CN101230331B

CN101230331B - 黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途及方法

Info

Publication number: CN101230331B
Application number: CN2008100595609A
Authority: CN
Inventors: 李连达; 乔洪翔; 吴理茂; 欧阳竞锋
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN101230331A

Abstract

本发明提供了黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途。本发明还提供了促进骨髓间充质干细胞体外定向分化为肝脏细胞的方法，它采用黄芩苷作为促细胞分化剂，在成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)存在的情况下，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞。本发明还提供了骨髓间充质干细胞在体外用黄芩苷诱导定向分化成的肝脏细胞作为肝脏组织工程和细胞移植的种子细胞或生物人工肝的用途。本发明还提供了黄芩苷或黄芩苷联合骨髓间充质干细胞移植作为促细胞分化剂在制备治疗肝脏疾病药物中的用途，将黄芩苷制备成治疗肝脏疾病的药物，联合骨髓间充质干细胞移植来治疗重大肝脏疾病。本发明还提供了含黄芩苷的细胞保存液用于种子细胞贮存的用途。

Description

黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途及方法

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种中药单体化合物的用途，具体涉及黄芩苷的用途及实现该用途的方法。

背景技术

黄芩(Radix Scutellariae)为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根。苦，寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎功效，现代医学用于呼吸道感染，急性胆道感染，泌尿系统感染，急性细菌性痢疾，病毒性肝炎，猩红热，流脑，高血压等症的治疗。其主要有效成分为黄酮类化合物，如黄芩苷元、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩新素及二氢黄酮苷等。

黄芩苷(Baicalin)是从黄芩中分离提纯的天然产物，为一种单体化合物，是黄芩的有效成分之一，化学结构为：

黄芩苷具有多种药理活性：

1.黄芩苷具有阻滞钙离子通道的作用。

2.黄芩苷对超氧自由基具有明显的清除作用，可有效对抗脂质过氧化损伤。

3.黄芩苷对各种实验性肝损伤都有一定的保护作用。

4.黄芩苷具有免疫调节作用，可以增加机体的免疫力。

5.黄芩苷有抑制醛糖还原酶的作用，可用于糖尿病慢性并发症的治疗。

6.黄芩苷具有抗HIV-1的活性，是一种有效的预防和治疗HIV感染的药物。

7.黄芩苷具有心脑血管的保护作用：黄芩苷有扩张血管及降压作用，抗心律失常，抑制血管平滑肌细胞增殖，保护心肌缺血再灌注损伤，调节血脂，抗动脉粥样硬化，保护脑组织损伤。

但目前尚未见有黄芩苷用于诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化为肝脏细胞的报道。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题提供一种黄芩苷的新用途：黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途。

所述的骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞。根据黄芩苷在诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化的成功案例，可以用骨髓间充质干细胞作为新的筛选治疗肝脏疾病药物的细胞模型。

本发明再一个所要解决的技术问题是提供促进骨髓间充质干细胞体外定向分化为肝脏细胞的方法。为此，本发明采用的技术方案是：它采用黄芩苷作为促细胞分化剂，在成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)存在的情况下，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞。

本发明还提供了：骨髓间充质干细胞在体外用黄芩苷诱导定向分化成的肝脏细胞作为肝脏组织工程和细胞移植的种子细胞或生物人工肝的用途。用黄芩苷诱导分化的种子细胞或生物人工肝进行移植，可避免肝移植出现的免疫排斥反应及肝供体来源少的问题。

本发明还提供了：黄芩苷或黄芩苷联合骨髓间充质干细胞移植作为促细胞分化剂在制备治疗肝脏疾病药物中的用途，将黄芩苷制备成治疗肝脏疾病的药物，联合骨髓间充质干细胞移植来治疗重大肝脏疾病。

本发明还提供了：含黄芩苷的细胞保存液用于种子细胞贮存的用途。所述种子细胞可以是肝脏细胞、骨髓细胞等，用含黄芩苷的细胞保存液保存与一般细胞保存液相比，可以明显提高种子细胞的存活率和活力。

附图说明

图1为细胞甲胎蛋白(AFP)表达图：分别为诱导4、7、10、14、21天细胞AFP表达情况，其中A为单因子组，B为双因子组，C为黄芩苷组，D为阳性对照Hep G2细胞。

图2为细胞甲胎蛋白(AFP)表达半定量结果图：分别为诱导4、7、10、14、21天细胞AFP蛋白表达半定量结果，其中黑色柱为单因子组，网格柱为双因子组，白色柱C为黄芩苷组。

