JP2004520372A - 抗血管形成性化合物及び細胞浸潤の阻害剤のアッセイ - Google Patents
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Abstract
本発明は細胞浸潤または血管形成の阻害のための大環状アミンの使用を提供する。本発明の化合物および医薬組成物は、癌を含む、細胞浸潤または血管形成を特徴とする状態の治療に有用である。本発明で用いることのできる化合物としては、モツポラミンが含まれる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞浸潤に影響を及ぼす薬剤のアッセイ、および細胞浸潤または血管形成を阻害する作用剤の疾患の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の自発運動性と浸潤は、胚形成、血管形成、創傷治癒、排卵、胚の着床および妊娠、免疫監視および炎症を含む組織の発達とホメオスタシスに不可欠の生理学的プロセスである。細胞の自発運動性と浸潤はまた、炎症、動脈硬化、再狭窄、神経膠腫、網膜症、心筋虚血、関節リウマチ、乾癬、および腫瘍の進行と転移などの多数の病理学的プロセスの重要な要素でもある。例えば、腫瘍の転移のプロセスは原発腫瘍からの細胞の播種で始まり、その後、原発腫瘍のある臓器の基質コンパートメントを通じての細胞の移動、血管系/リンパ系の支持組織から腫瘍細胞が血管内異物侵入し転移する先の離れた二次臓器内へ、移動し、ならびに腫瘍細胞の二次臓器の組織中への移動が起こる。
【０００３】
細胞の自発的移動と浸潤を阻害することは、癌、および上述したものを含むその他の細胞の自発的移動および浸潤が関与する疾患、ならびに避妊に有用なものとなろう。例えば、細胞と細胞外マトリックス(ECM)との間の相互作用の変化によって駆動される癌細胞の浸潤がその1例である。上皮由来の癌の場合、原発腫瘍は特別なECMである基底膜によって取り囲まれている。再構成基底膜マトリックスを用いる組織培養方法が、マトリックスの変化、沈着、マトリックスの分解、細胞のマトリックスへの付着、およびマトリックスを介する移動が癌細胞の浸潤に役割を果たしていることを示すために用いられてきた(Wyke, J. A.(2000), Eur. J. Cancer, 36:1589-1594)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ある薬剤が細胞浸潤に対して影響を及ぼすか否かを測定するためのこれまでの方法は生物学的なマトリックスの使用に依存しており、そのマトリックスを通過する細胞の浸透または移動の変化を検出することを含んだものである。とりわけ、そのような方法には、ある薬剤を適用した際のマトリックスを通過する細胞の浸透または移動する細胞数の減少の測定が含まれる。そのような方法は、該薬剤の細胞毒性または細胞の生物学的マトリックスへの付着に影響を及ぼす能力に関する情報が既知であるような状況での使用に適しているが、通常はスクリーニング法での使用に適したものではない。
【０００５】
血管のない腫瘍は増殖することができず、転移能もほとんどないので、血管形成の阻害は癌治療の方策の1つである。固形腫瘍の治療用としてこれまでに評価された抗血管形成性化合物としては、メタロプロテイナーゼ、イオンチャンネル、プロテインキナーゼ、または細胞増殖を阻害する小分子；増殖因子を不活化またはアンタゴナイズする薬剤；ならびに作用機作が依然として未知の薬剤が含まれる。新規の抗血管形成性薬剤の発見が、癌およびその他の疾患の治療法の発展のために望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は式IもしくはIIの化合物またはその化合物の製薬上許容される塩の、細胞浸潤の阻害剤として、もしくは抗血管形成性薬剤としての使用を提供する。ここで、式Iは：
【化１２】
【０００７】
［式中、
Xは、1個以上のエポキシド、ケトン(＝O)、チオカルボニル(＝S)、オキシム(＝N−OH)、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖で；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、O、S、NH、またはNRで置換することができ；このアルキル鎖中で1個以上のCおよびCH基は、NHまたはNRで置換することができ；
R1およびR2は独立して：水素；メチル；1個以上の−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；またはベンジルのフェニル環を1個以上のR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SO2Rで置換することのできるベンジルであるが；R1およびR2のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yは1個以上のエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、OまたはSで置換することができ；
Rは次のように定義される：1個以上のエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、−SO2R'で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基；このアルキル基でR'は−NH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
であり、式IIは：
【化１３】
【０００８】
［式中：
Xは、1個以上のエポキシド、ケトン(＝O)、チオカルボニル(＝S)、オキシム(＝N−OH)、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖で；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、O、S、NH、またはNRで置換することができ；このアルキル鎖中で1個以上のCおよびCH基は、NHまたはNRで置換することができ；
R1、R2、およびR3は独立して：メチル；1個以上の−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；またはベンジルのフェニル環を1個以上のR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできるベンジルであるが；R1、R2、およびR3のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yは1個以上のエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、OまたはSで置換することができ；ならびに、
Rは次のように定義される：1個以上のエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、−SO2R'で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基；このアルキル基でR'は−NH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
である。
【０００９】
好ましくは、式IまたはIIの化合物は下記の特徴の1つ以上を有する化合物である：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5であり、場合によって上述のとおり置換されたものである。
【００１０】
(b) Xは11〜16個の炭素原子の飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１１】
(c) Xは11〜16個の炭素原子の不飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１２】
(d) Xは11〜16個の炭素原子の不飽和で部分的に環状化したアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１３】
(e) 式Iで、R1およびR2の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１４】
(f) 式Iで、R1およびR2の1つは水素；メチル；または、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１５】
(g) 式Iで、R1およびR2の1つは直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１６】
(h) 式Iで、R1およびR2の1つは水素；メチル；または、直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１７】
(i) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１８】
(j) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つはメチル；または、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１９】
(k) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００２０】
(l) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つはメチル；または、直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００２１】
式Iの化合物は次のようなものとすることができる：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5、より好ましくはnは1、2、または3であり；
(b) Xは二者択一的に：11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで置換することができ、そのRは好ましくはC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基であるか；または、Xは11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和化され部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1およびR2のうちの一方が、水素、メチルまたは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) もう一方のR1およびR2は直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものであり、そのRはC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である。
【００２２】
式IIの化合物は次のようなものとすることができる：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5、より好ましくはnは1、2、または3であり；
(b) Xは二者択一的に：11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで置換することができ、そのRは好ましくはC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基であるか；または、Xは11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和化され部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1、R2、およびR3のうちの1個または2個、より好ましくは2個がメチルまたは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) R1、R2、およびR3の1つは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものであり、そのRはC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である。
【００２３】
本明細書で用いている「不飽和」および、より特定して「完全に不飽和」という用語には、芳香族の構造を含む。
【００２４】
本明細書で用いている「部分的に環状化した」という用語は「X」のアルキル鎖に関して用いる場合には、1つ以上の環状構造を含んでいる鎖を意味する。従って、式IおよびIIのいずれかで「X」および「N2」によって形成される構造は単一の環となることができ、または「X」が部分的に環状化したものである場合には、その構造は複数の環を含んでなる。
【００２５】
本発明は治療または避妊のための、式Iまたは式IIの化合物、ならびに許容される担体および1種以上の式Iまたは式IIの化合物を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾病状態の治療のための、細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害のための、または避妊のための医薬品を調製する目的でのそのような化合物もしくは塩の使用をも提供する。本発明はまた、疾病状態の治療のための、細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害のための、ならびに避妊のための、そのような化合物、塩、医薬組成物、および医薬品の使用をも提供する。代表的な疾病状態としては、癌、炎症、動脈硬化、再狭窄、関節炎、乾癬、神経膠腫、網膜症、および心筋虚血が含まれる。細胞浸潤または自発運動性の阻害のための治療を本発明に従って行うことのできるその他の状態または状況としては、神経細胞の回復の際の軸索の可塑性が低下することが挙げられる(例えば、神経性または脊髄の病変など神経細胞にダメージを受けた後の治療の際に)。本発明はまた、そのような状態の治療のための方法、細胞浸潤または自発運動性の阻害のための方法、避妊のための方法であって、ある化合物、ある化合物の製薬上用いうる塩、またはそのような化合物もしくはその塩の1種以上を含んでなる医薬組成物を、そのような治療を必要としている、もしくは所望している被験者に投与することを含んでなる方法をも提供し、その方法において該化合物は細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害剤であり、式IもしくはIIの化合物である。
【００２６】
本発明はまた、式IまたはIIの新規化合物；式IまたはIIの化合物の新規の塩；ならびに、許容される担体、および式IもしくはIIまたはそれらの塩を含んでなる医薬組成物をも提供する。新規化合物ではない式IもしくはIIの化合物はモツポラミン(Motuporamine)A、B、およびCで、Williams, D. E.ら, (1998) J. Org. Chem. 63:4838-4841に報告されている。しかし、モツポラミンA、B、およびCは本発明の医薬組成物、使用、および方法に含まれている。これらの既知のモツポラミンは弱い細胞毒性を有する大環状アルカロイドで、熱帯のカイメンの1種であるXestospongia exiguaから初めて単離されたものである(Williamsら[上述の文献])。
【００２７】
既知のモツポラミンの種々の合成法が知られており、文献中に報告されている(Goldring, W. P. D.とWeiler, L. (1999) Organic Letters 1:1471-1473; Goldring, W. P. D.ら(1998) Tetrahedron Letters 39:4955-5948; Furstner, A.とRumbo, A.(2000) J. Org. Chem. 65:2608-2611; およびBaldwin, J. E.ら(1999) Tetrahedron Letters 40:5401-5404を参照せよ)。本発明で用いるための化合物およびその製薬上用いうる塩、それには本明細書に記載の新規のモツポラミンおよび塩が含まれるが、それらは天然のソースから得ることができ、その後前述の参照文献中の後者の文献および本明細書中の実施例に記載されているように改変することができる。好ましくは、本発明で用いるための化合物は、例えば既知の合成経路を用いて、出発材料に適切な改変を加え、当業者には明白な方法を用いて、本明細書に記載のとおり新規のモツポラミンを得るために、合成される。当業者であれば既知のモツポラミンを改変するための従来の方法、および本明細書に記載の類似体を作成するための特別な方法論を、本発明に包含されている新規のモツポラミンおよび類似体の調製に用いるかまたは適合させることができる。
【００２８】
本発明はまた、細胞浸潤を阻害する薬剤の存在を試験するための方法をも提供し、その方法は：
(a) 浸潤性の細胞を生物学的マトリックスの表面上に置き；
(b) 細胞浸潤阻害活性を試験しようとする薬剤でその細胞を処理し；
(c) マトリックスの表面上の細胞を、その細胞がマトリックスに浸潤するために十分な時間保持し；
(d) (c)の後、マトリックス表面上の実質的に全ての細胞を除去し；
(e) (d)で除去した細胞を、その細胞が付着し増殖しうる表面上に移し；
(f) (e)の表面上の細胞をその表面上で付着および増殖が起こるために十分な時間保持し；
(g) (f)の後に該表面に付着した細胞の量を示す値を測定する、
ことを含んでなる。
【００２９】
上述の方法で、(a)と(b)は同時に起こってもよく、またはどのような順番であってもよい。該細胞はマトリックスに浸潤することができ、そのマトリックスは細胞浸潤の阻害剤が存在しない場合にはその細胞が浸潤性を示すこととなるようなものである。
【００３０】
上述の試験法はまた、(g)で測定した値を対照で測定された値と比較することをも含んでなる。対照は(b)での細胞の処理以外は同一の条件で上記の方法を行った細胞である。後者の場合には、本発明の方法はさらに薬剤での(g)の値を対照の(g)の値と比較して、該薬剤による阻害量を示す値を得ることをも含んでなる。該薬剤が細胞浸潤の阻害剤であることを示すような結果とは、本発明の方法で(g)で測定した値が、対照で測定した値よりも低いことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の試験方法において、浸潤性細胞は生物学的マトリックスの表面上に置かれる。本発明に用いる目的では浸潤性細胞は生物の膜または細胞外マトリックスもしくはその他の細胞の生存と適合しうる材料で作成したゲルを通過して動くことのできる、どのような細胞でもよい。適切な細胞としては、下記の実施例に記載のもの、またはPC-3前立腺癌、U-87神経膠腫、およびU-251神経膠腫などの細胞などの浸潤性の癌細胞、ならびに神経細胞、内皮細胞、有核造血細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞などの癌細胞でない細胞が含まれる。
