CN1058046A - 制备β-羟基-α-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

β-羟基-α-氨基酸是通过丝氨酸羟甲基转移 酶催化的醛与甘氨酸的缩合而得到的。对于大多数 醛主产物为L-赤式非对映体。例如，在该方法中， 琥珀酸半醛甲酯与甘氨酸缩合形成L-赤式α-氨 基-β-羟基己二酸单甲酯。

Description

本发明涉及制备β-羟基-α-氨基酸的方法。特别涉及基本上以L-赤式存在的制备β-羟基-α-氨基酸的酶催化方法。
β-羟基-α-氨基酸具有许多用途，包括用作制备β-内酰胺抗菌素的中间体。例如参见Mattingly，P.G.;Miller，M.J.，J.Org.Chem.1981，46，1557和Miller，M.J.等人，J.Am.Chem.Soc.1980，102，7026。制备β-羟基-α-氨基酸的一些化学方法已为公知，然而，其中大多数存在着一种或多种缺点。它们包括缺乏一般性，立体化学控制差，需要手性助剂，或产生的基本为苏式（或顺式）异构体。
酶催化方法比化学方法具有某些特殊的优点。例如，它们可以在水溶液体系中在温和的条件下进行，并且通常为立体选择性的。在本发明方法中所用的酶一般称为醛缩酶。一种这样的醛缩酶为丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）（Schirch，L.Adv.Enzy-mol.Relat.Areas  Mol.Biol.1982，53，83和Schirch，L.;Gross，T.J.Biol.Chem.1968，243，5651）。醛缩酶的天然生物作用包括一碳单元向或从丝氨酸的转移，和象苏氨酸及别苏氨酸这类β-羟基-α-氨基酸的逆醛醇裂解，生成醛和甘氨酸。
醛缩酶普遍存在于植物、细菌和动物中，例如，玉米籽苗、绿豆籽苗和兔肝。本发明方法包括在温和条件下使用SHMT合成β-内酰胺抗菌素的前体β-羟基-α-氨基酸。本方法以大量实例提供了L-赤式异构体形式的β-羟基氨基酸，这是形成β-内酰胺抗菌素的合适的非对映形所需的前体形式。
本发明提供了制备β-羟基-α-氨基酸的酶催化方法，该方法包括在PH约7到约8之间的水溶液介质中，在约30℃到约55℃之间的温度下，将甘氨酸和脂肪醛，如乙醛或丁醛或芳香醛，如2-呋喃甲醛与丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）一起培养。例如，在该方法中可将琥珀酸半醛的酯转化为β-羟基-α-氨基己二酸单酯。
本文提供的方法用于制备由下述通式（Ⅰ）表示的β-羟基-α-氨基酸
Figure 911043691_IMG3
该方法包括在PH约5.5到约9之间的水溶液介质中，在丝氨酸羟甲基转移酶和5-磷酸吡哆醛的存在下，混合甘氨酸和醛RCHO。该方法是在约30℃到约55℃之间，优选约37℃的温度下进行。
甘氨酸和醛RCHO的相对比例可以变化，然而，当使用等摩尔量时，可以得到较高的产品的收率。所用酶的量取决于酶已被纯化的程度以及存在的任何杂质对酶催化活性可能具有的影响。
反应介质的PH是用缓冲液处理，使其在约5.5到约9之间，对于大多数底物来说，优选PH在约7.0到约8.0之间。磷酸盐缓冲液适于提供所需的PH范围。
正如其他酶催化反应的情况一样，在催化特定底物的反应中，辅助因素能够影响酶的底物的专一性以及酶的效率。在该方法中，对丝氨酸羟甲基转移酶的主要辅助因素是5′-磷酸吡哆醛。除了PLP以外，可被附加的其他辅助因素对于以某些底物所得到的产品的收率具有有利的影响。例如，在转化底物丙酮醛过程中，四氢叶酸增加了酶的活性。此外，偏钒酸钠也可作为转化同一醛的辅助因素。
