KR20150097891A - 백강잠 생성에 유용한 보베리아 바시아나 jn19m2w1 및 jn15r2w1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 누에에 접종되어 백강잠을 유도할 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주, 상기 백강잠으로부터의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용, 항산화용 및 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주에 의해 형성되는 백강잠으로부터 추출되는 추출물은 뛰어난 항산화 및 항균 효과를 가지며, 동시에 항암 효과도 갖는다. 본 발명의 균주는 항균, 항산화 및 항균 기능성 소재로 사용될 수 있는 백강잠을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

백강잠 생성에 유용한 보베리아 바시아나 JN19M2W1 및 JN15R2W1 균주 및 이의 용도{Beauveria bassiana JN19M2W1 and JN15R2W1 Useful for Producing Bombysis corpus and Use Thereof}
본 발명은 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 나타내는 백강잠을 형성시킬 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주, 상기 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용, 항산화용 또는 항암용 조성물에 관한 것이다.
누에(Bombyx mori) 유충에 굳음병을 일으키는 백강균 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana)는 적당한 온도와 습도조건하에서 누에 충체에 균사체를 형성하고 강직현상을 나타내어 결국에는 죽게 하는데 이 죽은 누에를 백강잠(Bombycis corpus)이라고 한다. 이러한 백강잠은 예로부터 한약재로써 널리 이용되어 왔으며, 국내에서는 메뚜기, 누에번데기와 함께 식품원료로 등록된 3가지 곤충자원 중의 하나이다.
백강잠의 기본 재료가 되는 누에는 그 자체로 이미 한방 재료로써 당뇨병 치료, 허약체질 개선, 뇌질환, 항염증작용, 동맥경화 등 매우 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특성을 이용하여 최근에는 당뇨병 개선제가 건강보조식품 그리고 또 다른 곰팡이균인 동충하초(冬蟲夏草)를 이용한 다양한 제품이 개발되어 있다. 백강균에 의한 백강잠은 다양한 생리활성을 가진 누에의 기능에 더하여 일반적으로 널리 알려져 있는 동충하초와 유사한 백강균의 감염에 의해 새로운 물질들이 더욱 생성됨으로써 다양한 생리활성을 보이는 것으로 알려져 있다.
백강잠의 효능에 대해서는 신농본초경(神農本草經)을 비롯한 다양한 고서에 기록되어 있어, 동양의학에서는 순환계와 관련된 중풍(中風)을 비롯한 각종 풍사(風邪)를 다스리며 경련을 진정시키고, 결핵, 부인병, 소아병, 기미제거 및 종기치료 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 기록되어 있다. 백강잠의 약리효과에 대한 최근의 연구결과로는 항경련작용, 항균작용, 항암작용, 수면촉진작용, 미백작용, 부신피질자극작용 및 당뇨병 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 백강잠의 효능으로 인하여 백강잠은 한약재로써 뿐만 아니라 다양한 건강보조식품과 화장품의 원료로써 현재에도 널리 이용되고 있다.
누에 유충이 백강잠으로 되게 하는 원인균인 백강균은 곤충병원성 곰팡이(Entomopathogenic fungi)의 일종으로, 백강균인 Beauveria 속(genus)을 포함하여 Metarhizium 속, Isaria 속, Nomuraea 속, 및 Paecilomyces 속 등 매우 다양한 곤충병원성 곰팡이가 보고되어 있고, 고전적으로 해충방제를 위한 미생물 살충제로써 농업에서 이용되어 왔으며, 최근에는 이들 곤충병원성 곰팡이에 의한 항균, 항산화 및 항암 등 여러 가지 생리활성물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
백강균을 비롯하여 여러 가지 곤충병원성 곰팡이들은 같은 속(genus) 및 같은 종(species)에 속하는 것들이라도 분리된 곰팡이마다 살충활성을 비롯하여 서로 다른 생물학적 특성을 지니고 있어 이용 목적에 따라 최적의 곰팡이 균주 분리 및 선택이 매우 중요한 것으로 알려져 있다.
