製された抽出物を、枯草菌（Bacillus
subtilis）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、
および大腸菌（Escherichia coli）に対して測定したが、生物活性は観察されな
かった。

【００３１】 スピスロシン化合物、特にスピスロシン２８５（１）、２９９（２）、および
３１３（３）の製造法も、入手可能である。

【００３２】 好適な合成経路は、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノアルデヒドに有機金属を先に添
加して、高い立体特異性を有するβ−アミノアルコールを得ることに基づく。ア
ンドレス（Andres）ら、Org. Chem. 1996, 61, 4210とリーツ（Reetz）ら、Ange
w Chem. Int. Ed. Engl., 1987, 26, 1141を参照されたい。グリニャール試薬ま
たは有機リチウム化合物の非キレート調節添加により、ａｎｔｉ−ジアステレオ
異性体が得られ、有機亜鉛のキレート調節添加により、ｓｙｎ−ジアステレオ異
性体が得られる。

【００３３】 反応工程図Ｉは、化合物Ｉの形成のための好適な合成プロセスを例示する：

【００３４】 反応工程図Ｉ：

【００３５】 反応工程図Ｉに記載のように、β−アミノアルデヒド５０は、Ｌ−アラニンメ
チルエステルから、まずアミノ基を臭化ベンジルと炭酸カリウムでジベンジル化
し、次に水素化リチウムアルミニウムで還元してＮ，Ｎ−ジベンジルアミノアル
コール４０を得る。４０をスワーン（Swern）酸化して５０を高収率で得て、分
解を避けるためにさらに精製することなく使用することができる。グリニャール
試薬を５０に加えると、高選択性のａｎｔｉ−ジアステレオ異性体６０が得られ
る。化合物６０は容易に精製でき、例えばフラッシュクロマトグラフィーおよび
ＨＰＬＣで精製することができる。パーリマン（Peariman）触媒上で水素分解し
て６０を脱保護することにより１が高収率で得られ、全体的高収率で得られる。
化合物２と３は、グリニャール試薬の鎖の長さを増加させれば調製でき、本発明
の残りの化合物もまた、適当なグリニャール試薬を選択して調製することができ
る。

【００３６】 図面の簡単な説明 図１ 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｅおよび１Ｆは、スピスラ・ポリニマ抽出物のＬ１２
１０測定法で観察された細胞の形態を例示する。図１Ａは、正常細胞；図１Ｂは
、典型的なとがった細胞；図１Ｃは、非典型的とがった細胞；図１Ｄは、３つ以
上の突端を有する細胞；図１Ｅは、隆起した細胞；および図１Ｆは、隆起した細
胞ととがった細胞の組合さったものである。 図２ 本明細書に記載の化合物を、二枚貝スピスラ・ポリニマの抽出物から分離する
のに使用される反応工程図である。 図３ 例Ａの結果の顕微鏡写真である。 図４ 例Ｂの結果の顕微鏡写真である。 図５ 例Ｃの結果の電気泳動図である。 図６ 例Ｄの結果の顕微鏡写真である。

【００３７】 図１では、Ｌ１２１０測定法において、細胞の一部は球形（図１Ａ）から卵形
に変化し、長い突起が約１８０℃離れた（図１Ｂ）。これらの抽出物の測定法で
いくつかの他の形も観察され、突起が１８０℃未満で離れたもの（図１Ｃ）、３
つ以上の突起を有する細胞（図１Ｄ）、隆起のある細胞（図１Ｅ）、および突起
の１つが隆起になった細胞（図１Ｆ）などがある。しかし、２つの鋭い突起を反
対側に持つものが、最も多く特徴的なものであった。このタイプの形態変化は、
１０００を超える海洋抽出物のスクリーニングにおいて、従来報告されていない
。

【００３８】 （発明の詳細な説明） スピスロシン２８５、２９９、および３１３の単離 本発明において、マサチューセッツ州グロスター（Goucester）近辺からメー
ン州に広がるニューイングランド沖に位置するステルワゴン（Stellwagon）の浅
瀬の東の端にある二枚貝養殖所から、−１１０フェートの深さで、スピスラ・ポ
リニマを採取した。これらは、ニューイングランドクラムコーポレーション（Ne
w England Clam Corporation）（以前はニュードーンシーフードインク（New Da
wn Seafoods, Inc.）であった）により生きたまま運送され、次に急速に凍結さ
れた。

【００３９】 生物活性の元々の試験のための上記の抽出法と類似の精製法を使用した。最初
の３５個の二枚貝を解凍し、殻を除去して１．９kg（湿重量）を得た。これらを
３：１メタノール／トルエン中に放置して、数時間後ろ過した。この工程を繰り
返し、次にホモジナイズし、同じ溶媒で充分抽出して粗抽出物を得た。ここに１
Ｍ塩化ナトリウムを加えると、抽出物が２層に分離した。下の水層をさらにトル
エンで抽出し、トルエン層を合わせた。次に、得られた水層をジクロロメタンで
、図２に示したように抽出した。

【００４０】 トルエン抽出物を、メタノールとヘキサンで分配した。細胞障害活性と細胞変
化は、ほとんどメタノール画分中にのみ観察された。こうして得られたメタノー
ル抽出物を、シリカフラッシュカラムにのせ、クロロホルム／メタノール段階勾
配（１００：０、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、
７０：３０，５０：５０、０：１００）で溶出した。主要な細胞障害活性かつと
がった細胞形成活性は、カラムから非常に遅く溶出されたが、早期の画分もわず
かに細胞障害活性を示した。しかしここにとがった細胞はなかった。この後期の
溶出物をさらに、８：１２：１：１ クロロホルム／１−ブタノール／酢酸／水
を使用して、フラッシュシリカクロマトグラフィーにより精製した。画分を重炭
酸ナトリウムで中和した後、溶媒を除去して、酸中で濃縮された時に分解される
のを防止した。こうして一連の３つの生物活性画分が得られた。

【００４１】 初期の単離実験で、生物活性はシアノ固相抽出（ＳＰＥ）カラムからメタノー
ルで洗い流されないことが観察されており、細胞障害活性は、３：１ メタノー
ル／０．０１Ｍ蟻酸アンモニウム（０．５ml／分）で溶出することがわかった。
これは、同じＨＰＬＣカラム上の少量の生物活性画分を同じ溶媒系でクロマトグ
ラフィーを行い、次に同じ条件（ただし、蟻酸溶液の代わりに水を使用）で注入
を繰り返すことにより確認された。１５．６分で溶出するピークは最初にのみ観
察されたこと以外は、クロマトグラムは同じであった。

【００４２】 第２のシリカカラムからの３つの生物活性画分をそれぞれ、シアノＨＰＬＣに
より、上記と同じ条件（ただし、１ml／分）を使用して精製し、３つのシリーズ
の生物活性画分を得た。試料をＣ−１８ＳＰＥカラムに通し、まず水で洗浄し、
次にメタノールで溶出して、蟻酸アンモニウムを除去した。各シリーズ（画分Ａ
、Ｂ、およびＣ）の主要な細胞障害活性と形態変化活性は、上記に匹敵するピー
ク中に見つかった。しかし活性は、画分のほとんどに広がっていた。シリカＴＬ
Ｃ（３：１２：２：２ クロロホルム／１−ブタノール／酢酸／水）は、画分Ａ
（０．４mg）が１つのスポット（Ｒ_f ０．４７）を含有し、これはニンヒドリ
ンによりピンクになることを示した。画分Ｂ（１．３mg）は、この同じスポット
と、１つのわずかに小さいもの（Ｒf ０．４４、ニンヒドリンにより赤色）を
示し、一方画分Ｃ（０．２mg）は、これらの両方と３つ目のスポット（Ｒf ０
．３４、ニンヒドリンにより紫色）を含有した。３つすべては、良好な細胞障害
活性ととがった細胞形成活性を示し、ＡはＢよりわずかに大きく、Ｃよりかなり
大きい活性を示した。これは、一番上のＴＬＣスポットは、Ｌ１２１０細胞で形
態変化を引き起こした化合物に由来するはずであることを示した。これらの画分
は、これ以上精製せず、混合物として分析した。定量的バイオアッセイの結果を
以下に示す。

【００４３】 スピスラ・ポリニマの特定の臓器が、生物活性のほとんどまたはすべてを含有
するかどうかを調べる試みを行なった。生きた貝をジエチルエーテルで麻酔し、
次に９つの部分に解剖した：足、消化器系、生殖器、吸引管、えら、心臓、外套
膜、閉殻筋、および残りの内臓塊（足、消化器系および生殖器を除いて）。これ
らを、他の貝の図と比較して同定した。各臓器を、３：１メタノール／トルエン
でホモジナイズし、得られた抽出物を次にジクロロメタンとメタノールで粉砕し
て塩を除去した。すべての抽出物は細胞障害活性を示した（表）が、えらと生殖
器からのものだけが、強い形態変化活性を示した。消化器系からのものおよび内
臓塊の残りは、弱いとがった細胞形成活性を示し、これはおそらく生殖器からの
不完全な分離のせいであろう。他の臓器におけるとがった細胞形成活性は、１〜
３の欠如またははるかに低い濃度に由来するかも知れない。

【００４４】 別の実験では、短時間調理した１つの足を、同様にして抽出した。これも細胞
障害活性を示したが、形態変化活性は示さなかった。しかし、より多量の調理し
た試料を抽出すると、いくつかのとがった細胞がＬ１２１０測定法で観察された
。消化器系と生殖器の抽出物のシリカＴＬＣ（３：１２：２：２ クロロホルム
／１−ブタノール／酢酸／水、１００μg）は、Ｒf ０．４９に弱いニンヒドリ
ン陽性スポットを示した。

【００４５】 250 μg/ml 125 μg/ml 50 μg/ml ％ ％ ％ ％ ％ ％ 臓器 阻害 とがった^a 阻害 とがった^a 阻害 とがった^a 足 100 0, ad^b 100 0, ad 93 0, 0 消化器系 96 0, 18 62 0, 0 0 0, 0 生殖器 nr^c nr 99 56, 100 90 32, 100 吸引管 100 ad, ad 50 0, 0 0 0, 0 えら 100 ad, ad 100 50, ad 98 100, 93 心臓 100 ad, ad nr 0, 0 38 0, 0 外套膜 100 0, 0 99 0, 0 95 0, 0 閉殻筋 100 added 100 0, 0 95 0, 0 内臓塊 100 10, ad 100 2, ad 94 0, 0 調理した 100 0 100 0 97 0 足^d 調理した 91 21 25 0 0 0 足^e

【００４６】 脚注^a とがった細胞のパーセントは、測定の開始後５８時間と８２時間目に測定した
。^b ad＝すべて死亡。^c nr＝測定で物質が沈殿しこれが細胞を不明瞭にしたため、読まなかった。^d とがった細胞のパーセントは、測定の開始後７２時間目に測定した。^e この試料は、画分Ａ〜Ｃの単離の粗抽出物を得るために使用したものと同様に
抽出した。とがった細胞のパーセントは、測定の開始後７６時間目に測定した。

【００４７】 生物活性化合物の構造へのいくつかの手がかりは、単離法中にあった。活性と
相関するＴＬＣスポットは、ニンヒドリンでピンクまたは赤色に見え、その化合
物が一級アミンを含有することを示唆している。またこれらは、両新媒性を示し
た。これらは元々、水性メタノールからトルエン中に抽出されたが、この時これ
らはメタノール対ヘキサン中に分配された。これらは非極性溶媒中で可溶性であ
るが、シリカから溶出するのに非常に極性の溶媒（３：１２：２：２ クロロホ
ルム／１−ブタノール／酢酸／水）を必要とする。