【００３２】
本発明では、生物学的マトリックスは、浸潤性の細胞がその中に浸潤することのできるような、細胞外マトリックス材料もしくはその他の細胞の生存と適合しうる材料で作成した膜またはゲルとすることができる。例としては下記の実施例で用いている生物学的マトリックスならびにフィブリンゲル、または個々の細胞外マトリックス成分もしくは細胞外成分の混合物で形成されたゲル、または細胞の生存と適合しうる何らかの物質で形成されたゲル、または細胞の生存と適合しうる何らかの物質を含有するゲル、などのゲルを含む。適切な生物学的マトリックスには、細胞の浸潤性を評価するためにこれまで用いられてきたものが含まれる。
【００３３】
本発明の試験方法では、浸潤性細胞は生物学的マトリックス上に、その細胞がマトリックスへ浸潤するために十分な時間、保持される。保持する時間は当業者であれば用いる細胞のタイプおよびそのマトリックスの性質に基づいて決めることができる。その細胞がマトリックス中へ浸潤するために十分な時間が経過した後、実質的に全ての細胞をマトリックスの表面から除去する。この除去は当業界で既知の適切な方法であればどの方法を用いても行うことができ、そのような方法としては、下記の実施例に記載の方法が含まれる。除去した細胞は、その細胞が付着し増殖することのできるような表面上へと移される。そのような表面は、その試験で用いた細胞と適合しうるような当業界で既知のどのような表面でもよく、そのようなものとしては本明細書中に記載のプラスチックの表面が含まれる。その細胞は、細胞が付着し増殖するために十分な時間、その表面上で保持される。保持時間は、表面に付着し生存している細胞が増殖するのに十分な時間が経過するように、その細胞のタイプおよび表面の性質に従って試験実施者によって選択される。
【００３４】
本発明の試験方法では、該表面に付着し増殖した細胞の数または量を示す値が測定される。この値を測定するためには当業界で既知の種々の手段を用いることができ、そのような手段としては、細胞数の直接的計数、ならびに本明細書に記載のアッセイ方法などの間接的手段が含まれる。その他の方法としては、MTS、ニュートラルレッド、放射性チミジン取り込みアッセイ、ならびにその他の生細胞の量または数を測定することのできる方法が含まれる。
【００３５】
本発明の化合物または本発明で用いるための化合物には、それらの製薬上許容される塩が含まれるが、それらは上述の、または本明細書で例示している既知の方法に従って合成して得ることができる。本発明で用いることのできるいくつかの化合物は天然のソース、例えば従来技術および本明細書の実施例で開示されているものなどから得ることができる。そのような天然のモツポラミンを当業界では既知の方法論および本明細書で特に例示した方法論に従って改変することができる。本発明の、または本発明で用いるための化合物およびその製薬上許容される塩は実質的に精製された形態のものとなる。「実質的に精製された形態」とは、該化合物または塩(それが天然のものである場合)がソースとなった生物体または組織の細胞を実質的に含んでいないことを意味する。「実質的に細胞性夾雑物を含んでいない」という用語は、該化合物がex vivoで存在し、かつソースとなった生物体、組織、もしくはその他の天然ソース中での該化合物の濃度よりも高い濃度であることを意味する。
【００３６】
表１に示した合成スキームは、本発明に用いるためのモツポラミン化合物およびその類似体を調製するために用いることのできる反応を一般的に概説したものである。特定の化合物の調製のためのそのようなスキームの使用の例は下記の実施例中に記載している。
【表１】
【００３７】
本発明の化合物または本発明で用いるための化合物は通常は水溶性であり、塩の形態とすることができる。そのような場合には、本発明の医薬組成物はそのような化合物の塩、好ましくは塩酸塩などの生理学的に許容される塩を含んでなる。他の適切な塩については当業界では既知である。医薬組成物は、典型的には該組成物の投与方法、それが注射、吸入、局所投与、洗浄法、またはその他の選択された治療法に適した方法によるものであれば、その投与方法で許容される1種以上の担体を含んでなる。適切な担体とはそのような投与方法に用いるためのものとして当業界で既知のものである。
【００３８】
本発明の医薬組成物または本発明で用いるための医薬組成物は、標準的な方法によって患者に投与することができ、そのような方法としては、局所、経口、吸入、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与が含まれる。避妊に用いるには、その投与は子宮への直接的適用、例えば、子宮内洗浄、インプラント、または子宮内器具によって行うことができる。投与量と治療期間は、標準的なプロトコールおよび選択した化合物の活性と毒性に関する情報に従って実施者が定めることとなる。
【００３９】
本発明の化合物もしくは医薬組成物、または本発明で用いるための化合物もしくは医薬組成物は、医療器具または装置、例えばインプラント、移植片、補綴、ステントなどを用いて投与することができる。例えば、ステントは再狭窄または動脈硬化の阻止のためにそのような組成物で被覆することができる。また、インプラントはそのような化合物または組成物を含有し放出させるようにすることができる。
【実施例】
【００４０】
A. 細胞浸潤阻害剤のスクリーニング
Matrigel（商標）は、ラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンに富む、移植可能なEngelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫の抽出物である。4℃でMatrigelは液状であるが、37℃では陽イオン依存性に重合して半固体のゲルを形成する。これらの物理的性質は2種類の広く用いられている細胞浸潤法の開発に利用されてきた。「伸長(outgrowth)」法では、細胞を液状のMatrigel中に懸濁した後ゲル化させる。次いで、細胞がゲル内へと成長するので浸潤が形態学的にモニターされる(Bae, S. N.ら, (1993) Breast Cancer Res. Treat. 24:241-255)。「ボイデンチャンバー」法では、Matrigelは有孔フィルター支持体上にあらかじめゲル化させておく。次いで細胞をMatrigel上に置き、通常は走化性薬剤に応答して基底膜/フィルターバリアーの反対側へ横断した細胞数を測定することによって浸潤を定量する(Price, J. T.とThompson, E. W. (1999) Meth. Mol. Biol. 129:231-250)。「伸長」法の欠点は細胞の形態学的な変化を肉眼でモニターする必要があることである。「ボイデンチャンバー」法は定量的データが得られるが、「伸長」法と同様、この方法は細胞浸潤に影響を及ぼす薬剤と、細胞の生存または細胞接着に影響を及ぼす薬剤を区別することはできない。
【００４１】
本発明者らは各種の生物学的な粗抽出物のうちの非常に多数が、高い塩濃度およびその抽出物中に存在する他の毒性分子のために細胞死を起こすことを知っている。しかし、本発明のアッセイ法は定量的であり、細胞接着を妨げる薬剤、または細胞毒であるような薬剤は排除する。本発明のアッセイ法は、マトリックスに付着したままであって浸潤の低下を示し、この方法の最初から最後まで生存している細胞を「陽性」ヒットと数える。
【００４２】
MDA231ヒト乳癌細胞系は高度に浸潤性で転移性である。この細胞はMatrigelに15分以内に付着し、2〜4時間以内に、形態学的に評価しうるように再構成された基底膜マトリックス中に浸潤し移動し始める。これに対して、MDA453ヒト乳癌細胞は転移性がはるかに低く、Matrigelに急速に付着するが4時間以内にマトリックス中には浸潤しない。これらのような2種類の細胞系の間の浸潤性の相異は、本発明の方法での非浸潤性細胞の回収のための最適条件を開発するために用いることができる。本実施例では、より浸潤性の低いMDA453細胞系の回収はより浸潤性の高いMDA231細胞系の回収の5倍多かった。
【００４３】
本発明のアッセイ法の薬剤スクリーニングにおける適切性を海綿から得た粗抽出物の選択を用いて試験した。230種の抽出物を50〜100μg/mLで試験した。228種の抽出物が、ジメチルスルフォキシド(DMSO)(0.025)を含有しているそれらの陰性対照での示数に近似のまたはそれ未満の示数を示した。しかし、2種類の抽出物は強い活性を示し、それらはLY294002を用いた陽性対照よりも活性が高かった。活性化合物はその第1の抽出物から、下記のとおり分画をガイドするアッセイ法を用いて精製した。第2の活性抽出物は第1のものと形態学的に類似しており、その抽出物は同一の活性化合物を含有していることが判った。その活性化合物は、スペルミジン様副構造を有する大環状アルカロイドのファミリであるモツポラミンであると同定された。
【００４４】
細胞培養
American Type Culture Collection(Bethesda MD)から入手したヒト乳癌MDA231細胞およびMDA453細胞を、5%ウシ胎児血清(FBS)、インスリン(5μg/mL)、およびゲンタマイシン(50U/mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地およびF12培地の1:1(v:v)混合物（DMEM/F12）中で培養した。新鮮な臍帯静脈を50mLのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地で洗い、その後20mLのRPMI中にコラゲナーゼAを含む液(0.13mg/mL)で洗うことによってヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。次いでその臍帯をコラゲナーゼで満たし、室温で30分間インキュベートした。臍帯をこすって細胞を引き離し、その内容物を30mLのRPMIで洗い、回収して1200rpmで10分間遠心した。その細胞ペレットをRPMIで洗い、10%ウシ胎児血清、10%鉄添加ウシ胎児血清、16U/mLのヘパリン、20μg/mLの内皮細胞増殖用添加物(ECGS)、2mM グルタミン、および各100U/mLのペニシリンとストレプトマイシンを添加した、微量元素を完全に含む培地(MCDB)中に懸濁した。初回の継代では、細胞を0.2%のゼラチンをコートしたディッシュ上に蒔き、HUVECの付着を促進させた。その後の継代は標準的な組織培養用処理ディッシュを用いて行った。細胞は全て5% CO2中で37℃で保持した。
【００４５】
海洋生物体の採取と抽出物の調製
各々約250gの海綿をパプアニューギニアのMotuporeとMadangの海岸の水深約15mのところの熱帯の太平洋の岩礁から手で採取した。サンプルは採取場所で冷凍しドライアイスを入れて輸送した。分類学的な同定のための各採取物の証拠となるサンプルをカナダのUniversity of British Columbiaでメタノール中で−20℃で保管した。Xestospongia exiguaのサンプルはZoological Museum of Amsterdam(ZMA POR 11521)に寄託した。抽出物は海綿サンプル各200gをメタノール中でホモジナイズすることによって調製した。そのホモジネートをろ過し、真空下で濃縮してゴム状の残査を得た。約1mgを100μLのDMSO中に溶解し、浸潤阻害アッセイに用いた。
【００４６】
浸潤阻害剤のアッセイ
Matrigel(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)を氷冷DMEM/F12中に1:1で溶解し、その50μLをピペットで氷冷した96ウエルの細胞培養プレート(Falcon)のウエルに氷冷したピペットチップを用いて、各ウエルの側面を避けつつ入れた。次いで、そのマトリックスをゲル化させた後、乾燥させた37℃のインキュベーター中で一晩乾燥し、その後細胞をプレーティングする1時間前に100μLの増殖培地で再水和させた。この処理によって破れにくいマトリックスが作成される。Matrigelの上に37℃に加温した100μLの培地にDMSO中に溶解した海綿抽出物の1μLを加えたものまたは加えていないものを添加し、その後60,000個のMDA231細胞を含有する培地100μLを添加した。1μLのDMSOを陰性対照として用いた。浸潤を阻害するものとして既知のホスファチジルイノシトール3-キナーゼインヒビターLY294002(50μM)を陽性対照として用いた。次いでそれらの細胞を2.5時間インキュベートして浸潤が起こるようにした。
【００４７】
インキュベーション後、細胞はMatrigel中に浸潤したか、または浸潤できずにMatrigelの表面上に定着した。細胞培養用培地の大部分は細胞を乱すことなく除去された。この除去はハンドヘルドのピペッターで行うことができるが、より一定した結果はBio-Tek Elx405 96ウエルプレート洗浄機に吸引針を用いMatrigelの表面上約2mmに位置させてその吸引機能を用いて得られる。浸潤しなかった細胞は、MatrigelをHank's Balanced Salt Solution中に0.125% トリプシンを入れた液200μLと37℃で30分間インキュベートすることによって表面から引き離して回収した。この酵素処理はMatrigelの表層に付着した細胞を引き離すがマトリックスを分解せず、ゲルに浸潤した細胞を放出しない。次いで、その細胞を100μLのセッティングをしたハンドヘルドピペッターを用いて上下にピペッティングを3回行って懸濁させ、その100μLを取って、トリプシンを不活化するために30%ウシ胎児血清を添加した培地100μLを含有する、Matrigelを含まない新鮮なプレートに移した。次いでそれらの細胞をプラスチックの表面に付着させるために一晩インキュベートした。MTTアッセイを用いて生細胞を測定した：細胞培養用培地を、新鮮な培地100μLと、リン酸緩衝食塩液中に3(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドを5mg/mLとした溶液25μLに置換した。37℃で2時間置いた後、その溶液を除去し、ジメチルホルムアミド中に溶解した20%ドデシル硫酸ナトリウム:水(1:1)を100μL添加して細胞を溶解させた。37℃で一晩インキュベートした後、570nmで吸光度を測定した。
【００４８】
B. モツポラミンの単離と合成
全般的な化学的方法
衝突ガスとしてキセノンを用い、チオグリセロールサンプルマトリックスを用いて、低分解能および高分解能FABMSをKratos Concept II HQ マススペクトロメーターで記録した。
【００４９】
分析用薄層クロマトグラフィーにはMerck Type 5554シリカゲルプレート、およびWhatman MKC18F プレートを用いた。逆相HPLCでの精製はWaters 410 Differential RefractometerにWaters 600E System Controllerを付属させて行った。HPLCに用いた溶媒のグレードは全てFisher HPLCグレードのものとした。
【００５０】
モツポラミンの単離
Xestospongia exiguaの凍結サンプルの一部分(86g)を小片に切り、メタノール中に浸漬しさらにメタノールで繰り返し抽出した(3 x 150mL)。そのメタノール抽出液を併せ、真空下で濃縮し、酢酸エチル(3 x 70mL)と水(200mL)に分配させた。水層は浸潤アッセイで活性を示し、その水層をn-ブタノールで抽出した(3 x 70mL)。ブタノール抽出液を併せ、真空下で濃縮して1.16gの茶色の油を得た。活性のあるn-ブタノール可溶性物質をSephadex LH-20でのクロマトグラフィーを繰り返して行うことによって分離したが、その際の溶出は最初にメタノールを溶出液として用い(118.4mgの活性物質を得た)、次いで酢酸エチル/メタノール/H2Oが20:5:2の液で溶出して55.6mgの、ニンヒドリンで染まり浸潤アッセイで活性の認められる、青白い非晶質の固体が得られた。この非晶質固体は単一クラスの化合物でスペルミジン様構造を有しており、既知のモツポラミンA-Cおよびいくつかの新規のモツポラミンを含んだものであった。モツポラミンCはサンプル中の主要な成分であった(＞90%)。
【００５１】
それらの化合物をWhatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてメタノール/H2Oの11:9の液中に2%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む液を用いて、逆相HPLCで、高希釈度で(1回のインジェクションあたり＜0.1mg)分離した。このHPLCでの分画によって、モツポラミンAの純粋なサンプル、BおよびD(少なくとも4個のメチルが分枝状の類似体からなる)の混合物を含有する画分、モツポラミンCの純粋なサンプル、＞90%のモツポラミンEプラス他の2つのEのオレフィン異性体を含有する画分、およびアセチルモツポラミンCとトリフルオロアセチルモツポラミンC、これらはおそらく単離の際の人工産物であろうが、それらの純粋なサンプルが得られた。モツポラミンCを除いては、その他の全ての化合物の単離された量はmg以下の量であった。単離されたモツポラミンは全てアンモニウムTFA/水の塩であった。
【００５２】
その後に行った大規模の単離では、活性のあるn-ブタノール抽出物を５N NaOHを添加してpH＞12とした水中に再溶解した後にCH2Cl2で抽出することによって上記の方法を改良した。その後、活性のあるCH2Cl2抽出物を上述のとおりクロマトグラフィーにかけた。625gの冷凍海綿から総計379.7mgのモツポラミンが単離された。
【００５３】
