CN101503727A - 三角帆蚌酶解多肽及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

三角帆蚌酶解多肽及其制备和应用，酶解方法为：将新鲜蚌肉捣碎打浆，加入5－6倍量的水，煮沸，过滤，将沉淀干燥脱脂得蚌肉蛋白粉；蚌肉蛋白粉加6－8重量倍水浸泡11－12小时，超微粉碎均浆，调整pH至8.0－9.0；按蚌肉蛋白粉中的蛋白含量计，加入0.3％－0.6％的碱性蛋白酶，在40－60℃条件下酶解4－6小时；上清夜浓缩干燥后得到三角帆蚌酶解多肽；测定三角帆蚌酶解多肽总蛋白≥80％，其中天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸及精氨酸含量≥50％，分子质量主要集中于6,100Da和26,200Da两个区域。经小鼠淋巴细胞体外培养验证，三角帆蚌酶解多肽可以应用于制备促进T淋巴细胞增殖的药物，以及制备增强免疫力的保健食品。

Description

三角帆蚌酶解多肽及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及医药及保健食品及其制备和应用，具体为三角帆蚌酶解多肽(MPP)及其制备和应用，特别是在增强免疫力功能方面的应用。

背景技术

三角帆蚌(hyriopsis cumingii)，属软体动物门，瓣鳃纲真瓣鳃目，珠蚌科。据《本草纲目》记载：蚌肉味甘、性咸、无毒；耳聪目明，使人肌肤润泽，精力旺盛，不易衰老。蚌肉作为珍珠产业的下脚料，资源十分可观，蛋白质含量占干物质的80％。但是，由于其肉质粗韧，土腥味重难以食用，育珠后的蚌肉被作为废弃物丢弃或烘干用作饲料，不仅经济附加值低，同时还严重污染环境。据报道，由食物蛋白酶解制得的多肽具有降血压、抗肿瘤、免疫调节、抗菌等的生物学活性。多肽是一类结构相对简单的小分子物质，是构成及发挥作用的活性蛋白质的结构片段。从营养角度评价，多肽被人体消化吸收的效率要比同一组成的氨基酸高。此外，多肽的风味一般要优于单个氨基酸，也不易产生过敏。因此，充分运用现代食品生物技术对其进行深度开发利用，开发具有生物学活性的肽类物质，不仅能提高整个珍珠产业的经济价值，而且还能带来丰厚的社会效益。目前，有三个公开专利报道了相关的蚌肉产品。专利公开号CN101066086A公开了一种碱提酸沉提取三角帆蚌蛋白的方法，专利公开号CN101248866A为一种采用新鲜蚌肉为原料，在常温下放置，压滤得蚌肉提取物、蚌肉渣酶解的多肽取得三种物质的方法，此工艺蚌肉多糖提取并不完全，得率偏低，且肉渣常温放置易变质，专利公开号CN1517099A公开一种具有镇痛和抑制肿瘤作用的蚌类提取物制备方法，采用酸、醇、碱或自溶方法获得蚌肉得取物的药物组合物，但所需时间长，防腐难、难溶解，有酸碱排放对环境有污染。

发明内容：

本发明的目的是，提供一种三角帆蚌酶解多肽及其制备方法，并提供其在医药或保健食品中的应用。

本发明的三角帆蚌酶解多肽(MPP)，其来源于酶解的三角帆蚌，所述酶解方法如下：

(1)将新鲜蚌肉捣碎后打成浆状，按质量比加入5-6倍量的水，混合后煮沸15-20分钟，过滤，收集沉淀，将沉淀干燥脱脂得到蚌肉蛋白粉；

(2)将蚌肉蛋白粉加6—8重量倍的水充分浸泡11—12小时，超微粉碎均浆，调整pH至8.0-9.0；

(3)按蚌肉蛋白粉中的蛋白含量计，加入0.3％-0.6％的碱性蛋白酶，在40-60℃条件下酶解4-6小时，85-90℃灭酶15分钟；

(4)将酶解液离心去沉淀，上清夜浓缩干燥后得到三角帆蚌酶解多肽；

(5)测定三角帆蚌酶解多肽总蛋白≥80％，其中天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸及精氨酸含量≥50％，分子质量主要集中于6,100Da和26,200Da两个区域。