【００４８】 ＴＬＣから明らかなように画分ＡとＢのみが、不活性化汚染物質をあまり含有
せず比較的純粋であった。他の画分に対するそのサイズのために、ほとんどの構
造決定試験は、画分Ｂについて行なった。図３と４は、ＣＤＣｌ₃とＣＤ₃ＯＤ中
のこの画分の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。これらのスペクトルで明らかであっ
たのは、長いメチレン鎖（１．２５ppm）といくつかの重複末端メチル基（０．
８７ppm）に対応するピークであった。他のピークは、充分確定できなかった。
芳香族プロトンに対応するピークは観察されず、いくつかのピークは、アルケン
プロトン領域に現れた。いくつかの他のピークは、ヘテロ原子で置換された炭素
に結合したプロトンに対応するようであった。２つの異なる溶媒中のスペクトル
の大きな差は、ＣＤ₃ＯＤ中では、末端メチル基の下の方に明らかにメチルダブ
レット（１．２１ppm）が観察され、ＣＤＣｌ₃では、この共鳴は、メチレン鎖ピ
ークの上方向のショルダーとしてのみ現れた。

【００４９】 Ｄ−trans−エリトロ−スフィンゴシン（４）の真正試料を、単離した物質と
比較するためにシグマ（Sigma）から得た。その¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、多く
の点で画分Ｂに似ていた。予測されたように４は、長いメチレン鎖（１．２５pp
m）、末端メチル基（０．８７ppm）および２つのビニルプロトン（５．７５と５
．４６ppm）のために、大きいピークを示した。特に、ヘテロ原子置換炭素上の
プロトンに対応する共鳴の広さが顕著であった（４．４０、３．６６、２．８５
および２．１８ppm）。また、シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ クロロホルム
／１−ブタノール／酢酸／水）上で、４はＲfが０．４３を有し、画分Ｂの下の
スポットとＣの真ん中のスポットのように、ニンヒドリンで赤色になった。パル
メタ（Palmeta）とプロステニク（Prostenik）は、２−アミノ−３−オクタデカ
ノールと４は、珪酸を含浸させたペーパー上で溶媒系ジ−イソブチルケトン／酢
酸／水（４０：２５：５）で溶出すると、非常によく似たＲ_f値（それぞれ０．
３２と０．２９）を示すことを報告した。

【００５０】 画分Ａ〜Ｃもまた、いくつかの質量スペクトル法で試験した。すべてのスペク
トルの中で最も大きいイオンは、ｍ／ｚ ２８６であった。このピークの高分解
測定（ｍ／ｚ ２８６．３１０９）により、分子式Ｃ₁₈Ｈ₄₀ＮＯ（０．１mmu）
をスピスロシン２８５（１）に割り当てることができた。この化合物は、その名
前を一部は分子量から得ている。この分子式は、分子が完全に飽和されているこ
とを示した。このＭ＋Ｈイオンからの水の喪失に対応する強いピークが、２６８
．３０１９（Δ−１．５mmu）で観察された。すなわち、１は、ヒドロキシル基
を含有するはずである。ｍ／ｚ ２８６のマトリックス付加物に対応するイオン
が、ｍ／ｚ ４３８．３０７８（Ｃ₂₂Ｈ₄₈ＮＯ₃Ｓ₂、Δ−０．２mmu）、５９０
、および５９２で観察された。

【００５１】 １のように、ヒドロキシル基とアミン官能基で置換された１８個の炭素鎖から
なる１つの公知の主要な代謝物は、スフィンゴシン（４）である。この化合物は
、１より酸素が１つ多く水素が２つ少ない。スピスロシンのｍ／ｚ ３００の高
分解測定は、これは、スフィンゴシン（４）自身（３００．２９１４、Ｃ₁₈Ｈ₃₈ ＮＯ₂、Δ−１．１mmu）とともに、より大きいｍ／ｚ ２８６の同族体（２）（
３００．３２７０，Ｃ₁₉Ｈ₄₂ＮＯ、−０４mmu）のＭ＋Ｈに対応するダブレット
であることを示したため、この比較は正しいように思えた。これはまた、¹Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトル中のアルケン部分の存在を説明するのに役立つ。

【００５２】 いくつかの他のピークが、すべての３つのスペクトルで明らかであった。ｍ／
ｚ ３１４のイオンもまた、Ｃ₂₀Ｈ₄₄ＮＯ（３１４．３４３９，Δ−１．６mmu
）に対応するダブレットであり、これは、１の他の同族体であるスピスロシン３
１３（３）の分子イオンと、スフィンゴシン（５）の同族体であるＣ₁₉Ｈ₄₀ＮＯ ₂ （３１４．３０７５，Δ−１．６mmu）であった。化合物４は、ｍ／ｚ ４５２
．２８８５（Ｃ₂₂Ｈ₄₆ＮＯ₄Ｓ₂，Δ−１．７mmu）、６０４．２８３１（Ｃ₂₆Ｈ_{5 4} ＮＯ₆Ｓ₄，Δ０．３mmu）、および６０６．２９９５（Ｃ₂₆Ｈ₅₆ＮＯ₆Ｓ₄，Δ３
．６mmu）で、Ｍ＋Ｈイオンのマトリックス付加物を示し、５は、ｍ／ｚ ４６
４．２８８８（Ｃ₂₃Ｈ₄₆ＮＯ₄Ｓ₂，Δ−２．０mmu）、および６１８．２９４０
（Ｃ₂₇Ｈ₅₆ＮＯ₆Ｓ₄，Δ５．１mmu）で、Ｍ＋Ｈイオンのマトリックス付加物を
示した。画分Ｂではｍ／ｚ ３００と３１４はほとんど等しい強さのダブレット
であり、画分Ｂから個々にリストしたマトリックス付加物の１つのピークのみが
測定可能であったことが注目される。これは、これらの２つのシリーズの化合物
は全体の構造が非常によく似ているが、ＦＡＢＭＳでは挙動が異なることを示唆
した。スピスロシンシリーズ（飽和）は、強い分子イオンと弱いマトリックス付
加物を示し、スフィンゴシンシリーズ（非飽和）については逆が観察された。

【００５３】 上記データで同定される構造をより正確に確立するために、いくつかの誘導体
を調製した。最も有益なのは、スピスロシン２８５のジアセチル誘導体（８）で
あった。画分Ｂは最も大きかったため、その一部をピリジン中無水酢酸でアセチ
ル化した。このアセチル誘導体の混合物をここではＡｃＢと呼ぶ。シリカＴＬＣ
（３：１２：２：２ クロロホルム／１−ブタノール／酢酸／水）により、反応
は定量的を起き、新しいスポットがＲ_f ０．８６に現れた。比較のために、真
正の４のトリアセチル誘導体（９）を、同じ方法により合成した。

【００５４】 スピスロシンに関連する２つのシリーズの化合物はすでに単離されている。グ
ラビタ（Gulavita）とシェウア（Scheuer）は、パプアニューギニアのゼストス
ポンギア（Xestospongia）種海綿動物が、２つの光学異性体１４炭素のアミノア
ルコール１３４と１３５を含有することを報告した。これらは、遊離のアミンと
しては単離されず、混合物をアセチル化して、モノ−（１３６、１３７）とジア
セチル化合物（１３８、１３９）を得て、これらが分離された。ジメネツ（Jime
nez）とクルーズ（Crews）は、非誘導体化１のいくつかの分子イオンをｍ／ｚ
２８６で単離した。このＭ＋Ｈイオン（ｍ／ｚ ３７０）は断片化してｍ／ｚ
３１０と２６８を与え、これはおそらくそれぞれ、酢酸と次に第２アセチル基を
失ったためと考えられる。他のスピスロシンと比較できるイオンは小さいが、存
在した：２のジアセチル誘導体（１４４）についてｍ／ｚ ３８４、 ３２４、
および２８２、３のジアセチル誘導体（１４５）についてｍ／ｚ ３９８、３３
８、および２９６。試料中のスフィンゴシンからのイオンは小さすぎて、存在し
たかどうかは断言できない。再度これは、２つのシリーズの化合物は、大きく異
なるイオン化電位を有することを示した。ＣＩＭＳスペクトルは、強いｍ／ｚ
３７０と３１０イオンを示したが、ここでは、ｍ／ｚ ２６８イオンは非常に弱
かった。１４４についてはｍ／ｚ ３８４と３２４で、１４５についてはｍ／ｚ
３９８と３３８でより大きい同族体が見られた。ｍ／ｚ ４２６と３６６の弱
いイオンは、１３３を示していた。

【００５５】

【００５６】 スピスロシン２８５の合成 スピスロシン２８５の構造を確認し立体構造を決定するために、化合物を合成
した。２−アミノ−３−オクタデカノールの異性体は、天然物として知られてい
るものはないが、２Ｓ，３Ｓおよび２Ｓ，３Ｒ異性体はすでに合成されている。
より大きい同族体は新規化合物である。

【００５７】 プロステニク（Prostenik）とアラウポビック（Alaupovic）の合成を改変して
、比較のための真正物質を得た。

【００５８】 反応工程図IX

【００５９】 まず、マロン酸ジベンジル（１４７）を臭化テトラデシル（１４８）でアルキ
ル化した。得られたジベンジルテトラデシルアマロネート（１４９）を、次に塩
化Ｎ−フタロイル−Ｌ−アラニル（１５０）で縮合して、ベンジル基を除去し脱
炭酸した後、２−フタルイミド−３−オクタデカノン（１５１）を得た。このケ
トンを、過剰の水素化ホウ素ナトリウムで処理して、ケトン以外にフタルイミド
カルボニルの１つを還元して、１５２（これは、カルビノールアミンに還元され
た１つのフタルイミドカルボニルを有する）と１５３（これはさらに還元した）
を生成した。これらの２つの生成物は、シリカフラッシュクロマトグラフィーに
より容易に分離できた。

【００６０】 １５１から１５２への還元により、２つの新しいキラル中心の生成のため４つ
のジアステレオ異性体の混合物が得られた。この時点でジアステレオ異性体をシ
アノＨＰＬＣで分離した。次に水素化ホウ素ナトリウムでさらに還元し、次に酢
酸により、各々から保護基を除去した。保護基とともに１つの立体中心が除去さ
れたため、この操作で２つのジアステレオ異性体が生成した。この合成はＬ−ア
ラニンから出発したため，２つの生成物は（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−オ
クタデカノール（１５４）と（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−オクタデカノー
ル（１５５）であった。

【００６１】 生物活性 図１Ａ〜１Ｆに示すようにスピスロシンは非常に単純な化合物であるが、これ
らは非常に特異なタイプの生物活性を示した。前述のように、スピスロシンは、
Ｌ１２１０細胞中で細胞障害活性以外に、明瞭な形態変化を引き起こした。この
生物活性（形態の変化が観察された生きた細胞のパーセントとして記録した）は
、時に測定の開始後すでに１３時間目に観察され、５０〜６０時間で最大に達し
、以後低下した。この数を決定するために一般に６０個の細胞を観察した（ただ
し、生きていた細胞がこの数より少ないものは除く）。形態的作用は、通常測定
の開始後３０〜３５時間目に測定し、約２４時間後に再度測定し、細胞障害活性
は、対照中の細胞の数が約８０００に達した時（通常測定開始後３日目）に測定
した。とがった細胞は生きた細胞であり、従って細胞障害活性の読みにおいてそ
のように数えた。また１００％の細胞障害活性が記録された測定法では、とがっ
たているかまたはとがっていない生きた細胞（＜０．５％）をまださらに含有し
たかも知れない。すべての形態の変化した細胞は、とがった細胞のパーセントで
数えた。