백강잠의 생산에 이용될 수 있는 백강균 보베리아 바시아나의 경우, 현재까지 약 500여 종 이상이 보고되고 있으며, 곰팡이의 형태 및 흰색포자 생산 그리고 유사한 유전자 정보로 인해 같은 곰팡이로 분류되고 있으나 살충성을 비롯하여 증식양상 그리고 생산되는 물질들의 종류 등 생물학적인 특성에 있어서는 각 균주가 개별적인 특징을 지니고 있다. 따라서 백강균들의 다양성으로 인해 누에에 대한 살충활성을 포함하여 그를 통해 생성되는 백강잠과 활성물질의 종류 또한 매우 다양한 특징을 보일 것으로 여겨지고 있다.
백강잠의 약리효과는 기본적으로 누에 유충의 약리효과와 더불어 원인균인 백강균에 의한 약리효과 2가지로 크게 압축할 수 있고, 그 중 백강균은 미생물이라는 점에서 그 다양성이 누에에 비해 더욱 크며 그에 따라 어떤 백강균이 이용되는가에 따라 생성되는 백강잠의 종류나 효능 역시 크게 영향을 받을 것으로 여겨지고 있다. 그러나 현재까지 백강균의 종류에 따라 생성되는 백강잠의 다양성을 비롯하여 효능평가는 이루어지지 못하고 있으므로 백강균의 종류에 따라 생성되는 백강잠의 다양성 및 효능 평가가 필요한 실정이다. 다양한 산업적 목적으로 이용되는 백강잠의 효능을 목적에 맞게 극대화시키기 위해서는, 이용 목적에 따라 그에 맞는 생리활성 물질을 대량으로 생산할 수 있는 백강균의 선택에 대한 필요성이 매우 높을 것으로 여겨지고 있으나 현재까지 그러한 보고나 연구가 거의 이루어지지 못하고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제2008-0098940호 대한민국 등록특허 제10-0487112호 대한민국 등록특허 제10-0583030호
한국잠사학회지 45(1), 25-30(2003) 한국잠사학회지 47(1), 5-11(2005)
본 발명자들은 항균, 항산화 및 항암 활성을 나타내는 백강잠 추출물을 만들 수 있는 백강균을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 백강균 중의 하나인 보베리아 바시아나 균주를 누에에 접종시켜 백강잠을 형성시키고 형성된 백강잠으로부터의 추출물이 매우 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 나타낸다는 것을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 누에에 접종되어 백강잠을 유도할 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주로서, 상기 백강잠의 추출물이 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 나타내는 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주를 제공하는데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항균, 항산화 및 항암 활성을 갖는 백강잠 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 누에에 접종되어 백강잠을 유도할 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주로서, 상기 백강잠의 추출물은 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "백강잠(Bombysis corpus)"와 관련하여, 누에의 피부에 백강균을 접종한 후에 적당한 온도와 습도 조건하에서 일정기간 사육하면 누에 몸에서 균사체가 형성되며 강직현상을 보이며 죽게 되는데, 이 죽은 누에를 백강잠이라고 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "백강균"은 상기 누에에 감염하여 백강잠을 유도할 수 있는 균을 의미하며 대표적으로 보베리아(Beauveria)속(genus) 균이 포함된다.
본 발명에서 분리한 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주와 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주는 누에에 접종되었을 때 백강잠을 유도할 수 있으며, 형성된 백강잠으로부터의 추출물이 항균, 항산화 및 항암 활성이 매우 우수함을 확인하였고, 이 균주들을 2014년 1월 14일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 상기 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주는 수탁번호 "KACC93192P"으로, 상기 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주는 수탁번호 "KACC93191P으로 각각 기탁하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주와 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주에 의해 접종되어 형성된 백강잠의 추출물은 뛰어난 항균활성, 항산화 활성 및 항암 활성을 나타낸다.
본 발명에서 백강잠 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출방법에 의해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 추출용매와 접촉시키는 공정을 통해 제조된다. 추출 단계 전에 상기 백강잠은 건조 및/또는 분쇄될 수 있다.
본 발명에서 백강잠 추출물을 얻기 위해 사용할 수 있는 추출용매는 천연물 추출 공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매이며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 혼합하여 사용하거나 순차적으로 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출용매는 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH2Cl2), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출용매에 의해 얻은 추출물 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여 얻은 추출물도 실질적으로 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.
추출공정은 추출용매를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 통해 완성되며, 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다.
