CN1199959C - 朴塞奎宁,其生产方法和作为药物的使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以通过培养真菌ST 001837(DMS 13303)而获得的称为朴塞奎宁的化合物及其药物学可接受盐类。本发明还涉及用于生产朴塞奎宁的方法、微生物ST 001837(DSM 13303)、朴塞奎宁及其药物学可接受盐类作为药物的使用(特别是它们作为脂肪酶抑制剂的使用)、和包含朴塞奎宁或其药物学可接受盐类的药物学组合物。

Description

朴塞奎宁，其生产方法 和作为药物的使用
本发明涉及可以通过培养担子菌Stereum complicatum ST 001837(DMS 13303)而获得的称为朴塞奎宁(Percyquinnin)的化合物及其药物学可接受盐类和衍生物。本发明还涉及用于生产朴塞奎宁的方法、真菌ST 001837(DSM 13303)、朴塞奎宁及其药物学可接受盐类和衍生物作为药物的使用(特别是它们作为脂肪酶抑制剂的使用)、和包含朴塞奎宁或其药物学可接受盐类或衍生物的药物学组合物。
脂类代谢通常在合成与降解之间维持精密的平衡。当平衡被扰乱时，则可能发生高脂血症，继而可以引起动脉硬化、高血压、糖尿病、等。期望脂类代谢的调节物可用于控制这些紊乱。
推测非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中对脂解的抑制可减轻高血糖。利用脂肪作为能源的最初事件是脂肪酶(如激素敏感脂肪酶和单酰甘油脂肪酶)对三酰甘油的水解。三酰甘油的水解导致血液中甘油和脂肪酸水平升高。预计脂肪酶抑制剂可降低血浆脂肪酸水平和高血糖，且副作用也降低。
肥胖症和高胆固醇血症在一定程度上与高营养脂肪摄入有关。饮食甘油三酯吸收的关键酶是胰脂肪酶。因此，对胰脂肪酶的抑制可能导致对脂肪吸收的抑制。
已经发现称为朴塞奎宁的新型化合物抑制脂解作用。因而，本发明涉及朴塞奎宁，即具有如下通式的化合物：
Figure C0180649800041
及其药物学可接受盐类和衍生物，诸如酯、醚、和显而易见的化学等同物，包括所有的立体异构形式和所有的互变异构形式。
朴塞奎宁的分子式是C12H16O3(208Da)的化合物，而且可以表征为下文给出的它的任何一种或多种物理-化学和光谱特性，诸如表1和表2所提供的它的1H NMR光谱数据和它的13C NMR光谱数据。
朴塞奎宁可以描述成五元环携带羟甲基模块且在内酯α位置处具有2，3-异戊烯基侧链的新型β-内酯。朴塞奎宁具有至今未有报道的新型结构。化学摘要文献检索确定了朴塞奎宁是新型化合物。尚无其它化合物呈现朴塞奎宁的结构特征。
可以通过培养称为培养物编号ST 001837(以后称为ST 001837)的微生物来获得朴塞奎宁。用于生产朴塞奎宁的这种真菌采集于美国Pike郡密西西比国家公园(Mississippi State Park)Percy Quinn。真菌ST 001837属于担子菌目物种Stereum complicatum。该真菌已经于2000年2月11日保藏于德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物收藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，编号DSM No.13303。
因而，本发明还提供了用于生产称为朴塞奎宁的新型化合物的方法，包括在有氧条件下在包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素的营养培养基中培养担子菌物种ST001837或其突变体和变体，随后以常规方式分离和纯化所述化合物。
营养培养基优选包含碳源、氮源、和营养无机盐。碳源是例如淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、糖蜜、甘油、乳糖、或半乳糖，优选葡萄糖。氮源是例如大豆粗粉、花生粗粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆、明胶、或水解酪蛋白氨基酸，优选麦芽提取物和酵母提取物。营养无机盐是例如磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、碳酸钙、硝酸钾、硫酸铵、或硫酸镁，优选磷酸氢铵。
ST 001837的培养可以在20-35℃之间的温度和3.0-8.0之间的pH进行。优选于25℃(±1℃)和pH3-5培养ST 001837。
ST 001837的培养优选进行96-300小时，此时获得本发明脂肪酶抑制剂朴塞奎宁的最佳产量。特别优选通过在浸没条件下(例如在摇瓶及实验室发酵罐中)发酵216-264小时来进行培养。可以通过培养液的高压液相层析(HPLC)和生物活性测量来检测发酵的过程和朴塞奎宁的形成。在产生的培养液中，朴塞奎宁存在于培养物滤出液以及菌丝体中，优选存在于菌丝体中。