【００６２】 この形態の変化は、かなり高い細胞障害活性を有する画分でいつも観察された
。一般に、増殖阻害が７０％未満の測定法では、有意な数のとがった細胞は観察
されなかった。しかし細胞障害活性が１００％に近い測定法は、９０〜９８％の
増殖阻害を有するものより形態の変化した細胞のパーセントは低かった。これは
、変化した細胞は容易に死滅することを示唆した。細胞障害活性と形態変化が同
じ作用機序によるかどうかは不明である。ある例では、ある測定のとがった細胞
を再培養すると、正常な状態に復帰することがわかった。これは、化合物が代謝
された後はこの作用が可逆的であることを示唆する。アセチル化は、生物活性を
大幅に低下させる。

【００６３】 Ｌ１２１０細胞の形態変化が、スフィンゴシン（４）により引き起こされたか
または関連化合物によるのかを測定するために、いくつかの真正の化合物を得て
、Ｌ１２１０細胞に対して測定した。スフィンゴシンとステアリルアミン（１３
１）の両方とも、中程度の細胞障害活性を示したが、形態に影響を与えなかった
。スフィンゴミエリンは４の公知の誘導体であり、ホスホリルコリン単位が一級
アルコールに付加され、アミンは脂肪酸によりアシル化されている。主にステラ
リルおよびネルボノイル（nervonoyl）スフィンゴミエリン（１６１、１６２）
からなる、ウシ脳（シグマ（Sigma））から単離されたスフィンゴミエリンの混
合物は、わずかの細胞障害活性を示したがとがった細胞は示さなかった。４のホ
スホリルコリン誘導体（１６３、シグマ（Sigma））の細胞障害活性はは、少な
くとも部分的には１６３から４への加水分解によるのであろう。

【００６４】

【００６５】 モデル化合物の細胞障害活性 化合物 濃度（μg/ml） 阻害％ とがった細胞％ １２８ 5 100 0 2.5 100 0 1 75 0 0.5 31 0 0.25 13 0 0.1 0 0 １６１＋１６２ 50 7 0 25 0 0 10 0 0 １３１ 5 99 0 2.5 96 0 1 19 0 0.5 0 0 0.25 0 0 0.1 0 0 １６３ 50 88 0 25 50 0 10 38 0

【００６６】 スフィンゴシンと他の長鎖アミン（ステアリルアミンを含む）は、細胞障害活
性があることが知られている。この生物活性は、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞に対して測定すると、１８炭素同族体について最大であることが証
明されている。スフィンゴシンの４つすべての立体異性体は、ほとんど等しい活
性を有することがわかった。４の２重結合を還元してジヒドロスフィンゴシン（
１６４）を生成しても、細胞障害活性に影響を与えなかった。１６４にＮ−メチ
ル基を付加しても、生物活性に大きな変化はなく、このアミンをアセチル化する
と、細胞障害活性が大きく低下した。

【００６７】 他の海洋起源の単離された関連化合物（１３４、１３５、１４０〜１４２）に
ついて細胞障害活性は報告されていないが、これらはこのタイプの測定法では試
験されていないかも知れない。１３４と１３５の混合物は、シー・アルビカンス
（C. albicans）に対して活性があった（２つの混合物１９μgについて、８mmの
阻害ゾーン）。ゼスタミノール（Xestaminol）Ａは、いくつかのグラム陽性菌と
グラム陰性菌および真菌に対して弱い活性を示すことが報告されている。これは
また、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliens
is）に対して抗蠕虫活性を示した。１４０と１４２の両方とも逆転写酵素に対し
てある程度の活性を示した。

【００６８】 画分Ａ〜Ｃ、画分Ｂのアセチル誘導体、および化合物１５４と１５５の活性を
表に要約する。この測定結果は、ＮＭＲ分析の結果を明瞭に確認し、１５４では
なく１５５を１２５と同じであるとして割り当てた。またアセチル化は、生物活
性を大幅に低下させる。

【００６９】 表IX．画分Ａ〜Ｃ、ＡｃＢ、および１５４と１５５の生物活性 とがった細胞％^a/b 試料 濃度 阻害％^c 時間 １回目 ２回目 （μg/ml） 画分A 2.5 100 35, 59 ad ad 1.25 100 25 ad 0.5 90 42 45 0.25 85 45 55 0.125 75 8 35 0.05 19 0 0 画分B 2.5 100 35, 59 0 7 1.25 93 3 21 0.5 90 2 43 0.25 80 7 37 0.125 75 5 21 0.05 7 0 0 画分C 2.5 90 55 0 1.25 88 0 0.5 63 0 AcB 10 31 27 0 5 38 0 2 13 0 1 0 0 0.5 0 0 0.2 0 0 １５４ 5 100 27 0 2.5 100 0 1 63 0 0.5 0 0 0.25 0 0 0.1 0 0 １５４ 5 100 27 ad 2.5 100 22 1 100 64 0.5 99 56 0.25 96 40 0.1 63 33

【００７０】 脚注 a 特に明記しない場合は、とがった細胞のパーセントを２回読んだ。これらの
測定を行なった測定開始後の時間を、時間の欄に示す。 b ad＝すべて死亡。 c 対照ウェルと比較した処理したウェル中の生きた細胞のパーセントとして記
録した増殖阻害のパーセント。

【００７１】 可能な作用様式 スピスロシンの生物活性は、スフィンゴシンに似ているせいかも知れない。ス
フィンゴ脂質の命名法では、スピスロシン２８５は、１−デオキシスフィンガニ
ンとなるであろう。スピスロシンは、結合部位についてスフィンゴシンと競合す
るか、またはスフィンゴ脂質（例えばスフィンゴミエリン、セラミドまたはガン
グリオシド）に取り込まれる。いずれの場合も、スピスロシンは、これらの化合
物により制御される細胞機能を破壊する。スフィンゴシンとその誘導体は、細胞
増殖と分化の制御に関与している。スフィンゴシンは、プロテインキナーゼＣの
強力なインヒビターであり、結合部位についてジアシルグリセロールと競合し、
これが細胞障害活性の原因かも知れない。構造−活性研究では、この阻害は、陽
性に荷電したアミンを必要とすることを証明し、従ってＮ−アシル誘導体は不活
性であった。スピスロシンがスフィンゴシンと競合することにより作用するなら
、これは、アセチル化化合物（ＡｃＢ）の活性の相対的な欠如を説明するであろ
う。スフィンゴシンは、プロテインキナーゼＣを制御することにより第２のメッ
センジャーとして作用するかも知れないという、証拠が増えている。これはまた
、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（公知のプロテインキナー
ゼＣアクチベーター）で処理したＨＬ−６０細胞の分化を阻害することが証明さ
れている。スピスロシンは、プロテインキナーゼＣの阻害について試験すべきで
ある。この酵素の阻害が、スピスロシンについて観察された形態への引き起こす
かどうかは不明であるが、プロテインキナーゼＣは細胞増殖と分化の調節に関与
している。

【００７２】 実験 ＮＭＲスペクトルは、ジェネラルエレクトリク（General Electric）ＧＮ５０
０とＱＥ３００およびバリアン（Varian）Ｕ４００分光計で得た。ＮＭＲ分析の
ための試料は、ＣＤＣｌ₃またはＣＤ₃ＯＤに溶解した。化学シフト（Δ）は、テ
トラメチルシラン（ＴＭＳ）の下の磁界方向にppmで示し、残存溶媒ピークまた
はＴＭＳと比較した。低および高ＦＡＢＭＳスペクトルは、ＶＧ ＺＡＢ−ＳＥ
またはＶＧ７０−ＳＥ４Ｆ分光計で、マトリックスとしてジチオスレイトール−
ジチオエリトリトール（マジックブレット（magic bullet））の３：１混合物を
使用して、記録した。ＦＡＢＭＳ／ＭＳスペクトルは、同じマトリックスでヘリ
ウムを衝突気体として使用して、ＶＧ７０−ＳＥ４Ｆで記録した。ＣＩ質量スペ
クトルは、ＶＧ ＶＳＥ分光計で、メタンを試薬気体として使用して、交互のＥ
Ｉ／ＥＩモードで記録した。ＩＲスペクトルは、ＩＢＭ ＩＲ／３２ＦＴＩＲ分
光計で得た。光学的旋光度は、ＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３７０デジタルポラリメー
ターで測定した。

【００７３】 クロマトグラフィー ＨＰＬＣは、アルテックエコノスフィア（Alltech Econosphere）シアノカラ
ム（４．６×２５０mm、５μm粒子サイズ）を使用して行なった。使用したＨＰ
ＬＣシステムは、ベックマン（Beckman）モデル１１４Ｍポンプ、レオダイン（R
heodyne）７１インジェクターおよびイスコ（Isco）Ｖ⁴ またはベックマン（Bec
kman）１６５可変波長検出器またはウォーターズ（Waters）９９０フォトダイオ
ードアレイ検出器から構成された。

【００７４】 分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、プレコートシリカゲル（メルク
６０Ｆ−２５４）およびシアノ結合相（イーエムサイエンス（EM Science）ＣＮ
Ｆ_254SＨＰＴＬＣ）プレート上で行なった。スポットは、ＵＶ（２５４nm）、
ニンヒドリン（５％エタノール液）、ホスホモリブデン酸（５％エタノール液）
および／またはヨードで視覚化した。シリカカラムクロマトグラフィーは、５０
〜２００μmまたは４０〜６３μmシリカゲル（メルク）で行なった。他のカラム
クロマトグラフィーは、クロマトレックス（Chromatorex）ＯＤＳ（フジデビジ
ョン（Fuji-Division）１００〜２００メッシュ）とセファデックスＬＨ−２０
（ファルマシア（Pharmacia））を使用した。高速向流クロマトグラフィー（Ｈ
ＳＣＣＣ）は、＃１０コイルとミルトン−ロイ（Milton-Roy）ミニポンプを有す
るイトウ（Ito）多層コイルセパレーター−エクストラクター（ピー・シー・イ
ンク（P.C., Inc.））で行なった。固相抽出（ＳＰＥ）は、正常相カラム（シリ
カ、オールテックマキシクリーン（Alltech MaxiClean））、逆相カラム（Ｃ−
１８、ウォーターズ・セプパック（（Waters Sep-Pak）、および結合相カラム（
シーエヌ（ＣＮ）、フィッシャープレップセップ（Fisher PrepSep））で行なっ
た。

【００７５】 生物学的測定法 試料をメタノールおよび／またはヘキサンに溶解して、ドライ測定ウェルに適
用し、溶媒を蒸発させて、Ｌ１２１０マウスリンパ球性白血病細胞に対する細胞
障害活性を測定した。細胞（１０００）を最小基本培地（ＭＥＭ、１ml）に加え
、３７℃でインキュベートした。増殖の阻害を、対照ウェル中の生きた細胞に対
する試料ウェル中の生きた細胞のパーセントとして記録した。これは、対照ウェ
ルが８０００細胞に達した時（一般に、測定の開始後３日目）に測定した。

