CN105466874B - 一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,包括以下步骤:(1)选取三尖杉碱标准品,加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢,摇匀后微波加热,得标准品反应液;(2)将标准品反应液冷却至室温,定容,并比色,将比色得到的吸光值与步骤(1)中的三尖杉碱标准溶液的浓度相关联,建立三尖杉碱吸光度值‑浓度的标准曲线;(3)选取三尖杉科植物样品或三尖杉科植物的悬浮培养细胞,提取其中的三尖杉生物碱总碱,(4)参照步骤(2)、(3),测其吸光值,将测得的吸光值代入上述吸光度值‑浓度的标准曲线,获得三尖杉科植物样品的浓度,经换算即获得三尖杉科植物样品中三尖杉生物碱总碱含量。该方法简便、安全、快捷、准确。
Description
技术领域
本发明属于生物碱总碱含量测试技术领域,具体涉及一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法。
背景技术
三尖杉科(Cephalotaxaceae)仅有三尖杉属1属,该属植物共有7个种2个变种,包括篦子三尖杉(C.oliveri)、日本粗榧(C.harringtonia)、宽叶粗榧(C.Latifolia)、粗榧(C.sinensis)、海南粗榧(C.mannii)、三尖杉(C.fortunei)、高山三尖杉(C.fortuneivar.alpine)、台湾粗榧(C.sinensis var.wilsoniana)、贡山三尖杉(C.lanceolata)。本科分布于东亚南部及中南半岛,主产中国。零星分布于横断山脉以东、秦岭至大别山与江苏南部以南的省区及台湾。
该科植物均含有次生代谢产物三尖杉生物碱,为该科植物特有的次生代谢产物。于1954年首次发现,目前已鉴定出的三尖杉生物碱有50多种。其中部分化合物已被鉴定具有药物活性而备受关注,例如:三尖杉酯碱(harringtonine)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、脱氧三尖杉酯碱(deoxyharringtonine)和异三尖杉酯碱(isoharringtonine)。这些化合物在治疗白血病、淋巴癌、皮肤癌、鼻咽癌等疾病方面有效。
不同种的三尖杉科植物含有的三尖杉生物碱不同,不同的部位也有明显差异。并且随着产地、植株年龄及逆境的变化而变化。尽管可以通过液质联用、核磁共振的方法逐个定量、定性分析这些单体化合物。但是,目前仍然缺少安全、快捷、准确的三尖杉生物碱总碱的测定方法。
因此,建立三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱测定方法对于快速评估收获时期和药物提取等方面有重要意义。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,该方法简便、安全、快捷、准确。
本发明利用三尖杉生物碱的母环结构具有亚甲二氧基,亚甲二氧基在酸性条件下可以水解生成甲醛,而甲醛和变色酸进一步反应可以显色,根据朗博-比尔(Lambert-Beer)定律可以测定总碱含量。
本发明上述所要解决的技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,包括以下步骤:
(1)选取三尖杉碱标准品,采用有机溶剂配制一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液,将该组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液挥干有机溶剂,然后加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢,摇匀后微波加热,得标准品反应液;
(2)将标准品反应液冷却至室温,加入蒸馏水定容,并比色,将比色得到的吸光值与步骤(1)中的三尖杉碱标准溶液的浓度相关联,建立三尖杉碱吸光度值-浓度的标准曲线;
(3)选取三尖杉科植物样品,烘干后粉碎,获得生药粉末,取生药粉末,加入氨水,混匀后再加入氯仿浸提,浸提结束后过滤、离心,取氯仿层,挥发掉氯仿,残留物用有机溶剂定容;
或选取三尖杉科植物的悬浮培养细胞,离心后,取沉淀物,加入氨水,混匀后再加入氯仿,搅拌后超声处理,浸泡过夜浸提,浸提结束后过滤,取滤液,并挥发掉氯仿,残留物用有机溶剂定容;
(4)取定容后样品,加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢,摇匀后微波加热,冷却至室温,加入蒸馏水定容,并比色,将测得的吸光值代入步骤(2)建立的三尖杉碱吸光度值-浓度的标准曲线,获得三尖杉科植物样品的浓度,经换算即获得三尖杉科植物样品中三尖杉生物碱总碱含量。
在上述测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法中:
步骤(1)中所述的一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液的浓度分别优选为0、250、500、1000、2000μg/mL。
步骤(1)和步骤(3)中所述的有机溶剂优选为甲醇。
