DE60103995T2

DE60103995T2 - Perzychinin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als pharmazeutisches produkt

Info

Publication number: DE60103995T2
Application number: DE60103995T
Authority: DE
Inventors: Cordula Hopmann; Michael Kurz; Guenter Mueller; Luigi Toti
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-24
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2021-03-25
Also published as: CN1418203A; NO20024772D0; RU2266290C2; ATE269855T1; EP1274698A1; AU5621901A; BR0109854A; CN1199959C; DE60103995D1; PT1274698E; NZ521782A; WO2001077094A1; IL152073A; AU2006203704B8; US20020039768A1; KR100791798B1; SI1274698T1; AU2006203704A1; RU2002129890A; AU2006203704B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung mit der Bezeichnung Percyquinnin, welche durch Kultivierung des Basidiomyceten Stereum complicatum, ST 001837 (DSM 13303) erhältlich ist, und auf deren pharmazeutisch annehmbare Salze und Derivate. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung von Percyquinnin, auf den Pilz ST 001837 (DSM 13303), auf die Verwendung von Percyquinnin und dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzen als Arzneimittel, insbesondere auf deren Verwendung als Lipaseinhibitoren, und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Percyquinnin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Derivat hievon umfassen.
Der Lipidstoffwechsel hält normalerweise ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen der Synthese und dem Abbau. Wenn das Gleichgewicht gestört ist, kann Hyperlipidämie auftreten, welche ihrerseits Artherosklerose, Bluthochdruck, Diabetes etc. hervorrufen kann. Von Modulatoren des Lipidstoffwechsels wird erwartet, daß sie bei der Regulierung dieser Störungen nützlich sind. Es wird angenommen, daß die Inhibierung der Lipolyse bei nicht-Insulin-abhängigem Diabetes Mellitus (NIDDM) Hyperglycämie verringert. Der Anfangsschritt in der Verwendung von Fett als Energiequelle besteht in der Hydrolyse von Triacylglycerin durch Lipasen, z.B: hormonempfindliche Lipase und Monoacylglycerin-Lipase. Die Hydrolyse von Triacylglycerinen führt zu erhöhten Mengen an Glycerin und Fettsäuren im Blut. Von den Lipaseinhibitoren wird erwartet, daß sie sowohl die Plasmafettsäuremengen als auch die Hyperglycämie bei verringerten Nebenwirkungen reduzieren.
Fettleibigkeit und Hypercholesterinämie sind in einem relevanten Ausmaß an die hohe Aufnahme von Nahrungsfetten gebunden. Das Schlüsselenzym für die diätetische Triglyceridabsorption ist die Pankreaslipase. Die Inhibierung der Pankreaslipase kann daher zu einer Inhibierung der Fettabsorption führen.
Es wurde nun festgestellt, daß eine neue Verbindung mit der Bezeichnung Percyquinnin die Lipolyse inhibiert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf Percyquinnin, eine Verbindung der Formel:
und auf deren pharmazeutisch annehmbare Salze, einschließlich aller stereoisomeren Formen und aller tautomeren Formen.
Percyquinnin besitzt die Summenformel C₁₂H₁₆O₃ (208 Da) und kann durch irgendeine oder mehrere seiner physiko-chemischen und spektralen Eigenschaften, welche nachstehend angegeben sind, wie seine ¹H NMR-spektroskopischen Daten und seine ¹³C-NMRspektroskopischen Daten, welche in der Tabelle 1 und 2 angegeben sind, gekennzeichnet werden.
Percyquinnin kann als neues β-Lacton mit einem annelierten fünfgliedrigen Ring beschrieben werden, welcher einen Hydroxymethylrest und 2,3-Isopentenyl-Seitenkette in der α-Position des Lactons aufweist. Percyquinnin besitzt eine bislang nicht beschriebene neue Struktur. Eine Literaturrecherche in den Chemical Abstracts zeigte, daß Percyquinnin eine neue Verbindung ist. Keine andere Verbindung besaß die Strukturmerkmale von Percyquinnin.
Percyquinnin ist durch Kultivierung eines Mikroorganismus erhältlich, welcher als Kultur Nummer ST 001837 bezeichnet wird (nachstehend als ST 001837 bezeichnet). Dieser Pilz, welcher für die Herstellung von Percyquinnin verwendet wurde, wurde in Percy Quinn, Mississippi State Park in Pike County, USA, gesammelt. Der Pilz ST 001837 zählt zur Ordnung der Basidiomyceten-Spezies Stereum complicatum und wurde am 11. Februar 2000 bei der German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Germany, hinterlegt und hat die Zugangsnummer DSM Nr. 13303 erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ferner ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung mit der Bezeichnung Percyquinnin aus Basidiomyceten-Spezies ST 001837, dessen Mutanten und Varianten, unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches eine oder mehrere Kohlenstoffquellen und eine oder mehrere Stickstoffquellen enthält, und wahlweise nährende anorganische Salze und/oder Spurenelemente, gefolgt von der Isolierung der genannten Verbindung und der Reinigung in üblicher Weise bereit.