【００７６】 増殖の阻害パーセントを測定する時に、生きた細胞として、形態変化細胞（図
１Ａ〜１Ｆ）を計測した。測定の期間中、形態変化を評価した。とがった細胞の
パーセントは、約６０の生きた細胞中の変化した細胞数を計測して測定した。こ
のパーセントは、測定を行っている時間の長さとともに変化した。これは一般に
、測定の開始後約５０時間目に最大に達したが、とがった細胞は、測定法の開始
後すでに１３時間目に観察され、通常、増殖阻害パーセントを測定した時にもま
だ見られた。とがった細胞のパーセントは、しばしば約３５時間と５５時間後に
計測した。この測定を行なった時間を、データとともに示す。

【００７７】 フィルターディスク拡散法を使用して、抗菌測定法を行なった。ペーパーディ
スク（６．３５または１２．７mm、シュレイチャー・アンド・シュエル（Schlei
cher & Schuell））に、試料溶液（５０〜５００μg）を含浸させ、乾燥させた
。次にこれらのディスクを、枯草菌（Bacillus subtilis）、ペニシリウム・メ
リニイ（Penicillium melinii）（以前はピー・アトロベネツム（P. atrovenetu
m））、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）（以前はサルシナ・
ルテア（Sarcina lutea）、大腸菌（Escherichia coli）またはサッカロミセス
・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）を接種した寒天上に広げた。これ
らのプレートを、１２〜２４時間インキュベートした（３２〜３５℃、ただし、
ピー・メリニイ（P. melinii）では２５〜２７℃）。

【００７８】 初期生物学的試験のためのスピスラ・ポリニマの抽出 １つの貝（スピスラ・ポリニマ）を解凍し、殻を除去した（３５．３２ｇ、湿
重量）。これを、３：１ メタノール／トルエン３５０mlのブレンダー中に入れ
、ホモジナイズした。黄褐色の抽出物をろ過し、１Ｍ塩化ナトリウム溶液（１０
０ml）に加えた。上のトルエン層を除き、水層をトルエン（７５ml）で抽出した
。２つのトルエン層を合わせ、溶媒を除去して褐色の油状残渣を得た（３３３．
９mg）。水層をさらにジクロロメタンで抽出（２×７５ml）すると、溶媒の除去
後に黄褐色の残渣（１８．６mg）が得られた。次に水層を酢酸エチル（７５ml）
で抽出した。最後の工程後にも水相中に残った一部のジクロロメタンの存在のた
めに、下層が有機層であった。上層をさらに酢酸エチル（２４５ml）で抽出し、
上の有機層を水（１００ml）で逆抽出し、２つの酢酸エチル抽出物を合わせて、
溶媒の除去後に黄色の残渣（３６．８mg）を得た。合わせた水層を半分に濃縮し
、１−ブタノール（１５０ml、７５ml）で２回抽出した。合わせたブタノール層
を水（７５ml）で逆抽出して、ブタノールの除去後黄色の残渣（１３２．８mg）
を得た。合わせた水層を濃縮して、油状の淡黄色の残渣（９４６．１mg）を得た
。各抽出物を、ジクロロメタンとメタノールで粉砕して、塩を除去して、トルエ
ン（３０２．２mg）、ジクロロメタン（１８．６mg）、酢酸エチル（３６．７mg
）、ブタノール（１２０．９mg）および水性抽出物（５９０．４mg）を得て、こ
れらを測定した。

【００７９】 画分Ａ、Ｂ、およびＣ ３５個の貝を解凍し、殻を除去して、スピスラ・ポリニマの試料（１．９kg）
を得て、これをメタノール／トルエン（３：１、２×１．５リットル）に浸した
。次に同じ溶媒（６×１．５リットル）中で固体をすりつぶし、得られた抽出物
をろ過した。塩化ナトリウムの１Ｍ溶液（３リットル）をこの粗抽出物（１２リ
ットル）に加え、得られた上のトルエン層を除去した。図１に示したように、水
層をさらにトルエン（２×２．５リットル）、次にジクロロメタン（４×２．５
リットル）で抽出した。

【００８０】 溶媒の除去後、トルエン抽出物（２１．５５ｇ）をメタノールとヘキサン（１
．５リットルずつ）に分配した。メタノール層をさらにヘキサン（４×１リット
ル）で抽出した。合わせたヘキサン層を約１．８リットルに濃縮し、両方の抽出
物を冷却した（−１０℃）。それぞれで生じた２つの層を分離した。合わせたヘ
キサン層を、次にメタノール（０．５リットル）で抽出した。この操作により、
ヘキサンと３つのメタノール抽出物が得られ、このうち最初のメタノール抽出物
（６．８ｇ）が最も高い生物活性を含有した。

【００８１】 この生物活性メタノール画分を、クロロホルム／メタノール段階勾配（１００
：０、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０
，５０：５０、０：１００）を使用してフラッシュシリカクロマトグラフィーで
分離して、１２画分を得た。３、４、７および８番目の画分がある程度の細胞障
害活性を含有したが、これらはとがった細胞形成活性は示さなかった。この活性
は、ほとんどの細胞障害活性とともに最後の２つの画分中にあった。

【００８２】 これらの２つの画分を合わせ（３７０mg）、別のフラッシュシリカカラムによ
り、クロロホルム／１−ブタノール／酢酸／水（８：１２：１：１）を使用して
さらに精製した。酢酸を除去するために、こうして得られた各１２画分を、（ａ
）クロロホルム（４分の１量）を加え、（ｂ）水層のｐＨが７を超えるまで５％
重炭酸ナトリウムで洗浄（２〜３×半容量）し、そして（ｃ）有機層を水で洗浄
（半容量）して中和した。３、４、および５番目の画分は、とがった細胞形成活
性のすべてと細胞障害活性の基本的にすべてを含有した。これらの各画分を、Ｈ
ＰＬＣによりシアノカラムで３：１ メタノール／０．０１Ｍ蟻酸アンモニウム
（１ml／分）を使用して別々に精製した。６つの画分（このうち最も生物活性が
強かったのは５番目であった）を、各シリカ画分から採取した。水（２〜８ml）
を加えて各画分から蟻酸アンモニウムを除去し、試料をＳＰＥカラム（Ｃ−１８
）に適用し、水（５〜１０ml）で洗浄し、次にメタノール（５ml）で溶出した。
これにより、画分Ａ（０．４mg、収率２×１０^-5％）、Ｂ（１．３mg、収率７×
１０^-5％）、およびＣ（０．２mg、収率２×１０^-5％）を、それぞれ３、４、お
よび５番目のシリカ画分から得て、これらはすべてｔr ７．９分で溶出した。

【００８３】 画分Ａ 白色の固体：シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／
ＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ）Ｒ_f ０．４７（ニンヒドリン陽性、ピンク）； IR(NaCl) 2922, 2853, 1734, 1593, 1462, 1377, 1061 cm^-1；¹ H NMR (CDCl₃) δ 5.38, 5.15, 3.82, 3.67, 3.44, 3.24, 2.31, 2.03, 1.67,
1.60, 1.55, 1.25, 1.10, 0.86； FABMS m/z 606, 604, 592, 590, 466, 452, 438, 314, 300, 286, 268； CIMS m/z 354, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 300, 298, 296, 286, 284
, 268, 266, 149, 139, 137, 1, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59,
57, 55。 分析。C₁₈H₄₀NOの理論値：286.3110 (M+H)。実測値：286.3115 (HRFABMS)。

【００８４】 画分Ｂ 白色の固体：シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／
ＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ）Ｒ_f ０．４７（ニンヒドリン陽性、ピンク）、０．４４（ニ
ンヒドリン陽性、赤色）； IR(NaCl) 3273, 2953, 2918, 2851, 1639, 1591, 1510, 1466, 1379, 1344, 105
9, 970 cm^-1；¹ H NMR (CDCl₃) δ 5.98, 5.78, 5.55, 5.44, 5.32, 4.43, 3.78, 3.65, 3.24,
2.15, 2.08, 2.00, 1.95, 1.70, 1.44, 1.25, 1.19, 0.87； FABMS m/z 6.18.2940, 616, 606.2955, 604.2831, 592, 590, 480, 466, 464.28
88, 452.2885, 438, 314.3439, 314.3075, 300.3273, 300.2914, 286, 268； CIMS m/z 354, 352, 342, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298
, 296, 286, 284, 282, 280, 268, 266, 219, 193, 179, 165, 149, 137, 123,
111, 109, 97, 95, 85, 93, 71, 69, 59, 57, 55

【００８５】 画分Ｃ 白色の固体：シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／
ＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ）Ｒ_f ０．４７（ニンヒドリン陽性、ピンク）、０．４４（ニ
ンヒドリン陽性、赤色）、０．３４（ニンヒドリン陽性、紫色）； IR(NaCl) 2924, 2853, 1593, 1456, 1352, 1063, 972 cm^-1； FABMS m/z 620, 618, 616, 606, 604, 602, 466, 464, 452, 438, 314, 300, 29
8.2741, 296, 286, 280, 268；CIMS m/z 354, 352, 340, 338, 336, 328, 326,
324, 322, 314, 312, 310, 308, 300, 298, 296, 294, 292, 286, 284, 282, 28
0, 278, 268, 179, 165, 149, 137, 135, 1, 123, 121, 111, 109, 97, 95, 85,
83, 81, 71, 69, 60, 59, 57, 55。

【００８６】 初期分配 ２２個のスピスラ・ポリニマ貝を解凍し、殻を除去して、１．３kg（湿重量）
の生物体を得た。これを３：１ メタノール／トルエン（１．５リットル）とと
もにワーリングブレンダー中に入れ、すりつぶして濃いスラリーとし、これをセ
ライト層でろ過した。固形残渣をさらに抽出（４×１．５リットル）し、同様に
ろ過した。次に残存する固形分を５：１ メタノール／トルエン（７５０ml）に
入れ、３６時間浸してから、ろ過した。合わせたろ液（７．８リットル）を塩化
ナトリウムの１Ｍ溶液（２リットル）に加えた。上のトルエン層を除去後、水層
をさらにトルエン（２×１．５リットル）、次にジクロロメタン（３×１．５リ
ットル）で抽出した。残存する水層を、半分に濃縮し、酢酸エチル（２×１リッ
トル）で抽出した。得られた水層を水（２リットル）で希釈し、１−ブタノール
で２回抽出した（１．５リットル、１リットル）。溶媒を除去し、ジクロロメタ
ンとメタノールで粉砕して、トルエン抽出物（１４．１ｇ）、ジクロロメタン抽
出物（０．７５ｇ）、酢酸エチル抽出物（１．３ｇ）、１−ブタノール抽出物（
０．２ｇ）および水性抽出物（１．９ｇ）を得て、これらを測定した。

【００８７】 トルエン抽出物をヘキサンとメタノール（７５０mlずつ）に分配した。得られ
たメタノール層をさらにヘキサン（２×７５０ml、２×５００ml）で抽出した。
ヘキサン層を合わせ、約３リットルに濃縮し、両方の抽出物を冷却すると（−１
０℃）、それぞれ２つの層に分離した。合わせたメタノール層を真空下で濃縮し
て褐色の残渣（メタノール抽出物１．５３６ｇ）を得た。ヘキサン層をさらに約
１リットルに濃縮して、メタノール（５００ml）で逆抽出した。これらの各々か
ら溶媒を除去して、メタノール抽出物２（４．２６ｇ）とヘキサン抽出物（４．
５２ｇ）を得た。