步骤(1)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与每个三尖杉碱标准溶液的用量关系优选为:200~400μL:2~4mL、50~100μL:50~150μL,其中变色酸溶液的浓度优选为0.1~0.2g/mL,浓磷酸的质量百分含量优选为80~85%,过氧化氢的浓度优选为0.020~0.025mol/L。
步骤(1)中变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与每个三尖杉碱标准溶液的用量关系最佳为:300μL:3mL、70μL:100μL,其中变色酸溶液的浓度最佳为0.1g/mL,浓磷酸的质量百分含量最佳为85%,过氧化氢的浓度最佳为0.025mol/L。
步骤(1)和步骤(4)中在三尖杉生物碱总碱中加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢时,反应充分,加热时间短。
使用浓磷酸和过氧化氢作为反应介质,三尖杉生物碱总碱中的亚甲二氧基水解为甲醛,甲醛和变色酸反应生成紫色络合物在该介质条件下可以一步完成,并且使用浓磷酸较浓硫酸安全性得以提高。
步骤(1)和步骤(4)中微波加热时,微波功率优选为1000~1200W,加热时间优选为30~38s。
步骤(2)和步骤(4)中比色时,优选于波长540~580nm处比色。
步骤(2)和步骤(4)中比色时,最佳于波长558nm处比色。
在波长为558nm处比色,具有响应值高的特点,可以提高检测的灵敏度。
步骤(3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系优选为2~5g:2~5mL:25~40mL,步骤(3)中沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为3~5g:0.5~1.5mL:10~20mL,其中氨水的质量百分含量为20~28%。
步骤(3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系最佳为:3g:2mL:30mL,其中氨水的质量百分含量为28%;步骤(3)中沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为4g:1mL:15mL。
步骤(3)中选取三尖杉科植物样品,烘干后粉碎时,将三尖杉科植物样品优选于105℃烘干30~45min后,再于80~85℃继续烘干至衡重,烘干的样品优选粉碎至颗粒小于420μm,获得生药药粉。
步骤(3)中三尖杉科植物样品优选为三尖杉科植物叶片、枝条或者杀青后的树皮;三尖杉科植物优选为海南粗榧。
步骤(3)中超声时,超声波的频率优选为80Hz,超声时间优选为30min。
步骤(3)中浸提结束后过滤、离心时,离心机转速为3000~5000r/min,离心时间为10~20min。
步骤(4)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与定容后样品的用量关系优选为:200~400μL:2~4mL、50~100μL:50~150μL,其中变色酸溶液的浓度优选为0.1~0.2g/mL,浓磷酸的质量百分含量优选为80~85%,过氧化氢的浓度优选为0.020~0.025mol/L。
步骤(4)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与定容后样品的用量关系最佳为:300μL:3mL、70μL:100μL,其中变色酸溶液的浓度为0.1g/mL,浓磷酸的质量百分含量为85%,过氧化氢的浓度为0.025mol/L。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本方法选择磷酸与过氧化氢作为反应介质,避免了浓硫酸的使用,可以提高试验的安全性,且结果更加准确;
(2)本方法采用微波加热的方法可以促进反应的进行,缩短反应时间,使实验更为快捷;
(3)本方法采用溶剂挥干的方法,可以排除不同提取方法使用溶剂不同,因背景误差而导致测定结果不一致的问题;
(4)本方法确定了该反应体系条件下,响应值最高的检测波长,检测灵敏度高。
附图说明
图1是实施例1中建立的吸光度值-浓度的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
本发明方法精密度、稳定性、准确度和回收率情况
(一)稳定性测试
(1)分别取海南粗榧叶片和嫩枝,在105℃烘干30min,然后再在80℃烘干12小时,粉碎样品后,用40目筛子过滤,获得干粉。
(2)分别称取叶片和嫩枝干粉3g,加氨水(28%)2mL,加氯仿30mL后,震荡搅拌器搅拌均匀,浸泡过夜,离心15min(3000r/min),取氯仿层溶液10mL,通风橱内挥发干氯仿,残渣用甲醇溶解,转移至1mL容量瓶中定容,设3次重复。
(3)分别取海南粗榧叶片和嫩枝样液50μL和三尖杉碱标准品溶液100μL(2mg/mL,采用甲醇配制,购自上海源叶生物科技有限公司,下同),放入50mL的烧杯中,挥发干甲醇,加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/mL,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却,加蒸馏水3mL,摇匀,冷却至室温后,加水定容至10mL。
