DE69124143T2

DE69124143T2 - Verfahren zur Herstellung von Beta-Hydroxy-alpha-Aminosäuren

Info

Publication number: DE69124143T2
Application number: DE69124143T
Authority: DE
Inventors: Marvin Joseph Miller
Original assignee: University of Notre Dame
Current assignee: University of Notre Dame
Priority date: 1990-06-04
Filing date: 1991-06-03
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2011-06-04
Also published as: EP0460883A3; NZ238342A; CA2043761A1; EP0460883A2; CS164591A3; FI912626A0; HUT61597A; AU7814691A; JPH0787989A; HU212925B; DK0460883T3; EP0460883B1; FI912626A; AU637705B2; NO912120D0; ZA914201B; KR920000701A; ES2099135T3; DE69124143D1; YU97891A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosänren. Insbesondere betrifft sie ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren im wesentlichen in der L- Erythroform.
Die β-Hydroxy-α-aminosäuren haben viele Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Verwendung als Zwischenprodukte zur Herstellung von β-Lactamantibiotika. Siehe z.B. P.G. Mattingly; M.J. Miller, J. Org. Chem. 1981, 46, 1557 und M.J. Miller et al. 1 Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7026. Eine Anzahl von chemischen Methoden zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren sind beannt, die meisten jedoch haben einen oder mehrere Nachteile. Dies schließt ein, daß sie schlecht verallgemeinert werden können, schlecht stereochemisch kontrolliert werden können, chirale Hilfsstoffe erfordern oder daß hauptsächlich die threo-(oder syn-)Isomeren hergestellt werden.
FR-A 2 174 964 offenhart biologische Verfahren zur Herstellung von Aminosäurederivaten, während GB-A 2 130 216 eine enzymatische Synthese von L-Serin offenbart.
Enzymatische Verfahren haben einige wesentliche Vorteile gegenüber chemischen Verfahren. Z.B. werden sie in wäßrigen Systemen unter milden Bedingungen durchgeführt und sind häufig stereoselektiv. Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendete Enzym ist allgemein bekannt als Aldolase. Eine solche Aldolase ist Serinhydroxymethyltransferase (SHMT), L. Schireh, Adv. Enzymol. Relat Areas Mol. Biol. 1982, 53, 83 und L. Schirch; T. Gross, J. Biol. Chem. 1968, 243, 5651. Die natürliche biologische Rolle der Aldolase betrifft den Transfer einer Einheit mit einem Kohlenstoff zu oder von Serin und die Retroaldolspaltung von β-Hydroxy-α-aminosäuren, wie Threonin und allo-Threonin, um einen Aldehyd und Glycin zu erzeugen.
Die Aldolasen sind in Pflanzen, Bakterien und Tieren, z.B. Maissämlingen, Mungobohnensämlingen und Kaninchenleber ubiquitär vorhanden. Das Verfahren der Erfindung umfaßt die Verwendung von SHMT, um unter milden Bedingungen β-Hydroxy-α-aminosäurevorläufer in p-Lactamantibiotika aufzuarbeiten. Das Verfahren liefert in zahlreichen Fällen die β-Hydroxyaminosäure in der isomeren L-Erythroform, die die für den Vorläufer erwünschte Form ist, die die richtige diastereomere Form des β-Lactamantibiotikums liefert.
Die Erfindung stellt ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren zur Verffigung, das umfaßt, daß manin einem wäßrigen Medium bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8 und einer Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 55ºC Glycin und einen aliphatischen Aldehyd, z.B. Acetaldehyd oder Butanal oder einen aromatischen Aldehyd, z.B. 2-Furfural, mit Serinhydroxymethyltransferase (SHMT) inkubiert. Z.B. wird ein Ester von Bernsteinsäuresemialdehyd in dem Verfahren in P-Hydroxy-α-aminoadipinsäuremonoester umgewandelt.
Das hier bereitgestellte Verfahren zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren der Formel 1
umfaßt, daß man in einem wäßrigen Medium bei einem pH von etwa 5,5 bis etwa 9 Glycin und einen Aldehyd RCHO in Gegenwart von Serinhydroxymethyltransferase und Pyridoxal-5'-phosphat vermischt. Das Verfahren wird bei einer Temperatur zwischen etwa 30ºC und etwa 55ºC und bevorzugt bei etwa 37ºC durchgeführt. In der Formel ist R ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest, der mit veresterten Carboxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, Cyano-, Hydroxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkanoxy-, Phenyl-, Furyl- oder Benzyloxyresten substituiert ist.
Die relativen Anteile von Glycin und Aldehyd RCHO können variieren, jedoch werden offensichtiich höhere Ausbeuten des Produktes erhalten, wenn äquimolare Mengen verwendet werden. Die verwendete Menge an Enzym hangt davon ab, wie stark das Enzym gereinigt ist und von der Wirkung, die Verunreinigungen, die vorbanden sind, auf die enzymatische Aktivität haben.
Der pH des Reaktionsmediums wird auf einen pH zwischen etwa 5,5 und etwa 9 gepuffert und bei den meisten Substraten bevorzugt auf einen pH von 7,0 bis etwa 8,0. Phosphatpuffer sind geeignet, um den gewünschten pH-Bereich zu liefern.