【００８８】 画分Ｄ 第１のメタノール抽出物の一部（５９４mg）をＨＳＣＣＣにより、ヘキサン／
酢酸エチル／メタノール／水（４：７：４：３、ＭＰ＝ＵＰ）を４ml／分で使用
して分離した。これにより１２個の画分が得られ、このうち３、４、および５番
目が生物活性のほとんどを含有した。これらの３つの画分を合わせ（１５８mg）
、セファデックスＬＨ−２０でメタノールで溶出してクロマトグラフィーを行な
った。こうして、８つの画分が得られ、このうち４番目（８．４mg）が生物活性
のほとんどを含有した。この生物活性画分をさらに、ＨＰＬＣによりシアノカラ
ムで３：１ メタノール／０．０１Ｍ蟻酸アンモニウム（０．５ml／分）を使用
して精製した。８つの画分を集め、水（２〜８ml）を加えて各画分から蟻酸アン
モニウムを除去し、この試料をＳＰＥカラム（Ｃ−１８）に適用し、水（５〜１
０ml）で洗浄し、次にメタノール（５ml）で溶出した。７番目の画分（ｔ_r，５
．８分、白色の無定形固体、０．３mg、収率１×１０^-4％）が生物活性化合物を
含有し、これをここで画分Ｄと呼ぶ。シリカＴＬＣ（１−ＢｕＯＨ／ＡｃＯＨ／
Ｈ₂Ｏ、４：１：５、上層）は、ホスホモリブデン酸による視覚化で４つのスポ
ットを示した：Ｒf ０．５３（大きい）、０．３５（大きい）、０．３１（小
さい）、および０．１９（小さい）。不活性な６番目の画分は、Ｒf ０．５３
以外はすべて同じスポットを示した。画分ＤのＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ ２８６．
３０１９、３００．３２７０および２６８．３０１９で強いピークを示し、ｍ／
ｚ３１４、４３８、４５２、４６４、５９０、５９２、６６９、７９７、８０９
、および８２５で弱いピークを示した。示した最後の３つのイオンはまた、他の
ＨＰＬＣ画分のほとんどで観察され、Ｒf ０．３５のＴＬＣスポットに対応す
るようであった。 分析。C₁₈H₄₀NOの理論値：286.3110 (M+H)。実測値：286.3109 (HRFABMS)。

【００８９】 画分Ｅ 上記の第１のメタノール抽出物の第２の部分（６３３mg）をＨＳＣＣＣに付し
た。使用した溶媒系は、ヘキサン／メタノール／水（５：４：１、ＵＰ＝ＭＰ、
５ml／分）であり、これは固定相保持が少なかった。こうして、１０画分が得ら
れ、生物活性はこれらのほとんどに広がっていた。最初の３つの画分（３１０mg
）を合わせ、ヘキサン／酢酸エチル／メタノール／水（４：７：４：３、ＬＰ＝
ＭＰ、２ml／分）を使用してＨＳＣＣＣによりさらに精製して、１２画分を得た
。生物活性のほとんどを含有する２〜５番目の画分（８５mg）を、Ｃ−１８フラ
ッシュカラムで、メタノール／水／クロロホルム段階勾配（９０：１０：０、９
５：５：０、１００：０：０、９５：０：５、９０：０：１０：、５０：０：５
０）を用いて溶出した。こうして、すべてが生物活性である１０画分が得られた
。

【００９０】 第１のＨＳＣＣＣ実験からの４〜６番目の画分を、画分Ｄで記載したセファデ
ックスＬＨ−２０カラムからの副画分（２７０mg）と合わせた。この材料を上記
の２番目の実験と同じ条件（ただし流速は３ml／分であった）で、ＨＳＣＣＣに
付した。こうして９画分が得られ、このうち２番目と３番目の画分が、細胞障害
活性と細胞変化活性のほとんどを含有した。これらの２つの画分を合わせ（４２
mg）、フラッシュＣ−１８カラムでメタノール／水段階勾配（８０：２０、９０
：１０、９５：５、１００：０）を使用して分離した。こうして１２画分が得ら
れ、このうち８〜１１番目が、形態変化活性と細胞障害活性を示した。最初のＣ
−１８カラムからの１番目と５番目以外のすべての画分を、第２のカラムからの
８〜１１番目の画分（５０．４mg）と合わせ、クロロホルム／１−ブタノール／
酢酸／水（３：１２：２：２）を用いて分取用シリカＴＬＣにより分離した。プ
レートを８つの画分に分け、これらをかき取り、メタノールで溶出した。溶媒除
去後の各画分からの残渣を、ジクロロメタンで粉砕し、ろ過した。プレートの上
から２つ目の画分（Ｒf ０．８０〜０．４２）が、生物活性物質を含有し、こ
れを画分Ｅ（５．７mg）と呼ぶ。同じ溶媒系で溶出して画分Ｅの分析シリカＴＬ
Ｃを行うと、ニンヒドリン視覚化（Ｒf ０．４４）により１つのスポットが見
られたが、ホスホモリブデン酸スプレー試薬は、プレートの真ん中の３番目にす
じになった他の物質が示した。画分ＢのＦＡＢＭＳスペクトルは、主要なピーク
としてｍ／ｚ ２８６を、そして小さなピークとしてｍ／ｚ ２６８、３００、
４３８、４５２、および５９２を示した。

【００９１】 画分Ｆ メタノール抽出物の３番目の部分（４６８mg）を、溶媒系クロロホルム／１−
ブタノール／酢酸／水（８：１２：１：１）を使用して、フラッシュシリカクロ
マトグラフィーにより分離した。酢酸を除去するために、こうして得られた１０
画分を、（ａ）水（画分の半分の容量）を加えて２相を分離し、（ｂ）水層をク
ロロホルム（半分の容量×２）で抽出し、（ｃ）合わせた有機層を、水層のｐＨ
が７を超えるまで５％重炭酸ナトリウムで洗浄（２〜３×半容量）し、そして次
に（ｄ）有機層を水で洗浄（半容量）して中和した。生物活性のほとんどを含有
した３番目の画分を、セファデックスＬＨ−２０でメタノールで溶出してクロマ
トグラフィーを行なって８つの画分が得られた。６番目の画分（２．３mg）を、
画分Ａ〜Ｃの分離と同じ条件を使用して、ＨＰＬＣを繰り返して分離した。ｔ_r
８．１分で溶出する画分が最も生物活性の高い画分であり、これを画分Ｆと呼
ぶ。これは少なすぎたため、重量を正確に求めることができなかったが、おそら
く１００〜２００μg（収率約１〜２×１０^-4％）であった。これより遅く溶出
する画分はまた、それほど強くはなかったが細胞障害活性ととがった細胞形成活
性を示した。これは、生物活性化合物が充分明確なピークとしては溶出しないか
、または異なる同族体が異なる時間に溶出し、しかし分離されなかったことを示
唆した。シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ クロロホルム／１−ブタノール／酢
酸／水）は、Ｒ_f ０．４４で１つのニンヒドリン陽性スポットを示した。遅く
溶出する画分はまた、あまり強くはないが、これと同じスポットを示した。画分
ＦのＦＡＢＭＳスペクトルは、（強度が低下する順に）ｍ／ｚ ２８６、２６８
、３００、３１４、３４４、４３８、４５２、５９２、６６９を示す。

【００９２】 解剖 １つの生きた貝を、約１０mlのジエチルエーテルを有する容器に入れ、２０時
間冷却（４℃）した。これを９つの臓器に解剖した：足、消化器系（胃、腸、結
晶性スタイルサック（style sac））、生殖器、吸引管、えら、心臓、外套膜、
閉殻筋、および残りの内臓塊。各臓器を、まずメタノール／トルエン（３：１、
１０ml/g試料）に浸し、次にビルティスブレンダー（Virtis blender）でホモジ
ナイズした。得られた抽出物をろ過し、溶媒を除去した。残渣をジクロロメタン
とメタノールで粉砕して、１５５mg（足）、６０mg（消化器系）、１４７mg（生
殖器）、１０１mg（吸引管）、６５mg（えら）、２．５mg（心臓）、１６８mg（
外套膜）、１０１mg（閉殻筋）、および２５２mg（内臓塊）を得た。

【００９３】 別の実験において、調理した足を同様に抽出した（１８９mg）。調理した貝の
より大きな試料（４８３mg）を、まず３：１ メタノールリットル／トルエン（
３×５００ml）に浸して広範に抽出して、次に試料を同じ溶媒（５×５００ml）
でホモジナイズした。合わせた抽出物の小さい試料から溶媒を留去し、メタノー
ルに再溶解して測定した。

【００９４】 一般的方法 光学的旋光度は、３．５×５０mm １mlセルを備えたジャスコ（Jasco）ＤＩ
Ｐ−３７０デジタルポラリメーターで測定した。融点は、トマスフーバー（Thom
as Hoover）毛細管融点装置で測定した。¹Ｈ ＮＭＲと¹³Ｃ ＮＭＲは、バリアン
ユニティ−４００（Varian Unity-400）またはユニティ−５００（Unity-500）
分光光度計で記録した。化学シフトは、溶媒（７．２６、ＣＤＣｌ₃、および３
．３０、ＣＤ₃ＯＤ）に対するppmで報告する。高分解能（ＨＲＦＡＢ）と高速原
子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトルは、ＶＧＺＡＢ−ＳＥまたは７０ＳＥ４Ｆ分光
計で記録した。ＴＬＣは、メルクシリカゲル６０薄層プレートで行なった。クロ
マトグラフィー分離は、２３０〜４００メッシュのメルクシリカゲルを使用して
フラッシュクロマトグラフィーにより行なった。水分感受性のすべての反応は、
窒素雰囲気下でオーブンで乾燥したガラス器具で行なった。使用前に溶媒を蒸留
した：ベンゾフェノンケチルからのＴＨＦ、ＣａＨ₂からのジクロロメタン、お
よび他の溶媒は、試薬グレードであった。

【００９５】 （Ｓ）−２−（Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノ）プロピオン酸メチルエステル（３０
）： ３００mlの丸底フラスコに、２０（１０．０ｇ、７１．６mmol）、臭化ベンジ
ル（２５．７３ｇ、１５０．４mmol）、Ｋ₂ＣＯ₃（９．９０ｇ、７１．６mmol）
およびＣＨ₃ＣＮ（１７２ml）を加えた。ＴＬＣで反応が完全になるまで、混合
物を６０℃で攪拌した。反応は低温〜室温で、固形分はろ過により分離した。ろ
液を真空下で濃縮して油状物を得て、これをシリカゲル（９：１ ヘキサン／Ｅ
ｔＯＡｃ）でフラッシュクロマトグラフィーを行って、無色の油状物を得た：

【００９６】 [α]²⁵ _D= 113.6 (c 1.2, CHCl₃);¹ H NMR(400MHz, CDCl₃) δ 1.35 (d, 3H, J=7.1 Hz), 3.53 (q, 1H, J=7.0 Hz),
3.65 (d, 2H, J=1.38 Hz), 3.75 (s, 3H), 3.85 (d, 2H, J=13.8 Hz), 7.22-7.
42 (m, 10H);¹³ C NMR (100 MHz) δ 14.9, 51.1, 54.3, 56.0, 2.8, 4.1, 4.5, 139.1, 175.1
; FABMS m/z 284.1 (M+H), 282.1 (M-H), 224.2 (M=COOCH₃); HRFABMS C₁₈H₂₂NO₂の理論値、M_T 284.1651 (M+H)、実測値M_T 284.1650。

