ES2211620T3

ES2211620T3 - Procedimiento para preparar acido micofenolico y derivados del mismo.

Info

Publication number: ES2211620T3
Application number: ES00966338T
Authority: ES
Inventors: Istvan Barta; Sandor Boros; Gabor Ambrus; Gyula Horvath; Antal Szabo; Istvan Mihaly Szabo; Antonia Jekkel; Attila Konya; Julianna Mozes; Janos Salat; Gyorgy Somogyi
Original assignee: Ivax Drug Research Institute Ltd
Current assignee: Teva Hungary Pharmaceutical Marketing PLC
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: WO2001021607A2; HU9903226D0; HUP9903226A2; PT1216237E; JP3854866B2; EP1216237A2; KR20020060184A; AU7677600A; WO2001021607A3; JP2003509508A; DE60007338T2; CA2385317A1; AU768773B2; EP1216237B1; ATE256674T1; DE60007338D1; DK1216237T3

Abstract

Un procedimiento microbiológico para preparar compuestos de **fórmula** en la que R1 significa grupo metilo o Idroximetilo y R2 significa grupo hidroxilo o amino, que comprende hacer crecer una cepa de hongo de Penicillium waksmani capaz de biosintetizar ácido micofenólico, en un medio de cultivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables, así como sales minerales de 22 a 30ºC, separar del caldo de fermentación el compuesto de **fórmula**, en la que R1 significa grupo metilo y R2 significa grupo hidroxilo, y si se desea, purificarlo y, si se desea, bioconvertirlo a) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces griseoruber Nº 1/6 depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales como Streptomyces sp. Nº 1/6 con el Nº NCAIM (P)B 001275, para preparar un compuesto de **fórmula**, en la que R1 significa grupo metilo y R2 significa grupo amino; o b) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces resistomycificus Nº 1/28 depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales con el Nº NCAIM (P)B 001276, para preparar un compuesto de **fórmula**, en la que R1 significa grupo hidroximetilo y R2 significa grupo amino. en un medio de cultivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables así como sales minerales en condiciones aireadas y enterradas hasta completarse la bioconversión, después separar del cultivo el compuesto de **fórmula** formado y, si se desea, purificarlo.

Description

Procedimiento para preparar ácido micofenólico y sus derivados del mismo.

Esta invención se refiere a un procedimiento microbiológico para preparar el ácido micofenólico de fórmula (I)

1

(en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo hidroxilo) y sus derivados [en la fórmula (I) R_{1} significa grupo metilo o hidroximetilo y R_{2} es un grupo amino]. El ácido micofenólico de fórmula (I) [ácido (E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoico] se usa terapéuticamente debido a su efecto inmunosupresor.

El ácido micofenólico fue descrito por primera vez en 1896 en el caldo de fermentación de Penicillium glaucum [E.L. Jones y col.: J. Invest. Dermatol. 65, 537 (1975)] y más tarde se aisló también de los caldos de fermentación de otras especies del género Penicillium, por ejemplo, P. brevicompactum, P. stoloniferum, P. echinulatum, P. roqueforti y P. viridicatum. La estructura del ácido micofenólico fue determinada por J.M. Birkinshaw y col. [Biochem. J., 50, 630 (1952)] en 1952. Después del descubrimiento del ácido micofenólico también se describió su actividad antibacteriana, pero las cepas patógenas de Staphylococus se hicieron rápidamente resistentes a éste; por lo tanto, no hubo más desarrollo en este campo [E.P. Abraham y col.: Biochem. J. 39, 398 (1945)]. También se mostró la actividad antifúngica del compuesto contra algunas cepas de Epidermophyton y Trichophyton. Igualmente, su efecto antivírico también se probó, entre otros, en el virus Herpes simplex [R.H. Williams y col.: J. Antibiot. 21, 463 (1968)]. Asimismo, se publicó una actividad antitumoral, que se empezó a estudiar con profundidad en años recientes [Y. Sidi y col.: Br. J. Cancer 58, 61 (1988)]. Su derivado el éster morfolinoetílico descrito en la segunda mitad de los años ochenta, ha sido aprobado para uso terapéutico como un agente inmunosupresor.

La amplia gama de eficacia biológica del ácido micofenólico se puede explicar por su efecto inhibidor frente a la actividad de las enzimas inosina-5'-monofosfato-deshidrogenasa y guanina-5'-monofosfato-sintetasa, que da como resultado una disminución de la síntesis de guanina. En algunas células la síntesis de guanina también puede ser efectuada en otra ruta por la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa. Sin embargo, esta enzima está ausente en los linfocitos T y B, y por lo tanto, su crecimiento es inhibido selectivamente por el ácido micofenólico.

A primeros de los 70, se prepararon una serie de derivados del ácido micofenólico. Se hicieron modificaciones tanto en el anillo de isobenzofuranilo como en la cadena lateral de ácido 4-metil-4-hexenoico, por medios microbiológicos así como químicos [D.F. Jones y col.; J. Chem. Soc. 1725 (1970)].

Jones y Mills [J. Med. Chem. 14(4): 305, (1971)] y Suzuki y col. [J. Antibiot. 29(3): 275, (1976)] describen la preparación y la actividad antitumoral del ácido micofenólico y derivados del ácido micofenólico. Ambos informes pretenden que la mayor actividad antitumoral observada reside en el compuesto parental, el ácido micofenólico, y que ninguna de las sustituciones obtenidas mostraron ninguna actividad tumoricida potenciada.