Wie bei anderen enzymatischen Reaktionen können Cofaktoren die Substratspezifitat des Enzyms ebenso wie die Effizienz des Enzyms bei der Katalyse der Reaktion eines gegebenen Sübstrats beeinflussen. Ein wesentlicher Cofaktor für die Serinhydroxymethyltransferase in dem Verfahren ist Pyridoxal-5'-phosphat. Andere Cofaktoren außer PLP, die zugegeben werden können, haben einen nützlichen Effekt auf die Ausbeute des erhaltenen Produktes bei einigen Substraten Z.B. erhöht Tetrahydrofolsäure die Aktivität des Enzyms bei der Umwandlung des Substrats Pyruvaldehyd. Auch Natriummetavanadat dient als Cofaktor für die Umwandlung des gleichen Aldehyds.
Die obige Formel 1 zeigt die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten β-Hydroxy-α- aminosäuren in Form eines inneren Salzes. Diese Form des Salzes ist die, die bei dem pH des Verfahrens erwartet wird, jedoch kann die nichtionische Form der Formel
unter anderen Bedingungen auch existieren.
Der Aldehyd, RCHO, der in dem Verfahren angewendet wird, kann ein geradkettiger oder verzweigter Alkylaldehyd oder ein aromatischer oder heterocyclischer Aldehyd sein. Der Aldehyd kann Substituentengruppen tragen, z.B. Alkoxygruppen, wie Methoxy- oder Ethoxygruppen, veresterte Carboxygruppen, wie C&sub1;-C&sub4;-Alkylester der Carboxygruppe; Cyanogruppen; Hydroxygruppen; acylierte Hydroxygruppen wie Formyloxy-, Acetoxy-, Propionoxy- oder Butyloxygruppen; Halogenatome, wie Fluor oder Chlor; Halogenalkylgruppen, wie Trifluormethyl- oder Chlormethylgrpppen oder der aliphatische Aldehyd kann Oxogruppen enthalten, z.B. kann RCHO ein Ketoaldehyd wie 4-Oxopentanal oder Pyruvaldehyd und dgl. sein. Der aromatische Aldehyd oder heterocyclische Aldehyd kann in ähnlicher Weise am aromatischen oder heterocyclischen Ring oder an irgendeinem Alkyl- oder Alkenylteil davon substituiert sein. Beispiele für Alkylaldehyde RCHO, die in dem Verfähren verwendet werden können, sind Acetaldehyd, Propionaldehyd, Butyraldehyd, Valeraldehyd, Bernsteinsäuresemialdehydmethylester, Bernsteinsäuresemialdehydbenzylester, 4-Hydroxyvaleraldehyd, Glutarsäuresemialdehydniethylester, Pyruvaldehyd, O-Formyl-4-hydroxyvaleraldehyd, 2-Fluorvaleraldehyd, 5-Chlorvaleraldehyd, 2-Chlorpropionaldehyd. Beispiele für aromatische und heterocyclische Aldehyde RCHO zur Verwendung in dem Verfähren sind Benzaldehyd, Tolualdehyd, Anisaldehyd, Veratrylaldehyd, Phenylacetaldehyd, 3-Phenylpropionaldehyd, 2-Phenylpropionaldehyd, Furfural, 2-(2-Furyl)acetaldehyd, 3-Furylacroicin, 3-Phenylacrolein, 2-Thiophenaldehyd, 3-(2-Thienyl)acrolein, 3- (Methoxyphenyl)acrolein und ähnliche aromatische Aldehyde.
Bevorzugt ist in dem erfindungsgemäßen Verfähren R in der Formel 1 ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest, der mit veresterten Carboxygruppen C&sub1;-C&sub4;-Alkanoxyloxygruppen oder einer mit Arylalkoxygruppen substituierten C&sub1;-C&sub6;- Alkylgruppc substituiert ist. Der Ausdruck C&sub2;-C&sub6;-Alkenylrest wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffketten, wie Ethenyl-, Propenyl-, Butenyl-, Pentenyl- und Hexenylgruppen; der Ausdruck C&sub2;-C&sub6;-Alkinylrest bezieht sich auf Ethinyl-, Propinyl-, Butinyl-, Pentinyl- und Hexinylgruppen, die verzweigt sein können; ein mit einer veresterten Carboxygnippe substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf geradkettige und verzweigte Alkylgruppen, die mit einer veresterten Carboxygrnppe substituiert sind, worin die Estergruppe eine C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Phenyl-, Benzyl-, substituierte Benzyl-, wie p-Methoxybenzyl-, Methylbenzyl-, p-Nitröbenzyl-, Diphenylinethyl- oder andere übliche Carboxyschutzgruppe ist Beispiele für solche Gruppen sind Ethoxycarbonylmethyl-, 2-(Methoxycarbonyl)ethyl-, 3-(t-Butyloxycarbonyl)propyl-, 3- (Benzyloxycarbonyl)butyl-, 5-(4-Methoxybenzyloxycarbonyl)hexylgruppen und ähnliche Alkylgruppen, die mit veresterten Carboxygruppen substituiert sind. Der Ausdruck mit C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyresten substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf Methoxymethyl-, 2-Ethoxyethyl-, 4-t-Butyloxybutyl-, 3-Isopropoxypenlyl-, 2-Ethoxyhexylgruppen und dgl.; ein mit Fluor oder Chlor substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf solche Gruppen wie 2-Fluorethyl-, 2-Chlorethyl-, 4-Chlorbutyl-, 5-Chlorpentyl-, Chlormethyl-, Fluormethyl-, 3-Chlor-4-methylpentylgruppen und dgl.; ein mit einer Cyanogruppe substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf Cyanomethyl-, 2-Cyanoethyl-, 4- Cyanobutyl-, 3-Cyanobutyl-, 5-Cyanohexylgruppen und dgl.; ein mit einer Hydroxygruppe snbstituierter C&sub1;-C&sub6;- Alkylrest bezieht sich auf Hydroxymethyl-, 2-Hydroxymethyl-, 4-Hydroxybutyl-, 3-Hydroxypropyl-, 3-Hydroxyhexylgruppen und ähnliche Gruppen; ein mit C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyloxyresten substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf solche Gruppen, wie 2-Acetoxyethyl-, 2-Formyloxyethyl-, 3-Acetoxypropyl-, 4-Propionoxybutylgruppen und ähnliche Gruppen und ein mit Arylalkoxyresten substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest bezieht sich auf Benzyloxymethyl-, Diphenylmethoxymethyl-, 4-Benzyloxybutyl-, 2-(4-Methoxybenzyloxyethyl-, 3-Diphenylmethoxypropylgruppen und ähnliche Gruppen.