【００９７】 （Ｓ）−２−（Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノ）−１−プロパノール（４０）： ＴＨＦ（２０ml）中のＬｉＡｌＨ₄（５５０mg、１４．５mmol）の懸濁液に、
ＴＨＦ（２ml）中の３０（９１０mg、３．２１mmol）の溶液を滴下して加えた。
溶液を１５分攪拌し、次に６５℃に３時間加熱した。反応物を０℃に冷却し、０
．１Ｎ ＨＣｌで停止させた。反応物をセライト（Celite）でろ過し、セライト
をＴＨＦ（２×１５ml）で洗浄し、真空下で溶媒を除去した。シリカゲルのフラ
ッシュクロマトグラフィー（４：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、Ｒ_f＝０．３０）
により、７５０mg（収率９２％）の無色の固形分が得られた：融点４０〜４１℃
（ヘキサンから）文献融点４０〜４１℃（ヘキサンから）。スタンフィールド（
Stanfield）ら、J. Org. Chem. 1981, 49, 4799-4800を参照；

【００９８】 [α]²⁵ _D= +86.6 (c 1, CHCl₃)文献[α]²⁵ _D= +88.2 (c 1, CHCl₃);¹ H NMR(500MHz, CDCl₃) δ 0.98 (m, 3H), 2.98(m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.35 (
m, 3H), 3.45 (m, 1H), 3.81 (m, 2H), 7.19-7.41 (m, 10H);¹³ C NMR (1 MHz) δ 8.6, 52.9, 54.1, 62.7, 3.2, 4.5, 5.0, 5.3; FABMS m/z 256.2 (M+H), 224.2 (M-CH₂OH); HRFABMS C₁₇H₂₂NOの理論値、M_T 256.1701 (M+H)、実測値M_T 256.1702。

【００９９】 （Ｓ）−２−（Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノ）プロピオンアルデヒド（５０）； 乾燥ＤＭＳＯ（０．５３ml、７．４３mmol）を−７８℃のＣＨ₂Ｃｌ₂（７．５
ml）中の塩化オキサリル（０．３１ml、３．６mmol）の攪拌溶液に加えた。溶液
を１５分攪拌させ、次にＣＨ₂Ｃｌ₂（７．５ml）中の４０（７４０mg、２．９０
mmol）を加えた。３０分後、Ｅｔ₃Ｎ（１．０ml、７．２mmol）を加え、室温ま
で加熱させた。溶液を、飽和ＮａＨＣＯ₃（２０ml）で抽出し、水層をＣＨ₂Ｃｌ ₂ （２×１５ml）で抽出した。有機層を、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥し、真空下で室温で濃縮して、７２０mg（収率９８％）の黄色の油状物を
得て、これを−２０℃に冷却すると固体になった。このアルデヒドをさらに精製
することなく使用した； 融点５２〜５４１℃、文献融点５５．５℃。ディックス（Dix）ら、Arch Pharm
(Weinheim) 1995, 328, 203-205を参照;

【０１００】 [α]²⁶ _D= -36.0 (c 1, CHCl₃) 文献[α]²⁰ _D= -35.1 (c 1, EtOAc);¹ H NMR(400MHz, CDCl₃) δ 1.19 (d, 2H, J=7.0 Hz), 3.34 (q, 1H, J=7.0 Hz),
3.58 (d, 2H, J=13.7 Hz), 3.74 (d, 2H, J=13.7 Hz), 7.26 (m, 2H), 7.33 (m
, H), 7.42 (m, 4H), 9.74 (s, 1H);¹³ C NMR (100 MHz) δ 6.7, 54.9, 62.8, 3.3, 4.4, 4.8, 139.1, 204.6; FABMS m/z 408.2 (M+MB), 254.2 (M+H), 22.2 (M-CHO); HRFABMS C₁₇H₂₀NOの理論値、M_T 254.1545 (M+H)、実測値M_T 254.1545。

【０１０１】 （２Ｓ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノ）−３−オクタデカノール（
６０）： ＴＨＦ（１６０μl）中のＭｇリボン（２３７mg、９．７５mmol）、ジブロモ
エタン（１６μl、０．１８９mmol）を、還流冷却器を取り付けた２つ首フラス
コに加えた。０．５mlの１−ブロモペンタデカン溶液（９７０mg、３．３３mmol
、３．２５ml ＴＨＦ）を加えた。反応開始後、残りを滴下して加えた。灰色の
溶液に、ＴＨＦ（０．５ml）中の５０（１０５mg、０．４１３mmol）を滴下して
加えた。反応物を一晩攪拌し、次に溶液が清澄になるまでＨ₂Ｏ（５ml）と０．
１Ｎ ＨＣｌを加えた。混合物をＥｔＯＡｃ（３×１０ml）で抽出した。有機層
を５％ＮａＨＣＯ₃で、次にＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶媒
を真空下で除去して、油状物−固形物混合物を得た（７５０mg）。粗物質をシリ
カ（８：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、Ｒ_f ＝０．３４）のフラッシュクロマトグ
ラフィーで精製して、１２０mgの固体を得た。この固体をさらにシリカ（９３：
７ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）のＨＰＬＣで精製して、無色の蝋状の固体（９４．
３mg、収率４９％）を得た。

【０１０２】 [α]²⁵ _D= +16.3 (c 1, CHCl₃);¹ H NMR(500MHz, CDCl₃) δ 0.88 (t, 3H, J=7.0 Hz), 1.10 (d, 3H, J=6.7 Hz),
1.16-1.41 (bm, 26H), 1.56 (m, 1H), 1.69 (m, 1H), 1.79 (m, 1H), 2.72 (qu
in, 1H, J=6.7 Hz), 3.47 (d, 2H, J=13.8 Hz), 3.60 (m, 1H), 3.76 (d, 2H, J
=13.8 Hz), 7.22 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.34 (m, 4H);¹³ C NMR (1 MHz) δ 8.67, 14.11, 22.68, 25.90, 29.35, 29.61, 29.64, 29.68
, 29.69, 31.91, 34.27, 54.79, 57.26, 73.65, 2.89, 4.25, 4.77, 140.17; FABMS m/z 465 (M+H), 448 (M-H₂O), 464 (M-H), 388 (M-Ph), 224 (M-C₁₆H₃₃O)
; HRFABMS C₃₂H₅₂NOの理論値、M_T 466.4069 (M+H)、実測値M_T 466.4037。

【０１０３】 ２Ｓ，３Ｒ配向の割り当ては、６０中のベンジルプロトンの化学シフトと２−
（Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノ）−３−ペンタノールのｓｙｎおよびａｎｔｉジア
ステレオ異性体の文献値との比較に基づく。ａｎｔｉ異性体は、化学シフト鎖が
０．２９ppmであり、ｓｙｎは０．５２ppmである。他のｓｙｎ−ａｎｔｉ対の比
較は、ｓｙｎ異性体の範囲が０．４４〜０．５４ppmであり、ａｎｔｉが０．０
５〜０．２９ppmであることを示す。６０について値は０．２９ppmである。

【０１０４】 （２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−オクタデカノール（１）： １５mlの丸底フラスコにＭｅＯＨ（２ml）中の６０（８８．２mg、０．１８９
mmol）と２０％Ｐｄ（ＯＨ）₂−Ｃ（１１mg）を加えた。混合物を１気圧の水素
雰囲気下で攪拌した。２５mmシリンジフィルター（０．２μmナイロン膜）でろ
過して触媒を除去し、フィルターを４mlのＭｅＯＨで洗浄した。次に溶媒を真空
下で除去して、５１．５０mgの白色の固形分を得た。この生成物を６mlのＬＣ−
Ｓｉ ＳＰＥチューブ（９０：１０ ジクロロメタン／メタノール、次に１００
％メタノール）でクロマトグラフィーを行い、４９．４７mg（収率９２％）の白
色の固体を得た：

【０１０５】 mp ６６〜６７℃； [α]²⁶ _D= +24.9 (c 1, CHCl₃);¹ H NMR(500MHz, CD₃OD) δ 0.89 (t, 3H, J=7.0 Hz), 1.05 (d, 3H, J=6.6 Hz),
1.20-1.56 (bm, 31H), 2.81 (qd, 1H, J₁=6.6 Hz, J₂=3.8 Hz), 3.42 (dt, 1H,
J₁=8.8 Hz, J₂=3.8 Hz);¹³ C NMR (1 MHz) a 14.60, 16.82, 23.90, 27.40, 30.65, 30.90, 30.95, 30.96
, 33.23, 34.13, 52.33, 76.16; FABMS m/z 286.3 (M+H), 268.3 (M-OH), HRFABMS C₁₈H₄₀NOの理論値、M_T 286.3110 (M+H)、実測値M_T 286.3109。

【０１０６】 ３−ヒドロキシ−２−（１−メチル−２−２−ヒドロキシ−ヘプタデシル）−
イソインドリン−１−オン（１５２．２２mg）のジアステレオ異性体混合物を、
ヘキサン／２−プロパノール（９８：２、１ml／分）を用いてシアノＨＰＬＣで
分離して、４つの化合物（１５２ａ〜１５２ｄ）を得た。各ピークの純度は、Ｈ
ＰＬＣに再注入して決定した。分析、C₂₆H₄₄NO₃の理論値：418.3321 (M+H)、実
測値：418.3321 HRFABMS）

【０１０７】 152a：4.2 mg; t_T 13.3 分¹ H NMR(CDCl₃) δ 7.77 (1H, d, 7.3), 7.58 (2H, m), 7.50 (1H, m), 5.91 (2H
, s), 4.51 (1H, m), 3.78 (1H, m), 1.58 (2H, m), 1.40 (3H, d, 7.1), 1.24
(26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; ジアステレオ異性体の相対比 17:1:0:0 (152a:152b:152c:152d)。

【０１０８】 152b：13.7 mg; t_T 13.9 分¹ H NMR(CDCl₃) δ 7.70 (1H, d, 7.3), 7.54 (2H, m), 7.47 (1H, m), 5.88 (2H
, s), 4.37 (1H, m), 3.85 (1H, m), 1.52 (2H, m), 1.27 (3H, d, 7), 1.25 (2
6H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 41, 400; ジアステレオ異性体の相対比 1:6.8:0:0 (152a:152b:152c:152d)。

【０１０９】 152c：1.4 mg; t_T 20.0 分¹ H NMR(CDCl₃) δ 7.78 (1H, d, 7.3), 7.59 (2H, m), 7.51 (1H, m), 5.93 (2H
, s), 4.12 (1H, m), 3.99 (1H, m), 1.58 (2H, m), 1.37 (3H, d, 7.0), 1.25
(26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; ジアステレオ異性体の相対比 0:2.5:45:1 (152a:152b:152c:152d)。

【０１１０】 152d：1.5 mg; t_T 21.7 分¹ H NMR(CDCl₃) δ 7.77 (1H, d, 7.3), 7.59 (2H, m), 7.51 (1H, m), 5.86 (2H
, s), 4.12 (1H, m), 3.90 (1H, m), 1.58 (2H, m), 1.45 (3H, d, 6.6), 1.24
(26H, m), 0.87 (3H, t, 6.5); FABMS m/z 418, 400; ジアステレオ異性体の相対比 0:1:2:21 (152a:152b:152c:152d)。

【０１１１】 各ジアステレオ異性体をオズビー（Osby）らの方法により別々に脱保護した。
各異性体を２−プロパノール／水（６：１、１５２ａと１５２ｂについては０．
１Ｍ、１５２ｃと１５２ｄについては０．７Ｍ）に溶解した。水素化ホウ素ナト
リウム（５〜１０当量）を各溶液に加え、次にこれを２５℃で２４時間攪拌した
。次に各溶液を、酢酸でｐＨ４．５に調整し、８０℃でさらに２４時間攪拌した
。蟻酸アンモニウムを加えて各溶液のｐＨを７より上にし、次に窒素流で各々か
ら溶媒を除去した。各々の残渣をシリカＳＰＥカラムに適用し、これをまずヘキ
サン：２−プロパノール（９：１）で洗浄し、生成物を２−プロパノールで溶出
した。¹Ｈ ＮＭＲは、１５２ａと１５２ｄは１５４（それぞれ、１．１５mg、４
０％、および０．４８mg、４７％）を生成し、１５２ｂと１５２ｃは１５５（そ
れぞれ、３．３５mg、４２％、および０．３８mg、４０％）を生成したことを示
した。