Algunos derivados del ácido micofenólico han mostrado una actividad que se aproxima a la del ácido micofenólico [M.J. Sweeney y col.: Cancer Research 32 1795 (1972)] en ensayos antitumorales. Eran derivados del ácido micofenólico que ejercen un mayor efecto inhibidor en la inosina-5'-monofosfato-deshidrogenasa que el ácido micofenólico [M.J. Sweeney y col.: Cancer Research 32, 1803 (1972)].

En un aspecto la invención se dirige a la selección y mejora genética de un microorganismo, mediante cuyo uso se puede producir ácido micofenólico de forma más ventajosa comparado con los procedimientos conocidos en la bibliografía. En otro aspecto, la invención se dirige a un procedimiento microbiológico para preparar ácido micofenólico, y nuevos derivados del ácido micofenólico potencial y terapéuticamente eficaces.

En el transcurso de las investigaciones para buscar nuevos agentes activos de origen microbiológico, se investigaron microorganismos aislados de muestras de suelo recogidas de diferentes sitios geográficos. Dentro del marco del programa de cribado antifúngico, se aisló una cepa fúngica, cuyo caldo de fermentación contenía ácido micofenólico. A partir de esta cepa se preparó, una cepa mutante que producía una alta concentración de ácido micofenólico, usando procedimientos de mutación-selección. Como agentes mutágenos se aplicaron radiación ultravioleta y N-metil-N-nitro-N'-nitrosoguanidina.

La biosíntesis del ácido micofenólico ha sido descrita en los casos de las cepas de Penicillium glaucum, Penicillium stoloniferum, Penicillium brevicompactum, Penicillium scabrum, Penicillium nagemi, Penicillium patrismei, Penicillium griseobrunneum y Penicillium viridicatum. En el transcurso de la biosíntesis del ácido micofenólico, el resto de isobenzofurano de la molécula se forma de modo diferente de la cadena lateral unida a éste. La biosíntesis de la cadena lateral sigue la síntesis del esqueleto de esteroides hasta el pirofosfato de farnesilo. El resto de isobenzofurano se forman a partir de un acetil-CoA y tres malonil-CoA. El grupo metilo en el anillo aromático es incorporado a la molécula por la S-adenosilmetionina. El pirofosfato de farnesilo, a partir del cual se forma la cadena lateral del ácido micofenólico después de escisión de una cadena de 8 miembros, se une al C-6 del anillo de isobenzofurano. La última etapa de la biosíntesis comprende la formación de un grupo metoxilo a partir de la S-adenosilmetionina [W.L. Muth y col.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 8, 321 (1975)].

Todas las cepas que producen ácido micofenólico descritas en la bibliografía pertenecen a la sección Asymmetrica dentro del género Penicillium. Basándose en la determinación taxonómica, la cepa aislada por los autores de la invención pertenece a la sección Monoverticillata dentro del género Penicillium, y se puede clasificar en la especie Penicillium waksmani, cuya capacidad de producir ácido micofenólico todavía no se ha publicado en la bibliografía.

A continuación se da la determinación taxonómica.

Características de cultivo y morfológicas generales

La nueva cepa aislada es una representación característica del género Penicillium en el aspecto de formación de sus conidióforos y la disposición de ramificaciones, métulas así como sus fiálides. Su micelio aéreo esporulante generalmente es aterciopelado, y bien desarrollado. En un estado maduro es gris pardusco oscuro en un agar con almidón + sulfato amónico; gris pardusco claro en agar de Sabouraud con peptona + glucosa; gris oscuro en agar de Sabouraud con glucosa; verde claro en asparagina + glicerol; negro pardusco en agar de Czapek (nitrato + sacarosa) con sangre de vaca; gris pardusco oscuro en agar de Czapek simple; verde que oscurece en el agar malta; gris pardusco que oscurece en agar con extracto de malta + extracto de levadura + glucosa; gris pardusco oscuro en agar con copos de avena. Al principio, hay un gran número de hifas que con frecuencia son verde o verde azulado en el medio de cultivo, donde el micelio aéreo maduro es gris o gris pardusco. En general, el micelio del sustrato de la cepa es incoloro o marrón-amarillento pálido. No se pudo observar la producción de un pigmento soluble en ninguno de los medios. La superficie de las colonias está menos arrugada. El grosor medio del micelio aéreo no supera 1 a 3 mm. La producción de pigmento melanoide (actividad de tirosinasa) es negativa.

La longitud de los conidióforos es extremadamente diferente: con frecuencia crecen directamente desde el micelio del sustrato, otras veces son ramificaciones laterales de un filamento axial más largo (véase la Figura 1: conidióforos de tipos a a f; a, d, e y f en agar con asparagina + glicerol; b en agar malta; mientras que c en agar con almidón + sulfato amónico; g es una cadena de conidios). La cepa se puede clasificar en el grupo de especie Monoverticillata, considerando que en su inmensa mayoría lleva pinceles que constan de un solo verticilo de fiálides. Los pinceles de este tipo de Monoverticillata con mucha frecuencia están dispuestos en una forma de "Divaricata" (véase la Figura 1). También se pueden observar en cada caso por separado conidióforos de tipo Biverticillium (véase la Figura 1). Los verticilos formados por las fiálides pueden ser de 2 a 8 miembros (en la mayoría de los casos 3). Los conidios son redondos, y en la mayoría de los casos tienen una superficie suave con un tamaño de 2 a 25 \mum. El número de conidios individuales en las cadenas de conidios puede superar 20.