Das Nährmedium enthält vorzugsweise Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und nährenden anorganischen Salzen. Die Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, Glucose, Saccharose, Dextrin, Fructose, Molassen, Glycerin, Lactose oder Galactose, vorzugsweise Glucose. Die Stickstoffquellen sind beispielsweise Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Hefeextrakt, Rindfleischextrakt, Pepton, Malzextrakt, Maiseinweichlauge, Gelatine oder Casamionsäuren, vorzugsweise Malzextrakt und Hefeextrakt. Die nährenden anorganischen Salze sind beispielsweise Natriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Ammoniumhydrogen-phosphat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Kaliumnitrat, Ammoniumsulfat oder Magnesiumsulfat, vorzugsweise Ammoniumhydrogenphosphat.
Die Kultivierung von ST 00183.7 kann bei Temperaturen von 20 bis 35°C und einem pH von 3,0 bis 8,0 ausgeführt werden. Vor zugsweise wird ST 001837 bei 25°C (±1°C) und einem pH von 3 bis 5 kultiviert.
Die Kultivierung von ST 001837 erfolgt vorzugsweise während 96 bis 300 Stunden, wobei eine optimale Ausbeute des erfindungsgemäßen Lipaseinhibitors Percyquinnin erhalten wird. Es wird besonders bevorzugt, die Kultivierung durch Fermentation während 216 bis 264 Stunden unter Submersbedingungen, beispielsweise in Schüttelkolben sowie in Laborfermentern durchzuführen. Der Fortschritt der Fermentation und die Bildung des Percyquinnins können durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und durch Messen der Bioaktivität in der Kulturbrühe ermittelt werden. In der entstehenden Kulturbrühe ist Percyquinnin sowohl im Kulturfiltrat als auch in Mycel, vorzugsweise im Mycel, vorhanden.
Percyquinnin kann unter Verwendung bekannter Trennverfahren isoliert werden. Es kann daher aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Ethylacetat, Dichlormethan, Chloroform oder Butanol, bei einem pH von 5 bis 8 oder durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung polymerer Harze wie "Diaion HP-20" oder "MCI Gel CHP-20P" (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), "Amberlite XAD (Rohm and Haas Industries, USA) oder Ionenaustauschchromatographie bei einem pH von 5 bis 8 durchgeführt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Chromatographie auf MCI^® Gel CHP-20P. Das wirksame Material kann auch aus dem Mycel durch Extraktion mit einem wassermischbaren Lösungsmittel wie Methanol, Aceton, Acetonitril, n-Propanol oder Isopropanol oder einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Ethylacetat, Dichlormethan, Chlorofom oder Butanol bei einen pH von 5 bis 8 gewonnen werden und das bevorzugte Verfahren ist die Extraktion mit Methanol. Die Kon zentrierung und Lyophilisierung der Extrakte ergibt das wirksame Rohmaterial.
Der erfindungsgemäße Inhibitor Percyquinnin kann aus dem Rohmaterial beispielsweise wie folgt gewonnen werden:
Durch Fraktionierung unter Verwendung irgendeines der folgenden Verfahren: Normalphasenchromatographie (unter Verwendung von Aluminiumoxid- oder Silicagel als stationäre Phase und Eluierungsmitteln wie Petrolether, Ethylacetat, Methylenchlorid, Aceton, Chloroform, Methanol oder Kombinationen hievon und Zusätzen von Aminen wie NEt₃), Umkehrphasenchromatographie (unter Verwendung von Umkehrphasensilicagel wie Dimethyloctadecylsilyl-Silicagel, auch als RP-18 bezeichnet, oder von Dimethyloctylsilyl-Silicagel, auch als RP-8 bezeichnet, als stationäre Phase und Eluierungsmitteln wie Wasser, Puffern wie Phosphat, Acetat, Citrat (pH 2–8) und organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril, Aceton, Tetrahydrofuran oder Kombinationen dieser Lösungsmittel), Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Harzen wie Sephadex^® LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel Toyopearl^® HW (Toso-Haas, Tosoh Corporation, Japan) in Lösungsmitteln wie Methanol, Chloroform, Aceton, Ethylacetat oder deren Kombinationen Oder Sephadex^® G-10 und G-25 in Wasser; oder durch Gegenstromchromatographie unter Verwendung eines zweiphasigen Eluierungsmittelsystems, welches aus zwei oder mehr Lösungsmitteln wie Wasser, Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, Tetrahydrofuran, Aceton, Acetonitril, Methylenchlorid, Chloroform, Ethylacetat, Petrolether, Benzol und Toluol besteht. Diese Verfahren können wiederholt verwendet werden oder es kann eine Kombination von verschiedenen Verfahren angewandt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Chromatographie über Umkehrphasensilicagel (RP-18).