上面的通式Ⅰ描述了由本方法提供的以内盐形式存在的β-羟基-α-氨基酸。这种盐的形式是在本方法的PH条件下所预料的形式，然而，在其他条件下也可能存在由下面通式所表示的非离子形式。
Figure 911043691_IMG4
用于本方法的醛RCHO可以是直链或支链烷基、链烯基或炔基醛或芳香或杂环醛。醛可以具有取代基，例如，烷氧基，如甲氧基或乙氧基;酯化羧基，如羧基的C1-C4烷基酯，氰基;羟基;酰化羟基，如甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、或丁酰氧基;卤素，如氟或氯;卤代烷基，如三氟甲基或氯甲基;或脂肪醛可以包含氧基，即RCHO可以是酮醛，如4-氧代戊醛或丙酮醛等。同样，芳香醛或杂环醛可以在芳环或杂环上或在其任何烷基或链烯基部分上被取代。能用于本方法中的烷基、链烯基和炔基醛RCHO的实例有乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、琥珀酸半醛甲酯、琥珀酸半醛苄酯、4-羟基戊醛、戊二酸半醛甲酯、丙酮醛、O-甲酰基4-羟基戊醛、3-氟戊醛、5-氯戊醛、2-氯丙醛、炔丙醛以及由下面通式表示的烯烃醛
Figure 911043691_IMG5
其中R'为氢或C1-C4烷基，如丙烯醛、丁烯醛和4-戊烯醛。
用于本方法中的芳香和杂环醛RCHO的实例有苯甲醛、甲苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、3，4-二甲氧苯甲基醛、苯乙醛、3-苯基丙醛、2-苯基丙醛、呋喃甲醛、2-（2-呋喃基）乙醛、3-呋喃基丙烯醛、3-苯基丙烯醛、2-噻吩甲醛、3-（2-噻吩基）丙烯醛、3-（甲氧苯基）丙烯醛、及诸如此类的芳香醛。
在本发明的方法中通式1的R优选为C2-C6链烯基、C2-C6炔基、或被酯化羧基取代的C1-C6烷基、C1-C4链烷酰氧基、或被芳香烷氧基取代的C1-C6烷基。这里所用的术语C2-C6链烯基是指直链和支链不饱和烃链，如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基;C2-C6炔基是指乙炔基、丙炔基、丁炔基、可以被支链化的戊炔基和己炔基;可被酯化羧基取代的C1-C6烷基是指被酯化羧基取代的直链和支链烷基，其中酯基为C1-C4烷基、苯基、苄基、取代苄基，如对甲氧基苄基、甲基苄基、对硝基苄基、二苯甲基、或其他合适的羧基保护基。这类基团的实例有乙氧羰基甲基、2-（甲氧羰基）乙基、3-（叔丁氧羰基）丙基、3-（苄氧羰基）丁基、5-（4-甲氧苄氧羰基）己基、以及诸如此类被酯化羧基取代的烷基。术语被C1-C4烷氧基取代的C1-C6烷基是指甲氧甲基、2-乙氧乙基、4-叔丁氧丁基、3-异丙氧戊基、2-乙氧己基等等;被氟或氯取代的C1-C6烷基是指如下面这样的基团;2-氟乙基、2-氯乙基、4-氯丁基、5-氯戊基、氯甲基、氟甲基、3-氯-4-甲基戊基等等;被氰基取代的C1-C6烷基是指氰甲基、2-氰乙基、4-氰丁基、3-氰丁基、5-氰己基等等;被羟基取代的C1-C6烷基是指羟甲基、2-羟乙基、4-羟丁基、3-羟丙基、3-羟己基、以及诸如此类的基团;被C1-C4链烷酰氧基取代的C1-C6烷基是指如下面这样的基团;2-乙酰氧乙基、2-甲酰氧乙基、3-乙酰氧丙基、4-丙酰氧丁基以及诸如此类的基团;被芳烷氧基取代的C1-C6烷基是指苄氧甲基、二苯基甲氧甲基、4-苄氧丁基、2-（4-甲氧苄氧）乙基、3-二苯基甲氧丙基、以及诸如此类的基团。
用于该方法中的特别优选的醛是由RCHO表示的其中R为如上定义的链烯烃的醛，