图3为细胞CK18表达图：分别为诱导4、7、10、14、21天细胞CK18表达情况，其中A为单因子组，B为双因子组，C为黄芩苷组，D为阳性对照Hela细胞。

图4为细胞CK18表达半定量结果图：分别为诱导4、7、10、14、21天细胞CK18蛋白表达半定量结果，其中黑色柱为单因子组，网格柱为双因子组，白色柱C为黄芩苷组。

图5为细胞谷丙转氨酶(ALT)的活性图：分别为诱导2周、3周、4周时细胞ALT的活性，其中黑色柱为单因子组，网格柱为双因子组，白色柱C为黄芩苷组，灰色条带是正常肝细胞分泌水平。

图6为细胞谷草转氨酶(AST)的活性图：分别为诱导2周、3周、4周时细胞AST的活性，其中黑色柱为单因子组，网格柱为双因子组，白色柱C为黄芩苷组，灰色条带是正常肝细胞分泌水平。

图7为细胞尿素的分泌量图：分别为诱导2周、3周、4周时细胞尿素的分泌，其中黑色柱为单因子组，网格柱为双因子组，白色柱C为黄芩苷组，灰色条带是正常肝细胞分泌水平。

图8为糖原染色结果图：诱导2周糖原染色结果，其中A为单因子组，B为双因子组，C为黄芩苷组，D为未分化的MSCs。

图9为阿魏酸诱导干细胞表达AFP图：诱导7天时AFP的表达情况，其中A为单因子组，B为阿魏酸0.1μM组，C为阿魏酸1μM组，D为阿魏酸10μM组，E为阿魏酸10μM组。

具体实施方式

本发明通过实施例研究表明，黄芩苷可以促进骨髓间充质干细胞在体外定向分化为肝脏细胞。本发明结合附图和实施例作进一步说明。

实施例1：黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为肝脏细胞的研究

1.骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养：

取大鼠胫骨和股骨骨髓，用Percoll密度梯度离心后，中间白膜层细胞在条件培养基中(含10％胎牛血清的L-DMEM培养基)，按5×10³个/cm²的密度接种在培养皿中，当细胞密度达80％时，进行传代培养。

2.黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞的培养：

收获第四代MSCs后，按1×10⁴个/ml的密度接种在24孔板和6孔板中。待细胞100％融合后，用D-Hanks液洗细胞，共洗3遍；之后加入诱导培养基，基本组成为2％胎牛血清，H-DMEM培养基，ITS细胞培养基添加剂，200ug/L地塞米松。

本发明共设三组，第一组为黄芩苷组，即在诱导培养基中再加入10ng/mlFGF-4和2μM的黄芩苷；第二组为双细胞因子组，即在诱导培养基中再加入10ng/ml FGF-4和20ng/ml HGF；第三组为单细胞因子组，即在诱导培养基中再加入10ng/ml FGF-4。

实施例2：黄芩苷在促进MSCs定向分化为肝脏细胞的药效学研究

1.分化特异性蛋白的表达

由实施例1诱导培养4、7、10、14、21天所得的6孔板，对其中的细胞进行蛋白提取，并通过Western blotting方法检测肝性分化特异性蛋白甲胎蛋白(AFP)和CK18的表达(参见图1～4)，以此作为药效学评价指标之一，也可以用于新药开发和中药活性成分的筛选。

参见图1～2，黄芩苷组AFP表达量在第4、第7天都显著高于单因子组，而第10天的表达量显著低于单因子组。AFP是在诱导分化初始阶段表达的特征蛋白，是由开始分化但未成熟的肝细胞所表达的，而分化中后期及成熟的肝细胞不表达AFP。已有研究表明，单用FGF-4有一定的肝性分化能力，但分化效率很低；联用FGF-4和HGF，可以大大提高肝性分化效率。本实验结果也证明了这一点，同时也证明，黄芩苷可以大幅提高肝性分化效率，在第10天就能使分化的细胞趋向成熟，有明显的促分化能力及拟肝细胞生长因子(HGF)的作用。

参见图3～4，黄芩苷组CK18表达量在第10、第14、第21天都显著高于单因子组。CK18是成熟肝细胞表达的特异性蛋白之一，实验结果说明黄芩苷能显著提高分化效率，有明显的促分化能力及拟肝细胞生长因子(HGF)的作用。