【０１１２】 １５４：白色の固体；シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−Ｂ
ｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ） Ｒ_f ０．４８（ニンヒドリン陽性、ピンク）； IR(NaCl) 2919, 2851, 1563, 1466, 1406, 758 cm^-1; FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44。 C₁₈H₄₀NOの理論値：286.3110 (M+H)、実測値：286.3115 (HRFABMS）。

【０１１３】 １５５：白色の固体；シリカＴＬＣ（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−Ｂ
ｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ） Ｒ_f ０．５０（ニンヒドリン陽性、ピンク）； IR(NaCl) 3281, 2917, 2849, 1568, 1520, 1470, 1412 cm^-1; FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44。 C₁₈H₄₀NOの理論値：286.3110 (M+H)、実測値：286.3109 (HRFABMS）。

【０１１４】 アセチル化 無水酢酸（２００μl）に溶解した画分Ｂの一部（５６０μg）とピリジン（４
００μl）を、２５℃で４．５時間攪拌し、この時点でＴＬＣにより出発物質は
観察されなかった。窒素流で溶媒を除去してＡｃＢ：オフホウィトの固体を得た
； シリカＴＬＣＲ_f ０．８６（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／Ａ
ｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ、ホスホモリブデン酸） ０．６５（９：１ ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯ
Ｈ、ホスホモリブデン酸）； IR(NaCl) 2922, 2853, 1741, 1651, 1547, 1460, 1371, 1234, 1022, 970 cm^-1; FABMS m/z 370, 310, 268; CIMS m/z 426, 424, 412, 410, 398, 384, 370, 368, 364, 338, 324, 310, 165
, 149, 139, 1, 121, 111, 97, 86, 61, 57, 55。 C₂₂H₄₄NO₃の理論値：370.3321 (M+H)、実測値：370.3326 (HRFABMS）。

【０１１５】 トリアセチルスフィンゴシン（１３３） グローデ（Grode）とカーデリナ（Cardellina）に類似の方法で、無水酢酸（
１ml）中のｄ−エリトロ−スフィンゴシン（４．２mg、６．７μmol、シグマ（S
igma））とピリジン（２ml）を、２５℃で４．５時間攪拌し、この時点でＴＬＣ
により出発物質は観察されなかった。窒素流で溶媒を除去して１３３：白色の固
体を得た； シリカＴＬＣＲ_f ０．８６（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／Ａ
ｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ、ホスホモリブデン酸） ０．６５（９：１ ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯ
Ｈ、ホスホモリブデン酸）； FABMS m/z 580, 426, 366, 306, 264; CIMS m/z 468, 454, 426, 424, 394, 366, 364, 306, 264, 144, 85, 84, 83, 6
1。

【０１１６】 （２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−アセトキシオクタデカン（１５６） 無水酢酸（５０μl）中の（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−オクタデ
カノール（１５４、１５０μg、０．５μmol）とピリジン（１００μl）を、２
５℃で５時間攪拌し、この時点でＴＬＣにより出発物質は観察されなかった。窒
素流で溶媒を除去して１５６：白色の固体を得た； シリカＴＬＣＲ_f ０．８６（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／Ａ
ｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ、ホスホモリブデン酸）； IR(NaCl) 3286, 2924, 2853, 1740, 1653, 1541, 1456, 1371, 1238 cm^-1; FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268; C₂₂H₄₄NO₃の理論値：370.3321 (M+H)、実測値：370.3326 (HRFABMS）。

【０１１７】 （２Ｓ，３Ｒ）−２−アセトアミド−３−アセトキシオクタデカン（１５７） 無水酢酸（２００μl）中の（２Ｓ，３Ｒ）−２−アセトアミド−３−オクタ
デカノール（１５５、７５０μg、２．６μmol）とピリジン（４００μl）を、
２５℃で５時間攪拌し、この時点でＴＬＣにより出発物質は観察されなかった。
窒素流で溶媒を除去して１５７：白色の固体を得た； シリカＴＬＣＲ_f ０．８６（３：１２：２：２ ＣＨＣｌ₃／１−ＢｕＯＨ／Ａ
ｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ、ホスホモリブデン酸）； IR(NaCl) 3289, 2917, 2849, 1728, 1637, 1545, 1464, 1369, 1240 cm^-1; FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268; C₂₂H₄₄NO₃の理論値：370.3321 (M+H)、実測値：370.3319 (HRFABMS）。

【０１１８】 スピスロシン２８５アセトニド（１４６） 画分Ａの一部（４０μg）をアセトン（２００μl）に溶解し、ここに０．１Ｎ
塩酸（２０μl）を加えた。この溶液を２５℃で２４時間攪拌し、次に窒素流で
溶媒を除去した。ＦＡＢＭＳは、少量のアセトニド１４６が生成したことを示し
た： m/z 592, 452, 438, 326.3430, 300, 286, 268。 C₂₁H₄₄NOの理論値：326.3423 (M+H)、実測値：326.3430 (HRFABMS）。

【０１１９】 （４Ｓ，５Ｒ）−４−メチル−５−（ｎ−ペンタデシル）−オキサゾリジノン（
１５８） （２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−オクタデカノール（１５５、７５０μg、
２．６μmol）をジクロロメタン（１００μl）に溶解し、ここに１，１’−カル
ボニルジイミダゾール（０．８５mg、５．３μmol）とトリエチルアミン（０．
４μl、２．９μmol）を加えた。この溶液を５時間攪拌し、次に窒素流で溶媒を
除去した。粗生成物１５８を、精製することなく分析した： IR (NaCl) 36, 2919, 2861, 1742, 1713, 1551, 1470, 1395, 1321, 49, 1239,
1094, 1061, 1001, 768, 743, 664 cm^-1； FABMS m/z 785, 623, 474, 406, 362, 328, 312, 286, 268。 C₁₉H₃₈NO₂の理論値：312.2903 (M+H)、実測値：312.2903 (HRFABMS）。

【０１２０】 細胞形態の変化のさらなる研究 材料 リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ツブリンとファロイジンに対する抗体は、
すべてシグマ（Sigma）から得た。フルオレセイン−およびテキサスレッド−標
識ヤギ抗マウス抗体は、アマシャム（Amersham）（英国）から得た。Ｒｈｏタン
パク質に対する抗体は、スタクルッズバイオテク（Sta Cruz Biotechn）から得
た。

【０１２１】 細胞培養 ベロ細胞を、１０％胎児牛血清を補足したダルベッコー改変イーグル培地で増
殖させた。スピスロシンまたはＬＰＡを、４〜２４時間、それぞれ０．２〜１．
０μgおよび５０〜１０μMで、これらの培養物に加えた。ハンクス緩衝化食塩水
中の０．４％トリパンブルーの溶液を使用して、薬剤排除血球計算器を用いて、
細胞を計測した（セリス（Celis）とセリス（Celis）、「細胞生物学における組
織培養の一般的方法、実験室ハンドブック（General Procedures for Tissue Cu
lture in Cell Biology, a Laboratory Handbook）」、アカデミックプレス（Ac
ademic Press）、第１巻、５〜１７頁）。

【０１２２】 例Ａ スピスロシン２８５は細胞形態の変化を引き起こす ベロ細胞をスピスロシン２８５（０．５μM）と４時間インキュベートした。
図３は、例Ａの結果についての顕微鏡写真である。細胞の形は、多角形（未処理
細胞、パネルａ）から紡錘形（パネルｂ）に変化した。パネルｃは、スピスロシ
ンを加えた培養物の高倍率を示す。

【０１２３】 例Ｂ 細胞形態の変化は、細胞マイクロフィラメントに及ぼす作用のためである スピスロシンで処理した細胞中のマイクロフィラメントと微小管の構成を同定
するために、細胞をファロイジンで染色して、アクチンポリマーを検出し、抗ツ
ブリン抗体でツブリンを検出した。

【０１２４】 ベロ細胞を、０．５μMスピスロシンの存在下（パネルｂ、ｄ）または非存在
下（ａ、ｃ）で４時間インキュベートした。カバーガラスで増殖させた細胞を−
２０℃でメタノールで固定（ツブリン抗体用）したか、またはファロイジンイン
キュベーションのためにリン酸緩衝化生理食塩水ＰＢＳ中の４％パラホルムアル
デヒド（w/v）で固定した。後者の場合に、細胞はＰＢＳ中０．２％トリトンＸ
−１００で洗浄した。カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、ツブリン抗体（ＰＢＳで
１／１０００希釈）またはファロイジン（１mg/ml）と室温で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳで洗浄後、ツブリン抗体とインキュベートしたカバーガラスに
、フルオレセインまたはテキサスレッド標識ヤギ抗マウス抗体（ＰＢＳで１：５
０希釈）を重層した。カバーガラスをモウィオール（Mowiol）にマウントし、観
察するまで暗所に４℃で保存した。

【０１２５】 図４は、例Ｂの結果の顕微鏡写真である。パネル「ａ」は、ファロイジン（ア
クチン染色）で染色した細胞であり、スピスロシンで処理していない細胞である
。パネル「ｂ」は、ファロイジンについて染色し、スピスロシンで処理した細胞
である。パネル「ｃ」は、ツブリンについて染色し、スピスロシンで処理してい
ない細胞である。パネル「ｄ」は、ファロイジンについて染色し、スピスロシン
で処理した細胞である。スピスロシン処理細胞では、未処理細胞と比較して、ア
クチンの大幅な低下がある。同じ条件下で、微小管ネットワークは、重合した型
のままである。

【０１２６】 例Ｃ Ｒｈｏタンパク質に及ぼすスピスロシンの作用 小ＧＴＰ結合タンパク質であるＲｈｏは、アクチン−ミオシン「ストレス繊維
」の形成に関与している（エー・ホール（Hall, A.）、Science, 279, 1998, p
509-514）。従って電気泳動度とＲｈｏの細胞分布を、スピスロシンで処理した
細胞で分析した。

【０１２７】 図５は、例Ｃの電気泳動図である。パネルＡでは、未処理細胞（ａ）または０
．５μMスピスロシン処理（２０時間）細胞（ｂ）からの細胞抽出物の等量のタ
ンパク質を、ゲル電気泳動で分画し、ニトロセルロース紙にブロットして、Ｒｈ
ｏタンパク質の量を分析した。

【０１２８】 パネルＢでは、上記のように実験を行なったが、ホモジネートは、顆粒（膜、
「Ｍ」）画分および可溶性（「Ｓ」）画分中に分画した。

【０１２９】 細胞を低張緩衝液（０．５Ｍショ糖、２０mMヘペス、ｐＨ７．４、２mM ＥＤ
ＴＡ、１mM ＰＭＳＦ、１０μg/mlアプロチニン、ロイペプチンおよびペスタチ
ン）中に入れ、ダウンス（Dounce）で溶解して、亜細胞分画を行なった。まずホ
モジネートを７５０ｇで５分遠心分離して、核と破壊されなかった細胞を除去し
、上清をさらに３０，０００ｇで１時間（４℃）遠心分離して、ペレット化した
顆粒画分（推定の膜画分）と上清を単離した。異なる画分を、Ｒｈｏタンパク質
に対する抗体を使用して、電気泳動とウェスタンブロットにより性状解析した。