Figure 911043691_IMG6
或R为被酯化羧基或C1-C4链烷酰氧基取代的C1-C4烷基。这类基团的实例有2-（甲氧羰基）乙基、2-（苄氧羰基）乙基、3-（乙氧羰基）丙基、2-（甲酰氧基）乙基和2-乙酰氧乙基。
用于该方法中的醛RCHO均为市场上可买到的或通过常规方法可制备的已知化合物。本发明的优选方法包括使用醛RCHO，其中R为2-（酯化羧基）乙基、2-氰乙基、2-（酯化羧基）乙炔基、2-（酯化羧基）乙烯基、3-（酯化羧基）丙基、2-甲酰氧乙基、2-乙酰氧甲基、3-甲酰氧丙基、或3-乙酰氧丙基，其中被酯化羧基的酯部分为C1-C4烷基，如甲基、乙基或叔丁基;苯基、苄基，二苯甲基、三苯甲基或取代苄基，如4-甲氧基苄基或4-硝基苄基。用于本发明中的特别优选的醛为琥珀酸半醛酯。另一个特别优选的醛为戊二酸半醛酯。
下式描述了本发明的方法所进行的反应。
其中R如上所定义。
如上所述，丝氨酸羟甲基转移酶有许多来源。这样的三种来源是兔肝（LaVerne  Schirch和Merle  Mason，J.Biol.Chem.，Vol.237，No.8，1962年8月），玉米籽苗（Masuda，T.等人，Agric  Bi-ol.Chem.1986，50，2763），和绿豆籽苗（Rao，D.N.和Rao，N.A.，Plant  Physiol.1982，69，11）。
下面的表1列出了具有代表性的醛底物，在本方法中用由两种来源的SHMT将这些醛底物转化为β-羟基-α-氨基酸。表1中底物的转化是通过底物和甘氨酸与SHMT在本方法条件下培养来进行的。所用的一些方法条件为所有底物所共有并详述于下面的段落。无论何处出现例外，在每种情况中对它们均作了说明。
上述培养是在10mM磷酸盐缓冲液中，PH7.3，含浓度约80μm的5-磷酸吡哆醛的条件下进行的。为得到最佳结果，所有溶液均用蒸馏的去离子水配制。转化是在约37℃，在置于恒温水浴中的封闭的500μL聚丙烯微型离心管形瓶中进行的。除了当这些管形瓶被从水浴中移出以便取出等分试样进行分析以外，这些微型离心管形瓶均被保护兔受光照。对于所有的转化均用SHMT培养并联进行酶空白培养。培养混合物的总体积一般约为200μL。空白的条件与培养混合物的条件相同，只是没有酶的存在。
表1
受SHMT作用的醛（RCHO）底物
醛（RCHO） 酶1
R＝  兔肝  玉米籽苗
-CH3+ +
-CH2CH2CH3+ ND
-CH2CH3ND +
-CH2CH2CO2CH3+ +
-CH2CH2CO2（CH3）2+ ND
-CO2H - -
-CH2CH2CH2CO2CH3+ +
-C（O）C·2 3+ +
-CH2CH2CH2OCHO + ND
-C6O5+ -
-CH2OCH2C6H5ND +
2-呋喃基  +  +
2-（2-呋喃基）乙基  +  -
1/  +＝转化;-＝无可检测出的转化;
ND＝未测定
2/ 对于兔肝以SHMTVO- 3存在，对于玉米以SHMT四氢叶酸盐存在。
可以对生产β-羟基-α-氨基酸的本方法进行监测，这是通过不时地从培养混合物中取出等分试样，并通过HPLC分离和荧光检测存在于混合物中的所有伯胺化合物中的由异吲哚衍生的邻苯二醛来对这些样品进行分析。这种分析方法已于下列文献中描述：Jones，B.N.;Gilligan，J.P.，J.Chrom.1983，266，471;Jones，B.N.等人，J.Liq.Chrom.1981，4，565，和Simons，Jr.，S.S.等人，J.Am.Chem.Soc.1976，98，7098。对于培养混合物和酶空白样的HPLC分析能够确定色谱上属于酶产物的峰。