(3)分别在1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h于波长558nm比色测定,测定的吸光值如表1所示,分别计算其平均值和相对标准偏差(RSD)。结果表明标准品和样品反应后溶液24h内检测结果的RSD均在5%以下,三尖杉碱标准品及样品变色反应后溶液24h内显色很稳定。
表1样品及标准样品反应后溶液稳定性检测结果
(二)精密度测试
取三尖杉碱标准溶液(2mg/mL,采用甲醇配制)100μL,放入50mL的烧杯中,挥发干甲醇,加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/mL,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却后,加水定容至10mL。重复6次。计算平均吸光值,相对标准偏差。
检测结果为:平均吸光值为0.4307,相对标准偏差(RSD)为0.59%,表明实验仪器精密度良好。
(三)重复性测试
(1)分别取海南粗榧叶片和嫩枝,在105℃烘干30min,然后再在80℃烘干12小时,粉碎样品后,用40目筛子过滤,获得干粉。
(2)分别称取叶片和嫩枝干粉3g,加氨水(质量百分含量为28%,下同)2mL,加氯仿30mL后,震荡搅拌器搅拌均匀,浸泡过夜,离心15min(3000r/min),取氯仿层溶液10mL,通风橱内挥发干氯仿,残渣用甲醇溶解,转移至1mL容量瓶中定容。
(3)于波长558nm比色测定吸光值。检测结果:叶片,嫩枝样液吸光度平均值分别为:0.246和0.223,RSD值分别为4.75%和4.90%,表明本实验具有良好的重现性,条件合理。
(四)回收率测试
(1)精确吸取浓度为0、250、500、1000、2000μg/mL三尖杉碱标样稀释液各100μL,分别置于50mL的小烧杯中,挥发干甲醇。加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/mL,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却后,加水定容至10mL,于波长558nm比色测定,获得吸光值。用吸光值为纵坐标,样品浓度为横坐标作图,绘制得到标准曲线(y=0.018x,R2=0.999),如图1中所示。
(2)分别取三尖杉植物海南粗榧叶片和枝条干粉3g,加氨水(28%)2mL,加氯仿30mL后,震荡搅拌器搅拌均匀,浸泡过夜,离心15min(3000r/min),取氯仿层溶液10mL,通风橱内挥发干氯仿,残渣用甲醇溶解,转移至1mL容量瓶中定容。于波长558nm比色测定吸光值。把吸光值代入标准曲线方程(y=0.018x)计算获得总碱浓度,检测结果如表2中样品含量所示。
(3)分别取上述叶片和小枝样品液3份各20μL,置于50mL烧杯中,再给每个烧杯中加入1000μg/mL三尖杉碱标准品溶液25μL,挥发干溶剂。
(4)加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/mL,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却后,加水定容至10mL,于波长558nm比色测定,获得吸光值。吸光值代入标准曲线方程(y=0.018x)计算总碱含量,结果见表2中检测含量所示。
表2加样回收率结果分析
(5)以加样测得量减去原样品中含量,除以加样量,计算回收率,结果如表2。结果表明:平均回收率在98.85~106.86%之间,符合要求。
实施例2
海南粗榧叶片、嫩枝中三尖杉生物碱总碱含量的测定
(1)分别取海南粗榧叶片和嫩枝,用烘箱中105℃杀青,然后80℃烘干16h,研磨成细粉,过40目筛,获得生药;
(2)分别称取叶片和小枝干粉3g,加氨水(28%)2mL,加氯仿30mL后,震荡搅拌器搅拌均匀,浸泡过夜,离心15min(3000r/min),取氯仿层溶液10mL,通风橱内挥发干氯仿,残渣用甲醇溶解,定量转移至1mL小容量瓶中备用,设3次重复。
(3)吸取叶片和小枝样品液各50μL,加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/ml,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却后,加水定容至10mL,于波长558nm比色测定,获得吸光值,吸光值代入标准曲线方程(y=0.018x)计算总碱浓度
(4)根据以下公式计算生药中三尖杉生物碱总碱含量(w)。
式中:w-总生物碱百分含量;c-显色液总碱浓度(μg/mL);V1-反应液定容体积(mL);V2-吸取样液体积(μL);V3-样品提取后定容体积(mL);m-提取样品的质量(g)。
(5)经上述方法计算,叶片和嫩枝中总碱的含量分别为0.1470%和0.1585%。
实施例3
海南粗榧悬浮培养细胞中三尖杉生物碱总碱含量的测定
(1)取悬浮培养细胞10mL放入50mL的离心管中,离心15min(2000rpm),去除上清液,称重细胞4g;
其中,海南粗榧细胞培养过程参考:陈林,李永成.海南粗榧细胞悬浮培养体系的建立.广东农业科学,2014,24:52-57。
(2)加入氨水1mL,加氯仿15mL,震荡搅拌1min,超声处理30min(80Hz,30min)后,浸泡过夜,过滤,取滤液6mL,通风橱内挥发干氯仿,残渣用甲醇溶解,定容至1mL容量瓶;
