JPS63177795A - グリシン種の形質転換，体性胚形成および全植物体再生の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ダイズおよび他のグリシン劉ｂｊ四銭種の体
性組織からの形質転換および全植物体再生の方法に関す
る。

（関連する出願） 本出願は、係属中の出願番号第８９３，２５６号（１９
８６年８月４日出願）の部分継続出願である。

（従来の技術） 体性組織培養物からのダイズおよびその関連物の再生を
達成する方法が、長い間求められていた。

タバコおよびペチュニアのような容易に再生しうる種と
異なり、ダイズについては９体性組織から植物体全体を
再生する初期の試みが成功していない。このような方法
は、ダイズもしくはその種〔例えば、Ｇ、ソーヤ（Ｇ、
５ｏｊａ）に〕、望ましい特色（その特色とともに生育
しうるちの）を導入するのに非常に好適である。このよ
うな方法はまた。ヱグロバタテリウムによる感染または
他の方法による細胞の形質転換を許容するということで
遺伝子工学者に利益をもたらす。このことにより、外来
の（異種）　　ＤＮＡを含む形質転換細胞が培養物中に
得られ、それにより、植物体全体が再生される。

この全植物体は種子を生じ、外来遺伝子を発現する。

グリシン　キャネッセンス（Ｇ、ｃａｎｅｓｃ印Ｕおよ
びグリシン　クランデスチナ（Ｇ、ｃｌａｎｄｅｓｔｉ
ｎａ）のような野生のものについては、成功しているに
もかかわらず、グリシンの亜族（ｓａｂｇｅｎｕｓ）で
あるソーヤ（ｓｏｊａ）　（グリシン　マックス（Ｇ、
ｒｎａｘ　；ダイズ）およびグリシン　ソーヤ（Ｇ、５
ｏｊａ）を含む〕については、それを再生する方法かほ
どんど開発されていない。Ｐ、Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉ　ら
（１９８５）の「ダイズの未熟子葉組織からの植物再生
法Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、第３巻Ｎｏ、４．１６０〜１６
７頁）；およびり、Ｆ、ｔＩｉｌｄｅｂｒａｎｄら（１
９８６）の「ダイズ〔Ｇｌ　ｃｉｎｅ　ｍａｘ　（Ｌ、
）Ｍｅｒｒ、　）　　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
ｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒ
ｙ＋第２巻：ＣｒｏｐｓＩ（Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｂａｊａｊ　
ｅｄ、）　２８３〜３０８頁〕を参照されたい。

文献に記載された旦しハ虹種の胚形成を含む手法のほと
んどでは、胚を形成する誘導培地としてオーキシンを含
有する基本培地が提供される。胚が形成された後、その
胚は成熟培地に移され、そして、シュート（茎・葉）を
伸長させるためにサイトカイニンを含みオーキシンを減
少させた培地に移される。しかし、正常な体性胚を高頻
度で得るための助けとして、　　ＮＡＡを高濃度で使用
することが好ましいこと、またはＩＪ！　（炭水化物）
およびオーキシンの濃度を共働的に低下させることはこ
れまでに知られていない。さらに、　Ｇ、ｍａｙまたは
他の牡践釦（種を再生する方法において高効率を提供す
るために、任意のオーキシンを含有する培地で体性胚を
生じさせる特殊な子葉細胞はいまだに確認されておらず
、そして単離されていない。

Ｗ、Ｄ、Ｂｅｖｅｒｓｃｌｏｒｆらは、　　’す１江胛
工種の組織培養で得られる分化の程度（１９７７）　、
　（Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、第１７巻。

３０７〜３１１頁）において２体性胚形成を報告してい
るが、その胚のいずれもが「発芽」しなかった。

２、４−Ｄ　（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）およ
び／またはＮＡＡ　（α−ナフタレン酢酸）および２％
のシー！糖を含有する誘導培地を、　Ｇ、ｍａｘおよび
いくつかの関連した種の胚軸または成熟した子葉組織ま
たは先端部、または胚の培養に用い、　Ｂｅｖｅｒｓｄ
ｏｒｆらは、いくつかの品種について胚様の構造物を得
た。しかし、それらは小植物体へとは発達しなかった。

５６種のダイス品種の胚から発達した子葉は。

２■／ｌの２．４−Ｄおよび２　ｍｇ　／　１２のＮＡ
Ａを含有する培地上でカルスおよび「非カルス」構造に
発達した。しかし、それらのいずれもがそれ以上発達し
なかった。

Ｔ、Ｙ、Ｃｈｅｎｇら（１９８０）は「培養物中のダイ
ス子葉分節からの植物再生Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、
　Ｌｅｔｔ、第１９巻。

９１〜９９頁）において、調整した子葉分節を用いて。

培養物中でダイスの複数の茎・葉・芽の形成を促進する
ことを報告している。用いた培地は３％のショ糖（スク
ロース）および０．２５μ袴のオーキシンＩＢＭ（イン
ドール酪酸）を含有していた。この方法は２体性組織を
使用することを包含しない。しかし９種々の培地の有効
性を評価するために全形成能を有する細胞を含む外植を
用いている。土壌中で独立して生育し得る全植物体が再
生したことは明らかには報告されていない。

Ｉ＋、５ａｋａらは、「培養物中のダイズ茎分節におけ
る複数のシュート形成の促進Ｊ　　（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃ
ｉ、　Ｌｅｔｔ。

第１９巻、１９３〜２０１頁（１９８０）　）において
、オーキシンＩＢＭおよび３％のシュークロースまたは
イ也の炭水化物を含有する培養培地中でＧ、ｍａｘの茎
分節または先端部分からの茎・葉・芽の形成を同様に述
べている。この報告は２体性組織の使用を包含せず１通
常、茎・葉を形成しうる組織を使用し。

生育のための種々の培地の有効性を評価している。

植物体全体の再生は報告されていなかった。

’ｆ　、Ｋａｍｅｙａらは、「旦圧几（種の胚軸部分か
らの植物再生Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、
第２１巻２８９〜２９４頁（１９８１）　）に、正常な
植物を再生するために。

Ｇ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓおよびＧ、　ｔｏｍｅｎｔｅｌ
　Ｉａの胚軸の使用を開示している。これらの胚軸は、
　　ＮＡＡおよびＢＡ（６−ベンシルアミノプリン）が
種々の濃度で添加されたＭＳ培地で培養される。Ｇ、ｍ
ａｘおよび飢放ハを含む８種のテストされたもののなか
で、茎・葉の高頻度の再生が観察されたのは、１〜５■
／ｌのＢＡおよび０．１〜２　ｍｇ／　１．のＮＡＡを
用いたＧ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓの胚軸からである。全植
物体が再生された。

Ｇ、Ｃ，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓらは、「ダイスの懸濁細胞培
養物からの体性胚の誘発および発達Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　
Ｃｅ１ｌ　ＴｉｓｓｕｅＯｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｒｒｅ　
、第１巻、　　１２３〜１２９頁（１９８１）で。

Ｇ、ｓｏおの懸濁培養液から単一のシュートが得られた
ことを報告している。種々のオーキシンがバーゼルＬ２
およびＳＬ２基本培地と組み合わせて評価された。紅並
ハの培養物から単一のシュートが得られた。この培地は
ＮＡＡを０．１〜１３．４μＭ（約０．０２〜２．７ｍ
ｇ／ｆ）の割合で含有する。スクロース濃度は２．５％
から１２．５％が使用された。虹並りの培養物から単一
のシュートが得られた。この培養物は。

２．２５μＭの２．４−Ｄ　（０，４５ｍｇ／　Ｉ！、
）を含むＳＬ２培地で生育し、同量の２．４−　Ｄおよ
びサイトカイニン、抗オーキシンおよびジベレリン生°
合成抑制物を含有するＬ２培地に移された。

Ｋ、に、Ｋａｒｔｈａらは、「マメ科植物穀物の分裂組
織からの植物再生：ダイズ、ササゲ、ピーナツ、ヒヨコ
マメおよびインゲンマメＪ　　（Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、
第５９巻、　１６７１〜１６７９頁（１９８１）　３に
おいて、３％のスクロースおよび１μＭ／ｌのＮＡＡを
含む培地におけるダイスの茎頂分裂組織からの植物の再
生を開示している。植物体全体が再生した。しかし、こ
の論文は新しい植物を生じさせるのに体性組織を使用す
ることは開示されておらず１分裂組繊細胞の正常な連続
的分化を利用している。この文献は主としてこの目的の
ための好適な培地の決定に関する。

Ｂ、Ｄ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓらは、　１９８２年８月８〜
１３日にアイオワ州エームズで開催されたアメリカ園芸
科学会の７９年会において、　［ダイスの１次およびカ
ルス外植からの胚の形成」と題して報告を行っている。

この報告では、すｌ貢１Ｌｌ卦−を種々の培地で培養し
たときの１次外植（胚軸１葉および根）がらの胚の形成
が述べられている。この抄録においては。

培地を明確に規定しておらず、詳細についても述べられ
ていない。胚段階を越えて植物が再生されることについ
ても述べられていない。

Ｍ、Ｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎらは、「形態形成能
を有するダイズ懸濁培養」第２２２巻、６３２〜６３４
頁（１９８３）でＧ、ｍａｙの胚軸片からの小植物体の
再生を報告している。この方法では、胚芽誘導培地とし
てＭＳ　（ムラシゲ−スクーグ）培地が用いられている
。但し、このＭＳ培地中の窒素塩は）クエン酸アンモニ
ウム２０μ台に置き換えられ、さらに２．４−Ｄまたは
ＴＡＡ　　（インドール−３酢酸）が５　ｍｇ　／　ｆ
２の割合で含有されている。この文献においては、上記
の窒素塩の置換が上記方法において重要であると述べら
れている。ただひとつの組織だけが１例外的に胚を形成
した。従って、これは偶然であり得。

再現性がない事柄であり得る。事実、この実験を再現性
よく繰り返して行ったことは述べられていない。胚を、
　ＩＢ八を０．００５ｍｇ／　１２　、そしてＢＡを０
．２ｍｇ／ｌの割合で含有する培地に移すと茎・葉の形
成が起こる。この茎・葉をＩＡＡを０．１ｍｇ／ｐ、の
割合で含有する基本培地に移すと根が形成され、小植物
体が得られる。

米国特許第４，５４８，９０１号（Ｃｈｒｉｓ　ｔｉａ
ｎｓｏｎらに付与）は、上記研究を基礎とし、形態形成
能のある植物再生培養を行う方法の改良を特許請求の範
囲に開示している。この方法においては、大量に播種さ
れたマメ科植物の植物体の外植はうまく培養され、そし
て、外性オーキシンおよびアンモニウム塩を含み、硝酸
イオンを含有しない培地に選択的に移される。この特許
はまた。マメ科植物の双極胚を形成させる方法を特許請
求の範囲に開示している。この方法には、数段の培養工
程が包含され、外性オーキシンおよびアンモニウム塩を
含有し硝酸イオンを含まない培地を使用することが包含
される。この出願の実施例においては、上記の内容が述
べられているが、この時点においては根の形成は暗に示
唆されているだけであり、この特許を出願する時点にお
いては１発根は達成されていなかったことを示す。

Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎらの論文、およびＣｈｒｉｓ
ｔｉａｎｓｏｎらの特許出願または特許請求の範囲にお
いては、いずれの場合にも、土壌で独立して生育するこ
とが可能であり種子をつくることの可能な全植物体を再
生することができない。

Ｊ、Ｍ、旧ｄｈｏ１ｍ　らは、　「すｌ劇１東舌鼾且邦
旦那−組織培養からの茎・根の再生Ｊ　　（Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ。

第２巻、１９〜２２頁、　（１９８３））において、　
Ｇ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓの子葉および胚軸から得られる
カルスがら誘導される茎・葉の誘導に′ついて報告して
いる。この茎・　葉の誘導には、　　０．５ｍｇ／ｊ２
のＮＡＡおよび３％のスクロースを含有する培地を含む
いくつかの培地が用いられている。全植物体は再生され
ず、根の形成はまれであった。

０、Ｌ、Ｇａｍｂｏｒｇ　らは、　「且ｉ種の細胞培養
における体性胚形成Ｊ　　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ、第２巻、　　２０９〜２１２頁（１９８
３）　）において、数種の５種の胚軸組織の細胞懸濁培
養からの体性胚形成を報告している。このｊｂ旦暉Ｗ一
種には、り上り１（ｌ卦−の（試験された７種からの）
３つの品種が包含される。胚誘導培地は、主要塩として
ＳＬを含み、微量養分およびＢ５培地のビタミン類、１
０■／ｌのカザミノ酸、１５μＨの硫酸アデニン、０．
２μＭ（０，０４１Ｔ１ｇ／ｌ）のピクロラム（Ｐｉｃ
ｌｏｒａｍ）および０．０２５〜０．２５μＨのＡＭ０
１６１８を含有する。胚を誘導するにはピクロラムが最
も有効であることが見出された。

しかし、それは０．５〜５．０　μＭ（０，１〜０．４
　ｒｎｇ／　ｌ　）の２．４−Ｄで置き換えることが可
能であった。オーキシンとしてＮＡＡを用いた場合には
胚は誘導されなかった。胚が誘導された後、それらは、
サイトカイニンを含むＳＬ成長培地に移される。根が形
成されたが茎・葉は形成されなかった。

ヨーロッパ特許出願第８５１０９３４４．３号（Ｓｕｎ
ｇｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ、＋　１
９８６年２月１９日公開）には。

ダイズの再生方法が開示されている。この方法において
は、４つの独立した培地を使用することが包含される。

この培地は、胚誘導培地、培成熟培地、茎・葉生育培地
および発根培地である。上記胚誘導培地は、　　０．５
〜１０ｍｇ／　ｌの２．ＩＩＤまたは１．０〜３．Ｏｒ
ｎｇ／　ＩＩのＩＡＡ、および３．０〜１０ｍｇ／　Ｉ
！。

の２，４−Ｄおよび２％〜３％のスクロースを含有する
ことが開示されている。実施例のなかには。

根が形成されたことは明らかに述べられていない。

特許請求の範囲は「小植物体」に関する。土壌中で独立
して生育し得る全植物体の再生は、特許請求の範囲に開
示されていない。

Ｂ、Ｊ、Ｌｉら（１９８５）、　ｒダイズ□阻μ違！Ｊ
鮭における体性胚形成および小植物体再生Ｊ　（Ｐｌａ
ｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ＋第１ｌＲｅｐｏｒｔｓ
＋３４７ページ）は、未成熟のダイスの胚から採取され
た単細胞から小植物体が得られたことを報告している。

豆果をまず液体窒素中で冷凍した後に６０°Ｃの水浴中
に２０分間浸す必要があることが開示されている。未成
熟の胚は切開され、培養のために小部分に切断された。

そのようにして作られた培養物から単細胞を得るために
フィルタリング技術が適用され、報告されるところによ
ると、９５％の効率であった。胚誘導培地は２％のショ
糖および１から２　ｍｇ　／　ｌの２，４−Ｄを含んで
いた。小植物体の再生は記述されているが、植物全体の
再生の報告はされていない。本出願人はこの作業の再現
を試みたが失敗に終わった。その理由は２組織の冷凍お
よび解凍により組織が死んでしまうかあるいはそれ以上
の成長能力が破壊されてしまうからである。

Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎ等（１９８４）、　　ｒダイス（Ｇ
ｌ　ｃｉｎｅ　ｍａｘ□Ｌ、Ｍｅｒｒ）の子葉組織の体
性胚の誘導Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ
＋第１ｌＲｅｐｏｒｔｓ＋２１８ページ）はＧ、ｍａｘ
がらの未成熟の子葉を用いて、０．５からＬ■／ｌの２
．４−Ｄおよび０．２５から２％のショ糖を含む培地中
で胚を形成することを述べている。０．５μＭ＃２のゼ
アチンを含むし２培地を用いたいくつかの場合に、茎葉
の分化および根の形成が観察された。オーキシンとして
２．４−Ｄでなく　　ＮＡＡを用いた場合には胚の形成
は観察されなかった。２％を上回るショ糖または１．５
を％を上回るグルコースを含む培地では胚は形成されな
かった。全植物体の再生は報告されていない。

Ｊ、Ｅ、Ｇｒａｎｔ（１９８４）、　’ダイスの多年生
の野生類縁であるＧｌ　ｃｉｎｅ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ
の子葉組織からの植物体の再生Ｊ　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ
１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

第３巻、１６９〜１７３ページ）の報告するところによ
ると、　　０．１μＭ（０，０２ｍｇ／ｌ）のＮＡＡお
よび３％のショ糖を含むＭＳ培地を用い、　Ｇ、ｃａｎ
ｅｓｃｅｎｓの未成熟の胚からの子葉組織を！して胚の
形成が行われた。この文献は、牡匹江虹種からの全植物
体の初の再生について述べたものであると主張している
。しかし、　Ｇ、ｍａｘの再生は開示されていない。

Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｈ等（１９８５）　　ｒダイスの胚か
ら誘導された組織培養物からの植物再生Ｊ　（Ｉｎ　Ｖ
Ｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ＆　ｌｌｌｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１巻、第１１号、６
５３〜６５８ページ）は、　Ｇ、ｎ＋ａｘおよび恥並口
の未成熟の胚および胚から切り取られた子葉を用いて胚
が形成され、その胚から繁殖可能な全植物体が再生した
ことを述べている。胚誘導培地としては、　２２．５か
ら４５．２μＭ　（５，Ｑから１０．０ｍｇ／　Ｉｔ　
）の２．４−Ｄおよび３％のショ糖を含むＭＳ培地が用
いられた。Ｂ５にＩＢＡおよびＡＢＡを加えた胚成熟培
地が１発芽培地へ移すに先立って用いられた。繁殖可能
な全植物体が発生した。誘導培地にＮＡＡは用いられな
かった。出願人の発明に対してこの文献が先行技術とし
て当然適用され得るとは、出願人は認めない。

Ｃ，Ａ、Ｎｅｗｅｌｌ等（１９８５）は、　［すｃｉｎ
ｅ　ｃａｎｅｓｃ旦邦−におけるプロトプラストの培養
および植物再生」（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕ
ｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、第４巻、１４５〜１
４９ページ）において、　Ｇ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓの胚
軸組織からとられたプロトプラストからの植物全体の再
生について述べている。報告されている実験において、
胚形成誘導培地はＢＡを０．４ｍｇ／　ｆ　、　　ＮＡ
Ａを０．１ｍｇ／ｊ！および１．ｏｍｇ／ｊ２含んでい
る。基本培地は、Ｒ培地の主要塩およびＣＬ培地の浸透
圧からなり、　６．８４ｍｇ／ｐ、のショ糖に加えてマ
ンニトール、ソルビトール、キシリトールおよびイノシ
トールをそれぞれ２５ｍＭずつ含んでいる。

Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ等（１９３５）　ｒ胚形成およ
び器官形成を経た数種の遺伝子型のダイスのカルス培養
による植物再生Ｊ　（Ｐｌａｎｔａ、第１６７巻、　４
７３〜４８１ページ）は、ダイスの未成熟の胚を用いて
４３．０μＭ（８，９■／１．’）のＮＡＡおよび３％
のショ糖を含むＭＳ培地上に胚を得ることを開示してい
る。子葉および胚軸を両方とも含む無傷の胚が用いられ
た。植物全体が再生された。

Ｕｓｈａ　Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅの修士論文「植物再生潜
在力についてのダイス品種のスクリーニングおよび未分
化組織からのダイスの再生Ｊ　　（１９８６年３月１６
日にイリノイ大学図書館により目録に載せられた）は１
５９ページおよびそれ以降で、未成熟の胚全体を培養し
、不定胚形成カルスを作り出すことを開示している。開
示された培地は３％もしくはそれ以上の炭化水素および
１２ｍｇ／ｌを上限とするＮＡＡを含んでいる。

Ｈ，Ｒ，Ｋｅｒｎｓ等（１９８，６）　ｒダイス（Ｇｌ
　ｃｉｎｅ　ｍａｘ□Ｌ、Ｍｅｒｒ、）の懸濁培養にお
ける子葉性節茎葉増殖と体性胚の発達との相関ｊ　（Ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ＋第５巻、１４０
〜１４３ページ）は、６％のショ糖および０．４ｍｇ／
ｌの２．４−Ｄを含む液体培地を用いた。

発芽した種からの胚軸および子葉組織より得られた組織
上での胚の誘導を開示している。胚からの植物全体の再
生は報告されていない。

形質転換された牡匹釦虹種植物の再生は未だ報告されて
いないが、釦皿画虱肛旭し一鋤血間の相互作用について
はいくつかの文献で論じられている。

Ｈ，Ｃ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等（１９８３）　、　　ｒダ
イスのクラウンゴール腫瘍の誘導および対外培養」（Ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒ　ｔｓ　、第２巻、　　
２０１〜２０４ページ）は、接種部位を封入して脱水反
応を避けることによる。　Ｇ、ｍａｘのアグロバクテリ
ウムへの感染の初の成功を論じている。形質転換された
カルス組織から時折銀が出現することを除けば、この文
献では、形質転換された組織からは形態学上の構造は発
達しなかったこと、およびＢＡＰとＮＡＡとを用いて再
生を誘導しようとする試みは不成功に終わったことが述
べられている。

（以下余白） Ｅ、Ｅ、Ｈｏｏｄら（１９８４）　　’“植物の遺伝子
工学に対して可能性を有するＴｉプラスミドベクター、
　ｐＴｉＢ。

５４２の制限エンドヌクレアーゼマツプ゛、　Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２　：　７０２−７０９．にはＡ
２８１株を利用した大豆（ｃｖ、　Ｗａｙｎｅ）のアグ
ロバクテリウム（釦皿画牡ｅｒｉｕｍ）感染が記載され
ている。Ｅ、Ｅ、Ｈｏｏｄらによる後の論文、″大豆お
よびアルファルファ植物のアグロバクテリウムチューメ
ファシエンス（ｕ皿ユｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｔｓ）Ａ２８１によって刺激された腫瘍にお
けるＴ−ＤＮＡおよびオピン合成遺伝子座′。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６８：１２８３−１２９
０（１９８６）には、アグロバクテリウムに感染した大
豆におけるＴ−ＤＮＡはアルファルファにおけるＴ−Ｄ
ＮＡとは異なる長さを有することが開示されている。

Ｗ、Ｌｒａｎｚｈｅｎｇら（１９８４）　、　　”アグ
ロバクテリウムチューメファシエンスによるグリシン孤
り旦匹戸の多年化種における腫瘍の誘発および遺伝子移
入。

”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ
　５ｏｙｂｅａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏｎｆｅｒｅｎ
ｃｅ　ＩＩ　、　Ａｍｅｓ、　Ｉｏｗａ、　１９８４．
１９５−１９８には。

１５株のアグロバクテリウムチューメファシエンスの培
養物を、数多くの他のグリシン種だけでなく９８４種の
Ｇｏｍａｘに接種して感染させることにより腫瘍を誘発
する試みが記載されている。処理された３１３７のＧ、
　ｍａｘ植物の中、腫瘍はわずか４つに誘発された。植
物再生の試みは行われなかった。

Ｒ，Ｗｙｎｄａｌｅら（１９８５）　、　　”大豆クラ
ウンゴールおよび未転移のカルスの生長周期の間の内生
ＩＡＡおよびサイトカイニンのダイナミックス”’　、
　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２６　：　
１１４５−１１５４．には大豆におけるアグロバクテリ
ウム感染およびＩＩＩ瘍形酸形成いて記載され、ｕｇ組
織中のサイトカイニンが高レベルであることが見出され
た。

Ｌ、Ｄ、Ｏｗｅｎｓら（１９８５）、　”ＴｉまたはＲ
ｉプラスミドを宿すアグロバクテリウム株に対する大豆
の応答の遺伝子型変異性”　、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、７７　：　８７−９Ｃには腫瘍形成およびオピ
ン合成によるアグロバクテリウム感染に対する。大豆の
各種遺伝子型の応答が記載されている。

Ｈ，Ｂｉａｌｙによる非授権的な報告、“形質転換され
た大豆；　ｃＧＭＰの新しい役割”　、　Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ３　：　２００−２０１．にはＴｉプ
ラスミドによって移入されたカナマイシン耐性遺伝子の
大豆細胞培養物における発現の記述が与えられている。

再生については報告されていない。

Ｄ、Ｔ、Ｘｕｄｉｒｋａら（１９８６）、　　”組織培
養物中におけるアグロハクテリウムチューメファシェン
スと葉の外植片の反応”　、　Ｃａｎ、Ｊ、Ｇｅｎｅｔ
、Ｃｙｔｏｌ、２８　：　８０８−８１７、には大豆の
創傷組織が傷害を受けた後４時間だけは依然としてアグ
ロバクテリウム感染を受けやすいことが開示されている
。

Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ら（１９８６）、　　”アグ
ロバクテリウムチューメファシェンス由来の無力化され
た（ｄｉｓａｒｍｅｄ）バイナリ−ベクターはアグロバ
クテリウムリゾジェネス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｒｈｉｚｏ　ｅｎｅｓ）において機能する”　、　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６　
：　４０３−４１５＋にはアグロバクテリウムリゾジェ
ネスの他の領域（ｖｉｒ領域）をバイナリ−ベクター系
におけるアグロハクテリウムチューメファシエンスに利
用して（形質転換された毛状根を生産する効率の低い）
大豆を形質転換することが開示されている。Ｅ、Ａ、　
　。

ＳｈａｈｉｍおよびＲｏＢ、Ｓｉｍｐｓｏｎ、　１９８
６年度大豆の分子および細胞生物学に関する会議（Ａｍ
ｅｓ、　Ｉｏｗａにて開催）の公演予稿２表題“アグロ
バクテリウムリゾジェネスによる外来遺伝子の大豆への
導入および発現”″には上記論文中に開示された研究が
要約されており１体性胚は形質転換された大豆の根から
形成されたと述べられている。この要約ではりゾジェネ
スに誘発された毛状根は再生して全植物体となり得ると
推測しているが、全植物体の再生が達成されたか、ある
いはこのような再生が可能であったということは指摘さ
れていない。

Ｌ、Ｄ、Ｏｗｅｎｓ　ら（１９８５）　”ＴｉまたはＲ
ｉプラスミドを宿すアグロバクテリウム株に対する大豆
の応答の遺伝子型変異性”　、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、第７７巻、　８７−９４゜にはＧ、ｍａｘおよ
びＧ、並ハの効果、そしてアグロバクテリウムによる感
染に対する感受性の成熟度が記載されている。感染は２
〜３週齢の植物の第２節および第３節の間の創傷に５Ｘ
１０”細胞／　ｍｆｌを含む、細菌懸濁液１０ｍ１を塗
布することによって行われた。

Ｄ、Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ　ら（１９８５）、　　”アグ
ロバクテリウムで形質転換された大豆組織におけるキメ
ラ遺伝子の光誘導発現”　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、第３巻、　２４１−２４６゜には大豆の小サブユ
ニットのカルボキシラーゼ遺伝子の５゛部分に連結した
カナマイシン耐性遺伝子を含むアグロバクテリウムチュ
ーメファシェンスを注入することによって若い大豆植物
を形質転換することが記載されている。形質転換された
腫瘍カルス組織においてカナマイシン耐性遺伝子の発現
が得られた。形質転換された組織の再生は報告されなか
った。

Ｍ、Ｃ，Ｂｙｒｎｅ　ら（１９８７）、　　”アグロバ
クテリウムー大豆の相互作用における株特異性および品
種特異性−Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａ
ｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ１び３−１５．に
は腫瘍形成による大豆の各種遺伝子型の各種アグロバク
テリウム株に対する応答が考察され、形質転換された腫
瘍組織におけるカナマイシン耐性の発現が記載されてい
る。

上述の技術において、　ＮＡＡを用いた体性胚形式およ
び大豆の全植物体の再生、あるいは１５■／Ｉ！。

程度の濃度のオーキシン、または２％を越えない炭水化
物および低パーセントのオーキシンの協同的組み合わせ
を用いた。グリシン種の再生を記載したものはない。さ
らに、上記の技術には、効果的な形質転換に対する十分
高い再生効率が９選択された（特に、胚形成）細胞を、
移入されるべきＤＮＡと接触させることによって達成さ
れ得るという示唆または開示が存在しないばかりか、こ
のような形質転換が抗生物質に対する耐性遺伝子のよう
な選択可能なマーカを使用することなく成就し得るとい
う示唆または開示も存在しない。

（発明の要旨） 本発明のグリシン種植物の体性胚形成方法は。

（ａ）該植物の未熟胚から子葉組織を切り取ること。

および（ｂ）該子葉組織を少なくとも約１５ｍｇ／ｐ、
の濃度でＮＡＡ類のオーキシンを含有する誘導培地上で
培養すること、を包含する。本発明のグリシン種植物の
体性細胞から植物体全体を再生する方法は。

約２％（ｗ／ｖ）より少ない炭水化物および約５．０ｍ
ｇ／ｌと約５０ｍｇ／ｊ２との間の濃度でオーキシンを
含有する培地上に該細胞を培養して胚を生成させること
、および該胚を適当な培地上に配置して植物体全体を生
成させることを包含する。本発明の外来ＤＮＡを含有す
るグリシン種植物を生産する方法は、（ａ）繁殖能力の
ある三日月領域を有する核種の未熟胚から採取された子
葉組織を解離すること。

（ｂ）該外来ＤＮＡが該解離された組織の細胞へ組み込
まれるように該組織を該ＤＮＡと接触させること。

（Ｃ）該解離された組織を該組織用胚形成培地と接触さ
せて体性胚を生成すること、および（ｄ）該体性胚を外
来ＤＮＡを含有する全植物体の適当な再生用培地に移す
こと、を包含する。

グリシン種の未成熟胚から子葉組織を切除し。

好ましくは胚軸をそこから除去することを包含する１体
性組織から胚を生産する方法が提供される。

好ましくは、用いられるグリシン種は大豆（グリシンマ
ックス）またはグリシンマックスと容易に交雑するグリ
シンソーヤであり、最も好ましくはグリシン種はグリシ
ンマックスである。

ここに記述される体性胚形成の方法は、大豆および他の
グリシン種の体性組織から全植物体を再生するのに有用
である。“′体性組織”という用語は、胚細胞または配
偶子を含まない組織を意味する。体性組織は栄養組織お
よび栄養細胞からなる。

“′体性胚形成”ば５培養前には苗条または根の分裂組
繊を含まない体性組織または体性細胞から苗条および根
軸を有する胚を形成することを意味する。“′分裂組繊
゛とは分化して特殊化した組織を形成する娘細胞を木質
的に生産し得る細胞からなる組織を意味する。“誘発培
地”、“′胚誘発培地゛および“胚形成培地°”という
用語は、ここでは同義語として用いられる。

本発明の第１の実施態様において、子葉組織はＮ　Ａ　
Ａ　ｔｉのオーキシンを高濃度で有する培地上で培養さ
れる。ＮＡＡ類は、ここではＩ＾へ（インドール−３−
酢酸）、ＩＢ八（インドール−３−醋酸）、およびＮＡ
Ａ（α−ナフタレン酢酸）を含むように定義される。　
ＮＡＡ濃度は好ましくは少なくとも約１５ｍｇ／ｎであ
り、そして少なくとも約３０〜５０ｍｇ／ρまでであり
得る。培地には、さらに炭水化物、好ましくはスクロー
ス、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクト
ースおよびキシロース、そしてそれらの混合からなる群
より選択された炭水化物。

さらに好ましくはスクロースが約３％またはそれ以下の
濃度で含まれるべきである。

本発明の第２の実施態様においては、低濃度のオーキシ
ンおよび低濃度の炭水化物の協同的組み合わせを胚誘発
に用い得る。オーキシンはＮＡＡ類または２．１−Ｄ類
からのものであり得る。２，４−り頻は、ここでは２．
４−　Ｄ　（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ピク
ロラム（ダウケミカルＣｏ、）（４−アミノ−３，５，
６−）リクロロビコリン酸）　、　ｐＣＰＡ（パラクロ
ロフェノキシ酢酸）　、　２，４．５−Ｔ（２，４゜５
−トリクロロフェノキシ酢酸）、およびジカンバ（サン
トスコーポレーション）（２−メトキシ。

３．６−ジクロロ−〇−アニス酸）を含むように定義さ
れる。ここに請求された本発明を実施するためには、　
　ＮＡＡに類似の能力および操作特性を有するオーキシ
ンは、　　ＮＡＡ類に属し、そしてＮＡＡと等価である
と考えられる。また、２．４−Ｄに類似の能力および操
作特性を有するオーキシンは、２．４−Ｄ類に属し、そ
してそれと等価であると考えられる。

低濃度の炭水化物の不在下における２、４−Ｄ類のオー
キシンの最適濃度は約５　ｍｇ　／　Ｑと約１０　ｍｇ
　／ｌの間であり、　　ＮＡＡ＠のオーキシンの最適濃
度は約１５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは少なくとも約３０
ｍｇ／１以上であることが見出されている。高好率の正
常な胚誘発は、　　ＮＡＡ濃度が６．２５ｍｇ／　（ｌ
程度の低い場合でさえ０．５％ｕ／ｖの炭水化物で起こ
る。胚形成の効率は、出願人により炭水化物濃度に逆比
例することが見出されており、オーキシン濃度が低い場
合には、胚形成の効率が一般に損なわれず。

場合によっては向上するということが見出されたのは驚
きであつた。

ＮＡＡを使用すれば２．４−Ｄよりも多くの正常な形態
を有する再生物を産生ずることが見出されている。従っ
て、　　ＮＡＡまたはＮＡＡ類のオーキシンが好ましい
。

この第２の実施態様において、（上で考察したような種
類の）炭水化物は、低濃度、好ましくは約２％またはそ
れ以下、そしてより好ましくは約１．５％またはそれ以
下で存在すべきである。好ましい培地は約１２．５＋＋
＋ｇ／　ｌ　ＮＡＡおよび約２％スクロースを含有する
。別の好ましい培地は約１０ｍｇ／４２ＮＡＡおよび約
１．５％スクロースを含有する。