Die für das Verfahren verwendeten Aldehyde, RCHO, sind alle bekuinte Verbindungen, die im Handel erhältlich sind oder mit üblichen Methoden hergestellt werden können. Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung umfaßt die Verwendung des Aldehyds RCHO, worin R eine 2-(veresterte Carboxy)ethyl-, 2-Cyanoethyl-, 2- (veresterte Carboxy)ethinyl-, 2-(veresterte Carboxy)vinyl-, 3-(veresterte Carboxy)propyl-, 2-Formyloxyethyl-, 2- Acetoxymethyl-, 3-Formyloxypropyl- oder 3-Acetoxypropylgruppe ist, worin der Esteranteil der veresterten Carboxygrupe ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist, z.B. ein Methyl-, Ethyl- oder t-Butylrest; ein Phenyl-, Benzyl-, Diphenylmethyl-, Trityl- oder substituierter Benzylrest, z.B. ein 4-Methoxybenzyl- oder 4-Nitröbenzylrest ist. Ein besonders bevorzugter Aldehyd zur Verwendung für die vorliegende Erfindung ist Bernsteinsäuresemialdehydester. Ein weiterer besonders bevorzugter Aldehyd ist ein Ester des Glutarsäuresemialdehyds.
Das folgende Diagramm zeigt die in dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführte Reaktion:
RCHO + NH&sub2;CH&sub2;COOH T R-CH(OH)-CH(NH&sub3;&spplus;)COO&supmin;,
worin R wie oben definiert ist.
Wie oben beschrieben ist die Serinhydroxymethyltransferase aus einer Anzahl von Quellen verfügbar. Drei solche Quellen sind Kaninchenleber (Laverne Schirch und Merle Mason, 3. Biol. Chem., Band 237, Nr.8, August 1962), Maissämlinge (T. Masuda et al., Agric. Biol. Chem. 1986, 50, 2763) und Mungöbohnensämlinge (D.N. Rao und N.A. Rao, Plant Physiol. 1982, 69, 11).
Die folgende Tabelle 1 führt beispielhaft Aldehydsubstrate auf, die mit dem Verfahren mit SHMT aus 2 Quellen in β-Hydroxy-α-aminosäuren umgewandelt wurden. Die Umwandlung der Substrate in Tabelle 1 wurde durchgeführt, indem das Substrat und Glycin mit SHMT unter den Bedingungen des Verfahrens inkubiert wurden. Ein Teil der verwendeten Verfährensbedingungen war für alle Substrate gleich und ist detailliert in den folgenden Abschnitten angegeben. Wenn es Ausnaumen gab, sind sie in jedem Fall angegeben.
Die Inkubationen wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 7,3, der Pyridoxal-5'-phosphat in einer Konzentration von etwa 80 µM enthielt, durchgeführt. Alle Lösungen wurden aus destilliertem, deionisiertem Wasser durchgeführt, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Die Umwandlungen wurden bei etwa 37ºC in abgeschlossenen 500 µl Mikrozentrifugengläschen aus Polypropylen in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur durchgeführt Die Glaschen wurden vor Licht geschützt, außer wenn sie aus dem Wasserbad entfernt wurden, um Aliquots zur Analyse zu entnehmen. Bei allen Umwandlungen wurde eine Enzymleerwertinkubation durchgeführt parallel zu der SHMT-Inkubation. Das Gesamtvolumen der Inkübationsmischung war typischerweise etwa 200 µl. Die Bedingungen in der Leerpröbe waren identisch mit denen der Inkubationsmischung, außer daß das Enzym fehlte. Tabelle 1 Aldehyd-(RCHO)-Substrate für SHMT
1/ + = Umwandlung; - = keine nachweisbare Umwandlung; ND = nicht bestimmt
2/ Bei Kaninchenleber-SHMT war VO&sub3;&supmin; vorhanden und bei Mais-SHMT war Tetrahydrofolat vorhanden.
Das Verfahren kann bezüglich der Herstellung der β-Hydroxy-α-aminosäure überwacht werden, indem von Zeit zu Zeit Aliquots aus der Inkubationsmischung entnommen werden und die Proben mit HPLC-Trennung und Fluoreszenznachweis von aus o-Phthalaldehyd stammenden Isoindolen aller primären Aminverbindungen, die in der Mischung vorhanden sind, getestet werden. Das Testverfahren wird von B.N. Jones; J.P. Gilligan in J. Chrom. 1983, 266, 471; B.N. Jones et al. in J. Liq. Chrom. 1981, 4, 565 und S.S. Simons Jr. et al. in J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 7098 beschrieben. Die HPLC-Analyse sowohl der Inkubationsmischung als auch des Enzymleerwerts ließen eine Bestimung zu, welche Peaks auf den Chromatogrammen den Enzymprodukten zugeordnet werden konnten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt indem der Aldehyd einer gepufferten Lösung von Glycin, die PLP und einen anderen Cofaktor enthält, zugegeben wird und dann die Lösung mit einer gepufferten Lösung des Enzyms vermischt wird. Alternativ können die gepufferte PLP-haltige Lösung von Glycin und die Enzymlösung vermischt werden und der Aldehyd dann zugegeben werden. Es ist auch möglich, die Enzymlösung zu einer Lösung von Aldehyd und Glycin in Gegenwart des PLP-haltigen Puffers zuzugeben.
Es ist nicht notwendig, daß der Aldehyd, RCHO, vollständig in Lösung ist, damit in dem Verfahren eine Umwandlung auftritt. Aldehyde, die nur teilweise in dem wäßrigen Reaktionsmedium löslich sind, dienen auch als Suhsrate für das Enzym.
Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem der Aldehyd, RCHO, ein aliphatischer Aldehyd ist (d.h. das Kohlenstoffätom, das an die Carbonylgruppe der Aldehydfunktion gebunden ist, ist gesättigt, CH&sub2;) liefert hauptsächlich das L-Erythrodiastereomer der β-Hydroxy-α-aminosäure oder des Esters. Wenn jedoch das Aldehydsubstrat aromatisch ist (d.h. der Kohlenstoff; der an die Carbonylgruppe der Aldehydfunktion gebunden ist, ist Teil eines aromatischen Systems) wird das Produkt sowohl in Threo- als auch Erythroform in etwa gleichen Mengen erhalten. Z.B. bildet Benzaldehyd sowohl die Threo- als auch die Erythroisomeren von β-Phenylserin.
Beispiele für β-Hydroxy-α-aminosäuren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, sind β-Phenylserin, β-(2-Furyl)serin, β-hydroxy-α-aminoadipinsäure, β-Hydroxy-α-aminohexansäure, β-Hydroxy- α-amino-ω-formyloxyhexansäure, β-Hydroxy-α-amino-γ-oxovaleriansäure, β-Hydroxy-α-amino-γ-phenylbuttersäure, β-Hydroxy-α-aminoheptansäure, β-Hydroxy-α-amino-ω-(2-furyl)pentansäure und ähnliche Aminosäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird ein Ester des Bernsteinsäuresemialdehyds, z.B. ein C&sub1;-C&sub4;-Alkylester, z.B. der Methylester oder Isopropylester, mit Glycin und SHMT in Phosphatpuffer in Gegenwart von PLP inkubiert, was den Halbester der β-Hydroxy-α-aminoadipinsäure als L-Erythroisomer liefert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird ein Ester des Glutarsäuresemialdehyds, z.B. der Methylester, mit SHMR inkubiert, was den Halbester der β-Hydroxy-α-aminopimelinsäure liefert.
Die vorhergehenden zwei Ausführungsformen der Erfindung werden in dem folgenden Reaktionsschema dargestellt.
worin R&sub1; ein C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Phenyl-, Benzyl-, Diphenylmethyl-, 4-Methoxybenzyl- oder 4-Nitrobenzylrest ist und n 2 oder 3 ist.
Die Erfindung liefert weiterhin die Aminosäure, β-Hydroxy-α-aminoadipinsäure, die Mono- und Di- R&sub1;-Ester und Salze davon, die mit der Formel R&sub1;OOC-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(OH)CH(NH&sub2;)COOR&sub1;' dargestellt werden, worin R&sub1; wie cben definiert ist und R&sub1;' Wasserstoff oder R&sub1; ist. Diese Aminosäure wird in dem Verfahren in L- Erythroform erhalten. Salze der Disäure oder Monoester davon können nüt ublichen Mitteln gebildet werden. Solche Salze schließen die Alkalisalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, die Erdaikalisalze, wie das Calciumsalz und die Ammoniumsalze und Aminsalze ein, z.B. solche, die mit Benzylamin, Dibenzylamin, Cyclohexylamin, Dicydohexylamin, primären und sekundären C&sub1;-C&sub4;-Alkyaminen, wie Methylamin, Ethylamin, Diethylamin, Di-(n- butyl)amin, Ethanolamin, Diethanolamin, Dipropanolamin gebildet werden und alinliche Salze. Solche Salze sind geeignet zur Isolierung und Reinigung der Disäure oder eines Monoesters davon und liefern stäbile Formen zur Lagerung der Aminosäure. Es werden auch die Säureadditionssalze, die mit der Aminosäure und Estern davon gebildet werden, bereitgestellt. Solche Salze werden mit Säuren gebildet, die stärker als die sauren Carbonsäuregruppen der Aminosäure sind. Beispiele für solche Säuren sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure und die Sulfonsäuren wie Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Methansulfonsäure und n- Butansulfonsäure.
Die R&sub1;-Ester beziehen sich auf die Mono- und Diester, worin R&sub1; die gleiche Bedeutung hat, wie oben in dem Reaktionsschema deniert. Beispiele für solche Ester sind Monomethyl-, Monoethyl-, Dimethyl-, Diethyl-, t-Butyl- und Di-t-butyl-, Benzyl-, 4-Methoxybenzyl- und Dibenzylester.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten β-Hydroxy-α-aminosäuren sind geeignete Zwischenprodukte für wichtige β-Lactamverbindungen. Die Produkte werden mit bekannten Methoden in β-Lactamverbindungen umgewandelt, die nützlich sind zur Herstellung bekannter Antibiotikaverbindungen. Z.B. werden β-Hydroxy-α-aminosäuren in Hyroxamatderivate umgewandelt und letztere cyclisiert unter Bildung von 3-Amino- 4-substituierten β-Lactamverbindungen, wie im folgenden Reaktionsschema gezeigt:
worin R die gleiche Bedeutung wie Öben und für Formel 1 definiert hat und R&sub2; eine Alkyl-, Alkanoyl- oder Aralkylgruppe ist. Die Bildung des Hydroxamats und die Cyclisierung des Hydraxamats in das β-Lactam werden mit der Methode von M.J. Miller, Accts.-Chem. Res. 1986, 19, 49; G. Rajendra und M.J. Miller, Tetrahedron Lett., 1987, 28, 6257 und T. Kolasa und M.J. Miller, Tetrahedron Lett., 1987, 28, 1861, beschrieben, durchgeführt. Alternativ können die β-Hydroxy-α-aminosäuren in N-(sübstituierte Methyl)azetidinone umgewandelt werden, wie von M.J. Miller in U.S. Patent Nr. 4 595 532 beschrieben. Die Aminosäureprodukte des Verfahrens können auch noch in die von M.J. Miller in U.S. Patent Nr. 4 820 815 beschriebenen N-(Phosphonomethyl)azetidinone umgewandelt werden.
Die folgenden Herstellungsbeispiele und Beispiele beschreiben das erfindungsgemaße Verfahren und sollen es nicht beschranken.