본 발명의 백강잠 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 분말상태로 제조된 추출물은 용매 또는 혼합용매에 재분산시켜 사용된다. 상기 추출물이 용해되거나 분산되는 용매 또는 혼합용매는 상기 추출에 사용된 것과 동일하거나 또는 상이한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 항균용, 항산화용, 또는 항암용 조성물은 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물 형태로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분인 백강잠 추출물 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제 (타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 백강잠 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 상기 항균용, 항산화용 또는 항암용의 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 본 발명 항암용 조성물의 치료 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 항균, 항산화 및 항암 활성을 갖는 백강잠 추출물의 제조 방법을 제공한다: (a) 누에에 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)를 접종시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 제조한 보베리아 바시아나 균주가 접종된 누에를 백강잠으로 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 백강잠으로부터 추출물을 얻는 단계.
본 발명은 누에에 접종되어 백강잠을 유도할 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주로서, 상기 백강잠의 추출물이 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 나타내는 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주, 상기 균주에 의해 형성된 백강잠으로부터의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용, 항산화용 및 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 보베리아 바시아나(B. bassiana) 균주에 의해 형성되는 백강잠으로부터 추출되는 추출물은 뛰어난 항산화 및 항균 효과를 가지며, 동시에 항암 효과도 갖는다. 본 발명의 균주는 항균, 항산화 및 항균 기능성 소재로 사용될 수 있는 백강잠을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주가 만들어낸 백강잠(Bombycis corpus) 추출물들의 항세균활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주가 만들어낸 백강잠(Bombycis corpus) 추출물들의 항산화활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주가 만들어낸 백강잠(Bombycis corpus) 추출물들의 항암활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 곰팡이 동정 및 유연관계 추정을 위한 ITS 영역 증폭 PCR 프라이머(ITS1-ITS4 프라이머쌍)를 사용하여 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) JN19M2W1과 JN15R2W1 균주의 gDNA를 증폭시킨 산물의 염기서열을 결정하고 상동성을 비교한 것이다.
도 5는 곰팡이 동정 및 유연관계 추정을 위한 ITS영역 증폭 PCR 프라이머(ITS1-ITS4 프라이머쌍)를 사용하여 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) JN19M2W1 균주의 gDNA를 증폭시킨 산물의 염기서열을 Blast program을 이용하여 Genbank database에 등록되어 있는 기존의 다른 곰팡이 염기서열 정보와의 상동성을 검색해 본 결과의 도표이다.
도 6은 곰팡이 동정 및 유연관계 추정을 위한 ITS영역 증폭 PCR 프라이머(ITS1-ITS4 프라이머쌍)를 사용하여 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) JN15R2W1 균주의 gDNA를 증폭시킨 산물의 염기서열을 Blast program을 이용하여 Genbank database에 등록되어 있는 기존의 다른 곰팡이 염기서열 정보와의 상동성을 검색해 본 결과의 도표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 백강감( Bombycis corpus )의 생산
확보된 백강균 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana)의 증식과 누에 사육을 통해 일반적인 곰팡이 접종법에 따라 백강균을 접종하여 다양한 종류의 백강잠(Bombycis corpus)을 생산하였다.
백강균 생산을 위하여 확보된 백강균 JB6G3W1, JN19M2W1, JN13S5W1, JN13S3W1, JN15R2W1, JN5R1W1, JN15T2W1, KB17S1W1, KB9R2W1, JB9S1W1 10개 균주를 포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar) 평판 고체 배지에 접종하고 2주간 25℃에서 배양하였다. 2주간 자란 백강균은 균총의 가장자리를 6 mm로 자른 뒤, 20 ml의 포테이토 덱스트로스 브로스(Potato dextrose broth) 액체 배지가 들어있는 100 ml 플라스크(flask)에 접종하고 25℃, 150 rpm으로 3일간 배양 후 백강잠 생산에 이용하였다.
백강잠 생산을 위한 누에는 대성잠 품종의 누에를 인공사료를 이용하여 25℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 70％ 조건으로 사육하여 실험에 이용하였다. 백강잠의 생산을 위하여 액체 배양된 백강균 접종액을 5령 1일째의 누에 한 마리당 100 ㎕씩 접종하였고, 백강균이 접종된 누에는 곤충사육통에 넣어 25℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 70％ 조건에 유지시키며 백강잠 생산을 유도하였다. 모든 백강균이 접종된 누에는 접종 4일 만에 살충활성을 보였다. 생산된 백강잠은 물질 추출을 하기 전까지 -70℃에 보관하며 후속 물질 추출 실험에 이용하였다.