モツポラミンAは青白色の油として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z298.3229(C18H40N3, 計算値298.3222)。モツポラミンB、モツポラミンD、およびモツポラミンDのメチルの位置の異性体は白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z312.3387(C19H42N3, 計算値312.3379)。モツポラミンCは青白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z324.3380(C20H42N3, 計算値324.3379)。モツポラミンE、および他の2つのEのオレフィン異性体は青白色の油として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z310.3212(C19H40N3, 計算値310.3222)。アセチルモツポラミンCは白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z366.3484(C22H44N3, 計算値366.3484)。トリフルオロアセチルモツポラミンCは白色の非晶質固体として単離された；[M＋H]＋m/z420.3191(C22H41N3OF3, 計算値420.3202)。
【００５４】
モツポラミンG、H、およびIは全てごく少量得られた。その各々はHRFABMSでC19H41N3の分子式に対応する[M＋H]＋イオンが得られた。各化合物について得られたNMRデータの分析ではこれらが全て、天然の他の類似体に見出されるものと同じジアミン側鎖を有し、また、飽和大環状アミン断片をも有するモツポラミンファミリーのメンバーであることが示された。モツポラミンG、H、およびIを他のものから分けた特徴は各々の1H NMRスペクトルでのδ〜0.98での二重線メチル共鳴の存在であり、それは各化合物の大環状アミン中のメチル分枝によるものとされ、それらの化合物をモツポラミンAのメチル化類似体としているものである。C-10およびC-11の位置のメチル分枝を除外することが可能である。3種類の別個の異性体があるので、その各々は図１４に示すような一般構造を有しているはずであり、分枝はC-12からC-15の間に個々に位置している。
【００５５】
モツポラミンの化学修飾
アセチル化：モツポラミンの混合物のサンプル(89.2mg)を2mLの3:1ピリジン/無水酢酸の2mL中に溶解し、室温で16時間撹拌した。真空下で溶媒を除去してジアセチル化産物の混合物を得て、それをWhatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてMeCN/0.6% TFA/H2Oの2:3の液を用いて、半調製的逆相HPLCで部分的に分離した。ジアセチル化されたモツポラミンA(最初に溶出してくるもの)およびC(それぞれ1.5mgと95.8mg)は青白色の澄明な油として得られた。さらに3つの画分を得られた。それらの第1のものは、ジアセチルモツポラミンEを含んでいた。この画分はさらに、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液として35:65 MeCN/H2O中に0.39% TFAを含む液を用い、逆相HPLCで精製し、1.2mgの純粋な化合物を青白色の油として得た。次の溶出画分はジアセチルモツポラミンBとモツポラミンAのジアセルメチル分枝類似体を含んでおり、上述のジエチルモツポラミンEの場合と同様の条件を用いてHPLCでさらに分画した。純粋なジアセチルモツポラミンB(0.4mg)とモツポラミンAの2種類のメチル分枝付加化合物を各々含んでいる2種類の画分(0.8mgおよび0.6mg)が得られた。最も遅く溶出された画分はジアセチルモツポラミンCの後に溶出され、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液として33:67 MeCN/H2O中に0.39% TFAを含む液を用いて精製し、0.5mgのジアセチルモツポラミンCのホルムアミドを青白色の油として得た。上述のHPLCの各画分中に含まれる他のジアセチルモツポラミンを採取した。ジアセチルモツポラミンは全てアンモニウムTFA/水の塩として単離した。
【００５６】
ジアセチルモツポラミンAおよびCは以前から知られている。しかし、ジアセチルモツポラミンについての以前の報告は正しくない(Williams, D. E.ら, [上述の文献])。ジアセチルモツポラミンBは青白色の澄明な油として単離され；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z396.3580(C23H46N3O2, 計算値396.3590)であることが現在では示されている。メチル分枝型は2種類の青白色の油として単離され、その各々はモツポラミンDおよびジアセチルモツポラミンAのメチル分枝型異性体を含んでおり；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z396.3599(C23H46N3O2, 計算値396.3590)であった。ジアセチルモツポラミンCホルムアミドは青白色の澄明な油として単離され；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z436.3538(C25H46N3O3, 計算値436.3539)であった。ジアセチルモツポラミンEは青白色の澄明な油として単離され；[M＋H]＋m/z394.3427(C23H44N3O2, 計算値394.3434)であった。
【００５７】
水素化：モツポラミン混合物のH2/Pd/Cを用いた水素化によって完全に還元された混合物が得られ、その混合物は浸潤アッセイで強い活性を示した。1例はジヒドロモツポラミンCで、図１５に示しているとおりである。ジヒドロモツポラミンCは非晶質固体として単離され；1H NMR(400MHz, MeOH-d4)δ3.24(m, 2H)、3.10-3.21(m, 8H)、3.05(m, 2H)、2.17(m, 2H)、2.08(m, 2H)、1.72(m, 4H)、1.46(m, 8H)、1.36-1.42(m, 12H)ppm；13C NMR(100MHz, MeOH-d4)δ53.3, 52.9, 46.0, 37.8, 27.7, 27.4, 27.4, 27.3, 25.5, 25.4, 22.9, 22.6ppm；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z326.3532(C20H44N3, 計算値326.3535)であった。
【００５８】
塩酸加水分解：ジアセチルモツポラミンC(これは浸潤アッセイでは不活性である)の塩酸加水分解によって浸潤アッセイで強い活性を示すモツポラミンCとなる(図６)。
【００５９】
ジアルキル、環状、および大環状アミンからのモツポラミン、側鎖に修飾のあるモツポラミン類似体、およびその他のモツポラミン類似体の調製
第2アミン(例えば、約1.5ミリモル)(例えば、図７に示す大環状アミン)をMeOH中のメチルアクリレート(例えば、約1.6ミリモル)と反応させることができる(例えば、10mLを室温で16時間)。溶媒と過剰の試薬を真空下で除去した後、その結果得られたβ-アミノエステルを、MeOH中の(例えば、10倍過剰量の)ジアミノアルカン(例えば、エチレンジアミン、1,3-ジアミノプロパン、1,4-ジアミノブタン、スペルミジン)と反応させることができる(例えば、10mLを室温で4-5日間)。溶媒と過剰の試薬を真空下で蒸発させるとアミドが得られる。このアミドを水素化アルミニウムリチウム(LAH)(例えば、THF(7mL)中に1.3ミリモル、70℃で16時間)で還元することができる。過剰のLAHはH2Oの滴下によって反応を止め、反応混液を、pHを＞12に保持して(例えば、必要に応じて1N NaOHを添加することによって)H2O(例えば、10mL)とEt2O(例えば、3 x 4mL)に分配することができる。HPLCをさらに精製するために用いることができる。例えば、ある類似体の非晶質のTFA/H2O塩を、Goldring, W. P. D.とWeiler, L.[上述の文献]の方法を改変した方法で、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてMeOH/H2Oの11:9の液中に2%TFAを含む液を用いて、半調製用逆相HPLCで調製することができる。
【００６０】
2- アザシクロアルキル - オンからのモツポラミンおよびモツポラミン類似体の調製
2-アザシクロアルキル-オン(1.52ミリモル)(2-アザシクロアルキル-オンまたは4-アザトリシクロ[4.3.1.13,8]ウンデカノ-5-オン)を、上述のアミドの還元について概説した方法に従ってLAH(1.3ミリモル)で還元した。その結果得られた大環状アミン(収率は通常98%)をメチルアクリレートと反応させ、モツポラミンAを得るための方法として上述のしたとおりの残りの方法にかけた。
【００６１】
側鎖に修飾のあるモツポラミン類似体の調製
第2アミン(例えば、図７の大環状アミン；1.52ナノモル)をTHF(12mL)中のメチルハロアルキルエステル(1.57ミリモル)(メチルクロロ酢酸またはメチル-4-ヨード酪酸)と還流しつつEt3N(4.56ミリモル)の存在下で3時間、Sbiozakiら(1984)Tetrahedron 40:1795-1802に記載の方法に従って結合させた。H2O(30mL)とEt2O(3 x 8mL)間のでEt2Oでの抽出後、その結果得られたエーテルに可溶のαまたはγ-アミノエステルを、上述のモツポラミンA類似体を得るために用いる方法として上記に記載のとおり、10倍過剰のジアミノアルカンと反応させてモツポラミンA類似体を得る。
【００６２】
カルバゾール類似体の調製
カルバゾール(1.52ミリモル)をTHF(10mL)中に溶解し、NaH(1.56ミリモル)を添加した。その混合物を撹拌しつつ2時間室温で置き、メチルアクリレートを添加した後その反応混液を室温でさらに16時間撹拌しつつ置いた。過剰のNaHをH2Oを滴下することによって反応を止め、その反応混液をH2O(22mL)とEt2O(3 x 7mL)間で抽出した。この結果得られたβ-アミノエステルを10倍過剰の1,3-ジアミノプロパンと反応させ、その結果得られたアミドを上述のとおりLAHで還元して図１２に示す化合物を得た。
【００６３】
図１２に示した化合物は黄色の非晶質固体として単離された；1H NMR(400MHz, MeOH-d4)δ8.07(d, J＝7.5Hz, 2H), 7.52(d, J＝7.9Hz, 2H), 7.44(t, J＝7.9Hz, 2H), 7.20(t, J＝7.5Hz, 2H), 4.50(t, J＝6.7Hz, 2H), 2.94-3.04(m, 6H), 2.27(m, 2H), 1.97(m, 2H)ppm; 13C NMR(100MHz, MeOH-d4)δ141.5, 127.0, 124.3, 121.3, 120.3, 109.7, 46.9, 45.8, 40.6, 37.7, 26.9, 25.3ppm; 陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z282.1972(C18H24N3, 計算値282.1970)。
【００６４】
C. モツポラミンの活性
細胞浸潤の阻害
種々の濃度のモツポラミンA、モツポラミンB、モツポラミンC、BとC型の混合物、ならびにモツポラミンG、H、およびIの混合物を浸潤阻害アッセイで試験した。全てのものが浸潤を阻害した。モツポラミンC(IC50＝1μM；図３)、モツポラミンA(IC50＝3μM；図１)、BとDの混合物(IC50＝3μM；図２)、モツポラミンBおよびG,H,I混合物は類似の活性を示した。図４、５、６、および８〜１２も、本発明の種々の化合物による阻害を示している。図１３に示している各化合物のIC50値は約1〜10μMであった。
【００６５】
低細胞毒性
モツポラミンCの細胞毒性を、種々の濃度のモツポラミンCの存在下で24時間細胞をインキュベートすることによって調べた。モツポラミンCを洗い流し、さらにその後5日間まで細胞増殖を測定した。モツポラミンCは浸潤の阻害のIC50(1.6μM)に近い濃度で細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。4μMおよび8μMというより高い濃度とすると細胞増殖の軽度な阻害が認められた。従って、モツポラミンCは低いμMの濃度、それは浸潤の阻害は示す濃度であるが、その濃度ではMDA231細胞の増殖への毒性はほとんどまたは全く示さない。同様に、図１、２、４、５、６、および８〜１３に示す化合物も細胞毒性は低い。
【００６６】
モツポラミン類似体の活性
モツポラミンの目立った特徴はそのスペルミジン様テイルであり、それは生理学的pHでは正に荷電されている。合成および半合成モツポラミン類似体を調製し、種々の濃度で浸潤阻害アッセイを行った。スペルミジン様テイルを欠いているモツポラミンA類似体は完全に不活性であった(図７)。モツポラミンCの末端アミノ基をアセチル化(モノアセチルモツポラミンC；図５)、またはトリフルオロ酢酸で置換した(CF3Ac モツポラミンC；図８)。これらの2つの化合物はどちらも非常に活性が高く、荷電したアミノ基はこの位置には必要でないことを示している。
【００６７】
窒素原子とテイルとの間の炭素数は様々であった。末端アミノ基の近傍に2個の炭素原子しか有していない化合物は強い活性を示し(図９)、3個の替わりに4個の炭素原子を有する化合物も強い活性を示した(図１０)。環の近傍に3個の替わりに2個の炭素原子しか持たない化合物(図１１)は活性を示した。
【００６８】
天然のモツポラミンの第2の特徴は、単純な13〜15員環であることである。分析結果から、15員環を有するモツポラミンCは14員環のモツポラミンEおよび13員環のモツポラミンAよりわずかに活性が強いことが判った。種々の環のサイズを有する一連の合成類似体を調製し、浸潤阻害を調べた。5員環を有する化合物と6員環を有する化合物をスペルミジン様テイルと結合させたが活性は示さなかった。完全に不飽和で複数の環状構造を有する化合物は強力な活性を示した(カルバゾール類似体；IC50＝3μM；図１２)。
【００６９】
モツポラミンは癌細胞の拡散を阻害する
MDA231細胞は高度に浸潤性である。MDA231はMatrigelに急速に付着し、4時間以内に紡錘形の形態となりゲル中へと移動する。細胞をモツポラミンCとインキュベートするとMatrigel上の浸潤性で紡錘形の細胞の形成を防止する。浸潤を完全に阻害するモツポラミンの濃度(5μM)ではマトリックスからの細胞の脱離は起きなかった。むしろ、細胞は付着したままであったが丸みを帯び、マトリックスの上にあった。
【００７０】
モツポラミンCがMDA231細胞をMatrigel上で丸みを帯びたままの状態とするとの観察結果は、細胞の拡散の阻害を示唆していた。MDA231細胞を、拡散因子(Ham)を含んでいる血清の存在下で堅い組織培養用プラスチック上に蒔いた。これらの条件下で大多数のMDA231細胞はモツポラミンCがなければ4時間以内にプラスチック上に拡散する。拡散している細胞は大きく平らな層状で、連続的な突起のあるエッジを示した。これらの突起は位相差顕微鏡では黒く現れるが、これは拡散及び移動している細胞の双方で、アクチンがメディエートする膜のダイナミックな動きのある部位を示している。モツポラミンCの適用量を増加させると細胞の拡散が減少し、大多数の細胞では5μMで球状を示す。これらの球状の細胞は、小さく不連続な突起を有する小規模な層状となって組織培養用プラスチックに付着したままとなっていた。
【００７１】
また、MDA231細胞をあらかじめ20時間、組織培養用プラスチック上に拡散させ、次いでモツポラミンC(5μM)で4時間処理した。位相差顕微鏡での観察では、細胞はわずかに屈折性となり、これはわずかに収縮したことを示すが、丸くはならなかった。ローダミン-ファロイジンで染色して調べると、モツポラミンCでの処理はアクチン細胞骨格に微妙な変化を生じさせている：アクチンストレス線維は依然として見えるが、連続的な突起の替わりに細胞のエッジでのアクチンの局在化による、小さな不連続の「ボタン」となっていることがよく見られる。これに対してf-アクチン破壊剤であるサイトカラシンD(CD；1μg/mL)で処理すると細胞が完全に丸くなり、アクチンフィラメントとの完全な解離が起こる。細胞をモツポラミンCで48時間まで処理しても、表面上に既に付着し拡散した細胞の著しい球状化は起こらなかった。
【００７２】
モツポラミンは癌細胞の移動を阻害する
モツポラミンCが細胞拡散及びアクチン層状突起化に影響を及ぼすことは、細胞の移動の減少によって浸潤の阻害がなされたことを示している。滅菌済のようじでMDA231細胞のコンフルエントな単層を掻き取り、約100μmの細胞のない隙間を作った。その隙間が細胞の移動によって塞がれることを顕微鏡でモニターした。モツポラミンCがない場合には、細胞はその隙間に移動して24時間以内にその隙間を実質的に塞いだ。これらの細胞は幅広い層状の突起をそのリーディングエッジに沿って有しており、その全体にアクチンが濃縮されていた。これに対して、モツポラミンC(5μm)に暴露させた細胞では24時間目にもかなりの隙間が依然としてあり、このことはモツポラミンCが細胞の移動を遅延させることを示している。これらの細胞は小さく不連続な突起がそのリーディングエッジに沿ってあるにすぎず、アクチンは小さな不連続なパッチ上に含まれているのみで、これはあらかじめ拡散させた細胞中で観察された「ボタン様」濃縮と類似したもののように見えた。
【００７３】
内皮出芽アッセイ
内皮の出芽はNehls, V.とDrenckham, D.の方法((1995) Microvasc. Res. 50:311-322)を改変した方法によって評価した。変性コラーゲン(Cytodex 3, Sigma)をコートしたマイクロキャリアービーズをHUVECと共に蒔いた。その細胞がビーズ上でコンフルエンスに達したときに、同数のHUVECをコートしたビーズを96ウエルのプレート中のフィブリンゲル中に埋めた。フィブリンゲルの調製には、ウシフィブリノゲンをMCDB培地中に2.5mg/mLの濃度で溶解した。アプロチニンを0.05mg/mLの濃度で添加し、その溶液を0.22μmのフィルターでろ過した。そのフィブリノゲン溶液に15ng/mLの血管内皮細胞増殖因子(VEGF)をモツポラミンCとともにまたはモツポラミンCは用いずに添加した。対照としてVEGFまたはモツポラミンCを含まないフィブリノゲン溶液を用いた。そのフィブリノゲン溶液を96ウエルのプレートに移した後、HUVECをコートしたビーズを1ウエルあたり50個のビーズの密度で添加し、凝固はトロンビン(1.2U/mL)の添加により誘発させた。凝固が完了した後、ゲルを5%ウシ胎児血清を含有するMCDB培地で37℃で平衡化させた。60分間インキュベートした後、その培地をモツポラミンCを含んだ、または含まない同じ培地と交換した。培地を毎日交換しつつ3日間インキュベートした後、マイクロキャリアービーズ上に形成された毛細管様のチューブを顕微鏡で数えた(出芽数/ビーズ)。長さが150μmより長く、少なくとも3個の内皮細胞からなる出芽のみを数えた。