Herstellung von Serinhydroxymethyltransferase aus Maissämlingen

Die folgenden Verfahrensschritte wurden bei 4ºC durchgeführt Gewaschene 5 bis 7 Tage alte Maissämlinge wurden in einem Waring-Mischer in 100 mM Kaliummonohydrogenphosphat, das 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA), 1 mM Dithiothreitol und 125 µM Pyridoxal-5'-phosphat enthielt, homogenisiert Die Mischung enthielt ungefähr 960 g Sämlinge pro Liter. Das Homogenisat wurde durch Mulltuch filtriert und das Filtrat einer Ammoniumsuftätausfällung unterworfen. Das Protein, das bei einer Sättigung mit Ammoniumsulfat von 35 bis 50% bei einer 40-minütigen Zentrifugation mit 13 800 x g ausfiel, wurde in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,8, der 125 µM Pyridoxal-5'-phosphat und 1 mM EDTA enthielt, gelöst. Die Lösung wurde dialysiert und aufs bis 15 mg Protein/ml in dem gleichen Puffer ohne EDTA eingeengt. Der Test auf Aldolaseaktivitat des Proteins bestand aus einem gekuppelten System des durch Aldolase katalysierten Retraldols des L-allo-Threonins mit der NADH-(reduzierte Form des Nikotinamidadenindinukleotids)-abhangigen Reduktion des entstehenden Acetaldehyds durch Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH). Die spezifische Aktvität war im Durchschnitt 78 Millieinheiten/mg Protein. Eine Einheit Enzymaktivität wird definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um eine Veränderung einer Einheit optischer Dichte (bei 340 nm) pro Minute bei Raumtemperatur in Gegenwart von ADH, 120 mM L-allo-Threonin, 125 µM PLP und 120 µM NADH in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, zu bewirken.
Das SHMT wurde, wenn es nicht verwendet wurde, sobald es hergestellt war, entweder in lyophilisierter Form oder mit 10% Glycerin in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
In den folgenden Beispielen war, wenn nicht anders angegeben, das Puffersystem 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,3 und enthielt Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) in einer Konzentration von etwa 80 µM. Alle Lösungen wurden in destilliertem, deionisiertem Wasser hergestellt.
Die Inkubtion mit dem Enzym wurde bei 37ºC in verschlossenen 500 µl Mikrozentrifugengläschen aus Polypropylen in einem Wasserbad konstanter Temperatur durchgeführt.
Die in den Beispielen angegebenen Retentionszeiten können von Zeit zu Zeit bei der HPLC-Analyse leicht variieren, wegen leichter Variationen von Faktoren wie Säule, Equilibrierung, Puffer und dgl.
Das in den folgenden Beispielen angewendete SHMT wurde aus Kaninchenleber erhalten von L. Schirch (oben).

Beispiel 1

Herstellung von Threonin

Eine Lösung von Glycin (34 mM) wurde in dem PLP-haltigen Phosphatpuffer hergestellt und ausreichend frisch destillierter Acetaldehyd wurde zugegeben, um die Konzentration auch auf 34 mM zu bringen. Söbald die Enzymlösung zugegeben war, war die Konzentration jeden Substrats 17 mM.
Eine Lösung von SHMT (0,1 mg) in 200 µl des Standardphosphatpuffers wurde in ein 2-ml-Glaschen gebracht. Ein gleiches Volumen der Substratlösung wurde zugegeben und das Gläschen wurde mit einem Kautschukseptum und Kupferdraht verschlossen, um den Verlust an Acetaldehyd zu minimieren. Dieses Gläschen und eine Enzymleerwertlösung wurden bei 37ºC inkubiert.
Aliquots (10 µl) wurden mit einer 50-µl-Mikroliterspritze zu den Inkubationszeiten 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 20,5 Stunden entnommen und mit HPLC analysiert.
Das Chromatogramm zeigte den Hauptpeak für das L-Erythroisomer bei einer Retentionszeit von 21,9 Minuten und einen kleineren Peak für das Threoisomer. Die Identität der hergestellten Aminosäuren wurde durch gleichzeitige Injektion der authentischen im Handel erhaltlichen Threoninisomere bestätigt.