本发明的方法是通过将醛加到含PLP和另一种辅助因素的甘氨酸缓冲溶液中，然后将该溶液与酶缓冲溶液混合来进行的。另一种方法是将含PLP的甘氨酸缓冲溶液与酶溶液混合，然后加入醛。也可以在含PLP缓冲液的存在下，将酶溶液加到醛和甘氨酸溶液中。
在该方法中，醛RCHO不必完全在溶液中发生其转化。仅部分溶于水溶液反应介质中的醛也可以用作酶的底物。
其中醛RCHO为脂肪醛（即与醛官能团羰基连接的碳为饱和的，CH2）的本发明的方法优先形成β-羟基-α-氨基酸或酯的L-赤式非对映体。然而，当醛底物为芳族的（即与醛官能羰基连接的碳为芳族系的一部分）时，以约等量得到苏式和赤式产物。例如，苯甲醛形成β-苯基丝氨酸的苏式和赤式异构体。
在本发明的方法中所得到的β-羟基-α-氨基酸的实例有β-苯基丝氨酸、β-（2-呋喃基）丝氨酸、β-羟基-α-氨基己二酸、β-羟基-α-氨基己酸、β-羟基-α-氨基-ω-甲酰氧基己酸、β-羟基-α-氨基-γ氧代戊酸、β-羟基-α-氨基-γ-苯基丁酸、β-羟基-α-氨基庚酸、β-羟基-α-氨基-ω-（2-呋喃基）-戊酸、以及诸如此类的氨基酸。
在本方法的一个优选实施方案中，将琥珀酸半醛的酯，如C1-C4烷基酯如甲酯或异丙酯与甘氨酸和SHMT于磷酸盐缓冲液中在PLP存在下培养，生成β-羟基-α-氨基己二酸半酯，为L-赤式异构体。在本方法的另一个优选实施方案中，将戊二酸半醛的酯如甲酯与SHMT一起培养，生成β-羟基-α-氨基庚二酸半酯。
下列反应式说明了本发明的上述两个实施方案。
Figure 911043691_IMG7
其中R1为C1-C4烷基、苯基、苄基、二苯甲基、4-甲氧苄基或4-硝基苄基，并且n为2或3。
本发明进一步提供氨基酸，β-羟基-α-氨基己二酸，由通式R1OOC-CH2-CH2-CH（OH）CH（NH2）COOR1′表示的单和二R1酯及其盐，其中R1如上所定义，R1′为氢或R1。在本方法中的这种氨基酸以L-赤式被得到。二酸的盐或其单酯可以按照常规方法来形成。这些盐包括碱金属盐如钠和钾盐，碱土金属盐如钙盐、铵盐及胺盐，如与苄胺、二苄胺、环己胺、二环己胺、C1-C4烷基伯和仲胺，如甲胺、乙胺、二乙胺、二正丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、二丙醇胺所形成的胺盐，以及诸如此类的盐。这类盐可用于二酸或其单酯的分离和纯化，并提供便于储存的氨基酸的稳定形式。还可提供与氨基酸及其酯形成的酸加成盐。这类盐是与比氨基酸的酸性羧酸基更强的酸形成的。这类酸的实例有氢氯酸、氢溴酸、磷酸和硫酸、以及磺酸、如对甲苯磺酸、萘磺酸、甲磺酸及正丁磺酸。
该R1酯是指单和二酯，其中R1与在上面反应式中所定义的意义相同。这类酯的实例有它们的单甲酯、单乙酯、二甲酯、二乙酯、叔丁酯、二叔丁酯、苄酯、4-甲氧基苄酯及二苄酯。
由本发明方法提供的β-羟基-α-氨基酸是合成重要的β-内酰胺化合物的有用的中间体。可通过已知的方法将这些产物转化为可用于制备已知的抗菌素化合物的β-内酰胺化合物。例如，如下面反应式所示，将β-羟基-α-氨基酸转化为异羟肟酸酯衍生物，并将后者环化形成3-氨基-4-取代β-内酰胺化合物，
其中R与上述的及通式1的定义相同，R2为烷基、链烷酰基或芳烷基。异羟肟酸酯的形成及异羟肟酸酯环化为β-内酰胺是按照下列文献描述的方法进行的：Miller，M.J.Accts.Chem.Res.1986，19，49;Rajendra，G.和Miller，M.J.Tetrahedron Lett.，1987，28，6257;及Kolasa，T.和Miller，M.J.Tetrahedron Lett.，1987，28，1861。