Propiedades fisiológicas

Hidrólisis de esculina: positiva. Producción de sulfuro de hidrógeno: negativa. Tolerancia de NaCl: hasta 3% como máximo. Tolerancia de pH: de 3,0 a 9,0. No se pudo detectar la formación de nitrito a partir de nitrato, evolución de amoniaco o gas. Ensayo de la catalasa: positivo. Ensayo de la oxidasa: positivo; Descomposición de urea: positiva. Actividad de lecitinasa y gelatinasa: positiva. La hidrólisis de almidón es débil. Hidrólisis de Tween-20: positiva, pero la hidrólisis de Tween-40 y Tween-60 es muy débil. De las sales de sodio de ácidos orgánicos, crece ventajosamente en benzoato, salicilato, débilmente en acetato, tartrato y succinato. No crece en absoluto o sólo en trazas en malonato, piruvato, lactato y citrato. Utiliza excelentemente glucosa, fructosa, arabinosa, xilosa, ramnosa, sacarosa, rafinosa, manitol e inositol. Se observó una fuerte producción de ácido (usando indicador púrpura de bromocresol en el medio de cultivo de R.E. Gordon): en glucosa, sacarosa, ramnosa, dextrina, melibiosa, maltosa, rafinosa, fructosa, inositol, glicerol, xilosa, dulcitol y manitol. La producción de ácido era débil en galactosa, arabinosa y salicina.

Posición taxonómica

La cepa de Penicillium que produce ácido micofenólico aislada por los autores de la invención, se puede considerar que es una variante cercana de la especie Penicillium waksmani. Esta identificación también es verificada por los datos de la siguiente Tabla 1.

TABLA 1 Una comparación de la descripción patrón de Penicillium waksmani con las características de diagnóstico de la cepa de Penicillium que produce ácido micofenólico aislada por los autores de la invención

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En un aspecto, la invención se basa en el reconocimiento de que la cepa de Penicillium waksmani que produce ácido micofenólico aislada por los autores de la invención, que se depositó con el Nº NCAIM (P)F 001269 en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales, produce altas concentraciones de ácido micofenólico en condiciones de fermentación adecuadas, después de desarrollarlo por procedimientos de mutación-selección.

Además, la invención se basa en el reconocimiento de que los cultivos de cepas de Streptomyces griseoruber Nº 1/6 (depositada como Streptomyces sp. Nº 1/6) y Streptomyces resistomycificus Nº 1/28, respectivamente, aisladas de forma similar por los autores de la invención de muestras de suelo, son capaces de transformar el ácido micofenólico formado en un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo o hidroximetilo y R_{2} significa grupo amino.

Descripción taxonómica de la cepa de Streptomyces Nº 1/6

Propiedades de diagnóstico de cultivo y morfológicas: En agar con harina de avena un micelio aéreo bien desarrollado de coloración roja típica (Serie de color rojo; serie de color "Cinnamomeus") cubre la superficie del micelio del sustrato. El color de éste último es amarillento. Los pigmentos solubles no son visibles. Observando la masa de esporas roja, se pueden detectar que hay muchos esporóforos de tipo Retinaculum apertum. En agar de Czapek: Las colonias se caracterizan por micelio aéreo rojizo claramente desarrollado, micelio del sustrato amarillo rojizo y pigmentos difundibles ligeramente rojizos. En rodajas de patata, el micelio del sustrato marrón está cubierto por masa de esporas aérea rojiza, mientras que el color de la patata se vuelve rojo pardusco oscuro. En agar con soja-peptona, bajo el micelio aéreo rojizo bien desarrollado, el micelio del sustrato así como el propio medio es marrón oscuro o negro. En placas de agar malato, el micelio aéreo amarillento permanece en su mayor parte estéril y bajo el micelio del sustrato pardusco se puede observar la difusión de un pigmento soluble marrón rojizo intenso. En agar con levadura y hierro, la cepa Nº 1/6 muestra producción de pigmento melanoide positiva. Igualmente, se demuestra que es cromógeno también en agar con tirosina pero con menor intensidad.

Propiedades fisiológicas: La cepa Nº 1/6 no descompone la celulosa. Se ha observado uso positivo de glucosa, fructosa, sacarosa, ramnosa e i-inositol, además de crecimiento relativamente débil pero uso todavía positivo con xilosa y arabinosa, como únicas fuentes en el medio. Se detectó crecimiento muy débil (uso negativo) con
rafinosa.

Posición taxonómica: La cepa Nº 1/6 como un típico Streptomyces rojo (color de la masa de esporas en las serie Roja, color del micelio del sustrato: amarillo-marrón + rojo, pigmento soluble rojizo) caracterizado por esporóforos de Retinaculum apertum (espirales), muestra una similitud de cultivo y morfológica considerable con la especie Streptomyces griseoruber, Yamaguchi y Saburi (1955), que pertenece al Grupo 18 (23) del sistema de clasificación numérico de Kampfer y col. [J. Gen. Microbiol. 137, 1831-1891 (1991)]. Sin embargo, en relación con algunas diferencias fisiológicas, serán necesarios estudios adicionales para dejar claro su relaciones más estrechas.