Die Verbindung Percyquinnin kann in pharmazeutisch annehmbare Salze und Derivate, wie Ester und Ether, und in andere offensichtliche chemische Äquivalente übergeführt werden, welche alle von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind. Die Salze und Derivate können durch Standardverfahren, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Salze wie Natrium- und Kaliumsalze können beispielsweise durch Behandeln von Percyquinnin mit geeigneten Natrium- oder Kaliumbasen hergestellt werden.
Ester und Ether können durch die Verfahren hergestellt werden, welche in der Literatur angeführt sind, beispielsweise in Advanced Organic Synthesis, 4. Ausgabe, J.March, John Wiley & Sons., 1992. Ester können durch Reaktion mit Carbonsäuren oder z.B. Aminosäuren, z.B. Leucin, Glycin oder Alanin ausgebildet werden. Die Aminogruppe der Aminosäure kann nach der Veresterung einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen werden oder z.B. mit einer Formylgruppe geschützt werden. Die Veresterung kann in Gegenwart eines Entwässerungsmittels, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), wie es in der Literatur beschrieben ist (Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 6204; Arrieta et al. Synth.Commun 1983, 13, 471), durchgeführt werden.
Die Doppelbindungen können durch in der Literatur angeführte Verfahren, beispielsweise in Advanced Organic Synthesis, 4. Ausgabe, J. March, John Wiley & Sons., 1992, S. 771–775, oder wie in R. Bloch et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 4603–4605, reduziert werden. Sie können durch Verfahren, welche in H.O. House in "Modern Synthetic Reactions", W.A. Benjymin, Inc., New York (1972), S. 446–452, beschrieben sind, hydrohalogeniert werden. Hydroxylierte Derivate können durch Umsetzung der Doppelbindungen mit Reagenzien wie OsO₄, wie in der Literatur z.B. in Chem. Rev. 1980, 80, 187, beschrieben ist, hergestellt werden.
Derivate können auch durch Umwandlung der Doppelbindungen in Epoxide durch Oxidation z.B. mit MCPBA, wie es in Advanced Organic Synthesis, 4. Ausgabe, J. March, John Wiley & Sons., 1992, S. 826, oder in A.J. Pearson et al., J. Org. Chem. 1986, 51, 2505–2511, beschrieben ist, übergeführt werden.
Derivate können auch durch Ozonolyse der Doppelbindung der Isopentenylseitenkette ausgebildet werden. In Abhängigkeit von dem Aufarbeitungsverfahren kann die zu einem Aldehyd (z.B. mit Zn/HOAc oder Dimethylsulfid/Methanol), zu einer Carbonsäure (z.B. mit H₂O₂) oder zu einem Alkohol (z.B. mit LiAlH₄ oder NaBH₄) als funktioneller Gruppe führen [W.Curruthers, "Some Modern Methods of Organic Synthesis", Cambridge University Press (1971), Kap. 6; White, King und O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591 (1971); Bailey, P.S., "Ozonisation in Organic Chemistry", Bd. 1 und Bd. 2, New York, Academic Press (1978, 1982)]. Durch Umsetzung der so ausgebildeten Aldehyde mit Phosphoranen, wie es in der Literatur als Wittig-Reaktion bekannt ist, können Seitenketten mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen eingeführt werden. Die neu eingeführten Ketten können z.B. OR¹ (R¹=H oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen), NR²R³ (R²R³=H oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) , F, Cl, Br oder I als funktionelle Gruppen tragen, wie es in H.J. Bestmann et al., "Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products", Topics in Current Chemistry 109, 85 (1983), beschrieben ist.
Percyquinnin zeigt die Inhibierung der Lipase mit einem IC₅₀ von 2 μM (NBD-Assay, siehe Beispiel 6).
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Percyquinnin in Form seiner Racemate, racemischen Gemische und reinen Enantiomeren, und auf deren Diastereomere und Gemische hievon.
Pharmazeutisch annehmbare Salze sind für medizinische Anwendungen aufgrund ihrer größeren Wasserlöslichkeit im Vergleich zu den ursprünglichen Verbindungen, auf welchen sie basieren, besonders nützlich. Diese Salze müssen ein pharmazeutisch annehmbares Anion oder Kation besitzen. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze von Percyquinnin sind Salze anorganischer Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure, und organischer Säuren wie beispielsweise Essigsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, Zitronensäure, Ethansulfonsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Glycolsäure, Isethionsäure, Milchsäure, Lactobionsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure und Trifluoressigsäure. Für medizinische Zwecke ist es besonders bevorzugt, das Chlorid zu verwenden. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Basensalze sind Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze (wie Natrium- und Kaliumsalze) und Erdalkalimetallsalze (wie Magnesium- und Calciumsalze).
Salze mit einem pharmazeutisch nicht annehmbaren Anion liegen in gleicher Weise im Rahmen der Erfindung als nützliche Zwischenverbindungen zur Herstellung oder zur Reinigung pharmazeutisch annehmbarer Salze und/oder für die Anwendung in nichttherapeutischen (beispielsweise in vitro) Anwendungen.