【００７４】
血管形成のニワトリ絨毛尿膜アッセイ (CAM)
白色レグホン種のニワトリの受精卵を一定の湿度の条件下で37℃でインキュベートした。6日目の胚で、発達しつつある絨毛尿膜(CAM)を卵の平たい方の端の気嚢の上に小さな丸い穴を開けることによって殻から取り出した。内膜を除去した後、開口部をパラフィルムで封じ、その卵をさらに2日間インキュベートした。モツポラミンCは30ng/mLのVEGFを添加したPBS中に調製した。8日目に発達中のCAMの表面上に置いた2mm3のゼラチンスポンジ(Gelfoam, Pharmacia Upjohn)上に20μLをロードした。ヴィークルのみ(20μL PBS)を含んでいるスポンジを陰性対照として用い、陽性対照としては、PBS中の30ng/mLのVEGFの20μLを含んでいるスポンジを用いた。卵を再度封じ、インキュベーター内へ戻した。10日目にCAMの像を、Sport RT デジタルイメージングシステム(Diagnostics Instruments)を備えたOlympus SZX9立体顕微鏡を用いてデジタル的に捕捉した。
【００７５】
モツポラミンは血管形成を in vitro および in vivo で阻害する
モツポラミンCはin vitroの内皮出芽アッセイおよびin vivoのニワトリ絨毛尿膜(CAM)アッセイで示されるように血管形成を阻害する。内皮出芽アッセイでは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をコラーゲンをコートしたビーズ上に蒔いた。血管内皮増殖因子に暴露させると出芽と呼ばれる毛細管様チューブの形成が刺激され、その数と長さは顕微鏡によってある時間ずっと測定することができる。このアッセイで、2.5μMのモツポラミンCは血管内皮増殖因子(VEGF, 15ng/mL)に応答して出芽形成を明らかに阻害することが示された。5μMでモツポラミンCは出芽を完全に阻害した。
【００７６】
モツポラミンCはコンフルエントなHUVECの生存に10μMまでの濃度で72時間までは影響を及ぼさなかった。また、モツポラミンCはHUVECの増殖速度を低下させず、HUVECの増殖をわずかに増強させる可能性がある。従って、モツポラミンCは、毒性作用または抗増殖作用によっては血管形成を阻害しない。むしろ、モツポラミンCは、ボイデンチャンバーアッセイの改変したものを用いて評価したとき、HUVECの移動を阻害した。モツポラミンCはHUVECのVEGF(15ng/mL)に向かう移動を2.5μMおよび5μMの双方の濃度で阻害した。
【００７７】
モツポラミンは in vivo で腫瘍増殖を阻害する
ルイス肺癌およびSCCVII腫瘍を有するマウスに10〜15mg/kg/dayの投与量でモツポラミンCを毎日投与(i.p.)したところ、ヴィークルを投与した対照のマウスと比較して腫瘍増殖の顕著な減少が生じた。薬剤投与は腫瘍の容積が50〜200mm3の時に開始し、結果として対照と比較して腫瘍増殖速度の25〜50%の減少が起こった。
【００７８】
モツポラミンは in vivo で腫瘍転移の進行を阻害する
原発性ルイス肺癌を移植したC57マウスにモツポラミンCを15mg/kg/day投与(i.p.)したところ、ヴィークルで治療した対照の動物に比較して肺転移の発生の低下が見られた。原発腫瘍は特定のサイズまで増殖させ、次いで供試動物が肺転移の定量に十分なだけ長く生存しうるように考慮して放射線照射した。
【００７９】
モツポラミンは神経細胞の移動を阻害する
特徴の十分調べられている昆虫胚モデルで合成ジヒドロモツポラミン(DiH-MPC, 5μM)は神経細胞の移動に影響を及ぼした。DiH-MPCは究極的なシナプス標的が中枢神経系(CNS)中にある軸索成長円錐の型にはまった様式の移動を遅延させた。重要なことは、移動方向を進むこと、または移動方向を見つけ出すことがうまくいかなかったのではなく、軸索の発達の終わりの時点での神経成長円錐の移動の速度のみが阻害されたことである。従って、モツポラミンは、CNSの損傷後に軸索の出芽の減少が有益であるような状況での適用がある。このことは、損傷によって誘発される軸索の出芽および移動(すなわち、可塑性)がCNSの臨床的に効果的な再生に大きな障害となる神経経路の不適切な混合をもたらすような脊髄の病変において特に興味深い。
【００８０】
上述の本発明は理解を明確にするための図と実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、業者であれば本発明の説明していることを考慮すれば添付の特許請求の範囲の精神と範囲を逸脱することなく本発明に変更および改変を行いうることは容易に判るであろう。本明細書中で参照した特許、特許出願、および公表文献は参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンAでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンAの構造も示している。
【図２】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンBおよびDの混合物での浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンBおよびDの構造も示している。
【図３】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンCの構造も示している。
【図４】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンEでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンEの構造も示している。
【図５】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモノアセチルモツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モノアセチルモツポラミンCの構造も示している。
【図６】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のジアセチルモツポラミンCの酸加水分解後のものでの浸潤阻害率を比較した図を示す。ジアセチルモツポラミンCの酸加水分解後のものの構造も示している。
【図７】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミン環構造を有するがスペルミジン様テイル部を欠く化合物の種々の量での浸潤阻害率を比較した図を示す。該化合物の構造も示している。
【図８】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のCF3Ac-モツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。CF3Ac-モツポラミンCの構造も示している。
【図９】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１０】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１１】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１２】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミンカルバゾール類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１３】細胞浸潤の阻害剤である本発明のその他のモツポラミン類似体の構造を示した図を示す。
【図１４】モツポラミンAのメチル化された形態の一般構造を示し(図１４A)、それにはモツポラミンG、H、およびIが含まれ、その各々はモツポラミンAのC-12からC-15のうちの１つの位置で置換されたメチルを有している(図１４B)。
【図１５】ジヒドロモツポラミンCの構造を示す。
【０００１】
本発明は細胞浸潤に影響を及ぼす薬剤のアッセイ、および細胞浸潤または血管形成を阻害する作用剤の疾患の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の自発運動性と浸潤は、胚形成、血管形成、創傷治癒、排卵、胚の着床および妊娠、免疫監視および炎症を含む組織の発達とホメオスタシスに不可欠の生理学的プロセスである。細胞の自発運動性と浸潤はまた、炎症、動脈硬化、再狭窄、神経膠腫、網膜症、心筋虚血、関節リウマチ、乾癬、および腫瘍の進行と転移などの多数の病理学的プロセスの重要な要素でもある。例えば、腫瘍の転移のプロセスは原発腫瘍からの細胞の播種で始まり、その後、原発腫瘍のある臓器の基質コンパートメントを通じての細胞の移動、血管系/リンパ系の支持組織から腫瘍細胞が血管内異物侵入し転移する先の離れた二次臓器内へ、移動し、ならびに腫瘍細胞の二次臓器の組織中への移動が起こる。
【０００３】
細胞の自発的移動と浸潤を阻害することは、癌、および上述したものを含むその他の細胞の自発的移動および浸潤が関与する疾患、ならびに避妊に有用なものとなろう。例えば、細胞と細胞外マトリックス(ECM)との間の相互作用の変化によって駆動される癌細胞の浸潤がその1例である。上皮由来の癌の場合、原発腫瘍は特別なECMである基底膜によって取り囲まれている。再構成基底膜マトリックスを用いる組織培養方法が、マトリックスの変化、沈着、マトリックスの分解、細胞のマトリックスへの付着、およびマトリックスを介する移動が癌細胞の浸潤に役割を果たしていることを示すために用いられてきた(Wyke, J. A.(2000), Eur. J. Cancer, 36:1589-1594)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ある薬剤が細胞浸潤に対して影響を及ぼすか否かを測定するためのこれまでの方法は生物学的なマトリックスの使用に依存しており、そのマトリックスを通過する細胞の浸透または移動の変化を検出することを含んだものである。とりわけ、そのような方法には、ある薬剤を適用した際のマトリックスを通過する細胞の浸透または移動する細胞数の減少の測定が含まれる。そのような方法は、該薬剤の細胞毒性または細胞の生物学的マトリックスへの付着に影響を及ぼす能力に関する情報が既知であるような状況での使用に適しているが、通常はスクリーニング法での使用に適したものではない。
【０００５】
血管のない腫瘍は増殖することができず、転移能もほとんどないので、血管形成の阻害は癌治療の方策の1つである。固形腫瘍の治療用としてこれまでに評価された抗血管形成性化合物としては、メタロプロテイナーゼ、イオンチャンネル、プロテインキナーゼ、または細胞増殖を阻害する小分子；増殖因子を不活化またはアンタゴナイズする薬剤；ならびに作用機作が依然として未知の薬剤が含まれる。新規の抗血管形成性薬剤の発見が、癌およびその他の疾患の治療法の発展のために望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は式IもしくはIIの化合物またはその化合物の製薬上許容される塩の、細胞浸潤の阻害剤として、もしくは抗血管形成性薬剤としての使用を提供する。ここで、式Iは：
【化１２】
［式中、
Xは、1個以上のエポキシド、ケトン(＝O)、チオカルボニル(＝S)、オキシム(＝N−OH)、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖で；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、O、S、NH、またはNRで置換することができ；このアルキル鎖中で1個以上のCおよびCH基は、NHまたはNRで置換することができ；
R1およびR2は独立して：水素；メチル；1個以上の−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；またはベンジルのフェニル環を1個以上のR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SO2Rで置換することのできるベンジルであるが；R1およびR2のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yは1個以上のエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、OまたはSで置換することができ；
Rは次のように定義される：1個以上のエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、−SO2R'で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基；このアルキル基でR'は−NH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
であり、式IIは：
【化１３】
［式中：
Xは、1個以上のエポキシド、ケトン(＝O)、チオカルボニル(＝S)、オキシム(＝N−OH)、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖で；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、O、S、NH、またはNRで置換することができ；このアルキル鎖中で1個以上のCおよびCH基は、NHまたはNRで置換することができ；
R1、R2、およびR3は独立して：メチル；1個以上の−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；またはベンジルのフェニル環を1個以上のR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SOR、−SO2Rで置換することのできるベンジルであるが；R1、R2、およびR3のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yは1個以上のエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、−SO2Rで置換することのできる1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中で1個以上のCH2基は、OまたはSで置換することができ；ならびに、
Rは次のように定義される：1個以上のエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、−SO2R'で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基；このアルキル基でR'は−NH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
である。
【０００９】
好ましくは、式IまたはIIの化合物は下記の特徴の1つ以上を有する化合物である：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5であり、場合によって上述のとおり置換されたものである。
【００１０】
(b) Xは11〜16個の炭素原子の飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１１】
(c) Xは11〜16個の炭素原子の不飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１２】
(d) Xは11〜16個の炭素原子の不飽和で部分的に環状化したアルキル鎖で、場合によってRで置換されたものである。
【００１３】
(e) 式Iで、R1およびR2の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１４】
(f) 式Iで、R1およびR2の1つは水素；メチル；または、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１５】
(g) 式Iで、R1およびR2の1つは直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１６】
(h) 式Iで、R1およびR2の1つは水素；メチル；または、直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１７】
(i) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００１８】
(j) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つはメチル；または、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００１９】
(k) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つは直鎖状または分枝状のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものである。
【００２０】
(l) 式IIで、R1、R2、およびR3の1つはメチル；または、直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってOH、−OR、もしくは＝Oで置換されたものである。
【００２１】
式Iの化合物は次のようなものとすることができる：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5、より好ましくはnは1、2、または3であり；
(b) Xは二者択一的に：11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで置換することができ、そのRは好ましくはC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基であるか；または、Xは11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和化され部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1およびR2のうちの一方が、水素、メチルまたは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) もう一方のR1およびR2は直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものであり、そのRはC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である。