可以使用已知的分离技术来分离朴塞奎宁。因而，可以通过pH5-8的水不混溶剂(诸如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、或丁醇)的抽提或者通过使用聚合树脂(诸如Diaion HP-20或MCIGel CHP-20P(Mitwubishi Chemical Industries有限公司，日本)、Amberlite XAD(Dohm and Hass Industries，美国))的疏水相互作用层析、活性炭、或pH5-8的离子交换层析而由培养物滤出液进行回收。优选方法是在MCIGel CHP-20P上进行的层析。还可以通过pH5-8的水可混溶剂(诸如甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇、或异丙醇)或水不混溶剂(诸如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、或丁醇)的抽提由菌丝体回收活性材料。优选方法是甲醇抽提。将提取物浓缩并冻干，得到有活性的粗制材料。
例如，可以如下由粗制材料回收本发明的抑制剂朴塞奎宁：
通过使用任何下列技术的分级分离：正相层析(使用氧化铝或硅胶作为固定相，诸如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、氯仿、甲醇、或其组合作为洗脱剂，并添加胺类诸如Net3)、反相层析(使用反相硅胶像二甲基十八硅烷基硅胶(也称为RP-18)或二甲基辛硅烷基硅胶(也称为RP-8)作为固定相，诸如水、缓冲液即磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐(pH2-8)、和有机溶剂诸如甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、或其组合作为洗脱剂)、凝胶渗透层析(使用诸如甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、或其组合等溶剂中的诸如Sephadex LH-20(Pharmacia Chemical Industries，瑞典)、TSKgelToyopearl HW(TosoHaas，Tosoh公司，日本)等凝胶或者水中的Sephadex G-10和G-25等凝胶)、或逆流层析(使用由两种或多种溶剂诸如水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、苯、和甲苯组成的双相洗脱剂系统)。可以重复使用这些技术，或者可以使用不同技术的组合。优选方法是在反相硅胶(RP-18)上进行的层析。
化合物朴塞奎宁可以转变成药物学可接受盐类和衍生物，像酯和醚及其它显而易见的化学等同物，它们均包括在本发明范围内。可以通过本领域技术人员知道的标准流程来制备盐类和衍生物。例如，可以通过用合适的钠或钾碱处理朴塞奎宁来制备钠盐和钾盐。
可以通过文献例如《Advanced Organic Synthesis》(高级有机合成，第4版，J.March，John Wiley & Sons，1992)中给出的方法来制备酯和醚。可以通过与羧酸或如氨基酸如亮氨酸、甘氨酸、或丙氨酸的反应来形成酯。可以在酯化之后将氨基酸的氨基去保护，或者用如甲酰基保护。如文献(Smith等人，J.Am.Chem.Soc.，80：6204，1958；Arrieta等人，Synth.Commun.，13：471，1983)所述，可以在存在脱水剂如二环己基碳二亚胺(DCC)时进行酯化。
可以通过文献例如《Advanced Organic Synthesis》(高级有机合成，第4版，J.March，John Wiley & Sons，1992，第771-775页)或R.Bloch等人，J.Org.Chem.，52：4603-4605，1987中给出的方法来还原双键。可以通过H.O.House在《Modern Synthetic Reactions》(现代合成反应，W.A.Benjymin公司，纽约，1972，第446-452页)中描述的方法将它们氢卤化。如文献(Chem.Rev.，80：187，1980)所述，可以通过双键与像OsO4等的试剂的反应来生成羟化衍生物。
如文献《Advanced Organic Synthesis》(高级有机合成，第4版，J.March，John Wiley & Sons，1992，第826页)或A.J.Pearson等人，J.Org.Chem.，51：2505-2511，1986中所述，还可以通过用如MCPBA氧化而由双键转变成环氧化物，由此形成衍生物。