Der Ausdruck "physiologisch funktionelles Derivat", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jedes beliebige physiologisch tolerierte Derivat einer Verbindung gemäß der Erfindung, beispielsweise einen Ester, welcher zur Verabreichung an ein Säugetier, wie beispielsweise an Menschen, geeignet ist, um (direkt oder indirekt) eine derartige Verbindung oder einen aktiven Metaboliten hievon auszubilden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung besteht in der Verwendung von Prodrugs von Percyquinnin. Derartige Prodrugs können in vivo zu Percyquinnin metabolisiert werden. Diese Prodrugs können selbst wirksam oder nicht wirksam sein.
Percyquinnin kann auch in verschiedenen polymorphen Formen, beispielsweise in amorphen und in kristallinen polymorphen Formen existieren. Alle polymorphen Formen von Percyquinnin liegen im Rahmen der Erfindung und sie stellen daher einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Alle nachstehenden Bezugnahmen auf Percyquinnin beziehen sich auf Percyquinnin, wie es vorstehend beschrieben ist, und auf die Salze, Solvate und physiologisch funktionellen Derivate hievon, wie sie hierin beschrieben sind.
Die zur Erzielung der gewünschten biologischen Wirkung erforderliche Menge an Percyquinnin hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, beispielsweise der ausgewählten spezifischen Verbindung, der vorgesehenen Anwendung, dem Verabreichungsweg und dem klinischen Zustand des Patienten. Die tägliche Dosis beträgt im allgemeinen im Bereich von 0,3 mg bis 100 mg (typischerweise von 3 mg bis 50 mg) pro Tag und pro Kilogramm Körpergewicht, beispielsweise 3–10 mg/kg/Tag. Eine intravenöse Dosis kann beispielsweise im Bereich von 0,3 mg bis 1,0 mg/kg liegen, welche geeigneterweise als Infusion von 10 ng bis 100 ng pro Kilogramm und pro Minute verabreicht werden kann. Infusionslösungen, welche für diese Zwecke geeignet sind, können beispielsweise 0,1 ng bis 10 mg, typischerweise von 1 ng bis 10 mg pro ml enthalten. Einzeldosen können beispielsweise von 1 mg bis 10 g des wirksamen Bestandteils enthalten. Ampullen zur Injektion können daher beispielsweise 1 mg bis 100 mg enthalten und Einzeldosisformulierungen, welche oral verabreicht werden können, wie beispielsweise Tabletten oder Kapseln, können z.B. 1,0 bis 1000 mg, typischerweise 10 bis 600 mg enthalten. Im Fall von pharmazeutisch annehmbaren Salzen basieren die vorstehenden Gewichtsdaten auf dem Gewicht des aus dem Salz enthaltenen Aminothiazolions. Percyquinnin als solches kann als Verbindung für die Prophylaxe oder Therapie der vorstehend erwähnten Zustände verwendet werden, aber es wird vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem verträglichen Träger verwendet. Der Träger muß selbstverständlich verträglich im Sinne einer Verträglichkeit mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung sein und er darf für die Gesundheit des Patienten nicht schädlich sein. Der Träger kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit oder beides sein und wird vorzugsweise mit der Verbindung als Einzeldosis, beispielsweise als Tablette, formuliert, welche 0,05 Gew.-% bis 95 Gew.-% des wirksamen Bestandteils enthalten kann. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können durch eine der bekannten pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden, welche im wesentlichen aus dem Vermischen der Bestandteile mit pharmakologisch annehmbaren Trägern und/oder Exzipientien bestehen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung sind jene, welche für die orale, rektale, topische, perorale (beispielsweise sublinguale) und parenterale (beispielsweise subkutane, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse) Verabreichung geeignet sind, obwohl die geeignetste Verabreichungsweise in jedem Einzelfall von der Natur und der Schwere des zu behandelnden Zustands und von der Natur des in jedem Fall verwendeten Percyquinnins abhängig ist. Beschichtete Formulierungen und beschichtete, langsam freizusetzende Formulierungen liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Säure- und magensaftresistente Formulierungen sind bevorzugt. Geeignete magensaftresistente Beschichtungen umfassen Celluloseacetatphthalat, Polyvinylacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und anionische Polymere von Methacrylsäure und Methylmethacrylat.