Beispiel 2

α-Amino-β-hydroxycapronsäure

Eine Subsratlösung wurde hergestellt, indem Glycin (25,5 mg, 0,340 mmol) und n-Butanal (25,3 mg, 0,351 mmol) in 10 ml Standardphosphatpuffer gelöst wurden, was für die zwei Subsrate eine Konzentration von 34 mM bzw. 35 mM ergab.
Eine Lösung von SHMT (0,1 mg) in 100 µl Puffer wurde in ein 0,5-ml-Gläschen aus Polypropylen gebracht. Weitere 100 µl Puffer ohne Enzym wurden in ein weiteres Gläschen gebracht und 100 µl der Substratlösung wurden zu jedem Gläschen zugegeben.
Aliquots wurden aus der Enzym- und Leerwertlösung zu den Inubationszeiten 1,0, 3,0, 7,25 und 21 Stunden entnommen und mit HPLC analysiert.
Zwei Produktpeaks waren in dem Chromatogramm zu sehen, ein großer bei 25,7 Minuten und ein kleiner bei 24,3 Minuten. Die Peaks entsprachen denen des authentischen racemischen Produktes. Das authentische Materaal wurde racemisch gemacht, indem eine Aldolreaktion an einem Kupferkomplex von Glycin durchgeführt wurde, S. Akabari et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 1959, 83, 1, und J.P. Greenstein und M. Winitz, "Chemistry of Amino Acids", John Wiley and Sons, New York, 1961, Band 3, Seiten 2249 bis 2250.

Beispiel 3

α-Amino-β-hydroxyadipinsäuremonomethylester

Glycin (13,3 mg, 0,177 mmol) und Bernsteinsäuresemialdehydmethylester (20 mg, 0,172 mmol) wurden in 5,0 ml Puffer gelöst, was jeweils Konzentrationen von 35 mM bzw. 34 mM ergab. Der in diesem Versuch verwendete Aldehyd war frei von DMSO, obwohl vorherige Inkübationen mit diesem Aldehyd immer noch die Verunreinigung enthielten (die zurückblieb durch die Synthese durch Ozonolyse von CH&sub2;=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-COO-CH&sub3; und anschließende Aufärbeitung mit Dimethylsulfoxid).
Zu einer Lösung von SHMT (0,1 mg) in 100 µl Puffer wurden 100 µl der Substratmischung zugegeben. Aliquots wurden zu den Inkubtionszeiten 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 und 24 Stunden entnommen.
Der Hauptproduktpeak (L-Erythro) wurde bei tR Vofl 22,5 Minuten beobachtet und erreichte das Maximum nach 2 Stunden.
Wahrend der ersten 2 Stunden erschien ein kleiner neuer Peak in der HPLC-Analyse mit einer Retentionszeit von ungefähr 8 Minuten. Über einen Zeitraum von 24 Stunden wuchs die Intensität dieses Peaks, während die Peaks, die dem Ausgangsmaterial Glycin und dem Zwischenprodukt α-Amino-β-hydroxyadipinsäuremethylester entsprachen, abnahmen. Nach 24 Stunden war das Verhältnis von neuem Peak zu Glycin und Ester 38:47:15. Die Struktur der dem neuen Peak entsprechenden Verbindung wurde bestimmt als L-erythro-α-Amino-β- hydroxyadipinsäure (R = CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;H) durch unabhängige Synthese und gleichzeitige Injektion des authentischen Produktes, das dem enzymatisch erzeugten entsprach. Die chemische Synthese des authentischen Materials wurde erreicht durch Aldolkondensation des Bernsteinsäuresemialdehydmethylesters mit einem Boronenolat eines chiralen Oxazins (D.S. Reno; B.T. Lötz; M.J. Miller in Tetrahedron Lett., 1990, 31, 827) und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen und Hydrolyse, was die beschriebene Verbindung ergab.
Die Bildung dieser Stammaminosäure während der enzymtischen Synthese erfolgt durch Hydrolyse des anfangs gebildeten Aminosäuremonomethylesters. Da das Produkt eine zusätzliche ionisierte Carbonsäure gruppe hat, ist es kein Substrat für die enzymatisch reversible Aldolkondensation. Somit sammelt sich das neue Aminosäureprodukt (L-erythro-α-Amino-β-hydroxyadipinsäure) an. Als ein Dicarbonsäureaminosäureprodukt kann es aus der Reaktionsmischung durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden (J.P. Greenstein, M. Winitz, "Chemistry of the Amino Acids", Band 2, Seiten 1452 bis 1460, Wiley, New York, N.Y. 1961).

Beispiel 4

α-Amino-β-hydroxydipinsäuremonoisopropylester

Glycin (26,1 mg, 0,348 mmol) wurde in 10,0 ml Puffer gelöst und Bernsteinsäuresemialdehydisopropylester, 34 mg (der DMSO als Verunreinigung aus seiner Herstellung enthielt) wurde zugegeben. Die Gegenwart von DMSO bei der Inkubation hat keine schädliche Wirkung auf das Enzym oder die Reaktion. Die Konzentration des Aldehyds im Puffer, wenn man das vorhandene DMSO mitberechnet, war 18 mmolar. Die Anfangskonzentrationen von Glycin und Aldehyd in der Inkubationsmischung waren 17,4 mM bzw. 9 mM.
Die Substratmischung (100 µl) wurde zu einer Lösung von SHMT (0,1 mg) in 100 µl Puffer und zu der Enzymleerwertlösung zugegeben.
Aliquots wurden entnommen zu den Inkubationszeiten 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 17,25, 25 und 52 Stirnden und mit HPLC untersucht. Der Hauptproduktpeak (L-Erythro) erschien bei einer tR von 25 Minuten innerhalb von 0,5 Stunden und wuchs auf ein Maximum nach 2 bis 4 Stunden.