子葉組織には、好ましくは本発明で同定され。

そして第１図に示されるような、特に胚形成部分が含ま
れる。これらの特に胚形成部分には、残りの子葉組織と
比較して増加した数の胚を生じる細胞が含まれる。

胚誘発培地がＮＡＡ型のオーキシンを含む場合。

またはこの培地が２．４−　Ｄ型のオーキシンを含み。

組織が培地に軸を向けるように置かれる場合、“′繁殖
能力のある三日月（ｆｅｒｔｉｌｅ　ｃｒｅｓｃｅｎｔ
）”を含む子葉部分は特に胚形成部分である。“′繁殖
能力のある三日月゛１は第１図に関して定義される。

子葉には個体差があるので、この部分を正確に測定する
ことによって定義することを妨げられる；しかしながら
、この部分は子葉組織から切除を行う当業者に容易に明
らかとなる。

胚誘発培地が２．４−Ｄ型のオーキシンを含み。

組織が培地に軸を背けて置かれる場合、゛繁殖能力のあ
る卵形（ｆｅｒｔｉｌｅ　ｏｖａｌ）”　２を含む子葉
部分は特に胚形成部分である。また、この部分を正確に
測定してもいろいろな結果が得られるが、当業者によっ
て容易に同定され、子葉組織から取り出される。

ＮＡＡおよび゛繁殖能力のある三日月゛を含む組織を使
用することが好ましい。なぜなら、他のものの中でこの
組み合わせが（細胞群に対立するものとして）単一の体
性細胞からよりしばしば生じる胚に正常な植物の高い再
生効率を与えるからである。

さらに別の実施態様において、″繁殖能力のある゛領域
（特に、胚形成領域）を選択して用いる場合、当業者に
公知の、オーキシンを含まない栄養培地を用い得る。こ
れは、“繁殖能力のある”″領域が、依然として分割し
ており、胚細胞から子葉細胞へその挙動を変化させてい
ない細胞（ずなわち、これらの細胞はまだ分化していな
い）から構成されているからである。この実施態様にお
いては、“繁殖能力のある三日月“が好ましく用いられ
る。

組織を再生培地と（形質転換のプロセスでは用いる外来
ＤＮＡと）確実に最大限に接触させるために２組織は解
離される。解離は、ここでは細胞組織に完全な創傷を与
えるプロセスとして定義されるが、このプロセスは創傷
を受けた組織を、この組織が置かれるべき培地と最大限
に接触させるが。

この細胞に対する組織環境を保護するように行われる。

従って、この創傷は組織を分解して単離された単細胞に
するほど過激であってはならないが。

この組織の各細胞が確実に培地と接触するほど十分に激
しくなければならない。好ましくは２組織を網に押しつ
けるか、または圧力をかけて網に通すことによって解離
が行われるが、この網はステンレス鋼またはナイロンの
ような適当な無毒物質からなり、好ましくはステンレス
鋼である。好ましくは、この網は組織を約１／４ｍｍ２
またはそれ以下の小さな目視し得る組織片に分解するよ
うな目の細かさ２例えば約５００μｍのメツシュサイズ
（Ｎｏ、３５メツシユ）を有する。

体性組織は、好ましくは解離の後に、当業者に公知のい
かなる手段によっても外来ＩＩＮＡを含むように形質転
換され得る。この形質転換は好ましくは所望の外来ＤＮ
Ａを含むアグロバクテリウムチューメファシエンスで感
染させることによって行い得る。形質転換された組織は
培養され、繁殖能力のある全植物体に再生される体性胚
を形成し得る。

“外来ＤＮＡ”は宿主ゲノムの新しい位置では自然い存
在しないＤＮＡである。それはそれ自身のプロモーター
、あるいはグリシンまたは他の生物に由来のキメラ遺伝
子を有するＤＮＡあるいは遺伝子からなり得る。好まし
くはこの外来ＤＮＡは再生された宿主植物および／また
はその子孫に同定し得る表現型を与える。これにより形
質転換された植物は自然に存在する植物と区別し得る。

外来のＤＮＡによって与えられたこのような表現型は、
サザンプロット法、ノザンプロット法、ウェスタンプロ
シト法のような実験室における分析の成果を包含してい
る。本発明により、形質転換されたグリシンの全植物体
、好ましくはグリシンマックスが得られる。この全植物
体はそこに含まれる外来ＤＮＡを発現し得る。例えば、
外来プロモーターおよびエンハンサ−は作用して他の遺
伝子の活性を引き出し、および／または向上させるよう
に発現され。

そして外来遺伝子は発現されてＲＮＡおよび／またはタ
ンパクを産生じ得る。

形質転換のプロセスでは１組織の解離は、外来ＤＮＡと
接触させて細胞をＤＮＡと確実に最大限に接触させる前
であるのが好ましい。

組織を接触させて外来ＤＮＡで形質転換させた後。

この組織を選択培地上で培養する。これらはすべて当業
者に公知である。適当な選択培地はカナマイシン、　Ｇ
４１Ｂまたはハイグロマイシンのような当業者に公知の
抗生物質を含有するが、この抗生物質に対する耐性は対
応する耐性遺伝子によって形質転換された細胞に付与さ
れている。

好ましい実施態様では１選択剤は次の形質転換に用いら
れない。この方法は、クハコのようなモデル系と比較し
た場合に低い再生効率を有する大豆に関して特に有用で
ある。カナマイシンのような選択剤は形質転換された大
豆組織の生長さえ阻害するので、そして耐性遺伝子が植
物にとって有害であるので、このような選択剤の使用は
避けることが望ましい。本発明によって与えられた胚形
成および形質転換の向上した効率は１選択を行うことな
く形質転換を行うためには重要である。この効率は、未
成熟な子葉組織の特に胚形成部分。

特にパ緊殖能力を有する三日月゛部分を同定し選　　・
択する結果として、さらに組織のすべての細胞を外来Ｄ
ＮＡと最大限に接触させる解離プロセスの結果として、
そしてまたさらに細胞群と対立するものとしての単細胞
から高い率で胚形成を起こさせるＮＡＡの使用の結果と
して生し、従って再生物の形質転換を全体的に確実にす
る。形質転換された再生物の高い割合が得られ、そして
特定の植物の形質転換は外来ＤＮＡによって付与される
表現型を同定することによって確認し得るが、外来ＤＮ
Ａの存在はサザンプロットで検出される。

形質転換は好ましくは無力化されたＴｉベクターを含む
アグロバクテリウムで感染させることによって行われる
が、このアグロバクテリウムは選択可能なマーカも含み
得る。植物の感染に有用なアグロバクテリウムの量は組
織が生長しすぎてそれを殺さないほど十分に少量である
べきである。同様に、用いた選択培地、およびいったん
形質転換を起こしたアグロバクテリウムを殺すために用
いた抗生物質は、それらの目的を達成するのに十分であ
るが、鋭敏なグリシン組織を殺さないほど十分に低い濃
度で用いるべきである。これは特に大豆に関して重要で
ある。アグロバクテリウムを殺すのに有用な抗生物質は
当該分野に公知であり。

セフオキシチン、セフオキシチン ニシリンが含まれる。

体性胚が形質転換された組織から形成された後。

この体性胚を当該分野に公知の適当な培地に移し。

繁殖能力のある形質転換された全植物体に再生する。こ
の全植物体は形質転換に用いられた外来ＤＮＡを含み、
そしてそれを発現し得る。やはり外来ＤＮＡを含み、そ
してそれを発現し得る。このような再生された植物およ
びその子孫であって２表現型によって自然に存在する植
物と区別し得るものは本発明の主題に包含される。そし
て１本発明のプロセスによって生産されるすべての再生
物およびその子孫は、それらが表現型によって自然に存
在する植物と区別し得るかどうかにかかわらず、このよ
うな区別し得る植物と等価であると考えられる。

（以下余白） （力」缶しし粒実新ｌ旧１ｑ詳１じｌ市り上体性胚を導
入し、そして再生されたグリシン植物を得るために、い
くつかの胚導入プロトコルが。

出願人により用いられている。胚形成を導入するための
有用なプロトコルは、　Ｐ、Ａ、　Ｌａｚｚｅｒｉ＋　
　ら。

（１９８５）　（前出）に示され、その内容はここに示
されている。ここで特定された条件は、他に特定がなけ
れば、以下の記述で用いられる。

ここで用いられる体性組織は、野性のグリシン種を再生
するのが望ましいとき、茎部分２葉区分。

未成熟の花芽の栄養組織、胚軸、または培養物中に保た
れ得る他の組織とされ得る。当該技術分野で公知のあら
ゆる適当な再生培地が用いられ得る。

この再生培地中で有用な多くの基本培地は、当該技術分
野で公知であり１例えば、　ＳＬ、　Ｂ５．　Ｌ２培地
および旧培地がある。より好ましい培地はＭＳ培地であ
る。この基本培地は、　　ＮＡＡまたは２．４−Ｄ類に
由来のオーキシンのようなオーキシンを含有すべきであ
る。ここで請求された本発明を実施するために、　　Ｎ
ＡＡと類似の発生能および操作特性を有するオーキシン
が、　　ＮＡＡｉ中に存在しかつＮＡＡと等価であると
考えられる。また、２．４−Ｄに類似の発生能および操
作特性を有するオーキシンは。

２．４−ＤＩｌｉ中に存在しかつそれと等価であると考
えられる。

大豆（Ｇｌ　ｃｉｎｅ　　ｍａｘ）またはＧｌｙｃｉｎ
ｅ　５ｏｊａが再生されるとき、用いられる体性組織は
、好ましくは、未成熟の胚に由来の子葉である。好まし
くは。

未成熟の大豆胚を含む種は、長さにして、約２．０ｍｍ
と約８．５ｍｍとの間、好ましくは約３．０ｍｍと約５
．０＋ｎｎ＋との間である。類似の成熟程度の鮫並ハの
種は。

より小さい。好ましくは、胚軸がこの子葉から除かれる
か、および／またはこの子葉が、別のやり方で傷つけら
れる。胚軸の除去により、この組織の体性的性質が保証
される。ここで提供された試験結果により、胚軸が除去
されるとき１体性形成の頻度がより高くなることが示さ
れる。子葉を。

いくつかの断片、好ましくは三等分または四等分に分解
することでも１体性形成の頻度が高まる。

この組織の解離により、効率が大いに高まる。

形質転換プロトコルにおいて極めて有用とするために、
形成された体性の胚は、細胞群よりもむしろ単一細胞か
ら生じるべきである。このことから、単一の胚細胞（こ
れは生殖細胞を含む）から再生された植物の全組織は、
外来ＤＮＡを含むことが保証される。

この理由のために、第１図に示すように、子葉の最も多
くの胚形成部分が同定された。実施例１７に詳述するよ
うに、　　ＮＡＡ培地培地量大数の正常な胚を得るため
に、この″繁殖能力のある三日月”を含む子葉の周辺領
域が用いられるべきである。

この組織は、培地に対して前軸に位置すべきである。２
．４−〇が用いられるとき、この“繁殖能力のある卵形
゛が用いられ得る。この組織は、培地に対して前軸に位
置すべきである。しかしながら。

好ましくは、非常に多くの正常な胚に関し、この組織は
、２．ｉＤ培地に対し前軸に位置すべきであり、この゛
繁殖能力のある三日月″が用いられるべきである。この
ＮＡＡは、より多くのパ単細胞事象゛（これは、一群の
細胞からよりも、むしろ単一細胞から生じる胚である）
、およびより多くの正常形態の再生植物を生じる。その
ために、このオーキシンを使用することは、子葉のパ繁
殖能力のある三日月”部分を選択して、より好ましい。

同定された°°繁繁殖領領域おける胚形成細胞は。

まだ活発に分裂している。この細胞は、胚細胞よりもむ
しろ子葉細胞のごとく作用するようには。

まだ識別されていない。これら細胞が培養されるとき１
体性の胚を生成するのに、オーキシンを使用する必要は
ない。本発明のある実施態様では。

全てのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）　（好ましくはｐｐ
ａｘ　）植物体は、当該技術分野で公知の栄養培地（例
えば、オーキシンを加えないＭＳ培地）上にて。

子葉の繁殖部分（好ましくはパ繁殖能力のある三日月）
を培養することにより、再生される。

この子葉の胚形成部分を培地に確実に接触させ。

そして再生効率を高めるために、好ましくは、胚形成部
分を含む組織が、培養のために子葉から切断される。子
葉全体が用いられようと、切断された胚形成部分が用い
られようと、この子葉組織は。

メツシュに押し入れるかまたはメツシュを通すことによ
り５解離される。好ましくは、このメツシュは、大きさ
にしてせいぜい約１／４ｎｗｎ２の子葉片が生成するよ
うに、細かいメツシュ（例えば約５００μｍ　　（Ｎｏ
、３５））とされる。全体が単離された単一細胞から、
植物体全体を再生することは、不可能ではないが困難で
ある。単一細胞から胚を形成するのに２組織を環境と接
触させることが必要であると思われるからである。同時
に、メツシュが細かくなるほど、細胞が培地と最大で接
触するのを保証するべく、より多く傷がつけられる。

（以下余白） 好ましくは、多数の子葉またはその一部は、好都合な大
きさの一片のメツシュ（これは２ｃｍである）上にある
。これは、一般に、１平方あたり約２０子葉に調整され
る。ステンレス鋼メツシュは。

胚形成の頻度が高くなると、より好ましい。しかし、ナ
イロンや他の適当な非毒性材料もまた。用いられ得る。

銅メツシユは２組織に対して毒性があることが明らかで
あり、推薦できない。この子葉は、メツシュを通して、
一部または完全に押し出される。必要なければ、このメ
ツシュを通して子葉を部分的に押し出し、そして培地に
移すために子葉をメツシュ中に保持するのが、好都合で
ある。胚形成の効率をさらに高めるため、導電性のメツ
シュ（例えば、ステンレス鋼）を用いるとき。

２μへのような弱い電流が、このメツシュに流され得る
。

この体性組織は、まず、通分化性を与えながら。

培地上で培養され得る。このような培地は、当該技術分
野で公知であり、これは２例えば、　Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃ
ｈら、　　（１９８５）、前出、に記述されている。し
かしながら、好ましくは、この組織は、胚形成（胚を誘
導する）培地上に、直接位置している。″繁殖力のある
三日月゛領域または“′繁殖力のある卵形゛領域は、以
下に記述のような組織内に含まれる。

ここでの細胞解離方法が用いられ、通分化は必要ない。

大豆および虹鈴丹の再生のために２本発明で用いられる
胚分化培地は、当該技術分野で公知の基本培地（これは
、オーキシンを含む）である。この基本培地は、好まし
くは、Ｂ５ビタミン、炭水化物源（好ましくは、グルコ
ース、スクロース。

マルトース、ガラクトース、フルクトース、キシロース
のような糖）、寒−天（例えば、　Ｐｈｙｔｏａｇａｒ
。

（これはＧｉｂｃｏ社の商標である）またはＧｅｔｒｉ
ｔｅ（これは、　Ｍｅｒｃ、ｋ　＆　Ｃｏ、サンジエゴ
、カリフォルニア、の商標である）がある。このオーキ
シンは。

好ましくは、　ＮＡ＾系物質物質り、より好ましくは。

ＮＡＡである。本発明のある実施態様では、　ＮＡＡは
。

約１５ｍｇ／ｆｆｉと、少なくとも約３０ｍｇ／ｌであ
って約５０■／ｆｆｉ、　との間の濃度で用いられる。

このような高濃度のオーキシンが用いられるとき、炭水
化物の濃度は、約３％程度で約６％までとされ得る。

大豆の体性の胚形成に対しＮＡＡを用いるために。

従来一般的には成功していない試みによって、　２．４
−Ｄ（これは、従来技術の方法で最もうまく用いられる
オーキシンである）の最適量より高い濃度において、正
常な胚が高効率で生成することが見出されるのは、驚く
べきことである。（出願人は。

５〜１０ｍｇ／Ｉ！の２．．４−Ｄにより、高効率で胚
生成することを見出した。約１０ｍｇ／ｌ以上の２．４
−Ｄでは、望ましくない柔軟でもろいカルスが、高レベ
ルで生成すると知られている）。

本発明の他の実施態様では、低濃度（約１０ｍｇ／ｆま
たはそれより低い）のＮＡＡが、約２％を超えない、好
ましくは約１．５％を超えない炭水化物と相乗的に組み
合わせると、効果的であるとわかっている。５０ｍｇ／
ｌ程度までの濃度のＮＡＡが１通常の胚を高効率で生成
することが見出されてる。低濃度（約１０＋ｎｇ／／２
）のＮＡＡを、より低濃度の炭水化物と用いると、２．
４−Ｄよりも、単一細胞に由来の胚（これは、細胞群と
反対である）を多く生成するとわかっている。