【００２２】
式IIの化合物は次のようなものとすることができる：
(a) Yは(CH2)nで、この式中でnは1〜5、より好ましくはnは1、2、または3であり；
(b) Xは二者択一的に：11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで置換することができ、そのRは好ましくはC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基であるか；または、Xは11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和化され部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1、R2、およびR3のうちの1個または2個、より好ましくは2個がメチルまたは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) R1、R2、およびR3の1つは直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、または−NHCORで置換されたものであり、そのRはC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である。
【００２３】
本明細書で用いている「不飽和」および、より特定して「完全に不飽和」という用語には、芳香族の構造を含む。
【００２４】
本明細書で用いている「部分的に環状化した」という用語は「X」のアルキル鎖に関して用いる場合には、1つ以上の環状構造を含んでいる鎖を意味する。従って、式IおよびIIのいずれかで「X」および「N2」によって形成される構造は単一の環となることができ、または「X」が部分的に環状化したものである場合には、その構造は複数の環を含んでなる。
【００２５】
本発明は治療または避妊のための、式Iまたは式IIの化合物、ならびに許容される担体および1種以上の式Iまたは式IIの化合物を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾病状態の治療のための、細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害のための、または避妊のための医薬品を調製する目的でのそのような化合物もしくは塩の使用をも提供する。本発明はまた、疾病状態の治療のための、細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害のための、ならびに避妊のための、そのような化合物、塩、医薬組成物、および医薬品の使用をも提供する。代表的な疾病状態としては、癌、炎症、動脈硬化、再狭窄、関節炎、乾癬、神経膠腫、網膜症、および心筋虚血が含まれる。細胞浸潤または自発運動性の阻害のための治療を本発明に従って行うことのできるその他の状態または状況としては、神経細胞の回復の際の軸索の可塑性が低下することが挙げられる(例えば、神経性または脊髄の病変など神経細胞にダメージを受けた後の治療の際に)。本発明はまた、そのような状態の治療のための方法、細胞浸潤または自発運動性の阻害のための方法、避妊のための方法であって、ある化合物、ある化合物の製薬上用いうる塩、またはそのような化合物もしくはその塩の1種以上を含んでなる医薬組成物を、そのような治療を必要としている、もしくは所望している被験者に投与することを含んでなる方法をも提供し、その方法において該化合物は細胞浸潤、自発運動性、もしくは血管形成の阻害剤であり、式IもしくはIIの化合物である。
【００２６】
本発明はまた、式IまたはIIの新規化合物；式IまたはIIの化合物の新規の塩；ならびに、許容される担体、および式IもしくはIIまたはそれらの塩を含んでなる医薬組成物をも提供する。新規化合物ではない式IもしくはIIの化合物はモツポラミン(Motuporamine)A、B、およびCで、Williams, D. E.ら, (1998) J. Org. Chem. 63:4838-4841に報告されている。しかし、モツポラミンA、B、およびCは本発明の医薬組成物、使用、および方法に含まれている。これらの既知のモツポラミンは弱い細胞毒性を有する大環状アルカロイドで、熱帯のカイメンの1種であるXestospongia exiguaから初めて単離されたものである(Williamsら[上述の文献])。
【００２７】
既知のモツポラミンの種々の合成法が知られており、文献中に報告されている(Goldring, W. P. D.とWeiler, L. (1999) Organic Letters 1:1471-1473; Goldring, W. P. D.ら(1998) Tetrahedron Letters 39:4955-5948; Furstner, A.とRumbo, A.(2000) J. Org. Chem. 65:2608-2611; およびBaldwin, J. E.ら(1999) Tetrahedron Letters 40:5401-5404を参照せよ)。本発明で用いるための化合物およびその製薬上用いうる塩、それには本明細書に記載の新規のモツポラミンおよび塩が含まれるが、それらは天然のソースから得ることができ、その後前述の参照文献中の後者の文献および本明細書中の実施例に記載されているように改変することができる。好ましくは、本発明で用いるための化合物は、例えば既知の合成経路を用いて、出発材料に適切な改変を加え、当業者には明白な方法を用いて、本明細書に記載のとおり新規のモツポラミンを得るために、合成される。当業者であれば既知のモツポラミンを改変するための従来の方法、および本明細書に記載の類似体を作成するための特別な方法論を、本発明に包含されている新規のモツポラミンおよび類似体の調製に用いるかまたは適合させることができる。
【００２８】
本発明はまた、細胞浸潤を阻害する薬剤の存在を試験するための方法をも提供し、その方法は：
(a) 浸潤性の細胞を生物学的マトリックスの表面上に置き；
(b) 細胞浸潤阻害活性を試験しようとする薬剤でその細胞を処理し；
(c) マトリックスの表面上の細胞を、その細胞がマトリックスに浸潤するために十分な時間保持し；
(d) (c)の後、マトリックス表面上の実質的に全ての細胞を除去し；
(e) (d)で除去した細胞を、その細胞が付着し増殖しうる表面上に移し；
(f) (e)の表面上の細胞をその表面上で付着および増殖が起こるために十分な時間保持し；
(g) (f)の後に該表面に付着した細胞の量を示す値を測定する、
ことを含んでなる。
【００２９】
上述の方法で、(a)と(b)は同時に起こってもよく、またはどのような順番であってもよい。該細胞はマトリックスに浸潤することができ、そのマトリックスは細胞浸潤の阻害剤が存在しない場合にはその細胞が浸潤性を示すこととなるようなものである。
【００３０】
上述の試験法はまた、(g)で測定した値を対照で測定された値と比較することをも含んでなる。対照は(b)での細胞の処理以外は同一の条件で上記の方法を行った細胞である。後者の場合には、本発明の方法はさらに薬剤での(g)の値を対照の(g)の値と比較して、該薬剤による阻害量を示す値を得ることをも含んでなる。該薬剤が細胞浸潤の阻害剤であることを示すような結果とは、本発明の方法で(g)で測定した値が、対照で測定した値よりも低いことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の試験方法において、浸潤性細胞は生物学的マトリックスの表面上に置かれる。本発明に用いる目的では浸潤性細胞は生物の膜または細胞外マトリックスもしくはその他の細胞の生存と適合しうる材料で作成したゲルを通過して動くことのできる、どのような細胞でもよい。適切な細胞としては、下記の実施例に記載のもの、またはPC-3前立腺癌、U-87神経膠腫、およびU-251神経膠腫などの細胞などの浸潤性の癌細胞、ならびに神経細胞、内皮細胞、有核造血細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞などの癌細胞でない細胞が含まれる。
【００３２】
本発明では、生物学的マトリックスは、浸潤性の細胞がその中に浸潤することのできるような、細胞外マトリックス材料もしくはその他の細胞の生存と適合しうる材料で作成した膜またはゲルとすることができる。例としては下記の実施例で用いている生物学的マトリックスならびにフィブリンゲル、または個々の細胞外マトリックス成分もしくは細胞外成分の混合物で形成されたゲル、または細胞の生存と適合しうる何らかの物質で形成されたゲル、または細胞の生存と適合しうる何らかの物質を含有するゲル、などのゲルを含む。適切な生物学的マトリックスには、細胞の浸潤性を評価するためにこれまで用いられてきたものが含まれる。
【００３３】
本発明の試験方法では、浸潤性細胞は生物学的マトリックス上に、その細胞がマトリックスへ浸潤するために十分な時間、保持される。保持する時間は当業者であれば用いる細胞のタイプおよびそのマトリックスの性質に基づいて決めることができる。その細胞がマトリックス中へ浸潤するために十分な時間が経過した後、実質的に全ての細胞をマトリックスの表面から除去する。この除去は当業界で既知の適切な方法であればどの方法を用いても行うことができ、そのような方法としては、下記の実施例に記載の方法が含まれる。除去した細胞は、その細胞が付着し増殖することのできるような表面上へと移される。そのような表面は、その試験で用いた細胞と適合しうるような当業界で既知のどのような表面でもよく、そのようなものとしては本明細書中に記載のプラスチックの表面が含まれる。その細胞は、細胞が付着し増殖するために十分な時間、その表面上で保持される。保持時間は、表面に付着し生存している細胞が増殖するのに十分な時間が経過するように、その細胞のタイプおよび表面の性質に従って試験実施者によって選択される。
【００３４】
本発明の試験方法では、該表面に付着し増殖した細胞の数または量を示す値が測定される。この値を測定するためには当業界で既知の種々の手段を用いることができ、そのような手段としては、細胞数の直接的計数、ならびに本明細書に記載のアッセイ方法などの間接的手段が含まれる。その他の方法としては、MTS、ニュートラルレッド、放射性チミジン取り込みアッセイ、ならびにその他の生細胞の量または数を測定することのできる方法が含まれる。
【００３５】
本発明の化合物または本発明で用いるための化合物には、それらの製薬上許容される塩が含まれるが、それらは上述の、または本明細書で例示している既知の方法に従って合成して得ることができる。本発明で用いることのできるいくつかの化合物は天然のソース、例えば従来技術および本明細書の実施例で開示されているものなどから得ることができる。そのような天然のモツポラミンを当業界では既知の方法論および本明細書で特に例示した方法論に従って改変することができる。本発明の、または本発明で用いるための化合物およびその製薬上許容される塩は実質的に精製された形態のものとなる。「実質的に精製された形態」とは、該化合物または塩(それが天然のものである場合)がソースとなった生物体または組織の細胞を実質的に含んでいないことを意味する。「実質的に細胞性夾雑物を含んでいない」という用語は、該化合物がex vivoで存在し、かつソースとなった生物体、組織、もしくはその他の天然ソース中での該化合物の濃度よりも高い濃度であることを意味する。
【００３６】
表１に示した合成スキームは、本発明に用いるためのモツポラミン化合物およびその類似体を調製するために用いることのできる反応を一般的に概説したものである。特定の化合物の調製のためのそのようなスキームの使用の例は下記の実施例中に記載している。
【表１】
本発明の化合物または本発明で用いるための化合物は通常は水溶性であり、塩の形態とすることができる。そのような場合には、本発明の医薬組成物はそのような化合物の塩、好ましくは塩酸塩などの生理学的に許容される塩を含んでなる。他の適切な塩については当業界では既知である。医薬組成物は、典型的には該組成物の投与方法、それが注射、吸入、局所投与、洗浄法、またはその他の選択された治療法に適した方法によるものであれば、その投与方法で許容される1種以上の担体を含んでなる。適切な担体とはそのような投与方法に用いるためのものとして当業界で既知のものである。
【００３８】
本発明の医薬組成物または本発明で用いるための医薬組成物は、標準的な方法によって患者に投与することができ、そのような方法としては、局所、経口、吸入、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与が含まれる。避妊に用いるには、その投与は子宮への直接的適用、例えば、子宮内洗浄、インプラント、または子宮内器具によって行うことができる。投与量と治療期間は、標準的なプロトコールおよび選択した化合物の活性と毒性に関する情報に従って実施者が定めることとなる。
【００３９】
本発明の化合物もしくは医薬組成物、または本発明で用いるための化合物もしくは医薬組成物は、医療器具または装置、例えばインプラント、移植片、補綴、ステントなどを用いて投与することができる。例えば、ステントは再狭窄または動脈硬化の阻止のためにそのような組成物で被覆することができる。また、インプラントはそのような化合物または組成物を含有し放出させるようにすることができる。
【実施例】
【００４０】
A. 細胞浸潤阻害剤のスクリーニング
Matrigel（商標）は、ラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンに富む、移植可能なEngelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫の抽出物である。4℃でMatrigelは液状であるが、37℃では陽イオン依存性に重合して半固体のゲルを形成する。これらの物理的性質は2種類の広く用いられている細胞浸潤法の開発に利用されてきた。「伸長(outgrowth)」法では、細胞を液状のMatrigel中に懸濁した後ゲル化させる。次いで、細胞がゲル内へと成長するので浸潤が形態学的にモニターされる(Bae, S. N.ら, (1993) Breast Cancer Res. Treat. 24:241-255)。「ボイデンチャンバー」法では、Matrigelは有孔フィルター支持体上にあらかじめゲル化させておく。次いで細胞をMatrigel上に置き、通常は走化性薬剤に応答して基底膜/フィルターバリアーの反対側へ横断した細胞数を測定することによって浸潤を定量する(Price, J. T.とThompson, E. W. (1999) Meth. Mol. Biol. 129:231-250)。「伸長」法の欠点は細胞の形態学的な変化を肉眼でモニターする必要があることである。「ボイデンチャンバー」法は定量的データが得られるが、「伸長」法と同様、この方法は細胞浸潤に影響を及ぼす薬剤と、細胞の生存または細胞接着に影響を及ぼす薬剤を区別することはできない。
【００４１】
本発明者らは各種の生物学的な粗抽出物のうちの非常に多数が、高い塩濃度およびその抽出物中に存在する他の毒性分子のために細胞死を起こすことを知っている。しかし、本発明のアッセイ法は定量的であり、細胞接着を妨げる薬剤、または細胞毒であるような薬剤は排除する。本発明のアッセイ法は、マトリックスに付着したままであって浸潤の低下を示し、この方法の最初から最後まで生存している細胞を「陽性」ヒットと数える。
【００４２】
MDA231ヒト乳癌細胞系は高度に浸潤性で転移性である。この細胞はMatrigelに15分以内に付着し、2〜4時間以内に、形態学的に評価しうるように再構成された基底膜マトリックス中に浸潤し移動し始める。これに対して、MDA453ヒト乳癌細胞は転移性がはるかに低く、Matrigelに急速に付着するが4時間以内にマトリックス中には浸潤しない。これらのような2種類の細胞系の間の浸潤性の相異は、本発明の方法での非浸潤性細胞の回収のための最適条件を開発するために用いることができる。本実施例では、より浸潤性の低いMDA453細胞系の回収はより浸潤性の高いMDA231細胞系の回収の5倍多かった。
【００４３】
本発明のアッセイ法の薬剤スクリーニングにおける適切性を海綿から得た粗抽出物の選択を用いて試験した。230種の抽出物を50〜100μg/mLで試験した。228種の抽出物が、ジメチルスルフォキシド(DMSO)(0.025)を含有しているそれらの陰性対照での示数に近似のまたはそれ未満の示数を示した。しかし、2種類の抽出物は強い活性を示し、それらはLY294002を用いた陽性対照よりも活性が高かった。活性化合物はその第1の抽出物から、下記のとおり分画をガイドするアッセイ法を用いて精製した。第2の活性抽出物は第1のものと形態学的に類似しており、その抽出物は同一の活性化合物を含有していることが判った。その活性化合物は、スペルミジン様副構造を有する大環状アルカロイドのファミリであるモツポラミンであると同定された。
【００４４】
細胞培養
American Type Culture Collection(Bethesda MD)から入手したヒト乳癌MDA231細胞およびMDA453細胞を、5%ウシ胎児血清(FBS)、インスリン(5μg/mL)、およびゲンタマイシン(50U/mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地およびF12培地の1:1(v:v)混合物（DMEM/F12）中で培養した。新鮮な臍帯静脈を50mLのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地で洗い、その後20mLのRPMI中にコラゲナーゼAを含む液(0.13mg/mL)で洗うことによってヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を単離した。次いでその臍帯をコラゲナーゼで満たし、室温で30分間インキュベートした。臍帯をこすって細胞を引き離し、その内容物を30mLのRPMIで洗い、回収して1200rpmで10分間遠心した。その細胞ペレットをRPMIで洗い、10%ウシ胎児血清、10%鉄添加ウシ胎児血清、16U/mLのヘパリン、20μg/mLの内皮細胞増殖用添加物(ECGS)、2mM グルタミン、および各100U/mLのペニシリンとストレプトマイシンを添加した、微量元素を完全に含む培地(MCDB)中に懸濁した。初回の継代では、細胞を0.2%のゼラチンをコートしたディッシュ上に蒔き、HUVECの付着を促進させた。その後の継代は標準的な組織培養用処理ディッシュを用いて行った。細胞は全て5% CO2中で37℃で保持した。