Descripción taxonómica de la cepa de Streptomyces Nº 1/28

Propiedades de diagnóstico de cultivo así como morfológicas por microscopia óptica y electrónica: En placas de agar con harina de avena el micelio aéreo se desarrolla débilmente, su color es primero blanco y después grisáceo claro y no se puede caracterizar con precisión de acuerdo con las categorías de series de colores del Proyecto Internacional de Streptomyces [Shirling and Gottlieb, Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966)]. De acuerdo con los resultados de las observaciones con microscopio se muestra que las hifas son estériles, y no se observó su diferenciación en esporóforos y conidios. Se detectó desarrollo medio del micelio del sustrato y producción de pigmentos solubles marrón amarillento claro. En agar con extracto de levadura y extracto de malta se observó micelio aéreo blanco y estéril débilmente desarrollado, micelio del sustrato marrón rojizo y pigmentos difundibles amarillento claro. En placas de agar con sales inorgánicas-almidón, el micelio del sustrato gris rojizo oscuro bien desarrollado, estaba cubierto con micelio aéreo relativamente más desarrollado, cuyo color cambió de blanco a una masa gris amarillenta de esporóforos espirales cortos (tipo Retinaculum apertum) y esporas de superficies suaves. No se detectó la presencia de pigmentos solubles. Los cultivos de esta cepa (1/28) tanto en agar con peptona-levadura-hierro como en agar con tirosina produjeron pigmentos de melanoide marrón oscuro y negros.

Propiedades fisiológicas: Se observó un buen crecimiento en celulosa, pero sin la degradación visible de las fibras de celulosa. En caldo de nitrato mostró buen crecimiento, pero no se detectó la presencia de nitritos, amoniaco o desarrollo de gas. Mostró poder tolerar concentraciones de NaCl al 6%, y valores de pH entre 5 y 11. Se detectaron los ensayos de hidrólisis de esculina y ureasa positivos. Se observó buen crecimiento en glucosa, fructosa, arabinosa, xilosa, ramnosa, sacarosa, manitol, rafinosa y meso-inositol, como las únicas fuentes de carbono en el medio. Se observó crecimiento débil con citrato-Na, malonato-Na, piruvato-Na, lactato-Ca, y succinato-Ca. El crecimiento fue también sólo en trazas con acetato-Na, tartrato-Na y benzoato-Na.

Posición taxonómica: Aunque no fue posible la identificación correcta del color del micelio aéreo, basándose en las propiedades de diagnóstico más importantes, se puede denominar a esta cepa como una variante débilmente esporulante de la especie Streptomyces resistomycificus, Lindebenin, 1952 (Str. violaceus según Kampfer y col., 1991).

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento microbiológico para preparar compuestos de fórmula general (I),

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en la que R_{1} significa un grupo metilo o hidroximetilo y R_{2} significa un grupo hidroxilo o amino, que comprende hacer crecer una cepa de hongo Penicillium waksmani capaz de biosintetizar ácido micofenólico de 22ºC a 30ºC, en un medio de cultivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables así como sales minerales, separar del caldo de fermentación el compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo hidroxilo, y si se desea, purificarlo y, si se desea, fermentarlo

a) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces griseoruber Nº 1/6, depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales como Streptomyces sp. Nº 1/6 con el Nº NCAIM P(B) 001275, para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo amino; o

b) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces resistomycificus Nº 1/28 depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales con el Nº NCAIM P(B) 001276, para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo hidroximetilo y R_{2} significa grupo amino;

en un medio de cultivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables así como sales minerales en condiciones aireadas y enterradas hasta completarse la bioconversión, después separar del cultivo el compuesto de fórmula general (I) formado y, si se desea, purificarlo.

De acuerdo con la invención, los cultivos de la cepa de Penicillium waksmani que usan ventajosamente glucosa, maltosa, sacarosa, glicerol, extracto de malta y almidón soluble en agua como fuentes de carbono, se usan para la producción de ácido micofenólico. Se puede usar extracto de levadura, peptona, extracto de carne, caseína, tripcasina, harina de soja, agua de macerado de maíz, nitrato sódico o sulfato amónico como fuentes de nitrógeno.

Además de las fuentes de carbono y nitrógeno anteriores, también puede haber presente sales minerales, por ejemplo, sulfato magnésico, aminoácidos, vitaminas y agentes antiespumantes, en el medio de cultivo usado para producir ácido micofenólico.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de la invención para preparar ácido micofenólico, se prepara una suspensión de esporas con agua destilada a partir de los cultivos de agar inclinados de la cepa de Penicillium waksmani depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales con el Nº NCAIM P(F) 001269 o una de sus cepas mutantes, que es capaz de biosintetizar ácido micofenólico. Después de inocular 5 ml de esta suspensión de esporas en un medio de cultivo sembrado, se inocula un medio de cultivo productivo con el cultivo inóculo de 3 días crecido de 24ºC a 28ºC, preferiblemente a 25ºC, y después se incuba de 22ºC a 28ºC, preferiblemente a 25ºC durante 7 días. El cultivo se llevó a cabo en condiciones aerobias, durante el cual el valor de pH cambió entre 3,5 y 7,5. En el periodo principal de fermentación la entrada de aire era 120 l/hora, la velocidad de agitación era 400 revoluciones/minuto.

Durante la fermentación se determinó el contenido de sustancia activa del caldo de fermentación usando cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o densitometría después de cromatografía en capa fina (TLC). Cuando el cultivo contenía la concentración más alta de ácido micofenólico, se paró la fermentación. Para los análisis por cromatografía líquida de alta presión, se aplicaron los líquidos sobrenadantes centrifugados de las muestras de caldo de fermentación diluidos 4 veces con metanol [equipo: sistema isocrático LKB; columna: Nucleosil C_{18} 5 \mum (BST); columna intermedia: 40x4 mm; columna analítica: 250x4,6 mm; con termostato a 25ºC; medición a 238 nm; eluyente: acetonitrilo-agua destilada ajustada a pH 2 con ácido fosfórico (60:40); caudal: 1,0 ml/min; volumen de inyección: 10 \mul]. El tiempo de retención del ácido micofenólico es 15,8 minutos en este sistema.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de la invención para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo amino, se prepara una suspensión de esporas con agua destilada a partir de un cultivo de agar inclinado de la cepa de Streptomyces griseoruber Nº 1/6. Se inoculó un medio de cultivo sembrado con esta suspensión de esporas, y después se inoculó un medio de cultivo productivo con el cultivo inóculo de 3 días crecido de 25ºC a 37ºC, preferiblemente a 28ºC, el cual después se incubó de 25ºC a 32ºC, preferiblemente 28ºC, durante 3 días. Después de añadir ácido micofenólico al cultivo, el cultivo se continuó durante 7 días adicionales.