【０１３０】 スピスロシンで細胞を処理しても、Ｒｈｏの量または移動度に大きな変化は観
察されなかった。しかし、顆粒画分に結合したＲｈｏの比率の低下が観察された
。

【０１３１】 例Ｄ スピスロシンの作用に及ぼすリソホスファチジン酸（ＬＰＡ）の作用 ＬＰＡは、Ｒｈｏタンパク質を活性化することにより細胞中のストレス繊維の
レベルを上昇されることが知られている。スピスロシンで処理した細胞および未
処理の細胞へのＬＰＡの作用を調べた。

【０１３２】 ベロ細胞を、１０μM ＬＰＡの非存在下（ａ）または存在下（ｂ）で２時
間インキュベートしたか、または０．５μMのスピスロシンの存在下（ｃ）で２
０時間、またはまず１０μM ＬＰＡ（２時間）の存在下でそして後に０．５μM
スピスロシンでさらに１８時間（ｄ）インキュベートした。

【０１３３】 図６は、例Ｄの結果の顕微鏡写真である。パネルｂは、アクチンのレベルの上
昇におけるＬＰＡの作用を示す。ベロ細胞をスピスロシンと２４時間インキュベ
ートすると、丸い細胞が出現する（パネルｃを参照）。これらの細胞は、培養皿
から離れ、死滅する。スピスロシンにＬＰＡを添加すると、スピスロシンが促進
する形態変化が防止される。

【０１３４】 インビボデータ 例Ｅ−インビボでのスピスロシン２８５の作用 スピスロシン２８５を、ヒト前立腺癌（ＰＣ−３）とヒト腎臓癌（ＭＲＩ−Ｈ
−１２１）の異種移植片モデルに対して、インビボ試験で調べた。これらのモデ
ルは、時間とともに増殖し容量が増える皮下移植ヒト固形腫瘍を使用する。対照
動物での腫瘍増殖の平均容量は、比較の基礎を提供する。活性化合物のために、
腫瘍増殖は、完全に（％Ｔ／Ｃ値＜１％、または陰性）、または部分的に（＞１
％Ｔ／Ｃ−５０％Ｔ／Ｃ）阻害される。４０％Ｔ／Ｃ未満の活性レベルは、統計
的に有意であると考えられる。使用したスピスロシンの用量は、最大許容される
非致死用量（ＭＴＤ）、１／２ＭＴＤおよび１／４ＭＴＤで与えられる。薬剤の
送達は、腹腔内経路による。

【０１３５】 ヒト前立腺癌ＰＣ−３ 化合物 総用量 ％Ｔ／Ｃ 日 コメント （mg/kg） スピスロシン２８５ ９．９９０ −２１％ １１ 停止（完全な緩解） スピスロシン２８５ ５．０１０ −１％ １１ 停止（完全な緩解） スピスロシン２８５ ２．４９９ ２２３％ １５ 対照 １００％ １５

【０１３６】 ヒトＭＲＩ−Ｈ−１２１腎臓癌 化合物 総用量 ％Ｔ／Ｃ 日 コメント （mg/kg） スピスロシン２８５ ９．９９０ ２８％ １１ 阻止（部分的緩解） スピスロシン２８５ ５．０１０ ３５％ １１ 阻止（部分的緩解） スピスロシン２８５ ２．４９９ ４３％ １５ 対照 １００％ １８

【０１３７】 スピスロシン２８５は両方のタイプの腫瘍に有効であり、ヒト前立腺癌モデル
ＰＣ−３の場合は高用量で腫瘍サイズを有意に低下させる。スピスロシン２８５
は、ヒト腎臓癌の増殖を低下させ、この作用は薬剤の最後の投与後数週間続く。

【０１３８】 例Ｆ 一連の異なる細胞株に対して、スピスロシン２８５の拡張インビトロスクリー
ニングを行なった。以下のデータが得られた：

【０１３９】 分類 株 腫瘍 ＩＣ５０ ＣＶ−１治療指数 固形 SK-HEP-1 肝臓 3.51E-15 7863 PANC-1 膵臓 1.71E-12 16 HT-29 大腸 2.56E-12 11 786-0 腎臓 2.75E-12 10 FADU 咽頭 4.99E-12 6 Hs 746T 胃 7.89E-12 3 SK-OV-3 卵巣 1.40E-11 2 MX-1 乳房 3.89E-11 1 RAMOS ハ゛ーキット 4.82E-11 1 P3HR1 ハ゛ーキット 6.73E-11 0 SW684 繊維肉腫 1.05E-09 0 リンパ腫 U-937 リンパ腫 1.96E-11 1 H9 リンパ腫 3.10E-11 1 白血病 HL-60 白血病 8.50E-12 3 ARH77 白血病 1.36E-12 2 K562 白血病 1.57E-11 2 CCRF-SB 白血病 1.05E-09 0 正常 CV-1 腎臓繊維芽細胞 2.76E-11 1

【０１４０】 腫瘍細胞に対するＩＣ５０力価の範囲は、ナノモル（1.05E-09 nM）からフェン
タモル（3.51E-15 fM）である。nMとpM範囲外で、fM範囲で活性を有する薬剤を
見つけることは例外的である。固形腫瘍の中では、最も増殖の遅いものが最も感
受性であり、非常に増殖が遅いのは肝癌ＳＫ−ＨＥＰ−１である。

【０１４１】 ＩＣ５０力価（2.76E-11）が白血病／リンパ腫に匹敵するため、ＣＶ−１正常
細胞株と比較して最大の治療指数は、増殖の遅い固形腫瘍で見られた。固形腫瘍
のＴＩは１〜２０単位であり、肝癌のＴＩは＞３ｌｏｇであった。

【０１４２】 腎臓腫瘍細胞株は最も活性のある群（pM力価）であり、これはインビボの異種
移植片データと相関する。

【０１４３】 参考文献 以下の文献は、本発明に関連するバックグランド情報を与える：

【０１４４】 本発明を、好適な実施態様を含めて詳細に説明した。しかし、本発明の開示内
容を考慮すれば、本発明の修飾および／または改良が可能であることは、当業者
には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｅおよび１Ｆは、スピスラ・ポリニマ抽出物のＬ１２
１０測定法で観察された細胞の形態を例示する。図１Ａは、正常細胞；図１Ｂは
、典型的なとがった細胞；図１Ｃは、非典型的とがった細胞；図１Ｄは、３つ以
上の突端を有する細胞；図１Ｅは、隆起した細胞；および図１Ｆは、隆起した細
胞ととがった細胞の組合さったものである。

【図２】 本明細書に記載の化合物を、二枚貝スピスラ・ポリニマの抽出物から分離する
のに使用される反応工程図である。

【図３】 例Ａの結果の顕微鏡写真である。

【図４】 例Ｂの結果の顕微鏡写真である。

【図５】 例Ｃの結果の電気泳動図である。

【図６】 例Ｄの結果の顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 フルゴウ、ナンシイ、ルイーズ アメリカ合衆国 イリノイ、アーバナ、カ リフォルニア ストリート 1209、ボック ス 45−５、ロジャー アダムス ラボラ トリイ、 アーバナ − キャンペイン、 ユニバーシティ オブ イリノイ (72)発明者 ウォリック、ロバート、アーサー アメリカ合衆国 イリノイ、アーバナ、カ リフォルニア ストリート 1209、ボック ス 45−５、ロジャー アダムス ラボラ トリイ、 アーバナ − キャンペイン、 ユニバーシティ オブ イリノイ (72)発明者 ガルシア、グラバロス、ドロレス スペイン国 トレス カントス、ポリゴノ インダストリアル デ トレス カント ス、３、カルレ デ ラ カレラ、 ファ ルマ マル、ソシエダッド アノニマ (72)発明者 アビラ、ジーザス スペイン国 マドリッド、バイオロジア モレクラル、ドプト、ファクルタド デ シエンシアス、 ユニベルシダド アウト ノマ デ マドリッド (72)発明者 フェアクロス、グリン、トマス アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ケン ブリッジ、 パトナム アベニュー 320、 ファルマ マル ユーエスエイ、インコ ーポレイテッド Ｆターム(参考） 4C087 BB16 NA14 ZB26 ZB27 4C206 AA01 AA02 AA03 FA02 MA01 MA05 ZB26 ZB27

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２−アミノ基と３−ヒドロキシ基を有する長鎖の直鎖アルカ
   ンまたはアルケン化合物を、薬剤学的に許容される担体とともに含有する医薬組
   成物。
2. 【請求項２】 化合物は、置換２−アミノ−３−ヒドロキシアルカンまたは
   ２−アミノ−１，３−ジヒドロキシアルケンである、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 化合物は、置換Ｃ₁₆−Ｃ₂₄アルカンまたはアルケンである、
   請求項１または２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 化合物は、置換Ｃ₁₈−Ｃ₂₀アルカンである、請求項１、２ま
   たは３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 化合物は、２−アミノ−３−ヒドロキシＣ₁₈アルカンである
   、請求項１、２または３に記載の組成物。
6. 【請求項６】 化合物は、 スピスロシン２８５（１）、ｎ＝１２；スピスロシン２９９（２）、ｎ＝１３；
   スピスロシン３１３（３）、ｎ＝１４； スフィンゴシン（４），ｎ＝１２、およびノナデカ−４−スフィンゲニン（５）
   、ｎ＝１３；および スフィンガ−４，１０−ジエン（６）よりなる群から選択される、請求項１に記
   載の組成物。
7. 【請求項７】 癌の治療に使用される、前記請求項のいずれか１項に記載の
   組成物。
8. 【請求項８】 乳癌、頭部と首の癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、食
   道癌、肝臓癌、大腸癌、甲状腺癌、黒色腫、腎臓癌、睾丸癌、白血病、卵巣癌、
   消化器癌、およびリンパ腫から選択される癌の治療に使用される、前記請求項の
   いずれか１項に記載の組成物。
9. 【請求項９】 組織および腫瘍の血管新生の調節のための、血管内皮細胞に
   向けられた治療で使用される、請求項１〜７までのいずれか１項に記載の組成物
   。
10. 【請求項１０】 化合物は、スピスロシン２８５であり、組成物は固形腫瘍
    の治療用である、請求項６に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 化合物は、スピスロシン２８５であり、組成物は増殖の遅
    い腫瘍の治療用である、請求項６に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 化合物は、Ｒｈｏタンパク質活性を変化させるように作用
    する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 併用療法で使用される他の薬剤との、前記請求項のいずれ
    か１項に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 治療法で使用される、２−アミノ基と３−ヒドロキシ基を
    有する長鎖の直鎖アルカンまたはアルケン化合物。
15. 【請求項１５】 癌の治療で使用される組成物の製造における、２−アミノ
    基と３−ヒドロキシ基を有する長鎖の直鎖アルカンまたはアルケン化合物の使用
    。
16. 【請求項１６】 癌の治療で使用される薬剤の製造におけるスピスロシンの
    使用。
17. 【請求項１７】 悪性腫瘍に罹っている哺乳動物の治療法であって、２−ア
    ミノ基と３−ヒドロキシ基を有する長鎖の直鎖アルカンまたはアルケン化合物で
    ある活性化合物の治療上有効量を、罹患個体に投与することを特徴とする、上記
    方法。
18. 【請求項１８】 二枚貝スピスラ・ポリニマの生物活性抽出物。