CN108575758A - 一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用，属于生物医药领域。该培养基组合物由基本培养基MS、果糖、葡萄糖、琼脂、6‑BA和2,4‑D组成。本发明还提供了该组合物的应用，主要用于天山雪莲的愈伤组织诱导或愈伤组织继代培养，培养条件：温度23～25℃，光照时间9～15h/d，光照强度1900～2500lx。利用本发明培养基组合物进行天山雪莲的组织培养得到的愈伤组织干重和总黄酮含量与现有技术相比，均有显著提高。

Description

一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用。
背景技术
植物细胞具有全能性，一个植物细胞具有与亲本植物完全相同的遗传信息，不但具有发育成完整植株的能力，并且具有整株植物所具有的合成化合物的能力，通过植物细胞培养可以获得亲本植物的主要药用活性成分，这也就为药用活性成分的生产提供了新的途径。
天山雪莲(SaussureainvolucrataKar.etKir.)，又名新疆雪莲，大苞雪莲，系菊科凤毛菊属多年生草本植物，是一种极有开发和利用价值的民族药。雪莲在医药上应用已有数百年的历史，早在八世纪藏族古代药物文献《月王药珍》就有雪莲的记载，在清代，赵学敏所著的《本草纲目拾遗》一书中更把天山雪莲奉为雪莲药材的正品。天山雪莲民间主要用来除寒、壮阳、调经止血、祛痰及治疗风湿关节炎、痈疮肿毒和高山反应等病症。现代药理研究表明，天山雪莲主要具有抗炎镇痛、抗癌、抗衰老、扩张血管、降血压、清除自由基、抗疲劳、抗早孕、终止妊娠、收缩子宫、以及治疗糖尿病等多种药理作用。天然天山雪莲次生代谢产物成分复杂，具有药理活性的化合物主要集中在黄酮、生物碱和多糖类。研究发现，天山雪莲总黄酮和总生物碱具有较强的抗炎、镇痛、抗辐射和扩张血管作用。
天山雪莲生于海拔2400～4000米的高山雪线附近的高山流石滩、高山沼泽草地、高山草坡以及高山山顶碎石间，是一种高原多年生珍稀草本植物。自然条件下由于生长环境特殊，3至5年才能开花结果，花期时种子在山间随风飘散，只有遇到适宜环境的种子才有可能萌发和生长，故自然繁殖率较低。由于长期以来对雪莲的掠夺性采挖，加上自然环境中种子发芽率低，繁殖困难，生长缓慢，野生天山雪莲已处于濒危的境地，1996年中国已将天山雪莲列为二级濒危保护植物，天山雪莲是唯一列入《中国植物红皮书》的雪莲植物，是中国国家三级濒危物种。2000年国务院13号文件已明令禁止采挖野生雪莲。
由于天山雪莲严苛的生长条件和较低的繁殖率，加上人们长期的过度采挖，使天山雪莲资源严重不足，雪莲物种濒临灭绝。天山雪莲为高山特有品种，通过对其化学成分和药理活性分析比较发现，特定生长环境对该植物体内特殊成分的形成、积累和遗传有着特殊作用，因此实现其人工栽培较难，同时野生天山雪莲资源已难以满足临床药用开发的需要，运用植物组织培养技术进行雪莲次生代谢产物生产的研究越来越受到人们的重视。通过植物组培工程培育富含黄酮的天山雪莲培养物可为解决这一问题提供切实可行的途径。
鉴于此，本发明提供一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天山雪莲组织培养的培养基组合物及其应用方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种天山雪莲组织培养的培养基组合物，天山雪莲组织培养的培养基组合物由基本培养基MS、果糖、葡萄糖、琼脂、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)和2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)组成。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，天山雪莲组织培养的培养基组合物在每升MS基本培养基中含果糖10～25g、葡萄糖5～20g、琼脂5～8g、6-BA0.6～1.0mg和2,4-D 1.0～2.0mg。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，天山雪莲组织培养的培养基组合物在每升MS基本培养基中含果糖20g、葡萄糖10g、琼脂6g、6-BA 0.8mg和2,4-D1.5mg。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，天山雪莲组织培养的培养基组合物溶液pH值5.2～6.0。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，天山雪莲组织培养的培养基组合物溶液pH值5.6。
第二方面，本发明提供一种天山雪莲组织培养的培养基组合物的应用方法，本发明天山雪莲组织培养的培养基组合物用于天山雪莲的愈伤组织诱导或愈伤组织继代培养，培养条件：温度23～25℃，光照时间9～15h/d，光照强度1900～2500lx。