【００４５】
海洋生物体の採取と抽出物の調製
各々約250gの海綿をパプアニューギニアのMotuporeとMadangの海岸の水深約15mのところの熱帯の太平洋の岩礁から手で採取した。サンプルは採取場所で冷凍しドライアイスを入れて輸送した。分類学的な同定のための各採取物の証拠となるサンプルをカナダのUniversity of British Columbiaでメタノール中で−20℃で保管した。Xestospongia exiguaのサンプルはZoological Museum of Amsterdam(ZMA POR 11521)に寄託した。抽出物は海綿サンプル各200gをメタノール中でホモジナイズすることによって調製した。そのホモジネートをろ過し、真空下で濃縮してゴム状の残査を得た。約1mgを100μLのDMSO中に溶解し、浸潤阻害アッセイに用いた。
【００４６】
浸潤阻害剤のアッセイ
Matrigel(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)を氷冷DMEM/F12中に1:1で溶解し、その50μLをピペットで氷冷した96ウエルの細胞培養プレート(Falcon)のウエルに氷冷したピペットチップを用いて、各ウエルの側面を避けつつ入れた。次いで、そのマトリックスをゲル化させた後、乾燥させた37℃のインキュベーター中で一晩乾燥し、その後細胞をプレーティングする1時間前に100μLの増殖培地で再水和させた。この処理によって破れにくいマトリックスが作成される。Matrigelの上に37℃に加温した100μLの培地にDMSO中に溶解した海綿抽出物の1μLを加えたものまたは加えていないものを添加し、その後60,000個のMDA231細胞を含有する培地100μLを添加した。1μLのDMSOを陰性対照として用いた。浸潤を阻害するものとして既知のホスファチジルイノシトール3-キナーゼインヒビターLY294002(50μM)を陽性対照として用いた。次いでそれらの細胞を2.5時間インキュベートして浸潤が起こるようにした。
【００４７】
インキュベーション後、細胞はMatrigel中に浸潤したか、または浸潤できずにMatrigelの表面上に定着した。細胞培養用培地の大部分は細胞を乱すことなく除去された。この除去はハンドヘルドのピペッターで行うことができるが、より一定した結果はBio-Tek Elx405 96ウエルプレート洗浄機に吸引針を用いMatrigelの表面上約2mmに位置させてその吸引機能を用いて得られる。浸潤しなかった細胞は、MatrigelをHank's Balanced Salt Solution中に0.125% トリプシンを入れた液200μLと37℃で30分間インキュベートすることによって表面から引き離して回収した。この酵素処理はMatrigelの表層に付着した細胞を引き離すがマトリックスを分解せず、ゲルに浸潤した細胞を放出しない。次いで、その細胞を100μLのセッティングをしたハンドヘルドピペッターを用いて上下にピペッティングを3回行って懸濁させ、その100μLを取って、トリプシンを不活化するために30%ウシ胎児血清を添加した培地100μLを含有する、Matrigelを含まない新鮮なプレートに移した。次いでそれらの細胞をプラスチックの表面に付着させるために一晩インキュベートした。MTTアッセイを用いて生細胞を測定した：細胞培養用培地を、新鮮な培地100μLと、リン酸緩衝食塩液中に3(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドを5mg/mLとした溶液25μLに置換した。37℃で2時間置いた後、その溶液を除去し、ジメチルホルムアミド中に溶解した20%ドデシル硫酸ナトリウム:水(1:1)を100μL添加して細胞を溶解させた。37℃で一晩インキュベートした後、570nmで吸光度を測定した。
【００４８】
B. モツポラミンの単離と合成
全般的な化学的方法
衝突ガスとしてキセノンを用い、チオグリセロールサンプルマトリックスを用いて、低分解能および高分解能FABMSをKratos Concept II HQ マススペクトロメーターで記録した。
【００４９】
分析用薄層クロマトグラフィーにはMerck Type 5554シリカゲルプレート、およびWhatman MKC18F プレートを用いた。逆相HPLCでの精製はWaters 410 Differential RefractometerにWaters 600E System Controllerを付属させて行った。HPLCに用いた溶媒のグレードは全てFisher HPLCグレードのものとした。
【００５０】
モツポラミンの単離
Xestospongia exiguaの凍結サンプルの一部分(86g)を小片に切り、メタノール中に浸漬しさらにメタノールで繰り返し抽出した(3 x 150mL)。そのメタノール抽出液を併せ、真空下で濃縮し、酢酸エチル(3 x 70mL)と水(200mL)に分配させた。水層は浸潤アッセイで活性を示し、その水層をn-ブタノールで抽出した(3 x 70mL)。ブタノール抽出液を併せ、真空下で濃縮して1.16gの茶色の油を得た。活性のあるn-ブタノール可溶性物質をSephadex LH-20でのクロマトグラフィーを繰り返して行うことによって分離したが、その際の溶出は最初にメタノールを溶出液として用い(118.4mgの活性物質を得た)、次いで酢酸エチル/メタノール/H2Oが20:5:2の液で溶出して55.6mgの、ニンヒドリンで染まり浸潤アッセイで活性の認められる、青白い非晶質の固体が得られた。この非晶質固体は単一クラスの化合物でスペルミジン様構造を有しており、既知のモツポラミンA-Cおよびいくつかの新規のモツポラミンを含んだものであった。モツポラミンCはサンプル中の主要な成分であった(＞90%)。
【００５１】
それらの化合物をWhatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてメタノール/H2Oの11:9の液中に2%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む液を用いて、逆相HPLCで、高希釈度で(1回のインジェクションあたり＜0.1mg)分離した。このHPLCでの分画によって、モツポラミンAの純粋なサンプル、BおよびD(少なくとも4個のメチルが分枝状の類似体からなる)の混合物を含有する画分、モツポラミンCの純粋なサンプル、＞90%のモツポラミンEプラス他の2つのEのオレフィン異性体を含有する画分、およびアセチルモツポラミンCとトリフルオロアセチルモツポラミンC、これらはおそらく単離の際の人工産物であろうが、それらの純粋なサンプルが得られた。モツポラミンCを除いては、その他の全ての化合物の単離された量はmg以下の量であった。単離されたモツポラミンは全てアンモニウムTFA/水の塩であった。
【００５２】
その後に行った大規模の単離では、活性のあるn-ブタノール抽出物を５N NaOHを添加してpH＞12とした水中に再溶解した後にCH2Cl2で抽出することによって上記の方法を改良した。その後、活性のあるCH2Cl2抽出物を上述のとおりクロマトグラフィーにかけた。625gの冷凍海綿から総計379.7mgのモツポラミンが単離された。
【００５３】
モツポラミンAは青白色の油として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z298.3229(C18H40N3, 計算値298.3222)。モツポラミンB、モツポラミンD、およびモツポラミンDのメチルの位置の異性体は白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z312.3387(C19H42N3, 計算値312.3379)。モツポラミンCは青白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z324.3380(C20H42N3, 計算値324.3379)。モツポラミンE、および他の2つのEのオレフィン異性体は青白色の油として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z310.3212(C19H40N3, 計算値310.3222)。アセチルモツポラミンCは白色の非晶質固体として単離された；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z366.3484(C22H44N3, 計算値366.3484)。トリフルオロアセチルモツポラミンCは白色の非晶質固体として単離された；[M＋H]＋m/z420.3191(C22H41N3OF3, 計算値420.3202)。
【００５４】
モツポラミンG、H、およびIは全てごく少量得られた。その各々はHRFABMSでC19H41N3の分子式に対応する[M＋H]＋イオンが得られた。各化合物について得られたNMRデータの分析ではこれらが全て、天然の他の類似体に見出されるものと同じジアミン側鎖を有し、また、飽和大環状アミン断片をも有するモツポラミンファミリーのメンバーであることが示された。モツポラミンG、H、およびIを他のものから分けた特徴は各々の1H NMRスペクトルでのδ〜0.98での二重線メチル共鳴の存在であり、それは各化合物の大環状アミン中のメチル分枝によるものとされ、それらの化合物をモツポラミンAのメチル化類似体としているものである。C-10およびC-11の位置のメチル分枝を除外することが可能である。3種類の別個の異性体があるので、その各々は図１４に示すような一般構造を有しているはずであり、分枝はC-12からC-15の間に個々に位置している。
【００５５】
モツポラミンの化学修飾
アセチル化：モツポラミンの混合物のサンプル(89.2mg)を2mLの3:1ピリジン/無水酢酸の2mL中に溶解し、室温で16時間撹拌した。真空下で溶媒を除去してジアセチル化産物の混合物を得て、それをWhatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてMeCN/0.6% TFA/H2Oの2:3の液を用いて、半調製的逆相HPLCで部分的に分離した。ジアセチル化されたモツポラミンA(最初に溶出してくるもの)およびC(それぞれ1.5mgと95.8mg)は青白色の澄明な油として得られた。さらに3つの画分を得られた。それらの第1のものは、ジアセチルモツポラミンEを含んでいた。この画分はさらに、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液として35:65 MeCN/H2O中に0.39% TFAを含む液を用い、逆相HPLCで精製し、1.2mgの純粋な化合物を青白色の油として得た。次の溶出画分はジアセチルモツポラミンBとモツポラミンAのジアセルメチル分枝類似体を含んでおり、上述のジエチルモツポラミンEの場合と同様の条件を用いてHPLCでさらに分画した。純粋なジアセチルモツポラミンB(0.4mg)とモツポラミンAの2種類のメチル分枝付加化合物を各々含んでいる2種類の画分(0.8mgおよび0.6mg)が得られた。最も遅く溶出された画分はジアセチルモツポラミンCの後に溶出され、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液として33:67 MeCN/H2O中に0.39% TFAを含む液を用いて精製し、0.5mgのジアセチルモツポラミンCのホルムアミドを青白色の油として得た。上述のHPLCの各画分中に含まれる他のジアセチルモツポラミンを採取した。ジアセチルモツポラミンは全てアンモニウムTFA/水の塩として単離した。
【００５６】
ジアセチルモツポラミンAおよびCは以前から知られている。しかし、ジアセチルモツポラミンについての以前の報告は正しくない(Williams, D. E.ら, [上述の文献])。ジアセチルモツポラミンBは青白色の澄明な油として単離され；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z396.3580(C23H46N3O2, 計算値396.3590)であることが現在では示されている。メチル分枝型は2種類の青白色の油として単離され、その各々はモツポラミンDおよびジアセチルモツポラミンAのメチル分枝型異性体を含んでおり；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z396.3599(C23H46N3O2, 計算値396.3590)であった。ジアセチルモツポラミンCホルムアミドは青白色の澄明な油として単離され；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z436.3538(C25H46N3O3, 計算値436.3539)であった。ジアセチルモツポラミンEは青白色の澄明な油として単離され；[M＋H]＋m/z394.3427(C23H44N3O2, 計算値394.3434)であった。
【００５７】
水素化：モツポラミン混合物のH2/Pd/Cを用いた水素化によって完全に還元された混合物が得られ、その混合物は浸潤アッセイで強い活性を示した。1例はジヒドロモツポラミンCで、図１５に示しているとおりである。ジヒドロモツポラミンCは非晶質固体として単離され；1H NMR(400MHz, MeOH-d4)δ3.24(m, 2H)、3.10-3.21(m, 8H)、3.05(m, 2H)、2.17(m, 2H)、2.08(m, 2H)、1.72(m, 4H)、1.46(m, 8H)、1.36-1.42(m, 12H)ppm；13C NMR(100MHz, MeOH-d4)δ53.3, 52.9, 46.0, 37.8, 27.7, 27.4, 27.4, 27.3, 25.5, 25.4, 22.9, 22.6ppm；陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z326.3532(C20H44N3, 計算値326.3535)であった。
【００５８】
塩酸加水分解：ジアセチルモツポラミンC(これは浸潤アッセイでは不活性である)の塩酸加水分解によって浸潤アッセイで強い活性を示すモツポラミンCとなる(図６)。
【００５９】
ジアルキル、環状、および大環状アミンからのモツポラミン、側鎖に修飾のあるモツポラミン類似体、およびその他のモツポラミン類似体の調製
第2アミン(例えば、約1.5ミリモル)(例えば、図７に示す大環状アミン)をMeOH中のメチルアクリレート(例えば、約1.6ミリモル)と反応させることができる(例えば、10mLを室温で16時間)。溶媒と過剰の試薬を真空下で除去した後、その結果得られたβ-アミノエステルを、MeOH中の(例えば、10倍過剰量の)ジアミノアルカン(例えば、エチレンジアミン、1,3-ジアミノプロパン、1,4-ジアミノブタン、スペルミジン)と反応させることができる(例えば、10mLを室温で4-5日間)。溶媒と過剰の試薬を真空下で蒸発させるとアミドが得られる。このアミドを水素化アルミニウムリチウム(LAH)(例えば、THF(7mL)中に1.3ミリモル、70℃で16時間)で還元することができる。過剰のLAHはH2Oの滴下によって反応を止め、反応混液を、pHを＞12に保持して(例えば、必要に応じて1N NaOHを添加することによって)H2O(例えば、10mL)とEt2O(例えば、3 x 4mL)に分配することができる。HPLCをさらに精製するために用いることができる。例えば、ある類似体の非晶質のTFA/H2O塩を、Goldring, W. P. D.とWeiler, L.[上述の文献]の方法を改変した方法で、Whatman Magnum-9 Partisil 10 ODS-3カラムを用い、溶出液としてMeOH/H2Oの11:9の液中に2%TFAを含む液を用いて、半調製用逆相HPLCで調製することができる。
【００６０】
2- アザシクロアルキル - オンからのモツポラミンおよびモツポラミン類似体の調製
2-アザシクロアルキル-オン(1.52ミリモル)(2-アザシクロアルキル-オンまたは4-アザトリシクロ[4.3.1.13,8]ウンデカノ-5-オン)を、上述のアミドの還元について概説した方法に従ってLAH(1.3ミリモル)で還元した。その結果得られた大環状アミン(収率は通常98%)をメチルアクリレートと反応させ、モツポラミンAを得るための方法として上述のしたとおりの残りの方法にかけた。
【００６１】
側鎖に修飾のあるモツポラミン類似体の調製
第2アミン(例えば、図７の大環状アミン；1.52ナノモル)をTHF(12mL)中のメチルハロアルキルエステル(1.57ミリモル)(メチルクロロ酢酸またはメチル-4-ヨード酪酸)と還流しつつEt3N(4.56ミリモル)の存在下で3時間、Sbiozakiら(1984)Tetrahedron 40:1795-1802に記載の方法に従って結合させた。H2O(30mL)とEt2O(3 x 8mL)間のでEt2Oでの抽出後、その結果得られたエーテルに可溶のαまたはγ-アミノエステルを、上述のモツポラミンA類似体を得るために用いる方法として上記に記載のとおり、10倍過剰のジアミノアルカンと反応させてモツポラミンA類似体を得る。
【００６２】
カルバゾール類似体の調製
カルバゾール(1.52ミリモル)をTHF(10mL)中に溶解し、NaH(1.56ミリモル)を添加した。その混合物を撹拌しつつ2時間室温で置き、メチルアクリレートを添加した後その反応混液を室温でさらに16時間撹拌しつつ置いた。過剰のNaHをH2Oを滴下することによって反応を止め、その反応混液をH2O(22mL)とEt2O(3 x 7mL)間で抽出した。この結果得られたβ-アミノエステルを10倍過剰の1,3-ジアミノプロパンと反応させ、その結果得られたアミドを上述のとおりLAHで還元して図１２に示す化合物を得た。
【００６３】
図１２に示した化合物は黄色の非晶質固体として単離された；1H NMR(400MHz, MeOH-d4)δ8.07(d, J＝7.5Hz, 2H), 7.52(d, J＝7.9Hz, 2H), 7.44(t, J＝7.9Hz, 2H), 7.20(t, J＝7.5Hz, 2H), 4.50(t, J＝6.7Hz, 2H), 2.94-3.04(m, 6H), 2.27(m, 2H), 1.97(m, 2H)ppm; 13C NMR(100MHz, MeOH-d4)δ141.5, 127.0, 124.3, 121.3, 120.3, 109.7, 46.9, 45.8, 40.6, 37.7, 26.9, 25.3ppm; 陽イオンHRFABMS[M＋H]＋m/z282.1972(C18H24N3, 計算値282.1970)。