De acuerdo con otra realización preferida del procedimiento de la invención para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo hidroximetilo y R_{2} significa grupo amino, se prepara una suspensión de esporas con agua destilada a partir de cultivo de agar inclinado de la cepa de Streptomyces resistomycificus Nº 1/28. Se inoculó un medio de cultivo sembrado con esta suspensión de esporas, y después se inoculó un medio de cultivo productivo con el cultivo inóculo de 3 días crecido de 25ºC a 37ºC, preferiblemente a 28ºC, durante 3 días. Después de añadir ácido micofenólico al cultivo, el cultivo se continuó durante 7 días adicionales.

Los procedimientos de la invención se ilustran por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Se preparó la cepa mutante de Penicillium waksmani [NCAIM (P)F 001269] que biosintetiza ácido micofenólico en una alta concentración, en un experimento de mutación-selección llevado a cabo mediante N-metil-N-nitro-N'-nitrosoguanidina. La cepa de Penicillium waksmani que sintetiza ácido micofenólico aislada de una muestra de suelo se hizo crecer en agar MS inclinado a 25ºC durante 10 días.

Composición del medio de cultivo MS:
glucosa	4 g
extracto de malta	10 g
extracto de levadura	4 g
agar	20 g
en 1000 ml de agua destilada

Las esporas se lavaron del cultivo de agar inclinado con 5 ml de un tampón de fosfato 0,1 M estéril (pH 8,0). A la suspensión de esporas se añadió N-metil-N-nitro-N'-nitrosoguanidina con una concentración final de 1 mg/ml. La suspensión se agitó a 28ºC a 150 rpm durante 35 minutos. Posteriormente, las esporas se sedimentaron centrifugando a una velocidad de 5000 rpm y después se volvieron a suspender en agua destilada estéril. La suspensión se esparció en placas de agar MS. Después de incubar las placas a 25ºC durante 10 días, las colonias crecidas se inocularon en medio de cultivo MS. La capacidad de producción de ácido micofenólico de los cultivos inclinados de agar crecidos se investigó de la forma descrita en el Ejemplo 2, en experimentos en matraces agitados.

Ejemplo 2

Las esporas de un cultivo de 7 a 10 días de la cepa de Penicillium waksmani NCAIM (P)F 001269 crecida en agar inclinado que contenía extracto de malta y extracto de levadura, se lavaron con 5 ml de agua destilada estéril, y después se inoculó la suspensión de esporas en 100 ml de medio de cultivo inóculo MI esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. La composición del medio de cultivo MI era la siguiente:

glucosa	40 g
hidrolisato de caseína	5 g
nitrato sódico	3 g
dihidrógeno-fosfato potásico	2 g
cloruro potásico	0,5 g
sulfato magnésico	0,5 g
sulfato de hierro	0,01 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el valor de pH del medio de cultivo se ajustó a 6,0 y la esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 25 minutos. El cultivo se agitó en un aparato de agitación (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 3 días, y después se inocularon 100 ml de medio de cultivo A2 esterilizado en 50 matraces Erlenmeyer de 500 ml de volumen cada uno a 121ºC durante 25 minutos.

Composición del medio de cultivo A2:
glucosa	80 g
tripcasina	10 g
en 1000 ml de agua corriente

La esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 25 minutos. El matraz se agitó en un aparato de agitación (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) a 25ºC. El contenido de sustancia activa del caldo de fermentación se determinó usando el procedimiento de HPLC. La fermentación se continuó durante 168 horas y se aisló el ácido micofenólico del caldo de fermentación. A partir de 5 litros de caldo de fermentación que contenían 3100 mg/litro de ácido micofenólico, el producto se aisló como sigue.

Después de completar la fermentación, el valor de pH del caldo de fermentación se ajustó a 3,2 \pm 0,2 por adición de ácido sulfúrico al 20% en peso, después el caldo de fermentación ácido se agitó con 2500 ml de cloruro de metileno durante una hora. Posteriormente, después de separar las fases, la fase acuosa se extrajo con 3 x 1250 ml de cloruro de metileno como se ha descrito antes. Los extractos de cloruro de metileno combinados que contenían ácido micofenólico se extrajeron con 1 x 500 ml y 2 x 250 ml de solución de hidrógeno-carbonato sódico al 5% en peso. Las soluciones alcalinas acuosas combinadas que contenían la sal sódica del ácido micofenólico se enfriaron por debajo de 20ºC y el valor de pH de la solución se ajustó a 3,2 \pm 0,2 usando solución de ácido sulfúrico al 20% en peso. La solución ácida se extrajo con 3 x 280 ml de cloruro de metileno, después los extractos combinados de cloruro de metileno se evaporaron a presión reducida. El residuo de evaporación se disolvió en 88 ml de alcohol isopropílico a 80ºC y se clarificó con 1,1 g de carbón activo durante 30 minutos. Después de filtrar el carbón activo, la superficie del filtro se lavó dos veces con alcohol isopropílico caliente. Los filtrados de alcohol isopropílico combinados se evaporaron a presión reducida, y después el producto bruto se disolvió en 88 ml de alcohol isopropílico a 80ºC. Posteriormente, la solución obtenida se enfrió a temperatura ambiente y se dejó reposar de 0 a 5ºC toda la noche. Los cristales se filtraron y lavaron una vez con alcohol isopropílico enfriado y dos veces con n-hexano. El producto obtenido se secó de 50 a 60ºC a presión reducida. Posteriormente, el producto seco se disolvió en 55 ml de etanol a una temperatura externa de 60ºC y después se añadieron gota a gota 22 ml de agua desionizada con agitación a la solución obtenida. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se dejó reposar de 0 a 5ºC toda la noche. Después de filtrar, los cristales se lavaron una vez con una mezcla de etanol y agua 4:10 y dos veces con n-hexano y finalmente se secaron a presión reducida de 50 a 60ºC para dar 9,0 g de ácido micofenólico puro.