还可以通过异戊烯基侧链双键的臭氧分解来形成衍生物。根据处理流程，这可以产生醛(如用Zn/HOAc或二甲亚砜/甲醇)、羧酸(如用H2O2)、或醇(如用LiAlH4或NaBH4)作为官能基(W.Curruthers，《Some Modern Methods of Organic Synthesis》即一些现代有机合成方法，剑桥大学出版社，1971，第6章；Wihite、King、和O’Brein，Tetrahedron Lett.，3591，1971；P.S.Bailey，《Ozonisation in OrganicChemistry》即有机化学中的臭氧处理，第1和2卷，纽约，Academic出版社，1978，1982)。通过将如此形成的醛与正膦的反应(文献中称为Wittig反应)，可以导入含4-10个碳原子的侧链。如H.J.Bestmann等人，“Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis ofNatural Products”(天然产物合成中的Wittig反应的选择主题，Topicsin Current Chemistry，109：85，1983)中所述，导入的新链可以携带如OR1(R1＝H或含1-4个碳原子的烷基)、NR2R3(R2R3＝H或含1-4个碳原子的烷基)、F、Cl、Br、或I作为官能基。
朴塞奎宁显示对脂肪酶的抑制作用，IC50是2μM(NBD测定法，见实施例6)。
本发明还涉及外消旋物、外消旋混合物、和纯对映异构体形式的朴塞奎宁的使用，以及它们的非对映异构体及其混合物。
药物学可接受盐类特别适用于医学应用，因为它们在水中的溶解度高于作为基础的初始化合物。这些盐类必须具有药物学可接受的阴离子或阳离子。朴塞奎宁的合适的药物学可接受酸加成盐是无机酸诸如氢氯酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、和硫酸及有机酸诸如醋酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡糖酸、羟基乙酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、和三氟乙酸的盐类。特别优选将氯化物用于医学目的。合适的药物学可接受碱性盐是铵盐、碱性金属盐类(诸如钠盐和钾盐)、和碱土金属盐类(诸如镁盐和钙盐)。
具有药物学不可接受阴离子的盐类同样属于本发明的范围，可作为中间物用于制备或纯化药物学可接受盐类和/或用于非治疗性(例如体外)应用。
在用于本文时，术语“生理学功能衍生物”指依照本发明的化合物的任何生理学耐受衍生物(例如酯)，它在施用于哺乳动物(诸如人)后能够形成(直接或间接)这种化合物或其活性代谢物。
本发明的另一方面是朴塞奎宁前体药物的使用。这些前体药物可以在体内代谢成朴塞奎宁。这些前体药物自身可能有或者无活性。
朴塞奎宁还可以各种多态形式存在，例如无定形和晶体多态形式。朴塞奎宁的所有多态形式都属于本发明的范围，构成本发明的另一方面。
以后凡提及朴塞奎宁均指上文所述朴塞奎宁以及本文所述盐类、溶剂化物、和生理学功能衍生物。
实现期望生物学效应所必需的朴塞奎宁的量取决于许多因素，例如选择的特定化合物、预定用途、施用模式、和患者的临床状况。日常剂量通常是每天每千克体重0.3-100mg(通常是3-50mg)，例如3-10mg/kg/天。静脉内剂量可以是例如0.3-1.0mg/kg，合适的施用是每分钟每千克体重输液10-100ng。适用于这些目的的输液每毫升可以包含例如0.1ng-10mg，通常是1ng-10mg。单剂可以包含例如1mg-10g活性成分。因而，注射针剂可以包含例如1-100mg，可以口服施用的单剂配方(诸如片剂或胶囊)可以包含例如1.0-1000mg，通常是10-600mg。在药物学可接受盐类的情况中，上述重量数据基于衍生自盐类的氨基噻唑离子的重量。朴塞奎宁自身作为化合物可用于上述状态的预防或治疗，但是优选为含相容载体的药物学组合物的形式。当然，载体必须与组合物的其它成分相容，而且对患者的健康无害。载体可以是固体或液体或二者兼之，而且优选与化合物配制成单剂(诸如片剂)，它可以包含0.05-95％(重量百分比)的活性成分。可以通过已知药物学方法之一来生成依照本发明的药物学组合物，所述方法主要包括将所述成分与药物学可接受载体和/或赋形剂相混合。
依照本发明的药物学组合物是适用于口服、直肠、局部、经口(例如舌下)、和胃肠外(例如皮下、肌内、皮内、或静脉内)施用的组合物，尽管在每个个别案例中，最合适的施用模式取决于待治疗状况的本质和严重程度以及每例中所用朴塞奎宁的本质。涂层配方和涂层缓释配方也属于本发明的范围。优选耐受酸和胃液的配方。合适的胃液耐受涂层包括醋酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸盐(polyvinyl acetate phthalate)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、及甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子聚合物。