【００６４】
C. モツポラミンの活性
細胞浸潤の阻害
種々の濃度のモツポラミンA、モツポラミンB、モツポラミンC、BとC型の混合物、ならびにモツポラミンG、H、およびIの混合物を浸潤阻害アッセイで試験した。全てのものが浸潤を阻害した。モツポラミンC(IC50＝1μM；図３)、モツポラミンA(IC50＝3μM；図１)、BとDの混合物(IC50＝3μM；図２)、モツポラミンBおよびG,H,I混合物は類似の活性を示した。図４、５、６、および８〜１２も、本発明の種々の化合物による阻害を示している。図１３に示している各化合物のIC50値は約1〜10μMであった。
【００６５】
低細胞毒性
モツポラミンCの細胞毒性を、種々の濃度のモツポラミンCの存在下で24時間細胞をインキュベートすることによって調べた。モツポラミンCを洗い流し、さらにその後5日間まで細胞増殖を測定した。モツポラミンCは浸潤の阻害のIC50(1.6μM)に近い濃度で細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。4μMおよび8μMというより高い濃度とすると細胞増殖の軽度な阻害が認められた。従って、モツポラミンCは低いμMの濃度、それは浸潤の阻害は示す濃度であるが、その濃度ではMDA231細胞の増殖への毒性はほとんどまたは全く示さない。同様に、図１、２、４、５、６、および８〜１３に示す化合物も細胞毒性は低い。
【００６６】
モツポラミン類似体の活性
モツポラミンの目立った特徴はそのスペルミジン様テイルであり、それは生理学的pHでは正に荷電されている。合成および半合成モツポラミン類似体を調製し、種々の濃度で浸潤阻害アッセイを行った。スペルミジン様テイルを欠いているモツポラミンA類似体は完全に不活性であった(図７)。モツポラミンCの末端アミノ基をアセチル化(モノアセチルモツポラミンC；図５)、またはトリフルオロ酢酸で置換した(CF3Ac モツポラミンC；図８)。これらの2つの化合物はどちらも非常に活性が高く、荷電したアミノ基はこの位置には必要でないことを示している。
【００６７】
窒素原子とテイルとの間の炭素数は様々であった。末端アミノ基の近傍に2個の炭素原子しか有していない化合物は強い活性を示し(図９)、3個の替わりに4個の炭素原子を有する化合物も強い活性を示した(図１０)。環の近傍に3個の替わりに2個の炭素原子しか持たない化合物(図１１)は活性を示した。
【００６８】
天然のモツポラミンの第2の特徴は、単純な13〜15員環であることである。分析結果から、15員環を有するモツポラミンCは14員環のモツポラミンEおよび13員環のモツポラミンAよりわずかに活性が強いことが判った。種々の環のサイズを有する一連の合成類似体を調製し、浸潤阻害を調べた。5員環を有する化合物と6員環を有する化合物をスペルミジン様テイルと結合させたが活性は示さなかった。完全に不飽和で複数の環状構造を有する化合物は強力な活性を示した(カルバゾール類似体；IC50＝3μM；図１２)。
【００６９】
モツポラミンは癌細胞の拡散を阻害する
MDA231細胞は高度に浸潤性である。MDA231はMatrigelに急速に付着し、4時間以内に紡錘形の形態となりゲル中へと移動する。細胞をモツポラミンCとインキュベートするとMatrigel上の浸潤性で紡錘形の細胞の形成を防止する。浸潤を完全に阻害するモツポラミンの濃度(5μM)ではマトリックスからの細胞の脱離は起きなかった。むしろ、細胞は付着したままであったが丸みを帯び、マトリックスの上にあった。
【００７０】
モツポラミンCがMDA231細胞をMatrigel上で丸みを帯びたままの状態とするとの観察結果は、細胞の拡散の阻害を示唆していた。MDA231細胞を、拡散因子(Ham)を含んでいる血清の存在下で堅い組織培養用プラスチック上に蒔いた。これらの条件下で大多数のMDA231細胞はモツポラミンCがなければ4時間以内にプラスチック上に拡散する。拡散している細胞は大きく平らな層状で、連続的な突起のあるエッジを示した。これらの突起は位相差顕微鏡では黒く現れるが、これは拡散及び移動している細胞の双方で、アクチンがメディエートする膜のダイナミックな動きのある部位を示している。モツポラミンCの適用量を増加させると細胞の拡散が減少し、大多数の細胞では5μMで球状を示す。これらの球状の細胞は、小さく不連続な突起を有する小規模な層状となって組織培養用プラスチックに付着したままとなっていた。
【００７１】
また、MDA231細胞をあらかじめ20時間、組織培養用プラスチック上に拡散させ、次いでモツポラミンC(5μM)で4時間処理した。位相差顕微鏡での観察では、細胞はわずかに屈折性となり、これはわずかに収縮したことを示すが、丸くはならなかった。ローダミン-ファロイジンで染色して調べると、モツポラミンCでの処理はアクチン細胞骨格に微妙な変化を生じさせている：アクチンストレス線維は依然として見えるが、連続的な突起の替わりに細胞のエッジでのアクチンの局在化による、小さな不連続の「ボタン」となっていることがよく見られる。これに対してf-アクチン破壊剤であるサイトカラシンD(CD；1μg/mL)で処理すると細胞が完全に丸くなり、アクチンフィラメントとの完全な解離が起こる。細胞をモツポラミンCで48時間まで処理しても、表面上に既に付着し拡散した細胞の著しい球状化は起こらなかった。
【００７２】
モツポラミンは癌細胞の移動を阻害する
モツポラミンCが細胞拡散及びアクチン層状突起化に影響を及ぼすことは、細胞の移動の減少によって浸潤の阻害がなされたことを示している。滅菌済のようじでMDA231細胞のコンフルエントな単層を掻き取り、約100μmの細胞のない隙間を作った。その隙間が細胞の移動によって塞がれることを顕微鏡でモニターした。モツポラミンCがない場合には、細胞はその隙間に移動して24時間以内にその隙間を実質的に塞いだ。これらの細胞は幅広い層状の突起をそのリーディングエッジに沿って有しており、その全体にアクチンが濃縮されていた。これに対して、モツポラミンC(5μm)に暴露させた細胞では24時間目にもかなりの隙間が依然としてあり、このことはモツポラミンCが細胞の移動を遅延させることを示している。これらの細胞は小さく不連続な突起がそのリーディングエッジに沿ってあるにすぎず、アクチンは小さな不連続なパッチ上に含まれているのみで、これはあらかじめ拡散させた細胞中で観察された「ボタン様」濃縮と類似したもののように見えた。
【００７３】
内皮出芽アッセイ
内皮の出芽はNehls, V.とDrenckham, D.の方法((1995) Microvasc. Res. 50:311-322)を改変した方法によって評価した。変性コラーゲン(Cytodex 3, Sigma)をコートしたマイクロキャリアービーズをHUVECと共に蒔いた。その細胞がビーズ上でコンフルエンスに達したときに、同数のHUVECをコートしたビーズを96ウエルのプレート中のフィブリンゲル中に埋めた。フィブリンゲルの調製には、ウシフィブリノゲンをMCDB培地中に2.5mg/mLの濃度で溶解した。アプロチニンを0.05mg/mLの濃度で添加し、その溶液を0.22μmのフィルターでろ過した。そのフィブリノゲン溶液に15ng/mLの血管内皮細胞増殖因子(VEGF)をモツポラミンCとともにまたはモツポラミンCは用いずに添加した。対照としてVEGFまたはモツポラミンCを含まないフィブリノゲン溶液を用いた。そのフィブリノゲン溶液を96ウエルのプレートに移した後、HUVECをコートしたビーズを1ウエルあたり50個のビーズの密度で添加し、凝固はトロンビン(1.2U/mL)の添加により誘発させた。凝固が完了した後、ゲルを5%ウシ胎児血清を含有するMCDB培地で37℃で平衡化させた。60分間インキュベートした後、その培地をモツポラミンCを含んだ、または含まない同じ培地と交換した。培地を毎日交換しつつ3日間インキュベートした後、マイクロキャリアービーズ上に形成された毛細管様のチューブを顕微鏡で数えた(出芽数/ビーズ)。長さが150μmより長く、少なくとも3個の内皮細胞からなる出芽のみを数えた。
【００７４】
血管形成のニワトリ絨毛尿膜アッセイ (CAM)
白色レグホン種のニワトリの受精卵を一定の湿度の条件下で37℃でインキュベートした。6日目の胚で、発達しつつある絨毛尿膜(CAM)を卵の平たい方の端の気嚢の上に小さな丸い穴を開けることによって殻から取り出した。内膜を除去した後、開口部をパラフィルムで封じ、その卵をさらに2日間インキュベートした。モツポラミンCは30ng/mLのVEGFを添加したPBS中に調製した。8日目に発達中のCAMの表面上に置いた2mm3のゼラチンスポンジ(Gelfoam, Pharmacia Upjohn)上に20μLをロードした。ヴィークルのみ(20μL PBS)を含んでいるスポンジを陰性対照として用い、陽性対照としては、PBS中の30ng/mLのVEGFの20μLを含んでいるスポンジを用いた。卵を再度封じ、インキュベーター内へ戻した。10日目にCAMの像を、Sport RT デジタルイメージングシステム(Diagnostics Instruments)を備えたOlympus SZX9立体顕微鏡を用いてデジタル的に捕捉した。
【００７５】
モツポラミンは血管形成を in vitro および in vivo で阻害する
モツポラミンCはin vitroの内皮出芽アッセイおよびin vivoのニワトリ絨毛尿膜(CAM)アッセイで示されるように血管形成を阻害する。内皮出芽アッセイでは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をコラーゲンをコートしたビーズ上に蒔いた。血管内皮増殖因子に暴露させると出芽と呼ばれる毛細管様チューブの形成が刺激され、その数と長さは顕微鏡によってある時間ずっと測定することができる。このアッセイで、2.5μMのモツポラミンCは血管内皮増殖因子(VEGF, 15ng/mL)に応答して出芽形成を明らかに阻害することが示された。5μMでモツポラミンCは出芽を完全に阻害した。
【００７６】
モツポラミンCはコンフルエントなHUVECの生存に10μMまでの濃度で72時間までは影響を及ぼさなかった。また、モツポラミンCはHUVECの増殖速度を低下させず、HUVECの増殖をわずかに増強させる可能性がある。従って、モツポラミンCは、毒性作用または抗増殖作用によっては血管形成を阻害しない。むしろ、モツポラミンCは、ボイデンチャンバーアッセイの改変したものを用いて評価したとき、HUVECの移動を阻害した。モツポラミンCはHUVECのVEGF(15ng/mL)に向かう移動を2.5μMおよび5μMの双方の濃度で阻害した。
【００７７】
モツポラミンは in vivo で腫瘍増殖を阻害する
ルイス肺癌およびSCCVII腫瘍を有するマウスに10〜15mg/kg/dayの投与量でモツポラミンCを毎日投与(i.p.)したところ、ヴィークルを投与した対照のマウスと比較して腫瘍増殖の顕著な減少が生じた。薬剤投与は腫瘍の容積が50〜200mm3の時に開始し、結果として対照と比較して腫瘍増殖速度の25〜50%の減少が起こった。
【００７８】
モツポラミンは in vivo で腫瘍転移の進行を阻害する
原発性ルイス肺癌を移植したC57マウスにモツポラミンCを15mg/kg/day投与(i.p.)したところ、ヴィークルで治療した対照の動物に比較して肺転移の発生の低下が見られた。原発腫瘍は特定のサイズまで増殖させ、次いで供試動物が肺転移の定量に十分なだけ長く生存しうるように考慮して放射線照射した。
【００７９】
モツポラミンは神経細胞の移動を阻害する
特徴の十分調べられている昆虫胚モデルで合成ジヒドロモツポラミン(DiH-MPC, 5μM)は神経細胞の移動に影響を及ぼした。DiH-MPCは究極的なシナプス標的が中枢神経系(CNS)中にある軸索成長円錐の型にはまった様式の移動を遅延させた。重要なことは、移動方向を進むこと、または移動方向を見つけ出すことがうまくいかなかったのではなく、軸索の発達の終わりの時点での神経成長円錐の移動の速度のみが阻害されたことである。従って、モツポラミンは、CNSの損傷後に軸索の出芽の減少が有益であるような状況での適用がある。このことは、損傷によって誘発される軸索の出芽および移動(すなわち、可塑性)がCNSの臨床的に効果的な再生に大きな障害となる神経経路の不適切な混合をもたらすような脊髄の病変において特に興味深い。
【００８０】
上述の本発明は理解を明確にするための図と実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、業者であれば本発明の説明していることを考慮すれば添付の特許請求の範囲の精神と範囲を逸脱することなく本発明に変更および改変を行いうることは容易に判るであろう。本明細書中で参照した特許、特許出願、および公表文献は参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンAでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンAの構造も示している。
【図２】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンBおよびDの混合物での浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンBおよびDの構造も示している。
【図３】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンCの構造も示している。
【図４】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミンEでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モツポラミンEの構造も示している。
【図５】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモノアセチルモツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。モノアセチルモツポラミンCの構造も示している。
【図６】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のジアセチルモツポラミンCの酸加水分解後のものでの浸潤阻害率を比較した図を示す。ジアセチルモツポラミンCの酸加水分解後のものの構造も示している。
【図７】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミン環構造を有するがスペルミジン様テイル部を欠く化合物の種々の量での浸潤阻害率を比較した図を示す。該化合物の構造も示している。
【図８】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のCF3Ac-モツポラミンCでの浸潤阻害率を比較した図を示す。CF3Ac-モツポラミンCの構造も示している。
【図９】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１０】本発明のアッセイ法を用いて種々の量のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１１】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミン類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１２】本発明のアッセイ法を用いて種々の量の本発明のモツポラミンカルバゾール類似体での浸潤阻害率を比較した図を示す。該類似体の構造も示している。
【図１３】細胞浸潤の阻害剤である本発明のその他のモツポラミン類似体の構造を示した図を示す。
【図１４】モツポラミンAのメチル化された形態の一般構造を示し(図１４A)、それにはモツポラミンG、H、およびIが含まれ、その各々はモツポラミンAのC-12からC-15のうちの１つの位置で置換されたメチルを有している(図１４B)。
【図１５】ジヒドロモツポラミンCの構造を示す。
Claims (57)
- 細胞浸潤または血管形成を阻害する医薬組成物であって、該組成物が細胞浸潤または血管形成を阻害する1種以上の式IもしくはIIの化合物、またはその製薬上許容される塩、および製薬上許容される担体を含んでなり、式Iが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCおよびCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1およびR2は独立して：水素；メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1およびR2のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換される、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
であり、式IIが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCまたはCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1、R2、およびR3は独立して：メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル基；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SORおよび−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1、R2、R3のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；そして
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換される1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