Punto de fusión: 141ºC.

Los datos espectroscópicos del producto son los siguientes:

Espectro ultravioleta (con una concentración de 20 \mug/ml en etanol al 96% con un espesor de capa de 1 cm):

\lambda_{max} (nm)	\varepsilon	log \varepsilon	Asignación
215	44.640	4,650	Banda aromática
249	9250	3,966	Banda de conjugación
304	4950	3,694	Transición C=O n\rightarrow\pi*

IR: 3415; 1745; 1710; 1625 cm^{-1};

RMN ^{1}H (CDCl_{3}, \delta_{TMS} = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH_{3}); 2,13 (s, 3H, 7'-CH_{3}); 2,30 (t, J=8 Hz, 2H, H_{2}-3); 2,42 (t, J=8 Hz, 2H, H_{2}-2); 3,37 (d, J=6,6 Hz, 2H, H_{2}-6); 3,76 (s, 3H, 6'-OCH_{3}); 5,16 (s, 2H, H_{2}-1'); 5,25 (t, J=6,6 Hz, 1H, H-5);

RMN ^{13}C (CDCl_{3}, \delta_{TMS} = 0 ppm): 11,5, c (7'-CH_{3}); 16,0, c (4-CH_{3}); 22,5, t (C-6); 32,7, t (C-2); 34,1, t (C-3); 60,9, c (6'-OCH_{3}); 70,0, t (C-1'); 106,3, s (C-3a'); 116,7, s (C-7'); 122,0, s (C-5'); 122,9, d (C-5); 133,8, s (C-4); 144,0, s (C-7a'); 153,6, s (C-4'); 163,6, s (C-6'); 172,9, s (C-3'); 179,4, s (C-1).

Espectro de masas

Espectro de masas con ionización por impacto electrónico (EI)

Datos espectrales característicos:

EI (70 eV): m/z 320 ([M]^{+\bullet}); m/z 302 ([M- _{2}O]^{+\bullet}); m/z 247 ([M-^{\bullet}CH_{2} CH_{2}-COOH]^{+}); m/z 229 ([247-H_{2}O]^{+}); m/z 207 ([C_{11}H_{11}O_{4}]^{+}); m/z 159([C_{10}H_{7}O_{2}]^{+}).

Espectro de masas con ionización química (CI)

Datos espectrales característicos:

CI (i-butano): m/z 321 ([M+H]^{+}); m/z 320 ([M]^{+\bullet}); m/z 303 ([M+H - H_{2}O]^{+}).

Ejemplo 3

5 litros de medio de cultivo productivo A2 esterilizados a 121ºC durante 45 minutos en un fermentador de laboratorio de 5 litros de volumen de trabajo, se inocularon con 250 ml de inóculo de cultivo agitado preparado como se describe en el Ejemplo 2. Después de la inoculación, el fermentador se hizo trabajar a 25ºC burbujeando 120 litros/h de aire estéril y con el agitador a una velocidad de 400 rpm. La fermentación se continuó durante 168 horas, y después se aisló el ácido micofenólico del caldo de fermentación. El caldo de fermentación de 4,9 litros obtenido contenía 2000 mg/l de ácido micofenólico al final de la fermentación. El ácido micofenólico se aisló del caldo de fermentación como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4

5 litros de medio de producción A3 esterilizados en un fermentador de laboratorio a 121ºC durante 35 minutos se inocularon con 250 ml de cultivo sembrado preparado como se describe en el Ejemplo 2.

Composición del medio A3:
glucosa	80 g
Amina NZ YTT (Quest)	10 g
en 1000 ml de agua corriente

El fermentador se hizo funcionar a 27ºC con 120 l/h de aireación y agitación a 400 rpm. La fermentación se continuó durante 168 horas. El caldo de fermentación de 5 litros obtenido contenía 2550 mg/l de ácido micofenólico. El ácido micofenólico se aisló del caldo de fermentación de acuerdo con el Ejemplo 2.

Ejemplo 5

Se preparó una suspensión celular a partir de un cultivo de la cepa de Streptomyces groseoruber Nº 1/6 depositada como Streptomyces sp Nº 1/6 [NCAIM (P)B 001275] crecido en agar CM inclinado.

Composición del medio de cultivo de agar CM:
glucosa	25 g
peptona	2 g
extracto de levadura	1 g
sulfato magnésico - agua (1:7)	0,5 g
dihidrógeno-fosfato potásico	5 g
agar	20 g
en 1000 ml de agua destilada

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Se inocularon 5 ml de la suspensión en 100 ml de medio de cultivo MB inóculo esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml de volumen.