适用于口服施用的药物学化合物可以是分开单位的形式，诸如胶囊、扁囊、锭剂、或片剂，每粒包含确定量的朴塞奎宁；粉剂或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者水包油或油包水乳剂。如上所述，可以通过任何合适药物学方法来制备这些组合物，所述方法包括将活性成分与载体(可以由一种或多种添加成分组成)相接触的步骤。一般而言，通过一致或均一的混和活性成分与液体和/或细微分散的固体载体，随后根据需要将产物定形而生成组合物。因而，例如，可以通过将化合物的粉末或颗粒压缩或定形而生成片剂，适当时还混和一种或多种添加成分。可以通过在合适机器中将自由流动形式的化合物(诸如粉末或颗粒)制片而生成压制片剂，其中适当混和粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂、和/或一种或多种表面活性/分散剂。可以通过在合适机器中将用惰性液体稀释剂弄湿的粉末形式的化合物定形而生成定形片剂。
适用于经口(舌下)施用的药物学组合物包括含片，它包含朴塞奎宁及调味剂(通常是蔗糖)和阿拉伯树胶或黄蓍胶；和锭剂，它在惰性基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中包含该化合物。
适用于胃肠外施用的药物学组合物优选包括无菌的朴塞奎宁含水制剂，其优选与预定受纳者的血液等渗。这些制剂优选静脉内施用，尽管也可以通过皮下、肌内、或皮内注射来进行施用。优选通过混和化合物与水并使产生的溶液无菌且与血液等渗来生成这些制剂。依照本发明的可注射组合物通常包含0.1-5％(重量百分比)的活性化合物。
适用于直肠施用的药物学组合物优选单剂栓剂的形式。可以通过混和朴塞奎宁与一种或多种常规固体载体(例如可可油)并将产生的化合物定形来生成这些栓剂。
适用于皮肤局部使用的药物学组合物优选油膏、乳膏、洗剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂、或油的形式。可以使用的载体是凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、酒精、及两种或多种所述物质的组合。活性成分通常以0.1-15％(以组合物的重量计)的浓度存在，例如0.5-2％。
经皮施用也是可能的。适用于经皮应用的药物学组合物可以是单一贴剂的形式，它适用于长期紧密接触患者表皮。这种贴剂在缓冲的水性溶液中适当包含活性成分，它适当的溶解和/或散布于粘合剂或者散布于聚合物中。合适的活性成分浓度是大约1-35％，优选大约3-15％。作为具体的选项，可以如Pharmaceutical Research，2(6)：318，1986所述通过电转运或离子电渗释放活性成分。
下面是本发明的例示性实施例，而非对本发明范围的限制：
实施例1：培养物ST 001837的维持
1.维持培养基的组成
通过加热使成分彻底溶解后，将产生的溶液于121℃灭菌20分钟，并分装到Petri培养皿(15ml/个)中。凝固后，将平板接种起始培养物，并于25℃培养至观察到生长良好。将生长良好的培养物用于下列保存步骤。
维持培养基
               ％
麦芽提取物     2.00
酵母提取物     1.00
葡萄糖         1.00
(NH4)2HPO4 0.05
琼脂           2.00
2.保存于-135℃
将1.5ml无菌10％DMSO溶液倾倒至2ml冷冻瓶中。将来自维持琼脂平板的2cm2琼脂块加到DMSO溶液中，逐步冷冻(每分钟1℃)并保存于-135℃。
3.保存于液氮
将1.5ml无菌50％甘油溶液倾倒至2ml冷冻瓶中。将来自维持琼脂平板的2cm2琼脂块加到甘油溶液中，逐步冷冻(每分钟1℃)直至-80℃，然后保存于液氮中。
实施例2：培养物编号ST 001837在摇瓶中的发酵
1.在摇瓶中制备种子培养物
在300ml摇瓶中分装100ml种子培养基(见下文)，并于121℃高压灭菌20分钟。将摇瓶冷却至室温，并接种取自6天的琼脂平板培养物的2cm2琼脂块或保存瓶(-135℃或液氮)的内容物。在旋转摇床上以140rpm、于25℃培养96小时。
种子培养基
                ％
玉米浆          0.50
番茄酱          4.00
麦片粉          1.00
葡萄糖          1.00
微量元素        1.00ml
pH6.8
微量元素溶液
                            ％
FeSO4·7H2O              0.1000
MnSO4·1H2O              0.1000
CuCl2·2H2O              0.0025
CaCl2·2H2O              0.0100
H3BO3                    0.0056
(NH4)6Mo7O24·4H2O   0.0019
ZnSO4·7H2O              0.0200
2.生产条件