另外，β-羟基-α-氨基酸可以转化为N-（取代甲基）氮杂环丁酮，如Miller，M.J.于US4，595，532中所述。此外，本方法的氨基酸产物还可以转化为N-（膦酰甲基）氮杂环丁酮，如Miller，M.J.于US4，820，815中所述。
下列制备及实施例进一步描述了本发明的方法，而这并不意味着局限于此。
由玉米籽苗制备丝氨酸羟甲基转移酶
下面所有方法均在4℃下进行。用韦林氏搀合器使洗涤的5-7天大的玉米籽苗在含有1mM乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、1mM二硫苏糖醇和125μm的5'-磷酸吡哆醛的100mM磷酸-氢钾中均匀化。每升混合物含有约960g籽苗。将此匀浆经干酪布过滤，滤液经硫酸铵处理形成沉淀。将与35-50%饱和硫酸铵经在13，800xg下离心40分钟而形成沉淀的蛋白质溶于10mM磷酸盐缓冲液中，其PH为7.8，并含有125μm5′-磷酸吡哆醛和1mMEDTA。在没有EDTA存在的相同的缓冲液中，将此溶液渗析并浓缩至5-15mg蛋白质/mL。通过酵母醇脱氢酶（ADH），在醛缩酶催化的L-别苏氨酸的逆醛醇缩合与形成乙醛的该NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式）的相关还原之间，蛋白质的醛缩酶活性的测定包括-偶合体系。比活性平均为78毫单位/mg蛋白质。将一个单位的酶活性定义为，于室温下，在ADH、120mML-别苏氨酸、125μmPLP和120μmNADH的100mM磷酸盐缓冲液（PH为7.5）的存在下，每分钟引起一个光密度单位（在340nm）的改变所需要的酶的量。
当制备不使用SHMT时，可将其以冷冻干燥形式储藏或用10%甘油冷冻。
在下列实施例中，除非另有说明，缓冲体系均为10mM磷酸钾，PH为7.3，并含有浓度为约80μm的5′-磷酸吡哆醛（PLP）。所有溶液均用蒸馏的去离子水制备。
用酶培养是于37℃在置于恒温水浴中的封闭的500μL聚丙烯微型离心管形瓶中进行。
在实施例中给出的进行HPLC分析的保留时间可经常有微小的改变，这是由于存在如柱、平衡、缓冲液等等因素的微小变化。
在下列实施例中所用的SHMT由L.Schirch（上文）得自兔肝。
实施例1
苏氨酸的制备
在含PLP的磷酸盐缓冲液中制备甘氨酸（34mM）溶液，加入足够的新蒸馏的乙醛使其浓度也为34mM。当将其加入酶溶液时，每一底物的浓度为17mM。
将SHMT（0.1mg）的200μL标准磷酸盐缓冲液的溶液放入2mL玻璃管形瓶中。加入等体积的底物溶液，用橡胶隔膜和铜线将瓶密封以使乙醛的损失减至最小。将这个瓶和酶空白溶液在37℃下培养。
用50μL微升注射器在培养时间为1.0、2.0、3.0、4.0和20.5小时时取出等分试样（10μL），并通过HPLC进行分析。
色谱显示出L-赤式异构体在21.9分钟保留时间的大峰和苏式异构体的小峰。对所形成的氨基酸的识别是通过用可信的并在市场上可买到的苏氨酸异构体的共注射来证实的。
实施例2
α-氨基-β-羟基己酸
将甘氨酸（25.5mg，0.340mmol）和正丁醛（25.3mg，0.351mmol）溶于10mL标准磷酸盐缓冲液中来制备底物溶液，分别得到两种底物的浓度为34mM和35mM。
将SHMT（0.1mg）的100μL缓冲液的溶液放在0.5mL聚丙烯管形瓶中，将另外100μL没有酶的缓冲液放在另一个管形瓶中，向每个瓶中加入100μL底物溶液。
在培养时间为1.0、3.0、7.25和21小时时从酶和空白溶液中取出等分试样，并通过HPLC进行分析。