Geeignete pharmazeutische Verbindungen für die orale Verabreichung können in der Form von getrennten Einheiten wie beispielsweise Kapseln, Dragees, Pastillen oder Tabletten vorliegen, wovon jede eine definierte Menge an Percyquinnin enthält; als Pulver oder Granulate; als Lösung oder Suspension in einer wässerigen oder nicht wässerigen Flüssigkeit; oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion. Diese Zusammensetzungen können, wie bereits erwähnt, durch jedes geeignete pharmazeutische Verfahren hergestellt werden, welches einen Schritt umfaßt, worin der wirksame Bestandteil und der Träger (welcher aus einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen bestehen kann) in Kontakt gebracht werden. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch einheitliches und homogenes Mischen des wirksamen Bestandteils mit einer Flüssigkeit und/oder einem fein dispergierten festen Träger hergestellt, wonach das Produkt erforderlichenfalls einer Formgebung unterworfen wird. So kann beispielsweise eine Tablette durch Komprimieren oder Formen der Pulver oder Granulate der Verbindung, geeignetenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, hergestellt werden. Komprimierte Tabletten können durch Tablettierung der Verbindung in frei fließender Form wie beispielsweise eines Pulvers oder von Granulaten hergestellt werden, geeignetenfalls vermischt mit einem Bindemittel, einem Gleitmittel, einem inerten Verdünnungsmittel und/oder einem (oder mehreren) grenzflächenaktiven/dispergierenden Mitteln in einer geeigneten Maschine. Geformte Tabletten können durch Formen der Verbindung, welche in Pulverform vorliegt und mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchtet wurde, in einer geeigneten Maschine ausgebildet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für die perorale (sublinguale) Verabreichung geeignet sind, umfassen lutschbare Tabletten, welche Percyquinnin mit einem Geschmackstoff, normalerweise Saccharose, und Gummi Arabicum und Tragacanth enthalten und Pastillen, welche die Verbindung in einer inerten Grundlage wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi Arabicum enthalten.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen vorzugsweise sterile wässerige Zubereitungen von Percyquinnin, welche mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers vorzugsweise isotonisch sind. Diese Zubereitungen werden vorzugsweise intravenös verabreicht, obwohl eine Verabreichung auch durch subkutane, intramuskuläre oder intradermale Injektion stattfinden kann. Diese Zubereitungen können vorzugsweise durch Mischen der Verbindung mit Wasser und Sterilisieren der erhaltenen Lösung und mit dem Blut Isotonisch-Stellen hergestellt werden. Injizierbare Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten im Allgemeinen 0,1 bis 5 Gew.-% der wirksamen Verbindung.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die rektale Verabreichung liegen vorzugsweise in der Form von Einzeldosiszäpfchen vor. Diese können durch Vermischen von Percyquinnin mit einem oder mehreren herkömmlichen festen Trägern, beispielsweise Kakaobutter und Formen des erhaltenen Gemisches hergestellt werden.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die topische Verwendung auf der Haut besitzen vorzugsweise die Form einer Salbe, einer Creme, einer Lotion, einer Paste, eines Sprays, eines Aerosols oder eines Öls. Träger, welche verwendet werden können, sind Petrolatum, Lanolin, Polyethylenglycole, Alkohole und Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Substanzen. Der wirksame Bestandteil liegt allgemein in einer Konzentration von 0,1 bis 15 Gew.-% der Zusammensetzung, beispielsweise von 0,5 bis 2% vor.
Eine transdermale Verabreichung ist ebenfalls möglich. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die transdermale Verabreichung können in der Form von Einzelpflastern sein, welche für einen langzeitigen nahen Kontakt mit der Epidermis des Patienten geeignet sind. Pflaster dieses Typs enthalten geeigneterweise den wirksamen Bestandteil in einer wässerigen Lösung, welche, wenn geeignet, gepuffert ist, gelöst und/oder dispergiert in einem Haftmittel oder dispergiert in einem Polymer. Eine geeignete Konzentration an wirksamem Bestandteil beträgt von etwa 1% bis 35%, vorzugsweise etwa 3% bis 15%. Als besondere Option kann der wirksame Bestandteil durch Elektrotransport oder Iontophorese freigesetzt werden, wie sie beispielsweise in Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986), beschrieben sind.
Das Folgende sind veranschaulichende, aber nicht den Rahmen der Erfindung einschränkende Beispiele der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Pflege der Kultur ST 001837
a) Zusammensetzung des Pflegemediums
Nach dem gründlichen Lösen der Bestandteile durch Erhitzen wurde die erhaltene Lösung bei 121°C während 20 Minuten sterilisiert und in Petrischalen (15 ml/Schale) verteilt. Nach der Verfestigung wurden die Platten mit der Startkultur inokuliert und bei 25°C inkubiert, bis ein gutes Wachstum beobachtet wurde. Die gut gewachsenen Kulturen wurden für die folgenden Konservierungsschritte verwendet.
Pflegemedium