在300ml摇瓶中分装100ml生产培养基(见下文)，并于121℃高压灭菌20分钟。将摇瓶冷却至室温，并接种2ml4天的种子培养物。在旋转摇床上以140rpm、于25℃培养240小时。通过如实施例6所述测试抑制脂肪酶的生物活性或通过HPLC分析来检测抑制剂朴塞奎宁的生成。
生产培养基
                  ％
麦芽提取物        2.00
酵母提取物        0.20
葡萄糖            1.00
(NH4)2HPO4    0.05
实施例3：培养物编号ST 001837在发酵罐(12L)中的培养
1.在摇瓶中制备种子培养物
在2L厄伦美氏烧瓶中分装500ml种子培养基，并于121℃高压灭菌30分钟。如实施例2所述，在这些烧瓶中培养种子培养物。
2.大规模发酵
生产培养基的组成：将12L发酵罐(2个发酵罐)中的8L生产培养基与1ml(/10L发酵罐)作为消泡剂的Desmophen一起于121℃原位灭菌45分钟，冷却至25℃(±1℃)，并接种0.5L(12L发酵罐的6.25％)上述种子培养物。
以如下参数进行发酵：
温度          25℃
搅动          300rpm(Vtip＝1.57m/s)
通风          0.5vvm
收获时间      237h
通过如实施例6所述测试对脂肪酶的抑制来检测脂肪酶抑制剂朴塞奎宁的生成。培养液的最终pH是3-4。收获培养液并离心，通过实施例4描述的方法由培养物滤出液和菌丝体分离并纯化朴塞奎宁。
实施例4：朴塞奎宁的分离和纯化
收获培养液(3L)，离心分离菌丝体(20g)和培养物滤出液。用甲醇(3L)抽提菌丝体，合并活性提取物，并在减压下浓缩至50ml。通过制备性HPLC使用如下条件纯化粗制材料：
1)层析柱MCIGel CHP-20P(BioCart，50×100mm；Kronlab)
洗脱剂   A)H2O B)MeOH
梯度     min      ％A    ％B
          0       95     5
          5       95     5
          45      0      100
流速      45ml/min
检测      220和254nm
活性级分洗脱于17分钟后。在减压下浓缩合并的级分并冻干。
通过制备性HPLC使用如下条件进行最终纯化：
1) 层析柱Purospher Star RP-18e(5μ，125×25mm；Merck)
洗脱剂  A)0.1％TFA    B)CH3CN
梯度    min         ％A     ％B
        0           95      5
        5           95      5
        45          0       100
流速    38ml/min
检测    210和300nm
含朴塞奎宁的级分洗脱于21分钟后。在减压下浓缩合并的级分并冻干。
2)层析柱Purospher Star RP-18e(5μ，125×25mm；Merck)
洗脱剂 A)0.1％TFA   B)CH3CN
梯度      min        ％A    ％B
          0          80     20
          10         80     20
          10.1       75     25
          17         75     25
          17.1       70     30
          50         70     30
          55         0      100
          100        0      100
流速      5ml/min
检测      210nm
含朴塞奎宁的级分洗脱于37分钟后。在减压下浓缩合并的级分并冻干。20g菌丝体的整体产量是2mg化合物朴塞奎宁。
表1和2给出了朴塞奎宁的物理-化学和光谱特性。
表1
外观 浅黄色油
溶解性 甲醇、DMSO
HPLC(高压液相层析) 层析柱：Purospher Star RP-18e(Merck)，55×4mm，3μm
洗脱剂：CH3CN/0.01％H3PO4(85％)
梯度： 时间 ％CH3CN
 0.00  5.0
 3.00  95.0
 5.00  95.0
 6.00  5.0
 10.00  5.0
流速：2ml/min
温度：40℃
检测：210nm，254、280、320、380
停留时间：2.1min
EI-MS(56eV) m/z＝208Da[M+]
GC-MS(在CH2Cl2+MSTFA中，56eV) m/z＝280Da[M+-H+TMS]
分子式 C12H16O3
1H NMR 见表2
13C NMR 见表2
表2：朴塞奎宁在DMSO中的1H和13C NMR光谱数据(300K)
 1H  13C
 1  -  172.97