低濃度のオーキシンが用いられると、炭水化物濃度は、
好ましくは、せいぜい約２％、より好ましくは約１．５
％である。最も好ましくは、この炭水化物濃度は、せい
ぜい約２％である。せいぜい約０．５％の濃度もまた。

効果的である。驚くべきことに、正常な胚の生成効率は
、炭水化物濃度が増すと減少し、より低いオーキシン濃
度とより低い炭水化物濃度との間には相乗効果のあるこ
とがわかっている。例えば、約０．５％スクロースのよ
うな低レベルの炭水化物が用いられるとき、試験された
全濃度（５０ｍｇ／ｆｆｉまでの）のうちで最も正常な
胚が得られる。しかし、比較的低いオーキシンレベル（
６，２５＋ｎｇ／　Ｑ　ＮＡＡおよび１２．５ｍｇ＃！
　ＮＡＡ）であっても、生成効率は高くなる。一般に、
正常な胚の生成効率は、各オーキシン濃度における炭水
化物レベルが上がると、低下する。６．２５ｍｇ／Ｉ！
。

ＮＡＡおよび１．０％スクロースにおいて、最も高効率
の正常な胚が生成する。好ましくは、このオーキシンレ
ベルは、少なくとも５　ｍｇ　／　ｌであり、炭水化物
レベルは、約２％を越えない。

培地中では、また、約０．２％のゲルライ）　（Ｇｅｌ
ｒｉｔｅ）が存在するのがより好ましい。培地のｐＨは
約５．０と７．０との間が好ましい。培地が緩衝化され
ていないなら、せいぜい約５．８のｐＨがより好ましい
。

この胚の培養物は、好ましくは、低強度の光の下に置か
れる。この光強度は、約８０ミクロＥ　／　ｒｄ　ｓ（
これは、１秒、１Ｍあたりのミクロアインシュタインで
ある）を越えないのが好ましく、せいぜい約１０ミクロ
Ｅ／％ｓがより好ましい。この培養物が連続光下で生長
され得るか、またはこの胚形成は暗闇の中に置かれる。

しかし、好ましくは。

１６時間の露光時間が用いられる。グロルックス（Ｇｒ
ｏｌｕｘ、　　シルバニア社の商標）のようなランプ（
これは、青色の波長ハンド（４３０〜４９０ｎｍ　）お
よび赤色の波長バンド（６３０〜６８０ｎｍ　）にて、
より高い発光を有する）は、白色ランプを非発熱性とす
るために、より好ましい。

この組織は継代培養され得るが、これは必要ではない。

いったん胚が形成されると（例えば、約１５〜３０日後
）、この胚は別の成熟培地に移され得る。しかし、胚は
、好ましくは、成熟まで（すなわち約３０日で）または
約２．５ｍｍ長になるまで、この胚形成培地上に保持さ
れる。前出のＰ、Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉらの方法（１９８
５）に従って行われ得る。

サイトカイニンを含有する公知の茎葉形成培地（Ｓｈｏ
ｏｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）は、成熟した子葉を培養す
るべく用いられる。サイトカイニンの例には、　ＡＤＨ
（硫酸アデニン）　、　ＫＩＮ　（６−フリルアミノプ
リン）。

ＢＡ（６−ベンジルアミツブリン ＢＡＰ”および”６−ＢＡ”と呼ばれる）、ゼアチン。

およびカイネチンがある。このような培地であれば，　
（１）０．１５■／ｌのＮＡＡ，および各０．０３３＋
ｎｇ／　１のＢＡ，カイ′ネチンおよびクレアチン；（
２）約１ケ月後に発芽しないなら，　０．０５■／２の
ＮＡＡだけを含む同じ培地；または（３）各０．０１７
ｍｇ＃のＢＡ，カイネチンおよびゼアチンと０．０５■
／Ｉ１．のＮＡＡ，　とされる。好ましくは，この最終
培地が，特に、転移のためにうまく区切られた頂部が選
択されるとき。

全ての成熟した胚に対して用いられる。いったん−成性
の葉を有する小植物体（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）が再生さ
れると，この小植物体は発根培地に移され得る。

（概して，この技術分野での一般的な処理によれば，こ
こで用いられ他に特定されなければ，用語“小植物体パ
とは．葉は発育するが根は発育しない植物体を意味する
。） 当該技術分野で公知のあらゆる発根培地が用いられ得る
。小植物体が転移され得る有用な培地の例には，　　Ｏ
．’００５ｍｇ／　ｌ　ＩＢＡで補足された１／２　Ｍ
Ｓ２Ｓ培地（　Ｘ　１／２マクロ塩×１ミクロ塩，Ｂ５
ビタミン。

２％スクロース、　０．６５％Ｐｈｙｔｏａｇａｒ　）
がある。好ましくは．この培地は，　ｌ（ＰＮ塩および
約０．２５　ｇ　／！の酵母抽出物を含有している。こ
の培地は，水道水に溶解され，オートクレーブにかける
前にｐＨ約５．９に調整され，そして０．１５％Ｇｅｌ
ｒｉｔｅまたは０、６５　ｇ　／　ｆｆｉ寒天（Ｄｉｆ
ｃｏ　Ｂａｃｔｏ−寒天）でゲル化される。容易に発根
しない遺伝子型については，約５ｍｇ／／！のクマリン
、または約０．００５ｍｇ／　（！．のＩＢＡのいずれ
かで補足され得る。他の適当な発根培地には、以下があ
る：水耕の栄養性塩溶液（ｓｃｉｅｎｃｅ２２２　、６
２１−６２３）、　　Ｂ　５ビタミン、２％スクロース
。

Ｎｉ　１　μＭ　、　　ｌ　ｔｔｇ＃２　１ＡＡ、　　
９ｍｇ／／２クマリン、ｏ、２％Ｇｅ１ｒｉｔｅガラン
ガム（ｇｅｌｌａｎ　ｇｕｍ）　、または０．６％Ｐｈ
ｙｔｏａｇａｒ（ｐＨ５，９、オートクレーブにかける
前）；またはホワイトの培地−修飾されたホワイトの塩
溶液、Ｂ５ビタミン、２％スクロース、ｏ、２％Ｇｅ１
ｒｉ　ｔｅまたは０．６％Ｐｈｙｔｏａｇａｒ、　　１
　ｍｇ　／　ｐ、Ｉ＾八。

９　ｍｇ　／　１．クマリン（ｐＨ５，９，オートクレ
ーブにかける前）。生長室中において、２３時間の発光
時間（１００ミクロＥ／ｎ（ｓ　、　２０°Ｃおよび湿
度６０％）にて、最適の発根が起こる。好ましくは、こ
の小植物体は、　１００　ｍｌの発根培地を含むマゼン
タ（マゼンタ社の商標）ボックスのような分離された容
器内で生長する。光照射条件は公知であるが、好ましく
は、５０〜１００ミクロＥ／ｒｒｆｓのグロルクス（Ｇ
ｒｏｌｕｘ）または非発熱性の白色螢光ランプを用いた
２３時間の発光時間が使用される。

この小植物体が、うまく発育した根糸を有するとき、こ
の小植物体は、好ましくは、滅菌された（例えば、オー
トクレーブまたはマイクロウェーブで）鉢上げ混合物を
含有するポットに移される。

好ましくは、このような鉢上げ混合物は、土壌：プロミ
ックス：砂の２：２：１混合物を含有する。

（プロミックスとは、　Ｐｒｅｍｉｅｎ　Ｂｒａｎｄｓ
、　Ｉｎｃ、＋　ＮｅｗＲｏｃｈｅｌｌｅ、　ＮＹの商
標である）。これら小植物体は５好ましくは、硬化中の
蒸散を低減させるため、おヨヒヒーク−１２０：　２０
　：　２０の植物用肥料のような植物用総合肥料を供給
するために、被覆される。

（ピータ−とは、　Ｐｅｔｅｒｓ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅ
ｒ　Ｃｏ、＋　Ｆｏｇｅｌｓｖｉｌｌｅ。

ＰＡの商標である）。短時日にわたって１人工光（好ま
しくは高圧ナトリウム光）を約１３時間加えた自然光を
補足するのが望ましい。ダニや白ハエの侵入およびうど
ん粉病は、目的に合わして作られた市販の調製物により
、制御され得る。Ｐ、Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉ　。

ら（１９８５）　、前出、を参照せよ。

外来遺伝子を植物組織に導入するだめの形質転換法は、
当該技１本ｉ分野で公知であり２例えば、　Ｓ、ｌ（。

Ｍａｎｔｅｌｌ　ら、植物バイオテクノロジーの原理、
植物における遺伝子工学の導入（１９８５）　、特に、
　ｐ、３４〜１５７に記述され、その内容はここに示さ
れている。以下の論述は、より好ましい実施態様を記述
する。この論述は、牡り釦り種が形質転換され得るよう
ないずれの方法も、完全に記述することを意味しない。

Ｇ、ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎ□およびＧ、ｃａｎｅｓｃｅ
ｎｓのような野性種の形質転換は、茎３葉、花、胚軸ま
たは他の適当な外植を用いることにより、遂行され得る
。

この外植は、洗浄され、好ましくは７０％イソプロパツ
ールを用いて約１分間洗浄され、続いて、１０％クロロ
ックス（Ｃｈ　１ｏｒｏｘ）にリキノックス（Ｌｉｑｕ
ｉｎｏｘ）−滴が加えられる。この外植は１次いで、好
ましくは滅菌水で約５分間洗浄され、そしてこの手順が
繰り返される。組織が切断される適当なサイズの断片は
、茎部分に対して約１ｃｍ、葉区分および花芽に対して
約１ｃｍＸ　０．５ｃｍである。

より大きな芽は、好ましくは個々の断片に分離され得る
。しかし、未成熱井は、好ましくは約３つの芽の房に分
離される。

この組織は、上記の胚形成培地または器官形成培地のよ
うな再生培地に移されるべきである。より好ましい、器
官形成培地は、以下である：　（１）ＭＳ塩、Ｂ５ビタ
ミン、３％スクｏ−ス、　　５００ｍｇ／／２カゼイン
加水分解物または５００＋ｎｇ／ｊ２グルタミン。

０．５　ｒｎｇ／ｌＮＡＡ、　　２．０ｍｇ／ｆｆ　Ｂ
Ａ（６−ヘンシルアミノプリン）　、　１．０ｍｇ／　
１カイネチン、ｏ、６％Ｐｈｙｔｏａｇａｒ（ｐＨ５，
９，オートクレーブにかける前）；または（２）Ｍ　Ｓ
塩、Ｂ５ビタミン、３％スクｏ−ス、　５００　ｍｇ／
！カゼイン加水分解物、　０．１５ｍｇ／ｌＮＡＡ、　
０．３３ｍｇ／ｌ６−ＢＡ、　０．３３＋ｎｇ／ｊ２カ
イネチン、　０．３３ｍｇ／ｊ２ゼアチン、０．６％Ｐ
ｈｙｔｏａｇａｒ（ｐＨ５，９、オートクレーブにかけ
る前）。好ましくは、約２０〜３０片の組織が、各プレ
ート上に置かれる。この物質は２次いで、好ましくは約
１〜２日間ブレインキュベートされる。各外植は２次い
で９組織を殺すことなく感染させるために、以下に示す
一昼夜懸濁させたアゲロバクチリア（Ａ　ｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉａ）の培地を充分な濃度で、好ましくは約０．５
〜１．０μｌで含有するアグロバクテリウム懸濁液でイ
ンキュベートされる。より高濃度のアゲロバクチリアが
用いられるなら、またはこの外植がバクテリア溶液に浸
されるなら、このアゲロバクチリアは成長しすぎ。

外植を殺す。この外植は、アゲロバクチリアの存在下に
て、数日間（例えば、約１〜３日間）生長させるべく供
され１次いで上記のような再生培地に移される。この培
地はまた。アゲロバタテリアを殺すべく、抗生物質、好
ましくはメツオキシン（Ｍｅｆｏｘｉｎ）を約５００ｍ
ｇ／ｍＲの濃度で含有する。この形質転換されたと考え
られる物質は１次いで。

上記の再生培地に移される。この培地もまた２組織の形
質転換に用いられる選択可能マーカーに対応した２選択
試薬を含有する。好ましくは、この選択試薬は、カナマ
イシンまたはその類似物（例えば、　Ｇ４１８）であり
、これは、形質転換された細胞に対しカナマイシン耐性
遺伝子（ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ■）
を与えるために。

選択される。カナマイシンまたはＧ４１８は、好ましく
は、形質転換された組織に対し、これを殺すことなく選
択するのに、充分なレベル、好ましくは約５０〜３００
μｇ／ｍｆｌカナマイシンまたは約１０〜５０μｇ１ｍ
ｌ　Ｇ４Ｌ８で、用いられる。

この形質転換された外植は２次いで、上記のごとく再生
するべく供される。好ましくは、これら外植は、抗生物
質および選択剤を含有する再生培地上にて、茎頂が形成
されるまで、隔週間隔で継代培養され２次いで、適当な
茎葉培地１発根培地および土壌培地に移される。

且匹植ｍａｘおよびＧ、ｓｏハの形質転換は２体性の胚
形成の論述と比較した上記のように、未成熟の子葉細胞
が用いられる以外は、上記のごとく行われ得る。好まし
くは、この子葉細胞は、アゲロバクチリアによる感染前
に除去された胚軸を有する。

より好ましくは、この子葉細胞は、」二記のごとく解離
される。この組織の適当な胚形成部分が用いられる。こ
れらのより好ましい条件下にて、通分比倍地上でこの組
織を培養して、感染前にカルスを形成することは、必要
ではない。この子葉は。

好ましくは約１０／　１００ｍｍ　ｄｉｓｈの割合で、
対をなして置かれ、好ましくはアゲロバクチリアとすく
にインキュベートされる。しかし、接種は、形質転換さ
れる遺伝子型に依存して、必要により数日間遅らせても
よい。実施例２１を参照せよ。

この子葉が形質転換のために置かれる胚形成培地は、当
該技術分野に公知のいずれの胚形成培地であってもよい
。この胚形成培地には、好ましくはＮＡＡ類似物を含有
する上記の培地、または低濃度の炭水化物に低濃度のオ
ーキシンを組み合わせた相乗混合物がある。この子葉組
織が、形質転換を生じるべく、充分な時間にわたって、
バクテリアの存在下にて、胚形成培地上で生長に供され
た後、この組織は、バクテリアを殺すための抗生物質（
これは、好ましくは約２００〜約５００＋ｎｇ／　Ｉ！
　。

最も好ましくは約５００１Ｔ１ｇ／Ｉｌのメツオキシン
（セフオキチン）タラホランセフォタキシミンまたはカ
ルベニシリンである）を含有する新鮮な胚形成培地に移
されるべきである。カナマイシンまたはカナマイシン類
似物（例えば、　Ｇ４１８）　、またはハイグロマイシ
ンのような選択剤もまた。形質転換された体性の胚を選
択するために、用いられ得る。

選択のために、　Ｇ４１８の寒天中のより好ましいレベ
５フ ルは、約１０ｍｇ／４２であり、カナマイシンは約５０
ｍｇ／／２である。ハイグロマイシンが用いられるとき
７約２　ｍｇ　／　Ｉｔがより好ましい。しかしながら
、　Ｇｅ１ｒｉｔｅはより好ましい培地である。それは
２組織に対するストレスを減することが明らかだからで
ある。

組織は、最大数の細胞を形質転換させるのに充分な時間
ではあるが、細胞の過度の死滅を起こさない限りにおい
て、アゲロバクチリアで共栽培される。この時間は、約
１日と約３日間との間、より好ましくは約１日である。

大豆組織における選択剤のおそらく逆効果により、およ
び／または形質転換された大豆プラント上でのＮＰＴＩ
Ｉのような選択可能マーカー遺伝子のおそらく逆効果の
ために１選択剤を用いることなく形質転換工程を行うの
が、最も望ましい。タバコのようなモデル系と比較した
Ｇ、ｍａｙの低再生能のために、多くの大豆再生体が、
圧倒的に優位となる。上記の解離方法は、相対的にわず
かな未形質転換胚しか形成されないように、外来ＤＮＡ
とともに実質的に全ての胚形成細胞との接触を確実にす
る。さらに、この子葉のＮＡＡおよび゛繁殖力のある三
日月°′を使用することは、はとんどの胚が単一細胞に
由来することを意味する。そのために。

この発明から、実際上１選択段階を用いることなく、効
果的な形質転換を行うことが可能となる。

再生後、形質転換体は、外来ＤＮＡにより組織または再
生プラントに与えられる特性によって２表現型から同定
され得る。この外来遺伝子は、β−ガラクトシダーゼの
ようなレポーター遺伝子の活性を含むか、またはサザン
ブロット法のような分析での遂行能力を包含している。

この培養物は、好ましくは、それぞれ約２８〜３０日に
わたり３体性の胚が形成されるまで、抗生物質を加えた
胚形成培地（これは選択剤が存在するかまたは存在しな
い）に継代培養される。次いで。