%

Malzextrakt 2,00

Hefeextrakt 1,00

Glucose 1,00

(NH₄)₂HPO₄ 0,05

Agar-Agar 2,00
b) Konservierung bei –135°C:
1,5 ml einer sterilen 10% DMSO-Lösung wurden in 2 ml Kryophiolen geleert. Von der Pflege-Agar-Platte wurde ein 2 cm² Agarstück zur DMSO-Lösung zugesetzt, in Stufen eingefroren (1°C pro Minute) und bei –135°C gelagert.
c) Konservierung in flüssigem Stickstoff:
1,5 ml einer sterilen 50% Glycerinlösung wurden in 2 ml Kryophiolen geleert. Von der Pflege-Agar-Platte wurde ein 2 cm² Agarstück entnommen und zur Glycerinlösung zugesetzt, in Stufen eingefroren (1°C pro Minute) bis auf –80°C und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert.
Beispiel 2
Fermentation der Kultur Nr. ST 001837 in Schüttelkolben
Zubereitung der Impfkultur in Schüttelkolben
Das Impfmedium (siehe nachstehend) wurde in 100 ml Mengen in 300 ml Schüttelkolben verteilt und bei 121°C während 20 Minuten in einem Autoklaven gehalten. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 2 cm² Agarstücken, welche von einer 6 Tage alten Agar-Plattenkultur entnommen worden waren, oder mit dem Inhalt einer Konservierungsphiole (–135°C oder flüssiger Stickstoff) inokuliert. Die Inkubation wurde während 96 Stunden auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 140 UpM und 25°C ausgeführt.
Impfmedium

%

Maiseinweichlauge 0,50

Tomatenpaste 4,00

Hafermehl 1,00

Glucose 1,00

Spurenelemente 1,00 ml

pH 6,8
Spurenelementlösung

%

FeSO₄x7H₂O 0,1000

MnSO₄x1H₂O 0,1000

CuCl₂x2H₂O 0,0025

CaCl₂x2H₂O 0,0100

H₃BO₃ 0,0056

(NH₄ )₆Mo₇O₂₄x4H₂O 0,0019

ZnSO₄x7H₂O 0,0200
Produktionsbedingungen
Das Produktionsmedium (siehe nachstehend) wurde in 100 ml Mengen in 300 ml Schüttelkolben verteilt und bei 121°C während 20 Minuten im Autoklaven gehalten. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 2 ml einer 4 Tage alten Impfkultur inokuliert. Die Inkubation wurde während 240 Stunden auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 140 UpM und 25°C ausgeführt.
Die Produktion des Inhibitors Percyquinnin wurde durch Testen der Bioaktivität hinsichtlich der Inhibierung von Lipase, wie beschrieben (Beispiel 6), und durch HPLC-Analyse bestimmt.
Produktionsmedium