실시예 2: 백강잠으로부터 물질의 추출
백강잠으로부터 추출될 수 있는 물질들의 종류는 물질 추출 전 백강잠의 전처리 방법(건조 후 이용, 열처리 후 이용 등)과 추출 용매들의 종류(증류수과 에탄올(Ethanol)을 비롯한 다양한 유기용매) 및 추출방법(상온 추출, 열처리 추출 등)에 따라 다양할 수 있으나, 본 발명에서는 가장 일반적인 방법에 따라 전처리 및 추출 실험을 수행하였다.
백강균의 감염에 의해 형성된 백강잠으로부터 생리활성 물질을 추출하기 위한 전처리 과정으로, 백강잠을 -70℃에 급랭시킨 후 동결 건조하였다. 건조된 백강잠은 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄한 다음 두 가지 방법을 이용하여 추출물을 얻었다.
(i) 분쇄된 백강잠이 10％(무게/부피)되게 증류수를 가하고 3시간 동안 70℃에 진탕 처리한 후, 2,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 필터 페이터(Filter paper; ADVANTEC, No. 2)로 필터링(Filtering)하였다. 얻어진 추출물의 pH는 NaOH와 HCl를 추출물 총 부피의 1％ 내외로 되도록 첨가하여 pH가 7.4가 되도록 조절하였고, 0.45 ㎛ 필터(ADVANTEC, DISMIC-25cs)을 이용하여 필터링 후 항세균, 항산화, 항암활성 평가에 이용하였다.
(ⅱ) 분쇄된 백강잠이 10％(무게/부피)되게 70％ 에탄올(Ethanol)을 가한 후 24시간 동안 25℃, 150 rpm에 처리한 후, 2,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 필터 페이터(Filter paper; ADVANTEC, No. 2)로 필터링 하였다. 얻어진 추출물은 부피를 측정한 후, -70℃에 급랭 시킨 후 동결 건조과정을 거처 건조분말시료를 얻었으며, 이를 다시 동결 건조 전 부피의 증류수를 첨가하여 건조분말시료를 녹였다. 얻어진 추출물의 pH는 NaOH와 HCl를 추출물 총 부피의 1％ 내외로 되도록 첨가하여 pH가 7.4가 되도록 조절하였고, 0.45 ㎛ 필터(ADVANTEC, DISMIC-25cs)을 이용하여 필터링 후 항세균, 항산화, 항암활성 평가에 이용하였다.
한편, 대조구로 사용될 백강균이 접종되지 않은 일반 누에도 동일한 방법을 사용하여 활성물질을 추출하였다.
실시예 3: 백강잠 추출물의 항세균활성
백강잠 추출물의 항세균활성은 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) race-3을 이용하여 평가하였다. 랄스토니아 솔라나세아룸(R. solanacearum)을 비지(BG, 1 g casamino acid, 1 g yeast extract, 10 g peptone in 1000 ml distilled water, pH 7.4) 배지에 배양하면서 650 nm에서 흡광도를 측정하여 균수를 미생물 배지에 약 5 X 105 CFU/ml이 되도록 조절한 후, 96 웰 플레이트(SPL Co. Korea)에 100 ㎕ 접종하였다. 그 후, 백강잠 추출물 100 ㎕를 접종하고 25℃에서 16시간 배양 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 100 ㎕의 1X PBS(Dulbecco's PBS, pH = 7.4)와 백강균이 접종되지 않은 일반 누에 추출물을 사용하였다.
도 1은 백강잠 종류 및 추출 방법에 따른 항세균 활성을 나타낸 도면으로써, 백강잠 증류수 추출물들은 일반 누에 증류수 추출물과 비교하였을 시, 항세균활성이 거의 없거나 미미하게 나타났다. 그러나 백강잠 70％ 에탄올 추출물들은, 백강균 KB9R2W1이 만들어낸 백강잠 추출물을 제외하고, 일반 누에 70％ 에탄올 추출물 또는 활성성분이 없는 PBS 처리구 보다 항세균 활성이 모두 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 백강감 추출물의 항산화활성
백강잠 추출물의 항산화활성 측정은 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; Sigma, USA)의 환원성을 이용하여 그 발색 정도를 96 웰 플레이트를 이용하여 측정하였다. 99.9％ 에탄올에 0.2 mM 농도로 용해시킨 DPPH 용액 1 ㎖에 백강잠 추출물을 50 ㎕ 첨가하여 30분간 실온에서 반응시킨 후, 520 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 항산화력은 1.5 mM 트롤록스(Trolox) ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid; Sigma, USA)를 이용하여 표준곡선을 만들고 그 추세선 식에 의해 추출물의 항산화 효과를 나타내었다. 대조구는 백강균이 접종되지 않은 일반 누에 추출물을 사용하였다.