この培養物は２葉茎培地２発根培地および上記のような
鉢上げ混合物に形質転換される。この培養物は、抗生物
質とともに維持されるべきである。

もし選択剤が用いられるなら、この培養物は持続される
。

植物細胞に外来遺伝子を挿入するべく用いられ得るベク
ターを含有するアゲロバクチリアは、当該技術分野で公
知の方法により、培養される。このアゲロバクチリアは
、好ましくは適当な培地のプレート上にて生長させるこ
とにより、好ましくばＹＥＰ培地（１０，０ｇ／４２酵
母抽出物、　１０．０ｇ／ｊ２ペプトン、　　５．０ｇ
／ｊ２　ＮａＣ］、　１５ｇ／ｊ２寒天、　ｐＨ７，０
，これは約２８°Ｃにて選択剤を含有する）により、培
養される。ベクター中で用いられるマーカーは、カナマ
イシン耐性遺伝子とされ得る。この選択剤は、それゆえ
、カナマイシンまたはＧ４１８であろう。このマーカー
は、当該技術分野で公知のいずれのマーカーであっても
よい。この培地は。

従って、アゲロバクチリアを運ぶベクターのみに選択さ
れるべく、調整される。

アグロハタテリウムコロニーは、この培地から削り取ら
れ、　ＹＥＰ肉汁またはミネラル培地のような適当な培
地中に懸濁される。好ましくは、１．５雁の培地あたり
、約２５〜５０コロニーが懸濁される。

−昼夜懸濁後、この物質の１ループが適当な培地（例え
ば、適当な抗生物質を含有するＹＥＰ培地）に条はんを
つけて、単一のコロニーを与える。この単一コロニーは
、適当な肉汁培地（好ましくは。

適当な抗生物質を含有するＹＥＰ　）の約２５ｍ１とイ
ンキュベートするべく、用いられる。この培養物は。

約２５°Ｃで、好ましくは振盪しているウォーターバス
中にて、−昼夜生長される。この培養物は、細胞を収穫
するべく、スパンされる。この細胞は。

肉汁培地またはミネラル培地で再懸濁される。この−昼
夜再懸濁された培地の約０．５〜１．０μ！が。

上記のごとく、形質転換されるべく植物組織に接種する
ために用いられる。この植物組織に接種す　−るために
用いられる培養溶液は、相対的に低濃度。

好ましくはわずか約１０４〜１０８有機物／　ｍｌｌ　
、より好ましくはわずか約１０６有機物／　ｍｌのアゲ
ロバクチリアを含有するべきである。アゲロバクチリア
を形質転換する方法、およびそれに作用するベクターは
、多くの参考文献に詳細に記述されている。

例えば、　Ｓ、Ｈ６Ｍａｎｔｅｌｌ　ら、　　（１９８
５）　、前出の特に４章を参照せよ。この文献の内容は
ここに示されている。本発明で植物組織を形質転換する
ために用いられるベクターは、アグロバクテリウムベク
ターである必要はない。しかし、このベクターは。

アグロバクテリウムベクターであるのが好ましい。

好ましくは、このベクターは、形質転換体の選択を行う
マーカー遺伝子を含有する。このマーカーは、好ましく
は、カナマイシン耐性遺伝子である。

このようなベクターの多くは市販されているが。

または文献に再現的に記述されている。これらベクター
は、大豆種または他のグリシン（且り江虹）種を形質転
換するのに用いられる。好ましくは。

このベクターもまた。除草剤（例えばグリホサート）耐
性のような所望の形質に対し、コードする遺伝子を含む
。例えば、　Ｄ、Ｍ、５ｈａｈ、　　ら（１９８６）　
。

“′遺伝子導入植物における工学的な除草剤耐性°′５
ｃｉｅｎｃｅ、　２３３　：　４７８−４８１を参照せ
よ。グリシン組織は、このような植物組織を形質転換し
得る。当該技術分野で公知のいずれのベクターによって
も。

形質転換され得る。ここで記述がありかつ当該技術分野
で公知のように、適当なマーカーおよび選択手順が与え
られると１選択された形質転換組織は、この発明の方法
により、繁殖力のある植物体全体に再生され得る。

より好ましい実施態様で用いられるベクターはｐＨ５ｐ
Ｚ３Ｄであった。このベクターは、β−ファゼオリン（
β−ｐｈａｓｅｏｌ　ｉｎ）プロモーターの制御下にて
、ゼイン遺伝子を含有する。これは全てり、ｔｌｏｆｆ
ｍａｎ（１９８７）　”遺伝子導入タバコ種におけるト
ウモロコシ１５ｋｄゼインポリペプチドの高レベル合成
“Ｃｅ　１１　＋出版中、により完全に記述され、その
内容はここに示されている。このベクターは、アグロバ
クテリウム　゛ンメファシエンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｔｕ。

ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）株Ｌ　Ｂ　Ａ　４４０４中にあ
り、これはＨｏｅｋｅｍａら、　　（１９８３）　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３０３　：　１７９に記述されている。

これは、広く入手可能な株であり、また著者から入手で
きる。

グリシン植物および、好ましくは大豆の再生方法は記述
されている。これらの方法は、再生体での体性変異の分
析を行うため、および繁殖力のある植物体全体に形質転
換組織を再生させるために。

必要な効率を与える。この繁殖力のある植物体全体は、
それ自体および子孫植物において、外来り、Ｎ　Ａを含
有しかつそれを再生産させる。

本発明は、その特定の実施態様と関連して記述されてい
るものの、これはさらに改良することが可能なことは、
理解されるだろう。この適用は。

一般的に本発明の原理に従う、いかなる本発明の変化、
用途または応用も含むつもりである。そして、この適用
は９本発明の開示から逸脱したこのような事項も２本発
明に関連した技術範囲内の公知かつ常套な実施として、
包含する。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

記：処理の比較だけをこの中に含めて構成する。

全てのパ対照”処理としての実験間には、必ずしも同一
性はない。

実施例１　：　］／成における　々のホルモンの六植物
生長、胚の単離： 供与植物の生長手順、豆果の滅菌および胚の単離は、従
来記述されているように（Ｐ、Ａルａｚｚｅｒｉ。

Ｄ、Ｆ、ＨｉｌｄｅｒａｎｄおよびＧ、Ｂ、Ｇｏｌｌｉ
ｎｓ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、　３　（１９８５）　
１６０）　、行われた。要約すれば、植物は、自然光に
加えて冬期には人工光（高圧ナトリウム光）を１３時間
与えて、温室内の鉢で生長させた。長さ４．０±１　、
０ｍｍの種を含む豆果を、７０％イソプロピルアルコー
ルに３０秒間。

続いて２５％クロロックス　ブリーチ（Ｃｈｌｏｒｏｘ
　ｂｌｅａｃｈ）に１０分間浸すことにより２表面滅菌
した。次いで。

この豆果を滅菌水で２回洗浄した。

培地、培養条件： 基本培地は、　ＭＳ塩（Ｔ、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅおよび
Ｆ、Ｓｋｏｏｇ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　１５　（１９６２）
　４７３）、　　Ｂ　５ビタミン（０，Ｌ、Ｇａｍｂｏ
ｒｇ＋　Ｒ，八、Ｍｉｌｌｅｒおよびに、Ｏｊｉｍａ、
　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ、　Ｒｅｓ、、　５０　（１９６８）　１５１
）、　　３％スクロースおよび０．６５％ｐｈｙｔｏａ
ｇａｒ　（これはＧ　ｉ　ｂｃｏ社の商標である）を含
み、オートクレーブにかける前にはｐｌ（５，９である
。オートクレーブにかける前に、フィルター滅菌された
ＡＢＡを除いて、この培地にホルモンを加えた。胚（ま
たは葉対）を、非発熱性の螢光（２０ミクロＥ／ｒｒｆ
ｓ）の１６時間照射下にて。

２５±３°Ｃで、　２０　Ｘ　１００ｍｍプラスチック
皿において３０ｍ１培地あたり１０個の割合で培養した
。

（以下余白） 培養評価： 培養は３０日ごとに記録された。胚応答を評価するのに
６つのパラメーターが用いられた。■、胚形成頻度＝胚
形成培養物の数／当初の全培養物。

■、平均胚杯数胚形成培養物当りの体性胚（正常および
異常の両方を含む）の平均数、■、効率−胚形成頻度×
平均胚杯数■、正常胚の頻度−正常胚の培養物数／全胚
形成培養物、■、根付き頻度−根を有する培養物のパー
センテージ、および■。

カルス化頻度−カルスによる培養物のパーセンテージ。

評価にあたり、異なる根と発芽極および少なくとも一つ
の輪郭のはっきりした子葉を有する胚が“正常゛として
分類され、他方、子葉を有さないかもしくは融合した子
葉を有する異なる発芽極を欠く胚が“異常゛として分類
された。親子葉組織に融合した双極構造はもし異なる発
芽類が存在しないならば記録されなかった。その場合に
は、それら構造は異常胚として分類された。

最小の６０胚が一回の処理当り培養された。そして一般
に１００胚以上が処理当り培養された。

ホルモンの体性胚形成効率におよぼす効果が表　　−１
に示されるように試験された。１７グリシン　マックス
ゲッタイブが以下のように試験されそしてその結果がプ
ールされた。成熟グループＯＯ変種植物としてアクミ（
Ａｃｍｅ）　、アダ（Ａｄａ）　、アゲート（Ａｇａｔ
ｅ）　、アルトナ（Ａｌｔｏｎａ）、　　フレスト（Ｃ
ｒｅｓ　ｔ）　＋フラムビュー　（Ｆ　Ｉａｍｂｅａｕ
）　、　　ヒダザ（Ｈｉｄａｔｓａ）　、マニトバ（Ｍ
ａｎｉｔｏｂａ）　、ブラウン（Ｂｒａｗｎ）　、マツ
コール（ＭｃＣａｌｌ）　、モルソイ（Ｍｏｒｓｏｙ）
　、ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）　＋オゲマウ（Ｏｇｅｍ
ａｗ）　、パガダ（Ｐａｇａｄａ）　、バンド（Ｐａｎ
ｄｏ）　。

ポーテージ（Ｐｏｒｔａｇｅ）　、　シオウクス（Ｓｉ
ｏｕｘ）　、およびグループ■ゲッタイブＰＩ４０８．
２９４Ａ　０胚全部が培養された。

体性胚形成はそのタイプおよび培地中のオーキシン濃度
に依存した（体性胚は外生のオーキシンが存在しないと
数回の実験を通じて一度も観察されなかった）。オーキ
シンＩＢＡ、　ＮＡＡおよび２，４−Ｄのうち、最後の
ものが体性胚誘導に最も有力であり（表１）、そして各
濃度で最高の効率値を与えた（効率は培養された接合胚
当りの体性胚の収量をもって表される）。各オーキシン
に対して。

胚形成頻度がオーキシン濃度と共に増加した。平均の杯
数は類似してはいるがそれほど目立たない傾向を示した
。

オーキシンの種類は培養形態に明白な効果を与えた。Ｎ
ＡＡにより誘導される体性胚は最も正常な形態を有した
。しかし単−子葉胚および多子葉胚は普通であった。２
．４−Ｄで誘導された胚は通常この型であるが、高オー
キシン濃度（５および１０ｍｇ／／２）では葉状でかつ
そう主構造になるのが普通であった。ＩＢＭで誘導され
る胚は一般に不完全に生育し、特に低オーキシン濃度で
はそうであった。ＮＡＡもしくはＩＢＭ培地での培養は
カルスをほとんど生成しなかった。しかし２．４−Ｄで
はいつも何らかのカルスが誘導された。根は通常ＩＢＡ
およびＮＡＡ培地上に形成されたが；２．４−Ｄ培地で
はまれであった。

５■／！のＮＡＡとの組み合わせで試験されると。

０．０１ｒｒ１ｇ／ｌのＢＡではほとんど効果がなく　
、　０．０５ｍｇ／！のＢＡでは胚形成頻度が低下した
。より高いＢＡ濃度もまたカルス生成を鼓舞した。５　
ｍｇ　／　ＲのＮＡＡとの組み合わせの場合は０．１ｍ
ｇ／ｆｆｉのＡＢＡは、　ＮＡＡのみを含む培地と比較
して、胚形成を低下させた。

ＭｃＣａ　１１ゲツタイブを利用した５、０と１２．５
＋ｎｇ／ｊ！との間の４種のＮＡＡ濃度を比較した場合
（表２）。

以下のことが示唆された。胚形成の効率は５　ｍｇ　／
　Ｉ！。

以上の濃度により増加するが、正常胚の頻度はより高い
オーキシン濃度で減少するということ。胚全体が用いら
れた。同じ実験において、５＋ｎｇ／ｆｆｉの２．１１
−Ｄは最も効果的なＮＡＡ培地の効率値の２倍以上を与
えた。しかし、正常胚の生成は低頻度であった。５　ｍ
ｇ　／　（ｌのＮＡＡを０．０５．０．５　もしくは５
．０＋＋＋ｇ／／！の２．４−Ｄと組み合わせたとき、
これら二つの低い２．４−Ｄ濃度の場合は胚形成効率に
わずかに低下効果を示した。他方、高濃度の場合は５ｒ
ｒ１ｇ／ｊ２の２．４−Ｄのみの場合に近似の結果を与
えた（表２）。各組み合わせでは、２．４−Ｄは体性胚
の形態に関して″優性゛なオーキシンであるように見え
た。そして０．０５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄでさえ、２．
４−ＤなしのＮ５培地（５ｍｇ／　Ｉ　ＮＡＡ　）と比
較して、正常胚生成の頻度は著しく低下した。

ここでは以後、”Ｎ”の後につけられる数字はＮＡＡの
ｍｇ／／！数を指し、　′Ｄ”の後の数字は２．４−Ｄ
のｍｇ／ｆ数を指す。

５　ｒｎｇ　／　ｌの２．４−Ｄとの組み合わせでは０
．１ｍｇ／ｎのＡＢＡは胚形成効率にほとんど影響を及
ぼさなかったが、対照値（単なるＤ５　（５ｍｇ／ｆの
２．４−Ｄ）培地）に対し正常胚の頻度がわずかに増加
した。　　。

しかし、　　１．０＋ｎｇ／ｊ２ではＡＢＡは胚形成効
率が半減しそして正常胚生成が減少した。２．４−Ｄで
誘導された体性胚の形態に対するＡＢＡの効果は時々そ
れらの子葉を広くかつ葉様にした。

表３は高濃度のＮＡＡが体性胚形成におよぼす効果を示
す。Ｊ１０３　（ジャッキーズ　シード　カンパニー、
ウシコンシン州）から分離された子葉およびＭｃＣａｌ
ｌが試験され、同様な結果が得られた。

Ｊ１０３のデータのみがここに提示されている。

ここのデータは大豆体性胚形成を制御するときの外生オ
ーキシンの重要性を示す。オーキシンの種類および濃度
は効率（胚形成頻度および平均杯数）に関し工程に特定
でかつ異なった効果を与える。２．４−Ｄを含有する培
地は最高の胚形成功率を与えた。等濃度ではＮＡＡおよ
びＩＢＡが順次活性が低かった（表１．２および３）。

胚誘導についてのこの高い可能性はｃＣＰＡおよび２．
４．５−Ｔのような他のフェノキシ酢酸により示された
。試験された各オーキシンに関し、胚形成効率は濃度の
増加につれて増大した。オーキシンの種類もしくは濃度
に関しくおよび他の処理に関し）胚形成効率の変化は、
一般に二つの構成要素パラメーターについて類似の反応
を反映した（表１．２および３　）　。ＮＡＡについて
、１と３０ｍｇ／Ｉｌとの間の濃度が試験された。３０
＋ｎｇ／ｊ２が最高の効率を与えた。

これはこのレベルがなお準最適であり得ることを示唆し
ている。２．４−Ｄについて、胚形成効率がオーキシン
濃度と共に増加したが、もろい細胞の形成および早期の
体性胚の通分化に付属的な増加が見られた。それゆえ、
最適値は５と１０ｍｇ／ｊ２との間にあった。この効果
は小さな胚および単離された子葉の培養において著しか
った。大豆の体性胚形成についての他の研究では、　２
．４−Ｄがすでに最も普通に用いられているオーキシン
である（Ｗ、Ｄ、　Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７
）前出、　Ｇ、Ｃ，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓら前出、　Ｍ、Ｌ
、　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ　ら、前出、　Ｊ、Ｐ、
Ｒａｎｃｈら（１９８５）前出、　Ｂ、Ｊ、Ｌｉら、前
出）。ただし、はんの二つの研究だけが異なるオーキシ
ンについて胚形成頻度を比較している（Ｂ、Ｌｉｐｐｍ
ａｎら、　　（１９８４）前出、　Ｕ、Ｂ、　Ｂａｒｗ
ａｌｅら、　　（１９８６）前出）。これらの両研究は
２．４−Ｄが最も活性のあるオーキシンであることを示
している。異なる２、４−Ｄ濃度が試験されると、最適
値は異なる（　１　ｍｇ／　Ｉ！、（Ｂ、Ｌｉｐｐｍａ
ｎら（１９８４）前出）　、　　５ｍｇ／ｌ（Ｊ、Ｐ、
　Ｒａｎｃｈら（１９８５）前出）、１０■／１２　（
表１））。これらの差異は。