在色谱中出现两个峰，大峰在25.7分钟，小峰在24.3分钟。这些峰与真实的外消旋产物的峰相对应。该真实的物质是通过在甘氨酸的铜配合物上进行的醛醇缩合反应来外消旋地制备的，见下列文献：S.Akabari等人，生物化学和生物物理的案卷（Archives  of  Biochemistry  and  Biophyisics）1959，83，1和J.P.Greenstein及M.Winitz，“氨基酸的化学”John  Wiley  &  Sons，New  York，1961，Vol.3，pp2249-2250。
实施例3
α-氨基-β-羟基己二酸单甲酯
将甘氨酸（13.3mg，0.177mmol）和琥珀酸半醛甲酯（20mg，0.172mmol）溶于5.0mL缓冲液中，得到各自的浓度分别为35mM和34mM。在此试验中所用的醛不含DMSO，不过用这种醛前面的培养仍含有杂质（这是由其合成中通过CH2＝CH-CH2-CH2-COOCH3的臭氧分解接着用二甲亚砜处理所留下的）。
将100μL底物混合物加到SHMT（0.1mg）的100μL缓冲液的溶液中。在培养时间为0.5、1.0、2.0、3.0和24小时时取出等分试样。
观测到主产物峰（L-赤式）在tR22.5分钟并在2小时时达到其最大值。
在HPLC分析中，在开始的两个小时期间里出现一个小的新峰，其保留时间约8分钟。在24小时期间内，这个峰的强度逐渐增大，而相应于起始物甘氨酸及中间体α-氨基-β-羟基己二酸甲酯的峰则减小。24小时以后，新峰与甘氨酸和酯的比例为38∶47∶15。对应于新峰的化合物的结构通过单独的合成并将此真实产物与酶催化形成的产物共注射，被确定为是L-赤式-α-氨基-β-羟基己二酸（R＝CH2-CH2-CO2H）。真实产物的化学合成是通过琥珀酸半醛甲酯与手性恶嗪的烯醇化硼的醛醇缩合反应来完成的（Reno，D.S.;Lotz，B.T.;Miller，M.J.Tetrahe-dron Lett.1990，31，827），接着进行去保护并水解，得到所述化合物。
在酶催化合成过程中，这种母体氨基酸的形成是由于最初生成的氨基酸单甲酯的水解而发生的。由于该产物多了一个电离的羧酸基团，它不是酶催化的可逆醛醇缩合的底物。因此，新的氨基酸产物（L-赤式-α-氨基-β-羟基己二酸）就聚集起来。作为二羧酸氨基酸产物，可由离子交换色谱而将其从反应混合物中纯化出来（Green-Stein，J.P.，Winitz，M.，“氨基酸的化学”Vol2，pp1452-1460，Wiley，New  York，N.Y.1961）。
实施例4
α-氨基-β-羟基己二酸单异丙酯
将甘氨酸（26.1mg，0.348mmol）溶于10.0mL缓冲液中，并加入琥珀酸半醛异丙酯34mg（含有由其制备所带来的DMSO污染物）。在培养中DMSO的存在对酶或该反应无不利影响。在计及DMSO的存在后，缓冲液中醛的浓度为18mmol。在培养混合物中的甘氨酸和醛的起始浓度分别为17.4mM和9mM。
将底物混合物（100μL）加到SHMT（0.1mg）的100μL缓冲液的溶液中及酶空白样中。
在培养时间为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、17.25、25和52小时时取出等分试样，并通过HPLC检验。主产物峰（L-赤式）在0.5小时内在TR25分钟时出现，并在2-4小时逐渐增至最大值。
实施例5
α-氨基-β-羟基庚二酸单乙酯
用于该培养中的戊二酸半醛甲酯含有DMSO，其重量比约1∶1。DMSO是制备醛的副产物，该制备是通过1-甲氧基环戊烯的臭氧分解来进行的，它在处理中包含DMSO，（cline，D.L.J.;Russel，C.G.，Tetrahedron，1980，36，1399）。将甘氨酸（25.6mg，0.341mmol）和醛/DMSO混合物（66.7mg）溶于100ml缓冲液中制备底物溶液，得到甘氨酸和醛的浓度为34.1和～25mM。