도 2는 백강잠 종류 및 추출 방법에 따른 항산화 활성을 나타낸 도면으로써, 모든 백강잠 추출물들은 백강균 KB9R2W1이 만들어낸 백강잠 증류수 추출물을 제외하고 대조구인 일반 누에 추출물보다 모두 높은 항산화활성을 나타냈고, 같은 백강균에 의해 만들어진 백강잠이라도 70％ 에탄올 추출물들은 증류수 추출물들 보다 높은 항산화활성을 나타냈다. 특히 백강균 JN19M2W1과 JN15R2W1이 만들어낸 백강잠 70％ 에탄올 추출물들은 비타민 E 유사체 트롤록스(Trolox) 0.6 mg/ml에 견줄만한 항산화효과를 나타냈다.
실시예 5: 백강감 추출물의 항암활성
백강잠 추출물의 결장암세포주 HCT116에 대한 항암활성 검정은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium bromide) 평가를 이용하였다. 배양된 암세포를 96 웰 플레이트에 180 ㎕ (1 X 104 세포/웰)를 분주하였고, 24시간 동안 배양하면서 세포를 부착시켰다. 그 후, 백강잠 추출물 20 ㎕를 접종하여 24시간 처리하고, 20 ㎕의 MTT (5 mg/ml)를 4시간 처리하였다. 4시간 후, 상등액을 완전히 제거하였고, 각각의 웰에 200 ㎕의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣어 MTT 포르마잔(formazan)을 용해한 후, 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 평가는 1X PBS(Dulbecco's PBS, pH 7.4)를 처리한 대조구의 파장값 대비 퍼센트(％)를 구하여 세포의 생존률을 구하였다.
도 3은 백강잠 종류 및 추출 방법에 따른 결장암세포주(HCT116)에 대한 항암활성을 나타낸 도면으로써, 누에를 포함한 모든 백강잠 증류수 추출물들은 대조구인 PBS 처리구와 비교하였을 시, 항암활성이 없는 것으로 확인되었다. 그러나 누에를 포함한 모든 백강잠 70％ 에탄올 추출물들은 대조구인 PBS 처리구와 비교하였을 시, 암세포의 생존률이 약 20％-85％로 다양하게 나타났고, 특히 백강균 JN19M2W1, JN15R2W1, KB17S1W1이 만들어내는 백강잠 70％ 에탄올 추출물들은 암세포의 생존률이 40％ 이하로 관찰됨에 따라 가장 높은 항암활성을 보였다.
이상의 결과에 의해 항세균, 항산화, 항암활성이 모두 높았던 백강잠 70％ 에탄올 추출물을 만들 수 있는 백강균 JN19M2W1(수탁번호: KACC93192P), JN15R2W1(수탁번호: KACC 93191P)를 선별하여 2014년 1월 24일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다.
실시예 6: 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주의 염기서열 분석 및 상동성 비교
항세균, 항산화, 항암활성이 뛰어난 백강감을 만들어 내는 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 두 균주의 분자생물학적 특성을 알아보기 위하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction) 기법 및 18S와 28S 리보솜의 사이의 ITS(Interanl Transcribed Spacer)(5.8S를 포함하고 있음) 영역 염기서열 분석기법을 사용하였다. 리보솜 DNA영역 18S와 28S 사이의 ITS (Internal Transcribed Spacer)(5.8S를 포함하고 있음) 부위를 증폭 시키는 PCR 프라미어쌍(ITS1-ITS4)(White et al., 1990)을 아래 표1과 같은 서열로 제작하였다.