进一步地，本发明天山雪莲组织培养的培养基组合物用于天山雪莲的愈伤组织诱导或愈伤组织继代培养，培养条件：温度24℃，光照时间12h/d，光照强度2200lx。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
天山雪莲的愈伤组织干重和总黄酮含量与现有技术相比，均有显著提高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1～3组与对比例1～3组均采用下列步骤，不同之处在于“(2)愈伤组织诱导”，详细情况见表1。
(1)植株的诱导
将天山雪莲的种子用75％酒精消毒30s，然后用0.1％氯化汞溶液消毒10min，无菌水冲洗3次，用消毒好的滤纸吸干水分后，接种于培养基上。培养基组成：MS+3.0％蔗糖+0.6％琼脂粉。
(2)愈伤组织诱导
种子萌发后50d长成带叶的幼苗，将叶切成0.5cm长的外植体，平放在愈伤诱导培养基上。实施例1～3与对比例1～3不同的培养条件详细情况见表1。
(3)愈伤组织继代培养
将愈伤组织在继代培养基(同上述愈伤诱导培养基)上继代培养15d，其他培养条件同愈伤组织诱导。
(4)愈伤组织鲜重测定
从培养容器中取出天山雪莲愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分，称重即得鲜重(FW)。
(5)愈伤组织干重测定
将从培养容器中取出的天山雪莲愈伤组织置于40℃下真空干燥至恒重，称此时重量即为组织干重(DW)。
(6)培养物中总黄酮的分析
用紫外分光光度法测定天山雪莲培养物中的总黄酮含量。
将干重0.2g的天山雪莲愈伤组织用80％乙醇10mL超声提取20min，浸泡一夜，再超声提取20min，滤过，吸取滤液0.5mL，加4.5mL蒸馏水和5％NaNO2 0.3mL，摇匀，放置6min，再加10％AlCl3 0.3mL，摇匀，静置6min，加4％NaOH 4mL，最后加蒸馏水至10mL，510nm处测得吸光度(A)值。用芦丁对照品以同样方法得标准曲线方程C＝86.5296A-0.85152，r＝0.9995，其中C为总黄酮量，线性范围10～60mg/L。
表1
本发明的有益效果如下表2：
愈伤组织干重(g/L) 总黄酮含量(mg/g)
实施例1 39.7 50.1
实施例2 48.2 53.5
实施例3 50.9 58.8
对比例1 35.1 36.9
对比例2 28.6 25.3
对比例3 37.5 48.6
从2表可以看出，本发明实施例中利用本发明培养基组合物进行天山雪莲的组织培养得到的天山雪莲的愈伤组织干重和总黄酮含量与对比例相比，均有显著提高，特别是在其他条件相同的前提下，实施例3(果糖20g、葡萄糖10g)在提高愈伤组织干重和总黄酮含量方面均较对比例1～3组有明显优势。
本发明中未详细说明的环节均为本领域普通技术人员可自行选择的公知常识。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种天山雪莲组织培养的培养基组合物，其特征在于，所述天山雪莲组织培养的培养基组合物由基本培养基MS、果糖、葡萄糖、琼脂、6-BA和2,4-D组成。
2.根据权利要求1所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物，其特征在于，所述天山雪莲组织培养的培养基组合物在每升MS基本培养基中含果糖10～25g、葡萄糖5～20g、琼脂5～8g、6-BA 0.6～1.0mg和2,4-D 1.0～2.0mg。
3.根据权利要求2所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物，其特征在于，所述天山雪莲组织培养的培养基组合物在每升MS基本培养基中含果糖20g、葡萄糖10g、琼脂6g、6-BA0.8mg和2,4-D 1.5mg。
4.根据权利要求3所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物，其特征在于，所述天山雪莲组织培养的培养基组合物溶液pH值5.2～6.0。
5.根据权利要求3所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物，其特征在于，所述天山雪莲组织培养的培养基组合物溶液pH值5.6。
6.一种根据权利要求1～5所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物的应用，其特征在于，所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物用于天山雪莲的愈伤组织诱导或愈伤组织继代培养，培养条件：温度23～25℃，光照时间9～15h/d，光照强度1900～2500lx。
7.根据权利要求6所述的天山雪莲组织培养的培养基组合物的应用，其特征在于，所述培养条件：温度24℃，光照时间12h/d，光照强度2200lx。
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