酶溶液包括溶于40μL而不是100μL缓冲液中的0.1mgSHMT。将底物溶液（40μL）加到酶和空白溶液中并按常规培养。在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和17.0小时时取出等分试样（10μL）。截止到0.5小时，酶形成的峰在HPLC中于23.7分钟时出现，它相应于所需产物并且积分达到约20%收率。第二个小的酶诱导峰出现的保留时间为22.3分钟，它可相应于少量的苏式异构体。
实施例6
α-氨基-β-羟基-γ-氧代戊酸
将甘氨酸（25.5mg，0.340mmol）和丙酮醛（61.1mg的40wt%溶液，0.327mmol丙酮醛）溶于10mL缓冲液中，PH7.2，得到储备溶液的浓度为34mM（甘氨酸）和32.7mM（丙酮醛）。加入偏钒酸钠（1.5mg来自Aldrich的90%纯化合物）。约30分钟后它已溶解，得到浓度为1.11mM。
将80μL底物溶液加到酶溶液（在80μL中的0.1mgSHMT）中。在培养时间为0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、29和53小时时取出等分试样（10μL）。
通过HPLC对氨基酸的分析表明，新的氨基酸保留时间为8.5分钟。为了证实这就是所需要的氨基酸，用甘氨酸铜方法制备真实的外消旋物。因此，将4.23g甘氨酸铜（Ⅱ）（20mmol）溶于10mL9MKOH水溶液中。加入丙酮醛（16.2mL40wt%水溶液，相当于7.0g，9.71mmol醛）。5.25小时后，向得到的棕色溶液中加入3MNH4OH（40mL），并将溶剂蒸发得到棕色油状物。使该油状物通过Dowex-50（+NH4型）柱，用水洗脱，得到部分纯化的氨基酸。
实施例7
α-氨基-β-羟基-6-甲酰氧基己酸
在此培养中的醛仍残留大量的DMSO，它来自通过二氢吡喃的臭氧分解，接着用DMSO处理的醛的制备。向10.0mL缓冲液中加入O-甲酰基4-羟基丁醛（39.5mg，约0.20mmol，考虑到DMSO）和甘氨酸（25.5mg，0.340mmol）。
将底物溶液（40μL）加到酶溶液（0.1mgSHMT，在40μL中）和空白溶液中。在培养混合物中的两种底物的浓度为17mM（甘氨酸）和10mM（醛）。在培养时间为0.5、1.0、2.0、3.0、7.0及24小时时取出等分试样（10μL）。
在0.5小时时取出第一等分试样，通过氨基酸分析记录了两个新的氨基酸。紧跟在甘氨酸峰之后，在15.6分钟时出现一个小峰。另一个在22.5分钟时为一个大的尖峰。截止到3小时，对应于所期望的氨基酸在22.5分钟时的峰以约为甘氨酸峰的10%达到最大值，然后慢慢减小，而15.6分钟时的峰强度则稍微增大。在15.6分钟时流出的氨基酸为在反应介质中甲酸酯缓慢水解的产物。其结构相应于α-氨基-β-羟基-6-羟基己酸。
实施例8
β-苯基丝氨酸
所用的缓冲溶液含有浓度为160μM而不是80μM的PLP。苯甲醛在使用之前被立即蒸馏。在将缓冲溶液加入底物之前，用氮气鼓泡通过此溶液而使其脱氧。这是为了使苯甲醛处于溶液中时被氧化的可能性减至最小。
将甘氨酸（25.4mg，0.338mmol）和苯甲醛（35μL，0.344mmol）溶于10.0mL的缓冲液中。将此溶液（100μL）加入到100μLSHMT溶液（0.1mg酶）中。在培养时间为1.0、5.25和7.0小时时取出等分试样。