Composición del medio de cultivo MB:
glucosa	20 g
extracto de malta	30 g
extracto de levadura	10 g
sulfato magnésico - agua (1:7)	1 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización el valor de pH del medio de cultivo se ajustó a 7,0 y la esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 25 minutos. Los cultivos se hicieron crecer en un aparato con agitación (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) a 28ºC durante 3 días, y después se inocularon 5 ml de cada cultivo sembrado obtenido en 50 matraces Erlenmeyer de 500 ml de volumen cada uno en 100-100 ml de medio de cultivo de bioconversión esterilizado MBT, que tenía la siguiente composición:

glucosa	20 g
extracto de malta	10 g
harina de soja	5 g
peptona	10 g
sulfato magnésico - agua (1:7)	1 g
dihidrógeno-fosfato potásico	1 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el valor de pH del medio de cultivo se ajustó a 7,0. La esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 25 minutos. Se añadió en porciones al medio de cultivo glucosa esterilizada por separado en la inoculación. Los matraces se agitaron a 28ºC usando un aparato de agitación (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 3 días. A los cultivos de 72 horas se les añadió ácido micofenólico disuelto en etanol hasta una concentración final de 0,1 mg/ml. La fermentación se continuó durante 7 días adicionales después de la adición. Al final de la bioconversión, se añadieron 2,0 litros de acetona y 4,0 litros de acetato de etilo al caldo de fermentación de 4,0 litros. Después la mezcla se agitó durante una hora. Posteriormente, las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo otra vez con 4,0 litros de cloroformo. Las fases orgánicas emulsionadas obtenidas en el transcurso de la extracción se centrifugaron. Después, la fase orgánica separada se evaporó y después el producto bruto obtenido (2,0 g) se cromatografió en una columna preparada a partir de 100 g de adsorbente Kieselgel 60 (tamaño de partículas 0,063 a 0,2 mm; Reanal, Budapest). El producto bruto se aplicó en la columna con una mezcla de cloroformo, metanol y ácido acético al 99,5% (8,5:1,5:0,01), y en el transcurso de la cromatografía se usó la mezcla anterior como disolvente de desarrollo. Se recogieron de la cromatografía en columna fracciones de 10 ml cada una, y las fracciones se analizaron por TLC en un lámina de aluminio Kieselgel 60 F_{254} DC (Merck), usando la mezcla de desarrollo antes descrita (detección a temperatura ambiente con reactivo de FeCl_{3} al 1% en etanol). Las fracciones que contenían principalmente la amida del ácido micofenólico se combinaron, y después se añadieron 40 ml de agua desionizada a la solución de 120 ml obtenida. El valor de pH de la mezcla se ajustó a 4,0-4,5 por adición de solución de hidróxido sódico 1 N. Después de separar las fases, la fase acuosa se extrajo con 40 ml de cloroformo. Los extractos combinados se evaporaron a presión reducida y el producto obtenido (0,3 g) se sometió otra vez a cromatografía en una columna preparada a partir de 30 g de adsorbente Kieselgel 60 (tamaño de partículas 0,063 a 0,2 mm; Reanal, Budapest). La columna cromatográfica se preparó usando una mezcla de cloruro de metileno y acetato de etilo que contenía acetato de etilo al 10%. Para la elución, el contenido de acetato de etilo de esta mezcla se aumento en 10% en cada elución posterior. En el transcurso de la cromatografía, se cogieron fracciones de 15 a 20 ml y se investigaron por TLC en las condiciones antes descritas. (En el transcurso de la investigación se aplicó una mezcla que constaba de benceno y acetato de etilo (1:2) como sistema de desarrollo). El producto se disolvió de la columna usando una mezcla de cloruro de metileno y acetato de etilo que contenía acetato de etilo al 40%. Las fracciones que contenían el producto se evaporaron a presión reducida para obtener 0,2 g de amida del ácido micofenólico puro por cromatografía.

IR: 3433; 1737; 1665; 1622 cm^{-1};

RMN ^{1}H (CDCl_{3}, \delta _{TMS} = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH_{3}); 2,14 (s, 3H, 7'-CH_{3}); 2,31 (s, 4H, H_{2}-2 y H_{2}-3); 3,39 (d, J=6,3 Hz, 2H, H_{2}-6); 3,76 (s, 3H, 6'-OCH_{3}); 5,19 (s, 2H, H_{2}-1'); 5,21 (t, J=6,3 Hz, 1H, H-5);

RMN ^{13}C (CDCl_{3}, \delta_{TMS} = 0 ppm): 11,4, c (7'-CH_{3}); 16,0, c (4-CH_{3}); 22,5, t (C-6); 34,2, t (C-2); 34,9, t (C-3); 61,0, c (6'-OCH_{3}); 70,0, t (C-1'); 106,3, s (C-3a'); 116,7, s (C-7'); 122,0, s (C-5'); 123,0, d (C-5); 134,2, s (C-4); 144,1, s (C-7a'); 153,5, s (C-4'); 163,5, s (C-6'); 172,8, s (C-3'); 176,4, s (C-1).

Espectro de masas

Espectro de masas con ionización por impacto electrónico (EI)

Datos espectroscópicos característicos:

EI (70 eV): ([M]^{+\bullet}) 319, C_{17}H_{21}NO_{5}; m/z 302 C_{17}H_{18}O_{5} ([M-NH_{3}]^{+\bullet}); m/z 301, C_{17}H_{19}NO_{4}, ([M-H_{2}O]^{+\bullet}); m/z 261, C_{15}H_{17}O_{4}, ([M-^{\bullet}CH_{2}-CONH_{2}]^{+}); m/z 207, C_{11}H_{11}O_{4} ([M-^{\bullet}C_{5}H_{8}CONH_{2}]^{+}).