本发明所述三角帆蚌酶解多肽可以应用于制备促进T淋巴细胞增殖的药物，以及制备增强免疫力的保健食品。

上述发明方案进一步叙述如下：

原料采用普通三角帆蚌或采珠后的三角帆蚌，取出新鲜的蚌肉，将其捣碎并打成浆状，以1：5-6(质量比)加水混合，煮沸15-20min，趁热过滤，取走上清(大部分为蚌肉多糖)，沉淀经过干燥脱脂后，得到蚌肉蛋白粉，加入适量水充分浸泡12小时左右，超微粉碎均浆，调整pH至8.0-9.0(粉水比控制在1：6-8)，以0.3％-0.6％(用蛋白含量计算)的酶量加入碱性蛋白酶(Alcalase)，在40-60℃反应4-6小时，85-90℃灭酶15分钟，离心，上清夜浓缩干燥后得到三角帆蚌酶解多肽(MPP)。

体外免疫实验结果表明，该多肽不仅能促进T细胞致有丝分裂原刀豆蛋白A(Con A)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应，而且在无致有丝分裂原诱导下，也能显著增强小鼠脾淋巴细胞增殖反应。

试验说明，按本发明方法制备的三角帆蚌酶解多肽(MPP)可以应用于制备增强免疫力的药物或保健食品。

采用蛋白酶水解蚌肉蛋白，经离心干燥等技术制得三角帆蚌酶解多肽(MPP)，在制备增强免疫力的药物或保健食品中应用，国内外均未见其应用报道。三角帆蚌酶解多肽(MPP)，其总蛋白≥80％，其中蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸等必需氨基酸占30％以上，同时，富含了呈味氨基酸，包括呈鲜味的天冬氨酸和谷氨酸以及与甜味有关的脯氨酸等，由SDS电泳测定得知，酶解所得多肽分子量范围为6—20kD左右。本发明所述的制备增强免疫力的药物或保健食品剂型，可以为口服液型，粉剂型，片剂型或胶囊型。

发明的优点和应用前景：

本发明的蛋白原料可以采用新鲜采珠后的蚌肉采用沸水煮提取多糖以后，渣干燥脱脂而成的蚌肉蛋白粉，蛋白质含量高，易保存，便于工业化生产。

本发明制备三角帆蚌酶解多肽(MPP)的工艺稳定，得率高，可用作工业化生产，三角帆蚌酶解多肽(MPP)增强免疫力的验证为免疫力低下患者提供了一种新的预防和治疗途径，且这种药食同源的设计思路符合现代医药及保健食品工业发展的趋势，将具有广阔的市场前景和较大的社会和经济效益。

附图说明：

图1为SDS-PAGE多肽电泳图(a-样品；b-多肽分子质量标准)。

图2为蛋白质相对分子质量对数与蛋白质相对迁移率关系图。

图3为无刺激原存在时多肽对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响，其中^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

图4为多肽对在ConA刺激原诱导的小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响，其中^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

具体实施方式：

实施例一：

河蚌酶解多肽(MPP)的制备方法

采珠后的三角帆蚌取出新鲜的蚌肉，将其捣碎并打成浆状，以1：5-6(质量比)加水混合，煮沸15-20min，趁热过滤，取走上清(大部分为蚌肉多糖)，沉淀经过干燥脱脂后，得到蚌肉蛋白粉，加入适量水充分浸泡12小时左右，超微粉碎均浆，调整pH至8.0-9.0(粉水比控制在1：6-8)，以0.3％-0.6％(用蛋白含量计算)的酶量加入碱性蛋白酶(Alcalase)，在40-60℃反应4-6小时，85-90℃灭酶15分钟，离心，上清夜浓缩干燥后得到三角帆蚌酶解多肽(MPP)。

三角帆蚌酶解多肽(MPP)，其总蛋白≥80％，其中蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸等必需氨基酸占30％以上，同时，富含了呈味氨基酸，包括呈鲜味的天冬氨酸和谷氨酸以及与甜味有关的脯氨酸等，其中，谷氨酸含量最高，占氨基酸总量的17.22％。见表1。

表1 河蚌酶解多肽的氨基酸组成

注：带*者为必需氨基酸(EAA)

三角帆蚌酶解多肽(MPP)的分子质量集中在两个区域，多肽分子质量标准品的线性回归如图2所示，回归方程为y＝-1.27x+5.03，相关系数R²＝0.98。通过计算，河蚌多肽的分子质量集中在两个区域，即分子质量为26,200Da和6,100Da附近。见附图1和附图2。