両者が胚形成に強く影響をおよぼすので、異なる蔗糖レ
ベルの使用もしくは異なる外植体の使用から生じている
のかもしれない。同様に、この研究により示唆された最
適ＮＡＡ濃度（３０ｍｇ／　１　）は他の研究の最適値
（０，５ｍｇ／　１　・−９Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎら（１
９８４）前出；　８　ｍｇ／　１−−−　Ｕ、Ｂ、　Ｂ
ａｒｖａｌｅら（１９８６）前出）と対照的である。

体性肢誘導はホルモン源としてオーキシンのみを要求し
た。サイトカイニン（ＢＡ）かＡＢＡのいずれかがまた
供給される処理においては、供給濃度に依存して、胚形
成効率は影響されないかもしくは減少した（表１および
２）。サイトカイニンの大豆体性胚形成におよぼす阻害
効果は以前に報告されている（Ｌ、Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎ
ら（１９８４）前出）。ただし、他の胚形成のプロトコ
ールはサイトカイニンに暴露される期間を包含している
（Ｗ、Ｄ、　Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７）前出
、　Ｍ、Ｌ、　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら（１９８３
）前出、　Ｂ、Ｊ、Ｌｉら（１９８５）前出）。八ＢＡ
は大豆の胚形成を生体内で制御するように見える（Ｒ，
Ｃ，Ａｃｋｅｒｓｏｎ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｏｔ、、　３５　（１９８４）　４０３
）。そして胚段階に依存して試験管での接合胚生長およ
び繁殖を鼓舞もしくは阻害する（Ｒ，Ｃ，Ａｃｋｅｒｓ
ｏｎ、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｏｔ、＋　３５（１９８４）　
４１４）。ここのデータは、しかし、　ＡＢＡがオーキ
シンで誘導された体性胚形成を阻害することを示唆して
いる。ただし１体性胚形態への影響かい（つかの２．４
−Ｄ、誘導胚の子葉が葉様になるという点に認められた
。

大豆体性胚の品質もしくは形態学的正常性についての疑
問はいくつかの研究によりすでに議論されている０１．
、Ｄ、　Ｂｅｒｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７）前出９
Ｍ。

Ｌ、　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら（１９８３）前出、
　Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎら（１９８４）前出、　Ｊ、Ｐ、
Ｒａｎｃｈら（１９８５）前出、　Ｕ、Ｂ。

Ｂａｒｗａｌｅら（１９８６）前出）。しかし先の研究
はいずれも正常の異常胚の頻度を定量することを試みて
いない。しかし、このパラメーターは、胚から植物体へ
の変換効率が胚の正常性と共に顕著に変化するので、胚
形成系の応用に極めて重要なものである（Ｊ、Ｐ、Ｒａ
ｎｃｈら（１９８５）前出、　Ｐ：Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉ
ら（１９８５）前出、　Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅら（１
９８６）前出）。

大豆体性胚に影響を与える主たる要因はオーキシンの種
類および濃度である（Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎら（１９８４
）前出、　Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｈら（１９８５）前出、　
１１．Ｂ、　Ｂａｒｗａｌｅら（１９８６）前出）。た
だし他の物理的、化学的そして栄養的要因もまた重要で
ある。オーキシンの種類が体性胚の形態におよぼす効果
は２．４−Ｄもしくは他のフェノキシ酢酸（ｐＣＰＡ、
　　２．４．５−Ｔ）により誘導された胚と″非フェノ
キシバオーキシン（ＮＡＡ、　ＩＢＡ）により誘導され
た胚との差において見られる。２．４−Ｄ誘導胚は、は
っきりしない子葉を有し、一般にこの形状をなし葉状ま
たは帯化状である。これらの明確な根極をしばしば欠き
。

そして発芽頂はその他の点では“成熟胚においてしばし
ば未発達である。反対に、　ＮＡＡ誘導胚は通常明瞭な
双極性を有しはっきりした小根および胚軸領域、十分に
特定された子葉および発育の早期から可視され得る発芽
頂を備えている。これら形態学における全体の相違は容
易に反映され、それにより胚が発芽され得る。ＮＭ誘導
胚は容易に発芽する（Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅら（１９
８６）前出）、シかし２．４−Ｄ誘導胚は発芽が困難で
あり（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７）前
出、　Ｂ、ｌｉｐｐｍａｎら（１９８４）前出）。

発芽のためにしばしばインキュベーション期間を長くす
ること（Ｐ、Ａ、　Ｌａｚｚｅｒｉら（１９８５）前出
）もしくは複雑な培養操作（Ｊ、Ｐ、　Ｒａｎｃｈら（
１９８５）前出）を必要とする。他の研究（Ｗ、Ｄ、Ｂ
ｅｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７）前出、　Ｍ、Ｌ、　
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら（１９８３）前出、　Ｂ、
Ｌｉｐｐｍａｎら（１９８４）前出、　Ｊ、Ｐ、　Ｒａ
ｎｃｈら（１９８５）前出、　Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ
ら（１９８６）前出）の一致した見解はこれら所見を、
他の研究者達が両ＮＡＡおよび２．４−Ｄ培地上に生育
できる胚を生成させることができなかったという条件付
きで、支持している（Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎ　ら（１９８
４）前出、　Ｕ、　Ｂ。

Ｂａｒｗａｌｅら（１９８６）前出）。それゆえ、ここ
での研究は比較が同じ実験条件下でなされた唯一のもの
である。

ここでの研究では、高いＮＡＡ濃度が正常胚の最高の収
率を与えた。しかし、２．４−Ｄの高濃度は正常胚の大
変低い収率を与えた。反対に、　Ｒａｎｃｈら（１９８
５）前出によれば、胚の正常性は高２．４−Ｄ濃度で増
加したことを示している。これら二つの研究は前者の所
見が主培養に基づいているのに対して後者の所見は２．
４−Ｄでの組織化生長のため″にあらかじめ選択された
第二の培養にもとづいているという点で異なる。アルフ
ァルファにおいて。

２．４−Ｄの低濃度で誘導された体性胚は正常形態およ
び種保存たん白プロフィールを有し、そして２．４−Ｄ
の高濃度で誘導される胚よりもより高い頻度で苗木へ変
換する（Ｄ、Ａ、　５ｔｕａｒｔ、　Ｊ、Ｎｅ１ｓｏｒ
＋。

Ｓ、Ｇ、　５ｔｒｉｃｋｌａｎｄおよびＪ、Ｗ、　Ｎ１
ｃｈｏｌ、　　”アルファルファ細胞培養における生長
過程に影響を及ぼす要因”　、　Ｒ，Ｒ，Ｈｅｎｋｅ、
　Ｋ、Ｗ、　Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｍ、Ｐ、　Ｃｏｎ５ｔａ
ｎｉｎおよびＡ」ｏｌｌａｅｎｄｅｒ　（Ｅｄｓ、）、
　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　１ｎＦｏｒｅｓｔｒ
ｙ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８５、　Ｐ、５９）。

２．４−ＤおよびＮＡＡの両方を含有する培地において
、２．４−Ｄは体性胚形態に優性効果を与えた（表２）
。ＮＡＡ　ト２．４−Ｄとの組み合わせは先に用いられ
（Ｗ、Ｄ、　Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆら（１９７７）前出
）そして異常でつの形状の胚が報告された。ここでの研
究では、　ＡＢＡは２．４−Ｄ誘導胚の形態を変更しく
表２）、それらの子葉を葉様とした。

（以下余白） ｃＸＪｊ　　　　　　　　・ 胴　　：　　　゛ ！２：パｌ立　　　の　　コノ　に・する六来 ＮＡＡ濃度の増加は胚形成効率を比較的少し増大させる
ので（表２）、継代培養頻度の効果（つまり、非減損培
地の供給）が試験された（表４）。

ＭｃＣａｌｌゲッタイブが試験された。そして胚全体が
実施例１で述べた手順に従って培養された。

培養は５または１０ｍｇ／ｊ２のＮＡＡを含有する培地
上で開始され５，１０または１５日の間隔で同じ組成の
新しい培地へ継代培養された。全培養期間は３０日であ
り、それゆえ培養物は標準インキュベーション期間を有
する対照培養物と共に５．２または１回移された。

ＮＩＯ培地では胚形成効率は処理の違いによる変化をほ
とんど示さなかった。他方、　Ｎ５培地では効率値は５
日と１０日の継代培養処理においてわずかに高かった。

Ｎ５培地では正常胚生成は全体を通して下がった。他方
、Ｎ１０培地では１５日の継代処理が最も正常な胚を生
成した。

試験されたこれら二つのＮＡＡ培地（Ｎ５およびＮ１０
）において、継代頻度は胚形成にほとんど効果を与えな
かった。そして効率のレベルは高ＮＡＡ濃度（２０〜３
０■／ｌ）のとき得られるレベルよりも相当低かった。

これらのデータは、オーキシンの減損は胚形成を制限す
る要因ではないということと。

しかし培地と外植体との間の象、激なオーキシン勾配が
望ましいということを示唆している。大豆子葉組織は高
核酸抵抗を有す（Ｒ，Ｍ、ＧｉｆｆｏｒｄおよびＪ、Ｈ
，Ｔｈｏｒｎｅ　（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　７７　：　８６３）。

それゆえ高い外部オーキシン濃度が外植体内で展開すべ
き“誘導的゛オーキシン濃度のために必要とされるのか
もしれない。

培養が１０■／１．　ＮＡＡを含有する培地上で行われ
た後の研究では、３０〜４５日ではなく約７日の暴露期
間が好ましかった。この暴露期間を約１週間に減少する
と生成する胚の数が約倍になった。そしてこれら胚はよ
り健全でありかつより高い呼吸速度をもっていた。

（以下余白） 、］町二ｍ二ｉユ３□：　　　　の　２　多　　に　　
　　る　　２４−ＤとＮへへＮＡＡ　（２０または３０
■／ｌ）の高濃度の最初の培地と、２．、ＩＤの５■／
ｌについて種々の時期での影響が、いわゆる標準培養液
（１０■／ｊ２　ＮＡＡ）に変えられる前に調べられた
。

隔離された子葉が前述した実施例１の方法に従って培養
された。その結果は表５に示されている。

そこにはＪ１０３とＭｃＣａ　１１が共に試験され、同
様な結果が得られている。Ｊ１０３だけからのデータが
与えられている。

ＮＡＡ培地での体性の胚形成の効率は、２．４−Ｄ培地
で３ないし５日前培養することによって増加したが、こ
の胚生成の増加は、２．４−ＤＩ日処理を除くと、正常
な胚の頻度中での減少を伴った。

２．４−Ｄの高生産性の特性と、異常な形態の誘導は容
易に分離できないことがわかる。

ＮＡＡ移転処理に対して、２．４−Ｄの中で胚形成の効
率は２．４−Ｄを１日から５日へ長く接触するにつれて
増加し、そして１０日で減少した。〔この実験において
、　Ｄ５３０日処理での胚形成の頻度は。

この培地上で隔離された子葉から慣例的に期待されてい
るものより低いが、平均杯数はまったく典型的なもので
あった。〕 Ｄ５の１日の処理で正常胚の頻度は最も高＜、Ｄ５１０
日の処理で最も低い。

正常な体性の胚形成に関して、２．４−ＤへのＮＡＡ単
独処理は、最も低い効率を与え、　Ｄ５３０日の処理も
同様な結果となった。

根“の生長は培養期間１０日よりも、２．４−Ｄが存在
する間では減少し、一方、２．１−Ｄの接触を長くする
と、カルスが正の矯正を示した。

２番目の″移転°°実験では、培養はＮＩＯ，Ｎ２０゜
またはＮ３０培地について開始され、そしてそこで５、
１０．１５日後の新しいＮｏ培地に移されるか、または
３０日の培養期間を通して元の培地の上に放置された。

胚形成頻度はすべての処理中類似していたが。

Ｎ２０とＮ３０培地上での培養は、Ｎ１０培地（平均３
．６２．３．０５〜４．１２の範囲）よりも常により高
い千均胚数値（Ｎ２０では平均４．０７．３．８３〜４
，２７範囲。

Ｎ３０では平均４．７７、範囲４，４８〜５．００）を
与えた。

そしてＮ３０の３０日間処理は最も正常な胚を誘導した
（４０．５％）。移転の前の保温培養時間は胚形成頻度
に関し決まった効果は得られなかった。Ｎ＾＾の３レベ
ル濃度差は表３に概説されている実験においてよりも、
より目立っていた。しかしながら。

正常胚生長の最も高い頻度は、Ｎ３０培地で再び起こっ
た。根とカルスの生長ともＮＡＡレベルを上げることに
よって刺激されたのである。

（以下余白） 実流■↓：　　　の・タ　に　する２のサイズの≦豊 実施例１の手法を用いて、培養中の応答における胚サイ
ズの影響が二つの実験で検討された。まず、最初に１．
５〜８．５胴までの範囲の長さの種子から得た胚が比較
された。２．４から４．０ｍｍ長さの間の種子から得た
胚は、最も敏感であることがわかり、そしてこのサイズ
の範囲のものがさらに研究された。この実験では４つの
クラスの胚、すなわち２．５．３．０．３．５および４
．０ｍｍ（未成熟の種子の長さは０　、５　ｍｍに近づ
けている）のものが表１の最初の１２培地上で培養され
た。

１７の遺伝子型が用いられ、各胚のサイズのランクに対
するｎ値は２４０以上である。結果が表６に示されてい
る。

胚のサイズは、胚形成に関して重要な影響を与えた。１
．５〜８．５ｍｍまでの長さの種子から得た胚は敏感で
あり、２．５と４．０　ｍｍ長さ間の種からのものは、
最も増殖的である。この範囲で、４．０±０．５胴長の
種子の胚は最も高い胚形成頻度と平均杯数値を有してい
た。一般に小さい胚（２，Ｏｍｍ長以下の種子）は、軟
質でゼリー状のカルスを作る傾向にあるが、大きい胚（
種子長が６．０ｍｍ以上）は。

しばしば応答せず、またはオーキシンの低レベルの存在
で発芽する傾向にある。

他の研究でも同様な最適サイズ範囲について報告された
が（Ｂ、　Ｌｉｐｐｍａｎ、　　ら、　　（１９８４）
、　那臣ｐ−ＬＪ、Ｐ、　Ｒａｎｃｈ、　　ら、　　（
１９８５）、　５ｕｐｒａ、　Ｕ、Ｂ、　Ｂａｒｗａｌ
ｅ。

う、　（１９８６）　、　熟ｙ虹）遺伝子型と用いられ
た成長環境が異なるために、正しく比較することは不可
能である。

（以下余白） 尖施炎五：　生の不灸　に　する゛転子刑の影響体性の
胚形成に関する遺伝子型の影響は、１７成熟グループ、
００大豆培養変種植物と、遺伝子型Ｐ１４０８．２９４
Ａの１グループについて調べられた。

実施例１の手法がすべての胚を用いることについて準じ
られた。胚は表１の最初の１２の培地で培養され、その
すべての培地でプールされたデータは表７に記載されて
いる。Ｊ１０３についてのデータは。

ＭｃＣａ　１１のものと類似しているが、与えられてい
ない。

１７の大豆遺伝子型について比較され、　ＣＶＡｇａｔ
ｅの１つを除いて、胚形成培養を引き起こしている　　
′（Ａｇａ　ｔｅは、しかしながら後の実験で敏感であ
った）。

胚形成頻度と平均杯数については、遺伝子型の中でもか
なり変化があり、最も増殊性栽培変種植物である（Ｏｇ
ｅｍａｉｙ）は最も増殊性の少ないもの（Ａｃｍｅ）の
６倍以上の有効値を有していた。

体性の胚増殖におけるこの変化にかかわらず。

そのプロセスの全形態学は、そこには正常から異常体性
胚の割合に変化はあるとしても、すべての遺伝子型につ
いて一致しているように見えた。

これらの実験を通して、供給される植物は、できるだけ
同一条件に近づけるように保たれた。しかしながら、植
物の生成と培養の応答については季節的変化を注目すべ
きである。夏季での成長で植物は最も増殖的になり、そ
れらの胚は培養によってさらに敏感に現れた。（この影
響はまだ決定的に試されたわけだではないが）。夏季と
冬季間のより重要な環境の変化は光線の量と質である。

異なった大豆遺伝型から得られた胚形成頻度に変化はあ
るが、試験されたすべての系統のデータはいくつかの胚
形成レベルを与えており、そのプロセスは遺伝子型に特
異なものでないことを示している。この結論は（Ｂ、Ｌ
ｉｐｐｍａｎ、ら、　　（１９８４）、’」狙卯１．　
Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｈ＋ら、　　（１９８５）’、　ｕ肛
虹Ｕ、Ｂ。