である、上記組成物。 - Yが場合によって置換された(CH2)nであり、nが1〜5である、請求項１に記載の組成物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖である、請求項１または２に記載の組成物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、不飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖である、請求項１または２に記載の組成物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、完全に不飽和で部分的に環状化した直鎖状アルキル鎖である、請求項１または２に記載の組成物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のアルキル基である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が水素；メチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、からなる群から選択されるものである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が水素；メチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上が場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のアルキル基である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上がメチル；および、場合によって-OH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上が場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上がメチル；および、場合によって-OH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 該化合物が式Iのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1およびR2のうちの一方が、水素、メチルおよび直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものであり；
(d) R1およびR2の他方が直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項１に記載の組成物。 - 該化合物が式IIのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで、C1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1、R、およびR3の1つまたは2つが、メチル、または直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) R1、R、およびR3の別の1つが直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項１に記載の組成物。 - 該組成物中の細胞浸潤または血管形成を阻害する該化合物が、モツポラミンA、B、もしくはC、またはそれらの混合物のみからなるものではない、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
- 該組成物中の化合物の構造が：
請求項１に記載の組成物。 - 該組成物中の化合物が、モツポラミンA、B、およびCからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
- 該組成物中の化合物が、モツポラミンDである、請求項１に記載の組成物。
- 該組成物中の化合物が、ジヒドロモツポラミンCである、請求項１に記載の組成物。
- 該組成物中に次の構造：
- 実質的に精製された形態の式IまたはIIの細胞浸潤または血管形成を阻害する化合物またはその製薬上許容される塩であって、式Iが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCおよびCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1およびR2は独立して：水素；メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1およびR2のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換される、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
であり、式IIが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCおよびCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1、R2、およびR3は独立して：メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SORおよび−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1、R2、R3のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；ならびに
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
である、モツポラミンA、B、またはCではない、化合物。 - Yが場合によって置換された(CH2)nであり、式中nが1〜5である、請求項２２に記載の化合物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、飽和された直鎖状のまたは分枝状のアルキル鎖である、請求項２２または２３に記載の化合物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、不飽和の直鎖状または分枝状のアルキル鎖である、請求項２２または２３に記載の化合物。
- Xが11〜16個の炭素原子を有し、場合によってRで置換された、完全に不飽和で部分的に環状化したアルキル鎖である、請求項１または２に記載の化合物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のアルキル基である、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が水素；メチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基である、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式Iのものであり、R1およびR2の一方または双方が水素；メチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上が、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のアルキル基である、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上が、メチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上が、場合によってNH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基である、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式IIのものであり、R1、R2、およびR3の1つ以上がメチル；および、場合によってOH、−OR、および＝Oからなる群から選択される置換基で置換された直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものである、請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物。
- 該化合物が式Iのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されたものであるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1およびR2のうちの1つが、水素、メチルおよび直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものであり；
(d) もう一方のR1およびR2が直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項２２に記載の化合物。 - 該化合物が式IIのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで、C1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されたものであるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1、R2の、およびR3の1つまたは2つが、メチル、または直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) R1、R2の、およびR3の別の1つが直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項２２に記載の化合物。 - 該化合物の構造が：
請求項２２に記載の化合物。 - 該化合物がモツポラミンDである、請求項２２に記載の化合物。
- 該化合物がジヒドロモツポラミンCである、請求項２２に記載の化合物。
- 該化合物が次の構造：
- 細胞浸潤または血管形成を阻害する医薬品の調製のための、請求項２２から４０のいずれかに記載の化合物の使用。
- 細胞浸潤または血管形成を阻害する医薬品の調製のための、モツポラミンA、B、C、およびそれらの混合物ならびにそれらの製薬上許容される塩の使用。
- 細胞浸潤または血管形成を阻害するための、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物、または請求項２２から２６のいずれかに記載の化合物の使用。
- 細胞浸潤または血管形成を阻害するための、モツポラミンA、B、C、およびそれらの製薬上許容される塩のうちの1種以上の使用。
- 請求項４３または４４のin vivoでの使用。
- 請求項４３または４４のin vitroでの使用。
- 細胞浸潤を阻害する薬剤の存在を調べる試験方法であって；
(a) 細胞をその細胞が浸潤することのできる生物学的マトリックスの表面上に置き、
(b) 該細胞を、細胞浸潤阻害活性を試験しようとする薬剤で処理し；
(c) 細胞浸潤を阻害する薬剤が存在しない条件では該細胞が該マトリックス中に浸潤するような、十分な時間、該マトリックスの表面上に該細胞を保持し；
(d) (c)の後、該マトリックスの表面から実質的に全ての細胞を除去し；
(e) (d)で除去された細胞を、該細胞が付着し増殖することのできる表面上に移し；
(f) (e)での表面上の細胞を、該表面上で細胞の付着および増殖が起こるために十分な時間、保持し；
(g) (f)の後、該表面に付着した細胞の量を示す値を測定し；ならびに、
(h) (g)で測定した値を、(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、および(g)を細胞浸潤を阻害する薬剤の存在しない条件で該細胞を用いて行って測定した対照の値と比較すること、
を含んでなる方法。 - 該細胞が癌細胞である、請求項４７に記載の方法。
- 該マトリックスが膜またはゲルである、請求項４７または４８に記載の方法。
- 該マトリックスがMatrigel（商標）を含んでなる、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
- 細胞浸潤または血管形成の阻害を、それを必要とする患者に行うための方法であって、その患者の組織中での細胞浸潤または血管形成を阻害するために有効な化合物またはその製薬上許容される塩の量をその患者に投与することを含み、該化合物が式IまたはIIの化合物であり、式Iが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCおよびCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1およびR2は独立して：水素；メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1およびR2のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換される、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
であり、式IIが：
Xは、エポキシド、ケトン、チオカルボニル、オキシム、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された11個から30個の炭素を有する飽和、もしくは不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは部分的に環状化したアルキル鎖であって；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってO、S、NH、およびNRからなる群から選択される部分で置換され；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCおよびCH基は、場合によってNHまたはNRで置換され；
R1、R2、およびR3は独立して：メチル；−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NR2、−NR3＋、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、−COSH、−COSR、−CSOR、−NO2、−OSO3H、−SO3H、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んだ直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖；ならびにベンジルのフェニル環をR、−OH、−OR、−O2CR、−SH、−SR、−SOCR、−NH2、−NHR、−NHR2、−NHCOR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、−CONR2、−COSH、−COSR、−NO2、−SO3H、−SORおよび−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換されたベンジルからなる群から選択されるが；R1、R2、R3のいずれもN1とアミドを形成するアシルまたはチオアシル残基ではなく；
Yはエポキシド、−OH、−OR、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR、−SH、−SR、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2R、−CHO、−COR、−CONH2、−CONHR、NRCOR、−CONR2、NO2、−SOR、および−SO2Rからなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を含んでいる直鎖状、分枝状、もしくは環状の、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり；このアルキル鎖中に存在する１個以上のCH2基は、場合によってOまたはSで置換され；ならびに
Rはエポキシド、−OH、−OR'、＝O、＝S、＝N−OH、−O2CR'、−SH、−SR'、−SOCR'、−OSO3H、−NH2、−NHR'、−NHR'2、−NR'3＋、−NHCOR'、NR'COR'、−I、−Br、−Cl、−F、−CN、−CO2H、−CO2R'、−CHO、−COR'、−CONH2、−CONHR'、−CONR'2、−COSH、−COSR'、−NO2、−SO3H、−SOR'、および−SO2R'からなる群から選択される1個以上の置換基で場合によって置換された1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基であり；ここでR'は場合によってNH2で置換することのできる、1個から10個の炭素を有する、飽和または不飽和の、直鎖状、分枝状、もしくは環状のアルキル基である。］
である、上記方法。 - 該化合物が式Iのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってC1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されたものであるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1およびR2のうちの1つが、水素、メチルおよび直鎖状または分枝状のC2からC6のアルキル基からなる群から選択されるものであり；
(d) もう一方のR1およびR2が直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項５１に記載の方法。 - 該化合物が式IIのものであり：
(a) Yは(CH2)nで、nは1、2または3であり；
(b) Xは11〜15個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖状アルキル鎖で、場合によってRで、C1からC6の直鎖状または分枝状のアルキル基で置換されたものであるか；または、11〜16個の炭素原子を有する完全に不飽和で部分的に環状化された直鎖状アルキル鎖であり；
(c) R1、R2の、およびR3の1つまたは2つが、メチル、または直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基であり；
(d) R1、R2の、およびR3の別の1つが直鎖状もしくは分枝状のC2からC6のアルキル基で、場合によってNH2、−NHR、−NR3＋、および−NHCORからなる群から選択される置換基で置換されたものであり、そのRがC1からC6の直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル基である、
請求項５１に記載の方法。 - 該組成物中の化合物の構造が：
請求項５１に記載の方法。 - 該化合物が、モツポラミンA、B、およびCからなる群から選択されるものである、請求項５１に記載の方法。
- 該化合物が、モツポラミンDである、請求項５１に記載の方法。
- 該化合物が、ジヒドロモツポラミンCである、請求項５１に記載の方法。
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