프라이머 명칭 프라이머 위치 프라이머 염기서열
ITS1 forward primer 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(서열번호 1)
ITS4 backward primer 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(서열번호 2)
이어서, 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하였다. 포테이토 덱스트로스 브로스(Potato dextrose broth) 액체 배지가 1 ㎖ 들어있는 1.5 ㎖ microcentrifuge tube에 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주를 접종하여 25℃, 150 rpm의 조건하에서 3일 동안 배양한 후, 16,000 x g에서 10분간 원심분리하여 균체만 회수하였다. 균체에 400 ㎕의 DNA 추출 완충액(0.2 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 8.0), 1％ w/v SDS)과 400 ㎕의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1)을 넣고, 5분간 강하게 혼합 후 9,800 x g에서 8분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 1 ㎕의 RNase (20 mg/㎖, Sigma)를 넣고, 37℃에서 30분 반응시킨 후 상등액과 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1)을 위와 같은 조건으로 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액의 2.5배 양의 100％ 냉 에탄올을 넣고 가볍게 뒤섞은 뒤, 4℃에서 16,000 x g, 10분 동안 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 얻어진 DNA 침전물을 70％ 에탄올로 세척, 건조 후 멸균수 50 ㎕에 녹였다. 상기 제작한 PCR 프라이머를 사용하여 추출한 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주의 gDNA에 대해 PCR premix 키트(바이오니아. 대전)를 이용하여 증폭시켰다. 이때, PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후, 53℃에서 30초간 어닐링 반응과 72℃에서 1분간의 중합반응을 1사이클로 35회 반복하여 실시하였다. 생성된 PCR 산물은 1.0％ 아가로스 젤로 전기영동하여 약 500 bp의 밴드를 확인한 후 젤 추출 키드(Gel extraction Kit)로 정제하였다. 정제된 DNA는 자동화 DNA 서열분석기(솔젠트, 대전)로 서열을 분석하였다. 분석된 서열은 DNA맨(Lynnon BioSoft, Quebec, 캐나다)를 통해 정돈하였다. 본 발명의 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 두 균주 상동성 비교 결과, 99％의 상동성을 나타냄을 알 수 있었다.
도 4는 보베리아 바시아나 JN19M2W1와 JN15R2W1 두 균주에 대해 ITS1-ITS4 프라이머쌍으로 사용하여 증폭시킨 PCR 산물의 염기서열을 비교한 것을 보여주는 도면이다. 본 발명의 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 두 균주의 상동성은 99%이상으로 매우 높은 것을 알 수 있다.
실시예 7: 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주의 염기서열 분석에 의한 다른 곰팡이들과의 유연관계 분석
실시예 7에서 얻어진 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 두 균주의 염기서열을 이용하여 GenBank database ( 등록된 정보를 대상으로 Blast program에 의해 다른 곰팡이들과의 유연관계를 검색하였다. 검색결과, 본 발명의 보베리아 바시아나 JN19M2W1과 JN15R2W1 균주는 다른 여러 보베리아 바시아나 균주와 100％ 상동성을 보이는 것으로 확인되었다.
도 5는 보베리아 바시아나 JN19M2W1 균주에 대해 ITS1-ITS4 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물의 염기서열을 GenBank database ( 등록된 정보를 대상으로 Blast program으로 검색한 결과 다른 보베리아 바시아나 균주들과 100％ 상동성이 있음을 보여주는 도표이다.
도 6은 보베리아 바시아나 JN15R2W1 균주에 대해 ITS1-ITS4 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물의 염기서열을 GenBank database ( 등록된 정보를 대상으로 Blast program으로 검색한 결과 다른 보베리아 바시아나 균주들과 100% 상동성이 있음을 보여주는 도표이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC93192 20140114 농업생명공학연구원 KACC93191 20140114
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Claims (7)

  1. 누에에 접종되어 백강잠을 유도할 수 있는 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주로서, 상기 백강잠의 추출물은 우수한 항균, 항산화 및 항암 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P).
  2. 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
  3. 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
  4. 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)가 누에에 접종되어 형성된 백강잠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백강잠 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH2Cl2), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 항암의 대상암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 다음의 단계를 포함하는 항균, 항산화 및 항암 활성을 갖는 백강잠 추출물의 제조 방법:
    (a) 누에에 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN19M2W1 균주 (KACC93192P) 또는 보베리아 바시아나(B. bassiana) JN15R2W1 균주 (KACC93191P)를 접종시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조한 보베리아 바시아나 균주가 접종된 누에를 백강잠으로 형성시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 백강잠으로부터 추출물을 얻는 단계.
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