实施例二：

实施例一所得的三角帆蚌酶解多肽(以下简称多肽)的体外免疫活性的测定

1、体外免疫实验原理

刀豆蛋白A(ConA)为有丝分裂原，可以刺激T淋巴细胞内新的DNA合成及细胞分化从而引起细胞增殖。实验采用噻唑盐比色法(MTT法)检测淋巴细胞的转化功能。MTT比色是检测细胞存活和生长的方法，活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成蓝紫色结晶物，线粒体膜损伤时MTT的被还原量明显减少，而死细胞则无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶标仪在一定波长处测定其光吸收值，可直接反映细胞的代谢活性，间接反映活细胞数量。它的特点是灵敏度高、重复性好、操作简便。

2、小鼠淋巴细胞悬液的制备

于处死的小鼠中无菌取脾，磨碎过滤至离心管中用Hank’s液洗涤，1500rpm离心5min。弃上清，加Hank’s液至7mL混匀再离心，重复2次。细胞以适量的1640完全培养液混悬，加入0.25％的胰酶1mL，37℃培养箱中放置2-3min，再加新生小牛血清8mL，打匀混悬液。于显微镜下计数：每毫升混悬液中所含的淋巴细胞数＝四大方格总数×10⁵。最后稀释成1×10⁷个/mL。

3、淋巴细胞的转化

于96孔微量板中，每孔加100μL脾细胞悬液(1×10⁷/mL)和50μL多肽稀释液(终浓度分别为0.01、0.1、1.0、10、100、1000μg/mL)，每个浓度重复8孔，设置2个组，一组为加ConA(终浓度为2.5μg/mL)的实验组，另一组为加1640培养液的正常对照组，每组4个重复，最后使其终体积为200μL。另外，设置空白对照组(不含待测样品)。然后在37℃、5％CO₂条件下培养44h后，各孔加入50μLMTT溶液(2mg/mL)，继续培养4h。1000rpm离心5min，弃去各孔上清，分别加入150μL酸性DMSO溶液，振荡，于室温暗处放置15min，以酶标仪于波长578nm测定OD值。

多肽对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响如附图3、附图4和表2所示，其中^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。实验结果显示，当无样品存在时，正常对照组(无刺激原)的OD值为0.122，实验组(有刺激原ConA)的OD值为0.562。加入多肽样品后正常对照组的细胞增殖作用有所增加，当多肽浓度为10、100μg/mL时细胞的增殖显著水平P<0.05。在ConA刺激下淋巴细胞增殖实验中，随着样品浓度的增加T淋巴细胞增殖作用增强，当多肽浓度为0.1μg/mL时，T淋巴细胞的增殖显著水平P<0.05，当多肽浓度为1-1000μg/mL时，T淋巴细胞的增殖显著水平P<0.001。三角帆蚌酶解多肽(MPP)不仅能促进有丝分裂原Con A诱导的小鼠T脾淋巴细胞增殖反应，而且在无刺激原诱导下，也能显著增强小鼠脾淋巴细胞增殖反应。

表2 多肽对小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应的影响(x±s，n＝4)

试验说明，按本发明方法制备的三角帆蚌酶解多肽(MPP)可以应用于制备促进T淋巴细胞增殖的药物，或制备增强免疫力的保健食品。

Claims (2)

1、三角帆蚌酶解多肽，其特征在于：其来源于酶解的三角帆蚌，按如下制备方法所得：

(1)将新鲜三角帆蚌肉捣碎后打成浆状，按质量比加入5-6倍量的水，混合后煮沸15-20分钟，过滤，收集沉淀，将沉淀干燥脱脂得到蚌肉蛋白粉；

(2)将蚌肉蛋白粉加6—8重量倍的水充分浸泡11—12小时，超微粉碎均浆，调整pH至8.0-9.0；

(3)按蚌肉蛋白粉中的蛋白含量计，加入0.3％-0.6％的碱性蛋白酶，在40-60℃条件下酶解4-6小时，85-90℃灭酶15分钟；

(4)将酶解液离心去沉淀，上清夜浓缩干燥后得到三角帆蚌酶解多肽；

(5)测定三角帆蚌酶解多肽总蛋白≥80％，其中天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸及精氨酸含量≥50％，分子质量主要集中于6,100Da和26,200Da两个区域。

2、如权利要求1所述三角帆蚌酶解多肽应用于制备促进T淋巴细胞增殖的药物，以及制备增强免疫力的保健食品。

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