Beispiel 5

α-Amino-β-hydroxypimelinsäuremonomethylester

Glutarsäuresemialdehydmethylester, der für diese Inkubation verwendet wurde, enthielt DMSO in einem Verhältnis von etwa 1:1 bezogen auf Gewicht. Das DMSO ist ein Nebenprodukt bei der Herstellung des Aldehyds durch Ozonolyse von 1-Methoxycyclopenten, wobei DMSO bei der Aufarbeitung verwendet wird (D.L.J. Cline; C.G. Russel, Tetrahedron, 1980, 36, 1399). Die Substratlösung wurde hergestellt, indem Glycin (25,6 mg, 0,341 mmol) und die Aldehyd/DMSO-Mischung (66,7 mg) in 10,0 ml Puffer gelöst wurden, was Konzentrationen an Glycin und Aldehyd von 34,1 bzw. ungefähr 25 mM ergab.
Die Enzymlösung bestand aus 0,1 mg SHMT, gelöst in 40 µl Puffer statt 100 µl. Die Substratlösung (40 µl) wurde zu der Enzym- und Leerwertlösung zugegeben und wie üblich inkubiert Aliquots (10 µl) wurden nach 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0 und 17,0 Stunden entnommen. Nach 0,5 Stunden erschien ein durch das Enzym erzeugter Peak in dem HPLC bei 23,7 Minuten, der dem gewünschten Produkt entsprach und auf eine Ausbeute von etwa 20% integriert wurde. Ein zweiter kleiner durch das Enzym induzierter Peak erschien bei einer Retentionszeit von 22,3 Minuten, der einer geringeren Menge des Threoisomers entsprechen könnte.

Beispiel 6

α-Amino-β-hydroxy-γ-oxovaleriansäure

Glycin (25,5 mg, 0,340 mmol) und Pyruvaldehyd (61,1 mg einer 40 gew.-%igen Lösung, 0,327 mol Pyruvaldehyd) wurden in 10 ml Puffer, pH 7,2 gelöst, was Konzentrationen von 34 mM (Glycin) und 32,7 mM (Pyruvaldehyd) in der Vorratslösung ergab. Natriummetavanadat (1,5 mg einer 90% reinen Verbindung von Aldrich) wurde zugegeben. Nach etwa 30 Minuten hatte sie sich gelöst, was eine Konzentration von 1,11 mM ergab.
Zu der Enzymlösung (0,1 mg SHMT in 80 µl) wurden 80 µl der Substratlösung zugegeben. Aliquots (10 µl) wurden zu den Inkubationszeiten 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 29 und 53 Stunden entnommen.
Die Aminosäureanalyse mit HPLC zeigte eine neue Aminosäure mit einer Retentionszeit von 8,5 Minute. Um zu besttigen, daß dies die gewünschte Aminosäure war, wurde authentisches racemisches Material mit dem Kupferglycinatverfahren hergestellt. Es wurden 4,23 g Kupfer(II)glycinat (20 mmol) in 10 ml 9 M wäßrigem KOH gelöst. Pyruvaldehyd (16,2 ml einer 40 gew.-%igen Lösung in Wasser, entsprechend 7,0 g, 9,71 mmol Aldehyd) wurde zugegeben. Nach 5,25 Stunden wurde 3 M NH&sub4;OH (40 ml) zu der entstehenden braunen Lösung zugegeben und die Lösungsmittel wurden verdampft, was ein braunes Öl ergab. Das Öl wurde durch eine Dowex- 50-(&spplus;NH&sub4;-Form)-Säule geleitet, wobei mit Wasser eluiert wurde, was die halbgereinigte Aminosäure ergab.

Beispiel 7

α-Amino-β-hydroxy-6-formyloxyhexansäure

Der Aldehyd bei dieser Inkubation enthielt noch eine beträchtliche Menge an DMSO durch die Herstellung über eine Ozonolyse von Dihydropuran und anschließende Aufarbeitung mit DMSO. Zu 10,0 ml Puffer wurde O-Formyl-4-hydroxybutanal (39,5 mg, etwa 0,20 mmol, inklusive DMSO) und Glycin (25,5 mg, 0,340 mol) zugegeben.
Die Substratlösung (40 µl) wurde zu der Enzymlösung (0,1 mg SHMT in 40 µl) und der Leerwertlösung zugegeben. Die Konzentrationen der zwei Substrate in der Inkubationsmischung waren 17 mM (Glycin) und 10 mM (Aldehyd). Aiiquots (10 µl) wurden nach 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 7,0 und 24 Stunden Inkubationszeit entnommen.
Bei dem ersten Aliquot, das nach 0,5 Stunden entnommen wurde, wurden zwei neue Aminosäuren bei der Aminosäurenalyse festgestellt. Ein kleiner Peak erschien nach 15,6 Minuten, direkt nach dem Glycinpeak. Der andere war ein großer scharfer Peak bei 22,5 Minuten. Nach 3 Stunden erreichte der Peak bei 22,5 Minuten, der der erwarteten Aminosäure entsprach, ein Maximum bei etwa 10% des Glycinpeaks und nahm dann langsam ab, während der Peak bei 15,6 Minuten etwas in der Intensität zunahm. Die bei 15,6 Minuten eluierte Aminosäure ist das Produkt der langsamen Hydrolyse des Formiatesters in dem Reaktionsmedium. Die Strukur entspricht der α-Amino-β-hydroxy-6-hydroxyhexansäure.