(3)取定容后的样品溶液100μL,放入50mL的烧杯中,挥发干甲醇,加新鲜配制的变色酸溶液300μL(0.1g/mL,过滤),加入浓磷酸3mL、过氧化氢70μL(0.025mol/L),摇匀,于微波炉中加热(1200w)35s,取出后室温下冷却,加蒸馏水3mL,摇匀,冷却至室温后,加水定容至10mL,于558nm处比色。根据标准曲线y=0.018x,计算显色液中总碱浓度;
(4)根据以上步骤中稀释倍数关系计算细胞中三尖杉生物碱总碱含量为0.012%。
实施例1-3表明用本方法可以准确、快速测定植物中三尖杉生物碱总碱的含量。
实际上,采用本发明中的方法除了可以检测海南粗榧中的三尖杉生物碱总碱含量之外,还可以检测篦子三尖杉、日本粗榧、宽叶粗榧、台湾粗榧、高山三尖杉贡山三尖杉等中的三尖杉生物碱总碱含量。
显然,上述内容只是为了说明本发明的特点,而并非对本发明的限制,有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。
Claims (6)
1.一种测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是包括以下步骤:
(1)选取三尖杉碱标准品,采用有机溶剂配制一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液,将该组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液挥干有机溶剂,然后加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢,摇匀后微波加热,得标准品反应液;
(2)将标准品反应液冷却至室温,加入蒸馏水定容,并比色,将比色得到的吸光值与步骤(1)中的三尖杉碱标准溶液的浓度相关联,建立三尖杉碱吸光度值-浓度的标准曲线;
(3)选取三尖杉科植物样品,烘干后粉碎,获得生药粉末,取生药粉末,加入氨水,混匀后再加入氯仿浸提,浸提结束后过滤、离心,取氯仿层,挥发掉氯仿,残留物用有机溶剂定容;
或选取三尖杉科植物的悬浮培养细胞,离心后,取沉淀物,加入氨水,混匀后再加入氯仿,搅拌后超声处理,浸泡过夜浸提,浸提结束后过滤,取滤液,并挥发掉氯仿,残留物用有机溶剂定容;
(4)取定容后样品,挥发干有机溶剂,加入变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢,摇匀后微波加热,冷却至室温,加入蒸馏水定容,并比色,将测得的吸光值代入步骤(2)建立的三尖杉碱吸光度值-浓度的标准曲线,获得三尖杉科植物样品的浓度,经换算即获得三尖杉科植物样品中三尖杉生物碱总碱含量;
步骤(1)和步骤(3)中所述的有机溶剂为甲醇;
步骤(1)和步骤(4)中微波加热时,微波功率为1000~1200W,加热时间为30~38s;
步骤(2)和步骤(4)中比色时,于波长558nm处比色。
2.根据权利要求1所述的测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是:步骤(1)中所述的一组具有浓度梯度的三尖杉碱标准溶液的浓度分别为0、250、500、1000、2000 μg/mL。
3.根据权利要求1所述的测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是:步骤(1)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与每个三尖杉碱标准溶液的用量关系为:200~400μL:2~4mL、50~100μL:50~150μL,其中变色酸溶液的浓度为0.1~0.2g/mL,浓磷酸的质量百分含量为80~85%,过氧化氢的浓度为0.020~0.025mol/L。
4.根据权利要求1所述的测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是:步骤(3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系为2~5g:2~5mL:25~40mL,步骤(3)中所述沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为3~5g:0.5~1.5mL:10~20mL,其中氨水的质量百分含量为20~28%。
5.根据权利要求4所述的测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是:步骤(3)中所述生药粉末与氨水和氯仿的用量关系为:3g:2mL:30mL,其中氨水的质量百分含量为28%;步骤(3)中沉淀物与氨水和氯仿的用量关系为4g:1mL:15mL。
6.根据权利要求1所述的测定三尖杉科植物中三尖杉生物碱总碱含量的方法,其特征是:步骤(4)中所述变色酸溶液、浓磷酸和过氧化氢与定容后样品的用量关系为:200~400μL:2~4mL、50~100μL:50~150μL,其中变色酸溶液的浓度为0.1~0.2g/mL,浓磷酸的质量百分含量为80~85%,过氧化氢的浓度为0.020~0.025mol/L。
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三尖杉悬浮培养细胞中 hinokiol 的定量分析;徐晓辉 等;《色谱》;20110630;第29卷(第6期);第567-570页 * |
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