Malzextrakt 2,00

Hefeextrakt 0,20

Glucose 1,00

(NH₄)₂HPO₄ 0,05
Beispiel 3
Kultivierung der Kultur Nr. ST 001837 in Fermentern (12 l)
Bereitung der Impfkultur in Schüttelkolben
Das Impfmedium wurde in 500 ml Mengen in 2 l Erlenmeyer-Kolben verteilt und bei 121°C während 30 Minuten in einem Auto-klaven gehalten. Die Impfkultur wurde in diesen Kolben, wie in Beispiel 2 beschrieben, gezüchtet.
Fermentation in großem Maßstab
Zusammensetzung des Produktionsmediums:
8 l des Produktionsmediums in einem 12 1 Fermenter (in zwei Fermentern) gemeinsam mit 1 ml(/10 l Fermenter) Desmophen^® als schaumunterdrückendes Mittel wurden in situ während 45 Minuten bei 121°C sterilisiert, auf 25°C (±1°C) gekühlt und mit 0,5 1 (6,25% des 12 l-Fermenters) der vorstehenden Impfkultur beimpft.
Die Fermentation wurde mit den folgenden Parametern durchgeführt.

Temperatur 25°C

Rührung 300 UpM (V_Spitze=1 ,57 m/s )

Belüftung 0,5 vvm

Erntezeit 237 h
Die Produktion des Lipaseinhibitors Percyquinnin wurde durch Testen der Inhibierung von Lipase, wie in Beispiel 6 beschrieben, bestimmt. Der End-pH der Kulturbrühe betrug 3–4. Die Kulturbrühe wurde gewonnen und zentrifugiert und die Verbindung Percyquinnin wurde aus dem Kulturfiltrat und dem Mycel durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren isoliert und gereinigt.
Beispiel 4
Isolierung und Reinigung von Percyquinnin
Die Kulturbrühe (3 l) wurde gewonnen und zentrifugiert, um das Mycel (20 g) und das Kulturfiltrat zu trennen. Das Mycel wurde mit Methanol (3 l) extrahiert und die wirksamen Extrakte wurde gesammelt und unter verringertem Druck zu einem Volumen von 50 ml eingeengt. Das Rohmaterial wurde durch präparative HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen gereinigt:
1) Säule: MCI^® Gel CHP-20P (BioCart, 50×100 mm; Kronlab)
Die wirksamen Fraktionen wurden nach 17 Minuten eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden unter verringertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet.
Die Endreinigung erfolgte durch präparative HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen:
1) Säule: Purospher Star RP-18e (5μ, 125×25 mm, Merck)
Die Percyquinnin enthaltenden Fraktionen wurden nach 21 Minuten eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden unter verringertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet.
2) Säule: Purospher Star RP-18e (5μ, 125×25 mm, Merck)
Die Percyquinnin enthaltenden Fraktionen wurden nach 37 Minuten eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden unter verringertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Die Gesamtausbeute von 20 g Mycel betrug 2 mg der Verbindung Percyquinnin.
Die physikochemischen Eigenschaften und die Spektraleigenschaften von Percyquinnin sind in den Tabellen 1 und 2 angeführt.
Beispiel 5:
Herstellung und Reinigung von Lipase
Adipocyten von männlichen Ratten (Wistar 220–250 g) wurden durch eine Kollagenase-Behandlung, wie sie in der Literatur beschrieben ist, isoliert. Die Fettzellen von 10 Ratten wurden jeweils dreimal durch Flotation mit 30 ml Homogenisierungspuffer (25 ml Tris/HCl, pH 7,4, 0,25 M Saccharose, 1mM EDTA, 1mM DTT, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Antipain, 20 μg/ml Pepstatin) gewaschen. Danach wurden 10 ml Homogenisierungspuffer zugesetzt. Die Fettzellen wurden in einer Teflon-in-Glas-Vorrichtung (Braun-Melsungen) bei 1500 UpM und 15°C homogenisiert. Das homogene Produkt wurde zentrifugiert (Sorvall SM 24-Röhrchen, 500 UpM, 10 min, 4°C). Die Schicht zwischen der oberen Fettschicht und dem Pellet wurde abgetrennt und abermals zentrifugiert. Die Trennung der unteren Schicht wurde wiederholt und es wurde ein drittes Mal bei 2000 UpM während 45 