Espectro de masas con ionización química (CI)

Datos espectrales característicos:

CI (i-butano): ([M+H]^{+}) 320; ([M]^{+\bullet}) 319; m/z 303 ([M+H - NH_{3}]^{+}); m/z 207 ([M-^{\bullet}C_{5}H_{8}CONH_{2}]^{+}).

Ejemplo 6

La preparación del cultivo inóculo y bioconversión se llevaron a cabo con la suspensión celular preparada a partir del cultivo de la cepa de Streptomyces reistomycificus Nº 1/28 [NCAIM (P)B 001276] crecida en agar inclinado CM como se descrie en el Ejemplo 5.

Al final de la bioconversión, el caldo de fermentación de 4,5 litros de volumen se extrajo como se describe en el Ejemplo 4. Por evaporación de los extractos a presión reducida, se obtuvieron 3,8 g de producto bruto, que se purificaron en una columna cromatográfica preparada a partir de 114 g de absorbente Kieselgel 60 (tamaño de partículas: 0,063 a 0,2 mm; Reanal). En el transcurso de la purificación por cromatografía se usó una mezcla de cloroformo, metanol y ácido acético al 99,5% (8,5:1,5:0,01) como sistema de desarrollo. Durante la cromatografía se cogieron fracciones de 15 a 20 ml cada una y se analizaron por TLC como se describe en el Ejemplo 5. Se usó una mezcla compuesta de cloroformo, metanol y ácido acético al 99,5% (8,5:1,5:0,01) como sistema de desarrollo. Las fracciones que contenían principalmente amida del ácido hidroximetil-micofenólico se combinaron y la solución se procesó antes de la evaporación como se describe en el Ejemplo 5. El producto obtenido (0,4 g) después de evaporar la solución se sometió a cromatografía adicional en una columna preparada a partir de 40 g de adsorbente Kieselgel 60 (tamaño de partículas: 0,063 a 0,2 mm; Reanal). La columna cromatográfica se preparó en cloroformo, y durante la elución se usaron mezclas que contenían cloroformo y metanol, cuyo contenido de metanol se aumento en 10% en cada elución. Durante la cromatografía se cogieron fracciones de 10 ml cada una y se analizaron por TLC en las condiciones antes descritas. El producto se disolvió de la columna usando cloroformo que contenía metanol al 5%. Las fracciones que contenían el producto se evaporaron y el producto obtenido (0,3 g) se purificó más usando metanol como disolvente en una columna que contenía 300 ml de gel Sephadex LH-20 (Pharmacia, Suecia). En el transcurso de la cromatografía de filtración en gel, se cogieron fracciones de 10 ml cada una, y se analizaron por TLC en las condiciones antes descritas. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y evaporaron a presión reducida para obtener 0,22 g de amida del ácido hidroximetil-micofenólico homogéneo por cromatografía.

Datos espectroscópicos del producto obtenido:

IR: 3339; 1735; 1657; 1615 cm^{-1};

RMN ^{1}H (MeOH-d_{4}, \delta_{TMS} = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH_{3}); 2,25 (s, 4H, H_{2}-2 y H_{2}-3); 3,38 (d, J=6,5 Hz, 2H, H_{2}-6); 3,78 (s, 3H, 6'-OCH_{3}); 4,66 (s, 2H, 7'-CH_{2}-OH); 5,25 (t, J=6,5 Hz, 1H, H-5); 5,40 (s, 2H, H_{2}-1');

RMN ^{13}C (MeOH-d_{4}, \delta_{TMS} = 0 ppm): 16,2, c (4-CH_{3}); 23,4, t (C-6); 35,3, t y 36,5, t (C-2 y C-3); 57,8, t (7'-CH_{2}OH); 62,9, c (6'-OCH_{3}); 71,5, t (C-1');108,2, s (C-3a'); 122,0, s y 123,6, s (C-5' y C-7'); 124,2, d (C-5); 135,3, s (C-4); 146,8, s (C-7a'); 156,1, s (C-4'); 164,1, s (C-6'); 173,7, s (C-3'); 178,7, s (C-1).

Espectro de masas

Espectros FAB positivo (+) y negativo (-)

Datos espectrales característicos:

FAB + y - (xenón, 9kV): [M+H]^{+} 336, m/z 318 [M+H-H_{2}O]^{+}; [M-H]^{-} 334.

Claims

1. Un procedimiento microbiológico para preparar compuestos de fórmula general (I)

4

en la que R_{1} significa grupo metilo o Idroximetilo y R_{2} significa grupo hidroxilo o amino, que comprende hacer crecer una cepa de hongo de Penicillium waksmani capaz de biosintetizar ácido micofenólico, en un medio de cultivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables, así como sales minerales de 22 a 30ºC, separar del caldo de fermentación el compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo hidroxilo, y si se desea, purificarlo y, si se desea, bioconvertirlo

a) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces griseoruber Nº 1/6 depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales como Streptomyces sp. Nº 1/6 con el Nº NCAIM (P)B 001275, para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo metilo y R_{2} significa grupo amino; o

b) usando los cultivos de la cepa de actinomiceto Streptomyces resistomycificus Nº 1/28 depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales con el Nº NCAIM (P)B 001276, para preparar un compuesto de fórmula general (I), en la que R_{1} significa grupo hidroximetilo y R_{2} significa grupo amino.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se cultiva la cepa de Penicillium waksmani depositada en la Colección Nacional de Microorganismos Agrícolas e Industriales con el Nº NCAIM (P)F 001269 o una de sus cepas mutantes, que es capaz de biosintetizar ácido micofenólico.