2.对诱导分化的肝脏细胞进行功能方面的生化检测

由实施例1诱导培养24孔板中的细胞，在诱导后2周、3周、4周，分别提取细胞上清，用Olympus AU400全自动生化仪检测谷丙转氨酶ALT活性、谷草转氨酶AST活性和尿素的分泌(参见图5～7)，以此作为药效学评价指标之一，也可以用于新药开发和中药活性成分的筛选。

参见图5～7，图中灰色带是正常肝脏细胞表达水平，黄芩苷组ALT、AST的活性和尿素的分泌水平在分化各个时期都显著高于单因子组，从第三周开始基本到达正常肝脏细胞表达水平，说明骨髓间充质干细胞在黄芩苷的作用下，已分化成熟。而单因子组始终未能达到正常肝脏细胞表达水平，说明单因子只有一定的促分化能力，且分化效率很低。实验结果证明黄芩苷可以大幅提高肝性分化效率，有促分化的能力及拟肝细胞生长因子(HGF)的作用。

3.对诱导分化的肝脏细胞进行糖原染色

由实施例1诱导培养24孔板中的细胞，在诱导后2周，用Periodic acid-Schiff法检测细胞内糖原储存情况(参见图8)，以此作为药效学评价指标之一，也可以用于新药开发和中药活性成分的筛选。

参见图8，黄芩苷组糖原染色阳性细胞显著多于单因子组。肝脏细胞是体细胞中能够储存糖原为数不多的细胞之一，用Periodic acid-Schiff法进行糖原染色可以作为鉴定肝脏细胞的辅助方法之一。实验结果再次证明了黄芩苷可以大幅提高肝性分化效率，具有促分化的能力及拟肝细胞生长因子(HGF)的作用。

实施例3：黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞在其他方面的用途

1.黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞在制备治疗肝脏疾病药物中的用途

黄芩苷作为促细胞分化剂，在体外可以促进MSCs定向分化为肝脏细胞，因此将黄芩苷制备成治疗肝脏疾病的药物，联合骨髓间充质干细胞移植来治疗重大肝脏疾病。

2.黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞在组织工程中的用途

用黄芩苷诱导定向分化成的肝脏细胞可作为肝脏组织工程和细胞移植的种子细胞或生物人工肝，可避免肝移植出现的免疫排斥反应及肝供体来源少的问题。

3.黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞在种子细胞贮存中的用途

用含黄芩苷的细胞保存液来保存肝脏细胞、骨髓细胞等种子细胞，与一般细胞保存液相比，可以提高种子细胞的存活率和活力。

4.黄芩苷促进MSCs定向分化为肝脏细胞在建立新的筛选治疗肝脏疾病药物的细胞模型中的用途

根据黄芩苷在诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化的成功案例，可以用骨髓间充质干细胞作为新的筛选治疗肝脏疾病药物的细胞模型。

将待筛选的药物溶解在实施例1的诱导培养基中，与FGF-4共同诱导骨髓间充质干细胞分化。若细胞AFP、CK18的表达，细胞上清ALT、AST的活性，细胞上清尿素的分泌水平均有显著性的变化则该药物可以作为促细胞分化剂来治疗肝脏疾病。

将阿魏酸按实施例1的方法进行诱导，测定诱导3周时的细胞上清ALT、AST的活性，Urea的分泌量(参见表1)及诱导7天AFP的表达(参见图9)

表1用阿魏酸诱导3周时的细胞生化指标测定结果表

组别	浓度	ALT(U/L)	AST(U/L)	Urea(pg/cell/hr)
					阿魏酸组	0.1μM	8.379±0.490	17.993±1.098	5.48±0.39
1μM	8.558±0.341	17.478±1.211	5.57±0.44
					10μM	8.298±0.644	17.569±0.928	5.71±0.51
100μM	8.317±0.543	17.833±1.018	5.66±0.48
					双因子组		9.597±0.694^*	21.550±0.818^**	9.16±0.51^**
单因子组		8.527±0.580	17.819±1.117	5.64±0.49

注：与单因子组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

参见表1和图9，阿魏酸各剂量组诱导3周时的细胞上清ALT、AST的活性，Urea的分泌量及AFP的表达情况均与单因子组无显著性差异，说明阿魏酸并不能促进骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞，过去的研究也未发现阿魏酸对肝脏有保护作用。这个实例也说明了可以用骨髓间充质干细胞作为新的筛选治疗肝脏疾病药物的细胞模型。

Claims

1.黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途，其特征是：所述的骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞；黄芩苷在成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)存在的情况下，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝脏细胞。