 2  -  74.24
 3  -  148.37
 4  5.51  120.45
 5  2.7312.57  36.99
 6  4.93  78.41
 7  2.54/2.37  27.05
 8  5.11  117.92
 9  -  134.66
 10  1.60  17.77
 11  1.68  25.57
 12  4.01  59.39
 12-OH  4.97  -
Figure C0180649800161
实施例5：脂肪酶的制备和纯化
如文献中所述，通过胶原酶处理由雄性大鼠(Wistar 220-250g)分离脂肪细胞。将10只大鼠的脂肪细胞清洗3次，每次用50ml匀浆缓冲液(25ml Tris/HCl pH7.4、0.25M蔗糖、1mM EDTA、1mM DTT、10μg/ml亮抑酶肽、10μg/ml抗蛋白酶、20μg/ml抑胃酶肽)进行浮选。然后加入10ml匀浆缓冲液。在teflon-in-glass装置(Braun-Melsungen)中以1500rpm、于15℃将脂肪细胞匀浆。将均质产物离心(Sorvall SM24管，500rpm，10min，4℃)。分离上层脂肪层与沉淀之间的那层并再次离心。重复分离下层，并第三次离心(2000rpm，45min，4℃)。将产生的母层加到1g肝素Sepharose(Pharmacia-Biotech，CL-6B，用25mM Tris/HCl pH7.4、150mM NaCl清洗5次)上。于4℃保温60分钟后(间隔15分钟摇动)，将溶液离心(Sorvall SM24管，3000rpm，10min，4℃)。用醋酸将上层调至pH5.2，并于4℃保温30分钟。离心分离沉淀(Sorvall SS34管，12000rpm，10min，4℃)，并悬浮于2.5ml 20mM Tris/HCl pH7.0、1mM EDTA、65mM NaCl、13％蔗糖、1mM DTT、10μg/ml亮抑酶肽/抑胃酶肽抗蛋白酶。将悬浮液于4℃在25mM Tris/HCl pH7.4、50％甘油、1mMDTT、10μg/ml亮抑酶肽、抑胃酶肽、抗蛋白酶中透析过夜，然后用羟磷灰石柱(0.1g/1ml用10mM磷酸钾pH7.0、30％甘油、1mM DTT平衡的悬浮液)吸收。用平衡缓冲液将柱子清洗4次(流速：20-30ml/h)。用0.5M磷酸钾缓冲液洗脱脂肪酶。于4℃将产物透析并超滤(Amicon Diaflo PM 10)浓缩(5-10倍)。半纯的脂肪酶可以于-70℃保存4-6周。
实施例6：生物活性测定法
将荧光脂质类似物单NBD-酰基甘油(NAG)用作底物，它在整合到磷脂囊泡中后颜色由481nm转变成550nm。将溶于DMSO的待测化合物用测定缓冲液(25mM Tris/HCl pH7.4、150mM NaCl)1∶5稀释。向2.5μl这种溶液中加入180μl超声处理的底物溶液(测定缓冲液中包含20μg/ml磷脂酰胆碱、10μg/ml磷脂酰肌醇、50μg/mlNAG)。于30℃预保温15分钟后，加入用测定缓冲液1∶2预稀释的20μl酶溶液，并立即测量485nm的吸收。于30℃保温60分钟后再次测定吸收。480nm吸光值的升高是酶活性的度量。使用10个浓度的新鲜溶解的待测化合物测定IC50值。使用软件包PGRAPHIT(Elsvier-Biosoft)进行数据分析。
朴塞奎宁显示对脂肪酶有抑制作用，IC50是2μM。

Claims (6)

1.朴塞奎宁，它是具有如下通式的化合物：
2.用于生产权利要求1的朴塞奎宁的方法，包括在有氧条件下在包含碳源和氮源的营养培养基中培养保藏号为DSM 13303的担子菌物种Stereum complicatum(ST 001837)及随后的常规分离和纯化。
3.权利要求1的朴塞奎宁在制备药物中的用途。
4.药物学组合物，其中包含有效量的权利要求1的朴塞奎宁和药物学可接受载体。
5.权利要求1的朴塞奎宁作为脂肪酶抑制剂在制备药物中的用途。
6.权利要求1的朴塞奎宁在体外非疾病治疗性应用中作为脂肪酶抑制剂的用途。
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Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: AVENTIS PHARMACY (GERMANY)INTERNATIONAL CO., LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Frankfurt, Germany

Patentee after: Aventis Pharma GmbH

Address before: Frankfurt, Germany

Patentee before: Awentis Medicines Deutschland GmbH

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050504