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die entstehende Mutterschicht wurde zu 1 g Heparin-Sepharose (Pharmacia-Biotech, CL-6B, fünfmal gewaschen mit 25 mM Tris/HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl) zugesetzt. Nach einer Inkubation während 60 Minuten bei 4°C (geschüttelt in Intervallen von 15 Minuten) wurde die Lösung zentrifugiert (Sorvall SM24-Röhrchen, 3000 UpM, 10 min, 4°C). Die obere Schicht wurde mit Essigsäure auf einen pH von 5,2 eingestellt und während 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (Sorvall SS34-Röhrchen, 12000 UpM, 10 min, 4°C) isoliert und in 2,5 ml 20 mM Tris/HCI, pH 7,0, 1 mM EDTA, 65 mM NaCl, 13% Saccharose, 1 mM DTT, 10 μg/ml Leupeptin/Pepstatin/Antipain) suspendiert. Die Suspensi on wurde über Nacht bei 4°C gegen 25 mM Tris/HCl, pH 7,4, 50% Glycerin, 1mM DTT, 10 μg/ml Leupeptin, Pepstatin, Antipain dialysiert und danach auf einer Hydroxyapatit-Säule (0,1 g/l ml Suspension, äquilibriert mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 7.0, 30% Glycerin, 1 mM DTT) absorbiert. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer viermal gewaschen (Durchfluß: 20–30 ml/h). Die Lipase wurde mit 0,5 M Kaliumphosphatpuffer eluiert. Das Produkt wurde dialysiert und eingeengt (5–10 Mal) durch Ultrafiltration (Amicon Diaflo PM 10) bei 4°C. Die halbreine Lipase kann für 4–6 Wochen bei –70°C gelagert werden.
Beispiel 6:
Bioaktivitätsassay
Ein fluoreszentes Lipidanalogon, Mono-NBD-acylglycerin (NAG), wurde als Substrat verwendet, welches seine Farbe nach Integrierung in Phospholipidvesikel von 481 nm auf 550 nm verändert. Die Testverbindung, gelöst in DMSO, wurde mit AssayPuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) 1:5 verdünnt. Zu 2,5 μl dieser Lösung wurden 180 μl beschallte Substratlösung zugesetzt (20 μg/ml Phosphatidylcholin, 10 μg/ml Phosphatidylinosit, 50 μg/ml NAG in Assay-Puffer). Nach einer Präinkubation bei 30°C während 15 Minuten wurden 20 μl Enzymlösung, vorverdünnt 1:2 in Assay-Puffer, zugesetzt und die Absorption bei 485 nm wurde sofort gemessen. Nach 60 Minuten Inkubation bei 30°C wurde die Absorption abermals gemessen. Der Anstieg im Absorptionsvermögen bei 480 nm war ein Maß für die Enzymaktivität. Die Ermittlung von IC₅₀-Werten wurde unter Verwendung von 10 Konzentrationen der frisch gelösten Testverbindung durchgeführt. Für die Datenanalyse wurde das Softwarepaket GRAPHIT, Elsevier-Biosoft verwendet.
Percyquinnin zeigt eine Inhibierung von Lipase mit einem IC₅₀ von 2 μm.

Claims

Percyquinnin, eine Verbindung der Formel
und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Percyquinnin, eine Verbindung der Molekularformel C₁₂H₁₆O₃, erhältlich durch Kultivierung des Pilzes ST 001837 (DSM 13303) unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gefolgt von der Isolierung und Reinigung in üblicher Weise, und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Verfahren zur Herstellung von Percyquinnin oder einem Salz hievon, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, umfassend das Kultivieren der Basidiomyceten-Spezies ST 001837 (DSM 13303) unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gefolgt von der Isolierung und Reinigung in üblicher Weise.
Basidiomyceten-Spezies ST 001837 (DSM 13303).
Percyquinnin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hievon, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, zur Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge an Percyquinnin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz hievon, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Percyquinnin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hievon, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, zur Verwendung als Lipaseinhibitor.