Beispiel 3

β-Phenylserin

Die verwendete Pufferlösung enthielt PLP in einer Konzentration von 160 µM statt 80 µM. Benzaldehyd wurde direkt vor der Verwendung destilliert. Die Pufferlösung wurde von Sauestoff befreit, indem Stickstoff hindurchgeblasen wurde, bevor die Substrate zugegeben wurden. Dies erfolgte, um die Chance, daß der Benzaldehyd, während er in der Lösung war, oxidiert wurde, zu minimieren.
In 10,0 ml Puffer wurden Glycin (25,4 mg, 0,338 mmol) und Benzaldehyd (35 µl, 0,344 mmol) gelöst. Diese Lösung (100 µl) wurde zu 100 µl der SHMR-Lösung (0,1 mg Enzym) zugegeben. Aliquots wurden nach Inkubationszeiten von 1,0, 5,25 und 7,0 Stunden entnommen.
Zwei Produktpeaks waren in den Chromatogrammen zu sehen, der größere bei 24,8 Minuten und der kleinere bei 23,7 Minuten. Die Produktmischung dieses Versuchs wurde mit authentischem, racemischem, im Handel erhältlichen β-Phenylserin verglichen. Die Peaks der beiden Mischungen stimmten exakt überein. Auch wenn durch gleichzeitige Injektion mit authentischem threo-β-Phenylserin verglichen wurde, wurde der frühere (kleinere) Peak verstärkt gegeneber dem späteren. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Enzym beide Enantiomeren- Paare der aromatischen Aminosäuren erzeugt, aber die Erythroisomeren begunstigt.

Beispiel 9

α-Amino-β-hydroxy-β-(2-furyl)propionsäure

Das in diesem Beispiel verwendete 2-Furfural wurde hergestellt durch zwei Destillationen über Natriumcarbonat, wobei die zweite Destillation unter Stickstoffätmosphäre erfolgte. Der destillierte Aldehyd wurde vor der Verwendung entwässert, unter Stickstoff und geschützt vor Licht aufbewahrt.
Die Substratlösung wurde hergestellt, indem Glycin (14,0 mg, 0,186 mmol) und Furaldehyd (15,5 µl, 0,187 mmol) in Puffer (10,0 ml) gelöst wurden. Als 360 µl davon zu der Enzymlösung zugegeben wurden (0,2 mg SHMT in 40 µl) war die Konzentration jeden Sübstrats 17 mM.
Aliquots (10 µl) wurden nach 1,0, 2,0, 4,0, 5,0, 18, 24, 72 und 114 Stunden entnommen. Innerhalb einer Stunde wurden zwei neue Aminosäuren erzeugt, was mit HPLC-Analyse bestimmt wurde. Der einem Isomer entsprechende größcre Peak hatte eine Retentionszeit von 21 bis 22 Minuten, wahrend der dem anderen (Threo-)- Isomer entsprechende kleinere Peak (< 50% des größeren Peaks) eine Retentionszeit von 19 bis 20 Minuten hatte.

Beispiel 10

α-Amino-β-hydroxy-δ-(2-furyl)valeriansäure

Die Substratlösung wurde hergestellt, indem Glycin (25,5 mg, 0,340 mmol) und der Aldehyd (46,3 mg, 0,373 mmol) in 10,0 ml Puffer gelöst wurden. Der Aldehyd (eine Flüssigkeit) brauchte etwa 15 Minuten, um sich zu lösen.
Die Substratlösung (100 µl) wurde zu der Enzymlösung (0,1 mg SHMT in 100 µl Puffer) zugegeben und bei 37ºC inkubiert. Aliquots wurden nach 0,55, 1,0, 2,0, 4,25, 8,0 und 21 Stunden entnommen. Innerhalb von 0,5 Stunden erschien ein Peak mit einer Retentionszeit von 21,3 Minuten bei der HPLC-Analyse, der eine etwa 3%ige Umwandlung von Glycin in das Aldolprodukt anzeigte.

Beispiel 11

α-Amino-β-hydroxyhex-5-insäure wird erhalten mit den in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Inkubationsverfahren ausgehend von Propargylaldehyd.

Beispiel 12

α-Amino-β-hydroxyhex-5-ensäure wird mit Allylaldehyd unter den in den Öbigen Beispielen beschriebenen Inkubationsbedingungen erhalten.

Beispiel 13

α-Amino-β-hydroxypent-4-ensäure wird mit Acrolein erhalten init den Verfahren und unter den Bedingungen, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden.

Beispiel 14

α-Amino-β-hydroxy-δ-cyanovaleriansäure wird hergestellt unter den Bedingungen der vorhergehenden Beispiele aus β-Cyanopropionaldehyd.

Claims

1. Verfähren zur Herstellung einer β-Hydroxy-α-aminosäure der Formel

worin R ein mit veresterten Carboxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, Cyano-, Hydroxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyloxy-, Phenyl-, Furyl- oder Benzyloxygruppen substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist, das umfäßt, daß man bei einer Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 55ºC in einer waßrigen Lösung bei einem pH von etwa 5,5 bis etwa 9 einen Aldehyd der Formel RCHO, worin R die gleiche Bedeutung wie oben hat, und Glycin mit Serinhydroxymethyltransferase in Gegenwart von Pyridoxal-5'-phosphat vermischt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R ein mit veresterten Carboxy- oder C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyloxyrest oder mit Arylalkoxygruppen substituierter Alkylrest ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin R ein; mit veresterten Carboxy- oder C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyloxygruppen substituierter C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aldehyd RCHO

R&sub1;O -(CH&sub2;)nCHO

ist, worin R&sub1; ein C&sub1;-C&sub4;-Aikyl-, Benzyl-, Diphenylmethyl-, 4-Methoxybenzyl oder 4-Nitrobenzylrest ist und n 2 oder 3 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Aldehyd RCHO Bernsteinsäuresemialdehydinethylester ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Aldehyd RCHO Glutarsäuresemialdehydmethylester ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin R ein mit veresterten Carboxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkanoyloxy-, Phenyl-, Furyl- oder Benzyloxyresten substituierter C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist.

8. Verfähren nach Anspruch 7, worin die α-Amino-β-hydroxysäure das L-Erythrodiastereomer ist.