在色谱中出现两个产物峰，较大的峰在24.8分钟，较小的峰在23.7分钟。将本实验的产物混合物与市场上可买到的真实的外消旋β-苯基丝氨酸进行比较。两种混合物的峰正好相吻合。此外，通过用真实的苏式β-苯基丝氨酸共注射进行比较时，前面的（较小的）峰较之后面的峰是被增大了。这些结果说明，酶产生出芳香氨基酸的两对对映体，但更有利于赤式异构体。
实施例9
α-氨基-β-羟基-β-（2-呋喃基）丙酸
用于该实施例中的2-呋喃甲醛是通过经碳酸钠的两次蒸馏来制备的，其第二次蒸馏是在氮气氛下进行的。在使用之前，将蒸馏过的醛在氮气氛下干燥避光保存。
将甘氨酸（14.0mg，0.186mmol）和呋喃甲醛（15.5μL，0.187mmol）溶于缓冲液（10.0mL）中制得底物溶液。将此溶液360μL加入到酶溶液（0.2mgSHMT，在40μL中）中时，每一底物浓度为17mM。
在1.0、2.0、4.0、5.0、18、24、72和114小时时取出等分试样（10μL）。在1小时之内，通过HPLC分析确定形成了两个新的氨基酸。相应于一个异构体的较大的峰具有保留时间21-22分钟，而相应于另一异构体（苏式）的较小的峰（小于较大峰的50%）具有保留时间19-20分钟。
实施例10
α-氨基-β-羟基-δ-（2-呋喃基）戊酸
将甘氨酸（25.5mg，0.340mmol）和醛（46.3mg，0.373mmol）溶于10.0mL缓冲液中制得底物溶液。该醛（一种液体）溶解需要15分钟。
将底物溶液（100μL）加到酶溶液（0.1mgSHMT，在100μL缓冲液中）中并在37℃下培养。在0.55、1.0、2.0、4.25、8.0和21小时时取出等分试样。在0.5小时内在HPLC分析中出现的具有保留时间21.3分钟的峰表明，约3%的甘氨酸转化为醛醇缩合产物。
实施例11
按照前面实施例中所描述的培养方法，用炔丙醛得到α-氨基-β-羟基-己-5-炔酸。
实施例12
在上面实施例所描述的培养条件下，用丙烯醛得到α-氨基-β-羟基-己-5-烯酸。
实施例13
按着前面实施例所描述的方法并在所述条件下，用丙烯醛得到α-氨基-β-羟基-戊-4-烯酸。
实施例14
在前面实施例的条件下，用β-氰基丙醛形成α-氨基-β-羟基-δ-氰基戊酸。

Claims (8)

1、一种制备下述通式的β-羟基-α-氨基酸的方法，
Figure 911043691_IMG1
其中R为C2-C6链烯基；C2-C6炔基；被酯化羧基、C1-C4烷氧基、氟、氯、溴、氰基、羟基、C1-C4链烷酰氧基、苯基、呋喃基、或苄氧基取代的C1-C6烷基；苯基；或呋喃基；该方法包括在约30℃到约55℃之间的温度下，在PH约5.5到约9之间的水溶液中，将通式RCHO的醛(其中R与上面的定义相同)和甘氨酸在5′-磷酸吡哆醛存在下与丝氨酸羟甲基转移酶混合。
2、权利要求1的方法，其中R为C2-C6链烯基;C2-C6炔基;或被酯化羧基、C1-C4链烷酰氧基取代的C1-C6烷基;或被芳烷氧基取代的烷基。
3、权利要求1的方法，其中R为被酯化羧基或C1-C4链烷酰氧基取代的C1-C4烷基。
4、权利要求1的方法，其中醛RCHO为下式
Figure 911043691_IMG2
其中R1为C1-C4烷基、苄基、二苯甲基、4-甲氧苄基或4-硝基苄基;n为2或3。
5、权利要求4的方法，其中醛RCHO为琥珀酸半醛甲酯。
6、权利要求4的方法，其中醛RCHO为戊二酸半醛甲酯。
7、权利要求1的方法，其中R为被酯化羧基、C1-C4链烷酰氧基、苯基、呋喃基或苄氧基取代的C1-C6烷基。
8、权利要求7的方法，其中α-氨基-β-羟基酸为L-赤式非对映体。
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