Ｂａｒｗａｌｅ、ら、　　（１９８６）、影」二〇−に
報告された。遺伝子型の影響についての他の研究は既に
報告されているが、これは胚形成について最適以下条件
で用いたことによる結果である（Ｗ、Ｄ、　Ｂｅｖｅｒ
ｓｄｏｒｆ、ら。

（１９７７）、　ト阻り扉Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ、ら
、　　（１９８６）、　５ｕｐｒａ）再生に関し無視で
きる遺伝子型効果は、大豆の改良におけるシステムの適
用に対する多数のインプリケーションを持ち、　　（Ｄ
、Ｆ、　Ｈ４１ｄｅｂｒａｎｄ、　　ら、　（１９８５
）、　５ｕｐｒａ）その再生中で実験記録は大豆育種系
の選良に直接通用されるべきである。

（以下余白） １狗±■：　　　の不多”に　する声”八と究素ヒ実施
例１の一般的な手法を用いて、３つの培地塩の組成と３
つの窒素源の影響が１０遺伝子型培養で試験された。

Ｂ５（０，Ｌ、　Ｇａｍｂｏｒｇ＋　ら、　（１９６８
）　、　ｕ肛虹）とＢ２（Ｇ、Ｃ，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　
ａｎｃｌ　Ｇ、Ｂ、　Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｃｒｏｐ　Ｓ
ｃｉ、。

１９　（１９７９）　５９）は、標準ＭＳ塩と比較され
た。硝酸アンモニウムの添加（１，６５ｇ／　ｊ２　）
またはグルタミンとメチオニン（８，５ｇ／４２と１．
５ｇ＃２）が、　Ｂ５塩で試験され、そしてカゼイン加
水分解（Ｄｉｒｃ。

ｅｎｚｙｍｉｃ　ｄｉｇｅｓＬ　Ｏ，５ｇ＃２　）がＭ
Ｓ塩中で試された。

結果は表８に示されている。

２番目の実験では、窒素化合物の添加効果の調査が、つ
まりアミノ酸とポリアミンの割合が、　ＭｃＣａｌｌと
Ｊ１０３遺伝子型の両方を用いて比較された。結果は両
遺転子型とも類似しており、　ＭｃＣａｌｌからのデー
タだけが与えられている。結果は表９に示されている。

グルタミン、メチオニン、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）
とアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）は、すべてそれぞれ
２０ｍＭ添加された。グルタミンとメチオニンはそれぞ
れ１０ｍＭづつ混合して、プトレシン（ｓｐｅｒｍｉｎ
ｅ）　、スペミジン（ｓｐｅｍｉｄｉｎｅ）そしてプト
レシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）は単独で１ｍＭ供給さ
れ、そしてカゼイン加水分解物は０．５ｇ＃！添加され
た。カゼイン加水分解物を除いてすべての化合物がフィ
ルター殺菌消毒液として冷却培地へ加えらえた。

ＭＳ、　Ｂ２とＢ５塩が比較される時（表８）、胚形成
頻度は最後の化合物が著しく低かった。余分にＢ５を添
加することは、　ＮＨ４ＮＯ３の形態で、またはグルタ
ミンとかメチオニンの形で窒素を減少させ、最も有効な
アミノ窒素の供給で胚形成頻度をＭｓ、　　Ｂ２培地の
ものと比較できるレベルにまで引き上げた。カゼイン加
水分解物としてのアミノ窒素をＭＳ塩に添加することは
、平均歴数を増加させ。

添加されない場合に比べて胚形成頻度を上げた。

窒素化合物の添加効果は２表９に示す実験で、さらに試
験された。この試験で、　ＮＩＯ培地（ＭＳ塩。

１０ｍｇ／　ｌ　ＮＡＡ）の中に２０＋ｎＭで添加され
る時、４つのアミノ酸とカゼイン加水分解物（０，５ｇ
／　１．　）は。

すべて胚形成を変化させ得る程度に抑制した。同様な結
果がポリアミン（１ｍＭ）を含む培地で観察された。

正常な胚の頻度は、添加培地でも低下した。添加培地で
は、胚形成の応答における変化は強調されているように
見えた。そして、ポリアミン　スペルミジン（ｓｐｅｒ
ｍｉｄｉｎｅ）とプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）
の２つの特殊な添加によって、極端に多産培養となり、
正常胚の結実数が（５〜１５）時々増殖した。

いくつかの化合物、特にプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）　
。

グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）　とカゼイン加水分
解物の添加効果はクロロフィルレベルを上げることと。

黒く着色された化合物−それは培地にあるフェノールで
あるが−を濾過させることである。最後の結果はＰＩ　
４０８．２９４Ａで最も述べられている。

大豆の体性胚形成における窒素減少の重要性は。

ＭＳ、　　Ｂ２とＢ５塩（表８）間の比較で実証された
。

２．０ｍＭのアンモニウムイオンを含むＢ５塩での胚形
成頻度は、それぞれ１２．５と２０．６ｍＭ　ＮＨ４＋
を含むＢ２とＭＳ塩でのものの１７２より少ない。

窒素添加が減少された無機（ＮＨ４ＮＯ３）または有機
（Ｇｉｎ、　＋Ｍｅｔ）は共に、Ｂ５不足の培地では胚
形成頻度を回復することができ、アミノ−窒素の添加は
より有効であった。窒素の減少は体性の胚形成を促進す
るという観察は以前に述べられている。

つまり未成熟の子葉は無視できる硝酸塩還元酵素活性を
持っており、活性は硝酸塩を含む培地で培養されること
によって誘導されるということである（Ｒ，Ｃ，Ａｃｋ
ｅｒｓｏｎ（１９８５）、　Ｃｒｐｏ　Ｓｅｔ、　２５
　：　６１５）。

大豆の体性胚形成に関する他の研究で、窒素の減少は概
してアンモニウム硝酸塩として添加されている（Ｗ、Ｄ
、　Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆ　ら、　　（１９７７）、　
那伊ｒａ　。

Ｂ、　Ｌｉｐｐｍａｎ、　　ら、　　（１９８４）、５
ｕｐｒａ、　Ｊ、Ｐ、　Ｒａｎｃｈ、　　ら。

（１９８５）＋　基１戸＝、　Ｂ、Ｊ、　Ｌｉ、ら、　
　（１９８５）、　ｕ肛虹。

Ｕ、Ｂ、　Ｂａｒｗａｌｅ＋　　ら、　　（１９８６）
、　那用戸−）　。しかし。

この明細書のデータは適当条件下で、オーキシンと窒素
の一定レベルで、完全な胚形成を促進するであろうこと
を示している。

表８に示す最初の実験で、カゼイン加水分解物（０，５
ｇ／　１　）をＭＳ培地へ添加することは、平均胚数を
大きく増加させるため胚形成頻度を８０％増加させる。

しかしながら、２番目の実験で、全ての添加物（アミノ
酸、ポリアミン、カゼイン加水分解物）は胚形成頻度を
抑制し、そして正常胚の頻度を減少した。

窒素を含む添加物のこれら抑制効果は特定のアンモニウ
ムイオンと、用いられた添加物の濃度によって生じる。

アルファルファの体性の胚形成に関し、アミノ酸とアン
モニウムの影響についての研究は、それらの相互作用が
複雑であると説明している（Ｄ、八、５ｔｕａｒｔ　ａ
ｎｄ　Ｓ、Ｇ、５ｔｒｉｃｋ　１ａｎｄ、　ＰｌａｔＳ
ｃｉ、Ｌｅｔｔｙ　３４（１９８４）１７５）、そして
刺激および抑制の効果がそれら両成分の濃度変化から生
じていることが示されている。ここで試験されたいくつ
かの窒素含有化合物は、培養の胚形成強さに影響した。

グルタミンとカゼイン加水分解物が深い緑の培地で生長
し、そしてスペルミジンとプトレシンが非常に多産の培
地で時々生産した。しかしながら、試験されたレヘルで
は２体性の胚形態学について補足しないことは重要な影
響を与えた。この発見はいくつかのアミノ化合物を体性
の胚生産。

形態学と品質に深く影響しているアルファルファの場合
と対比された。（Ｄ、Ａ、　５ｔｕａｒｔ　ｅｔ　ａｌ
、（１９８５）。

５ｕｐｒａ）　、そして、ニンジンでは体性の胚形成中
でポリアミン代謝を内包することを示唆している。

（八、Ａ、Ｆｉｅｎｂｅｒｇ、　　Ｊ、Ｈ，Ｃｈｏｉ、
　　Ｗ、Ｐ、　　Ｌｕｂｉｃｈ　　ａｎｄＡ、ＲｌＳｕ
ｎｇ、　ｐｌａｎｔａ、１６２（１９８４）５３２）。

（以下余白） ゛１°°ニ″′〜Ｃ’Ｊ−１ｃｍ３へ°゛１災旅■韮：
　生不灸　におけるシヨ声とグルコ−実施例１の一般的
方法を使用し１体性胚形成におよぼすショ糖濃度の影響
を２つの実験で研究した。まず最初に、Ｎ１０培地にお
けるショ糖とグルコースの濃度がそれぞれ１．５．３．
０．６．０および１２．０％で比較した。結果は表１０
に示す。

ＭｃＣａ　１１とＪ１０３との遺伝子型が試験され、同
様の結果を得た。Ｊ１０３のデータのみを示す。

２番目の実験では、３濃度のショ糖（２，５，５，０お
よび７．５％）が、　ＰＩ　４０８，２９４Ａを使用し
て、２゜Ａ−Ｄ濃度２．５．５．０または７．５　ｍｌ
／　ｌとの階乗の組み合わせで試験された。結果は表１
１に示す。

ＮＩＯ培地では、ショ糖濃度が１．５から１２％に増加
するにつれ２胚形成効率は著しく減少する。（表１０）
。培養に対する残りのパラメーター、つまり、正常な胚
の頻度１発根類度およびカルス形成頻度は、全て、９５
１１１度の増加に従い、同じように阻害されることが示
された。

培養組織は、低濃度ショ糖培地では、あまり稠密ではな
く２体性胚はより透明に見える傾向がある。ショ糖とグ
ルコースは同様の結果を与えるが。

例外として、グルコースは根とカルスの形成に対し、よ
り阻害的であった。

３つの２．４−Ｄ培地（Ｄ２．５．０５．０およびＤ７
．５）の各々において、胚形成頻度は、ショ糖濃度が２
．５から７．５％に増加するにつれ、減少した（表１１
）。

しかしながら、最適２．１−Ｄレベルが、ショ糖２．５
および５．０％で５．０ｍｇ／］から、シＥ１１！７．
５％で７．５１１＋ｇ／ｆｆｉへと変化する中で、ショ
糖とオーキシン濃度との間には相互作用がみられた。こ
の実験で、最大の胚生産は高２．１１−Ｄと低ショ糖で
起こるのであるが、これらの条件下では発生が続けられ
る代わりに、一部の胚は再カルス形成をした。

ＮＡＡと２．４−Ｄ培地での胚形成は両方とも、ショ糖
濃度が減少するにつれ、効果的に改善された（表１０お
よび表１１）。そして、培養の他のパラメーターは同様
に影響を受けた。炭素源としてのショ糖とグルコースと
の間には、高濃度のグルコ−ス（６および１２％）が同
じショ糖濃度よりも形態形成を阻害するということを除
いては、相違はなかった。例えば、ある与えられた重Ｍ
／容積グルコース濃度は同じショ糖濃度よりも高い浸透
圧をもたらす。阻害におけるこれらの違いは、おそら＜
″毒性”効果よりもむしろ、グルコース培地の高浸透圧
による結果であろう。ダイズの体性胚形成の研究の大部
分は、２％または３％ショ糖を含有する培地を使用した
ものである。（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆ。

ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　、　且肛虹、　Ｍ、Ｌ、
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ、ｅｔａｌ、（１９８３）＋
製肛し、　Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、　　（
１９８５）＋ｕ肛虹、　Ｂ、Ｊ、Ｌｉ、　ｅｔ　ａＬ　
（１９８５）＋　並■虹、　Ｕ、Ｂ。

Ｂａｒｗａｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、用肛し
）　ｏ　しかし、ある研究では（Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎ、
　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、前出）非常に低濃度の２
．４−Ｄとともに種々の濃度のショ糖とグルコースが試
験された。ショ糖はクルコースよりも限界的に優れてい
ることがわかり、１ｍｇ／ｌ２．４−Ｄを含む培地にお
いては、いずれかの糖の最適濃度は０．５％であった。

最近の研究は、インビトロで成育する未成熟なダイズ種
子にとって０Ｇ の炭素源として、グルコースがショ糖よりも優れている
ことを示唆している（Ｒ，Ｃ，Ａｃｋｅｒｓｏｎ、　Ｃ
ｒｏｐＳｃｉ、、２５（１９８５）　６１５）。未熟な
子葉の培養についての以前の研究が、ショ糖のほうが優
れていると示唆していたにもかかわらずである（Ｊ、Ｆ
、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ。

Ｊ、Ｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ａ−Ｍ、Ｅ、Ｍ
ｕｅｕｓｔｅｒ、、Ａｎｎ、　　Ｂｏｔ、ｌ　４１（１
９７７）２９）。ここでの研究においては、ショ糖とオ
ーキシンとの間の相互作用が観察され、その中で、ショ
糖濃度が２．５％または５％から７．５％に増加するに
つれ、２．４−Ｄの最適濃度が５．０ｍｇ／ｌから７．
５ｍｇ／ｊ２へと増加した（表１１）。この相互作用は
、　Ｌｉｐｐｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、前
出により得られた最適２．４−Ｄ濃度（０，５−１，０
ｍｇ／　Ｉ！　）と、ここで前述した実施例、すなわち
ここでの実施例１およびその他の研究（Ｊ、Ｐ、Ｒａｎ
ｃｈ、　ｅｔ　ａｌ＋　　（１９８５）＋前出）で得ら
れた最適濃度（５，０−１０，Ｏｆｆ１ｇ／　ｍｆｌ　
）との間の明らかな不一致を説明するだろう。前者の研
究は１％ショ糖を含む培地を使用しており、一方、後者
の研究は３％ショ糖を含む培地を使用していた。

前埋 １差■■：　　ネタ　におけるＨの≦１培養反応におけ
る培地ｐｌ（の影響を測定するために、実施例１の一般
的方法に従い、一連の５種類のＮＩＯ培地が調製された
。培養前（オートクレーブ後）のｐＨ値は、それぞれ５
．０．５．５．６．０．６．５および７．０であった（
予備試験は２次のことを示した。つまり、オートクレー
ブ前のｐｕｓ、５および７．０の間のｐＨ値では、オー
トクレーブ後も同じｐＨ値が生じる；使用された培地は
、所望の値の十〇、１ｐＨ単位内であったということが
試料で確認された）。

上述のような５種類の培地に加えて、３つの緩衝培地も
また試験された。これらの培地はそれぞれ１０ｍＭ　Ｍ
ＢＳ　（２（Ｎ−モルホリノ）エタン硫酸）を含み。

オートクレーブ前に、それぞれｐＨ５，０，５，５およ
び６．０に調整された（それらのｐＨ値はオートクレー
ブ後も変化なかった）。結果は表１２に述べる。

初期（培養前）のＮＩＯ培地のｐＨをｐＨ５，０とｐＨ
７，０との間に変化させても、胚形成効率又は発根頻度
に一貫した影響はなかった。対照的に、正常な胚の産生
とカルス形成は培地のｐＨにより著しく影響を受けた。

両方のパラメーターは最適ｐＨが５．０あるいは５．５
であり、より高いｐＨ値でパラメーターが低下する。緩
衝培地では、胚形成効率に対する最適ｐＨは、　（ｙ、
　ＭｃＣａｌｌでは６．０そしてｃｖ、Ｊ１０３では５
．５であった。ところが一方、　ｐＨ５，０は、すべて
の成長と発生のパラメーターに対して阻害的であった。

ｃｖ、　ＭｃＣａｌｌにおいては、正常な胚の頻度は、
明らかにｐｉ１５．５に緩衝作用させた培地で最大であ
った。ところが、　ｃｖ、　Ｊ１０３においては、正常
な胚の頻度はｐＨ５，５およびｐＨ５，０で同じであっ
た。

後者の値が、産生されたちの全部で３つのうちから１つ
の正常な胚を表すのではないかと思われたにもかかわら
ずである。緩衝作用させていないすべての培地において
は、最終（培養後の）ｐＨは６．７±０．７であった。

ところが、緩衝作用させた培地では、最終ｐＨは初期値
の０．０５単位以内であった。

その他のダイズの体性胚形成の研究は、オートクレーブ
前のｐＨ値がｐＨ５，８と６．０の間にあるような緩衝
作用させていない培地を用いており、それはオートクレ
ーブ後に５．４−５．６のｐＨ値となった（Ｗ、Ｄ、Ｂ
ｅｖｅｒｓｄｏｒｆ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　
、前出、　Ｍ、Ｌ。

Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８３
）、前出、　Ｂ、Ｌｉｐｐｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、前出、　Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃ
ｈ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）。

前出、　Ｂ、Ｊ、Ｌｉ、　ｅｔ　ａＬ（１９８５）、前
出、　１１．Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ。

ｅｔ　ａｌ、　　（１９８６）、前出）　、　ｐＨ６，
０は、単離された子葉培養における乾燥重量とタンパク
質の蓄積にとって最適であるということが、以前に発見
された（Ｊ、’Ｆ、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｊ、Ｔ、＋
　ｅｔ　ａｌ＋　（１９７７）＋　且肛虹）。

ここにおける研究では、最終ｐＨは、異なったｐＨ値か
らはじめた培地においてと生産的および非生産的培養に
おいてとで、同じ値であった。ムラサキウマゴヤシ（ａ
ｌｆａｌｆａ）では１体性胚形成は高い細胞内ｐＨと関
連していたが（Ｊ、５ｃｈａｅｆｅｒ　（１９８５）Ｐ
ｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７９（１９８５）５８４
）　、しがし、外部のｐ）ｌの影響、又は、培地のｐＨ
変化についてのデータは示されていなかった。

（以下余白） 災施孤豆：　　　１タ　における　　　　゛のＬイの影
響 胚軸の影響と胚形成における種々のレベルの組織損傷の
影響を研究するために、胚はＮＩＯ培地で培養する前に
異なった切開処理をうけた。実施例１の一般的方法は、
別な方法でひき継がれた。最初の実験では、４つの処理
が比較された；１、胚全体 ２、損傷を受けた子葉−胚の長軸に平行して。

両方の子葉を通過して末端からの子葉の長さの３分の１
のところまで伸ばした。２つの切れ目を入れた。

３、軸の除去−胚の長袖に垂直に、子葉の末端から下へ
４分の３のところに両方の子葉を通して。

１つの切れ目を入れることにより、胚軸を除去した（単
離された子葉のみを培養した）。

４、胚の２分割−胚の長袖に垂直に、子葉の下から半分
のところに２両方の子葉を通して１つの切れ目を入れ、
胚を２分割した（単離された半分の子葉と胚−軸部分の
両方を培養した）。結果は表１３に述べる。２番目の切
開の実験では、３つのレベルの組織損傷、つまり、全体
、半分あるいは４分の１に単離した子葉を比較した。結
果は表１４に述べる。ＭｃＣａ　Ｉ　ＩおよびＪ１０３
の遺伝子型の両方が。

２番目の実験に使用された。結果が同様であったので、
　Ｊ１０３のデータのみを示した。１番目と２番目の実
験データの両方とも、　“′１つの胚あたり′”を基本
として表した。

２つの実験で、Ｎ１０培地を用いた切開の影響を試験し
た。１番目の実験（表１３）では、胚形成の効率は肝移
植の切開（損傷）により増加したことが示された。そし
て、効率の両方の構成パラメーターが影響をうけること
を示した。胚軸の除去は。

胚形成効率をさらに増加させることが明らかとなった（
“′子葉損傷°”対“軸の除去“処理）。パ胚の２分割
”処理では２体性胚は単離された子葉部分と胚軸に付け
られた子葉の端との両方で形成された。２番目の切開実
験では、単離された子葉“全体°”が半分または４分の
１に分割された子葉と比較された（表１４）。胚形成頻
度は２組織の損傷の度合が増加するにつれ増加した。し
かし、胚の平均数は半分にした子葉で最大であったので
、胚形成効率は“′半分にした子葉″′処理と４分の１
にした子葉”処理とで非常に似ていた。発根とカルス形
成の頻度は９組織の損傷が増加するにつれ。

増加した。２つの切開実験の間の重要な不一致は。

以下であった。つまり、１番目においては、最も高い正
常な胚の頻度は最少の組織損傷で見られる（゛′胚全体
゛処理）。ところが、２番目においては、正常な胚の頻
度は最も組織損傷を伴うもの（“４分の１にした子葉″
処理）で最も高かった。

肝組織に対する損傷あるいは切開処理は、Ｎ１０培地に
おける胚形成効率を明らかに増加させた。

両方の処理においては、同じレベルの組織損傷は保証さ
れてはいないのではあるが２表１３の゛損傷をうけた子
葉゛と軸を除去゛処理との胚形成における増加では、胚
軸は子葉組織からの胚形成を抑圧し得ることを意味して
いる。最初の実験における観察で、正常な胚の頻度は゛
′胚全全体培養で最も高かった（表１３）。一方、２番
目の実験では。

正常な胚の頻度は組織損傷のレベルとともに増加しく表
１４）、説明するのが困難である。これは。

実験間で別の品種が使われているので、遺伝子型−特異
性反応であり得る。しかし、この疑問にはさらなる研究
を要する。刺激された胚形成２発根およびカルス形成に
おける切開の影響は、高濃度のオーキシンの影響と似て
いる。それは、子葉組織のオーキシンに対する感受性に
ついての創傷の影響を示唆している。このような過程の
、可能性ある媒介物はエチレンである。ダイズの体性胚
形成の研究の多くは、単一の外植体型と切開技術を使用
していた（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆ、　ｅｔ　ａ
ｌ、（１９７７）、前出、　Ｍ、Ｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａ
ｎｓｏｎ＋　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、前出、Ｂ。

Ｌｉｐｐｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ＋　（１９８４）＋前出
、　Ｂ、Ｊ、Ｌｉ、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）　、前出、　Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ、　
ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、前出）。

ある研究は、胚全体と単離した子葉の両方からの胚形成
を報告している（Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｔ＋＋　ｅｔ　ａｌ
、（（１９８５）、　ｕ肛娃。しかし、比較データは示
されていなかった。

実差七田トｕ渡ｐ引≦＋′およびネタ　における組成 胚形成における光強度および組成の影響を調べるために
、培養物に１６時間にわたり、高強度の光（約８０マイ
クロＥｍ−”　ｓ−’）または低強度の光（１０マイク
ロＥｍ−２ｓ−’）をＧｒｏｌｕｘ　（シルバニア社製
）または非発熱製白色螢光ランプから照射した。引き続
き暗黒下での５番目の処理もまた包含される。

それ以外は、実施例１の方法が用いられた。その結果を
表１５に示す。

光強度および組成の比較において、胚形成の効率は、い
ずれの光のタイプにおいても低光強度のほうが高かった
。さらに、高強度の光処理を行って得られる胚は、しば
しば脱色されており発達障害を示す。高および低光レベ
ルのいずれにおいても、　Ｇｒｏｌｕｘライトを用いる
と非発熱性白色螢光ライトを用いた場合よりも胚形成の
効率が高い。胚形成は暗黒下でも起こるが、光照射下よ
りも低効率である。胚形成に比較して、根およびカルス
の生成は高強度の光レベルで促進される。

光強度および組成は、ホルモンまたは糖濃度のような因
子に比べて影響が少ない（上記を参照されたい）。Ｇｒ
ｏｌｕｘおよび非発熱性白色光においては、低光強度が
、高光強度よりも好ましい。他方。

どの光レベルにおいてもＧｒｏｌｕｘ光が白色光よりも
好適であった。Ｇｒｏｌｕｘランプは、非発熱性白色光
に比べ、青色（４３０〜４９０ｎｍ）および赤色（６３
０〜６８０ｎｍ）波帯において高発光を有する（Ｖ、Ａ
、Ｈｅ１ｓｏｎ、Ｃａｎ、　Ｊ。

ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、　４５（１９６５）４６１）。

そして、従来の研究において、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの
形態生成に優れていることが明らかにされた（Ｇ、　Ｓ
ｃｈｌｅｇｅｌ　ａｎｄ　Ｒ，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＭａ
ｅｓｓｅｎ、　　Ｇａｒｔｅｎｂａｕｗｉｓｓｅｎｓｃ
ｈａｆｔ　も、　　４６　　（１９８１）１０６）。ダ
イズ接合体胚の培養においては、生育は暗黒下に限定さ
れ、それに続く種子の発芽の割合は減少する（Ｒ，Ｃ，
八ｃｋｅｒｓｏｎ、Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　２５（１９８
５）６１５、　Ｒ，Ｌ、０ｂｅｎｄｏｒｆ、　Ｅ、Ｅ、
Ｔｉｍｐｏ、　Ｍ、Ｃ，Ｂｙｒｎｅ。

Ｔ、Ｖ、Ｔｏａｉ、　Ｇ、Ｔ、Ｒｙｔｋｏ、　Ｆ、Ｃ，
ＨｓｕおよびＢ’、Ｇ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ａｎｎ、　Ｂｏｔ、、　５３（１９８４）８５３）。

（以下余白） １９１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　−ｍ−１１１：ハ育　　への　　不の　小 植物体への生長を促進するために、実施例１の方法によ
り形成された体性胚を、　２．５ｍｍ長になったとき、
親培養物から分離し、二次培養培地に移した（Ｐ、Ａ、
Ｌａｚｚｅｒｉ、ら、　　（１９８５Ｌ　前出）。胚の
発育および“′発芽°′を支える能力について、多数の
培地を試験した。予備試験では、低ホルモンレベルが望
ましいことが示された。そこで、以下の一連の培地（こ
れは、　ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロースおよび
ＮＡＡ　（Ｎ）と３種のサイトキニンＢＡ（Ｂ）との組
み合わせ、カイネチン（Ｋ）およびゼアチン（Ｚ）を含
有する）を比較した。　Ｎ　Ｏ，１，ＢＫＺ　Ｏ，００
１；Ｎ　Ｏ，１，ＢＫＺ　ｏ、ｏｌ；　Ｎ　Ｏ，００１
，ＢＫＺ　Ｏ，０１，Ｎ　Ｏ，０１，ＢＫＺＯ，１；　
Ｎ　Ｏ，００１，ＢＫＺ　Ｏ，１ａｎｄ　Ｎ　Ｏ，１，
ＢＫＺ　Ｏ，０１，ＧＡ３０．１（これはｍｇ／ｌでの
全ホルモン濃度である。各ＢＫＺレベルでは２個々のサ
イカイキニンは、それぞれ。

全サイトカイニン濃度の１７３であった）。この一連の
培地は、オーキシン：サイトカイニンの比が１００　：
　１　と１：１００との間であった。

土壌に移すのに適当な根を付けた小植物体を生産するた
めに、“発芽した胚（これは、−成葉の外植を有する）
を、マゼンタ（Ｍａｇｅｎｔａ　Ｃｏｒｐ、＋シカゴ）
ボックス（Ｐ、Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉ＋ら、　　（１９８
５）。

前出）に移した。強力な植物生長を促進する能力につい
て、多くの培地を試験した。試験された突然変異体には
、以下の異なる塩組成物を含有させた；ＳＧＬ　（Ｇ、
Ｂ、　Ｇｏｌｌｉｎｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｃ，Ｐｈ１ｌｌｉ
ｐｓ、　）リホリウム　プラテンセ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕ
ｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ）での組織培養および植物再生、
　Ｅ、Ｄ、　Ｅａｒｌｅ　ａｎｄ　Ｙ。

Ｄｅｍａｒｌｙ　（Ｅｄｓ、　）　、組織培養から再生
された植物における変異性、　Ｐｒａｅｇｅｒ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２＋　ｐ。

２６）＋　ＭＳ　（Ｔ、　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ
　Ｆ、　Ｓｋｏｏｇ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｐｌａｎｔ、　１５　（１９６２）　４７３）および１
／２　ＭＳ　（Ｐ、八、　Ｌａｚｚｅｒｉ。

ら、　　（１９８５）、前出）、Ｂ５および１／２　Ｂ
５　（０，Ｌ。

Ｇａｍｂｏｒｇ、ら（１９６８）　、前出）　、　Ｗｈ
ｉｔｅｓ’　　（改変された）　　（Ｐ、Ａ、　Ｌａｚ
ｚｅｒｉ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍ、　ＤｕｎｉｌＩｅｌｌ、八
ｎｎ。

Ｂｏｔ、、　５４（１９８４）　３５１Ｌ　）ＩＰＮ　
（水耕性の栄養培地。

０．２５ｍｇ／　４２　Ｎ１５Ｏｎ・６ＨｚＯを含む塩
（Ｄ、Ｌ、Ｅｓｋｅｗ、　Ｒ。

Ｍ、　Ｗｅｌｃｈ　ａｎｄ　Ｅ、Ａ、　Ｃａｒｙ＋　（
１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２２　：６２１）　
）　、、窒素源補足物；カゼイン加水分解物（酵素分解
、　　０．５ｇ＃！、　ＫＮＯ３（１，０ｇ＃り　、　
ＮＨ４Ｎ０３（０，５ｇ／ｊ２）、ゲル化剤；　Ｐｈｙ
ｔｏａｇａｒ　（Ｇｉｂｃｏ）　（６，０ｇ　／　ｊ２
　）　、　Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（６，５
ｇ　／　Ｉ！、）　、　Ｇｅ１ｒｉｔｅ（Ｋｅｌｃｏ）
　（２，０ｇ　／　Ｉ！、）　、生長制御剤；　ＩＢＡ
（０，０５ｍｇ／ｌ）、カイネチン（０，０５ｍｇ／　
１２　）　、クマリン（５ｍｇ／ｊ２）；水供給源（Ｍ
ｉｌｌｉＱで濾過された水、水道水、市販の温泉水（ハ
イブリッジ温泉））、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ　１．Ｏ
ｇ　／　Ｉ！、）　、　Ｋａｏビタミン（ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ）　　（Ｋ、Ｎ、Ｋａｏ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔ、、　１５０　（１９７７）　２２５）、、
　フルクトース（２％）、活性炭（１％）、および緩衝
液（１０ｍＭ　ＭＥＳ）。

（以下余白） 体細胞胚の「発芽」速度は、試験した６種のＮＡＡ／Ｂ
ＫＺ培地において、オーキシン：サイトカイニン供給を
変化させることにより、はとんど影響を受けなかった。

より重要な因子は２体細胞胚の本質的な、「成熟」であ
った。目視でき、明りょうな頂端を持つ胚は、６種のど
の培地においても迅速に「発芽した」が、明りょうな茎
頂を欠く胚は。

「発芽する」前に２０〜６０日の時間的なずれを一般に
示した。培養物の一般的な「健康」の評価より。

０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ、　０．１　ｗ／Ｉ！　ＢＫＺ
を含む培地（Ｐ、Ａ。

Ｌａｚｚｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８５）前出
）が、常套な用途に適していた。

第−葉の発生を伴って、「発芽した」胚は、マゼンタ筒
中の低塩培地に移した時、容易に根を出し、トリフロリ
エートを生産し、正常な大きさに生長したが、より古い
葉は、しばしば葉脈間の白化を示し、ある場合では、未
成熟葉の老化を示した。この白化は、土壌への効果的な
輸送を妨げなかった。（白化／老化応答は２体細胞胚由
来の小植物体だけに制限されることなく、実生において
も見られた。）多種の培地を小植物体の質を改良するた
めに調べた。

小植物体の生長に影響を与える因子は、塩組成。

水供給源、ゲル化剤および酵母抽出物であった。

１１ＰＮ塩および０．２５ｇ／　ｊ２酵母抽出物（水道
水に溶解させ、オートクレーブにかける前にｐＨ５，９
に調節し、　０．６５ｇ／　Ｉｔ　Ｄｉｆｃｏバタトア
ガーでゲル化する）を含む培地が、良い生長を与えた。

根を容易に出さないという遺伝子型のため、このＨＰＮ
培地には。

５　ｍｇ　／　１クマリンまたは０．００５ｍｇ／　Ｅ
　ＩＢＡを加えた。

体細胞胚の「発芽」の頻度および速度は、胚の「正常さ
」と密接に関連していた。異常な胚は。

「発芽」速度が低く、外殖が伸び出る前の時間的なずれ
がより長かった。同様の関係は、アルファルファにおい
て報告されている（Ｄ、Ａ、５ｔｕａｒｔ＋　ｅｔａｌ
、　　（１９８４）　、前出）。アルファルファ、およ
び他の大豆の研究（Ｊ、Ｐ、Ｒａｎｃｈ、　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８５）　。

前出）における状況とは対照的に、最近の研究では、誘
導培地へのアミノ酸の添加、および発芽培地でのホルモ
ン操作のいずれも、胚発芽に対して一貫した効果を有し
なかった。

再生した小植物体における葉の白化、および未成熟葉の
老化は、インビトロの条件に特有であった。白化した葉
が、土壌へ移した小植物体において、再び緑化すること
が認められると、培養物における毒性や欠乏が暗示され
た。インビトロでの組織の生長のために開発された塩組
成物のがわりに、水栽培用に開発された塩組成物に基づ
いた。

（Ｄ、Ｌ、Ｅｓｋｅｗ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）
前出）修正１１ＰＮ培地を用いると、植物の健康が著し
く改善された。満足な大豆小植物体のインビトロでの生
長の難しさに関しては、他では、はとんど考察されてい
ない（Ｚ、Ｙａｎｇ、　Ｚ、　Ｃｈａｎ、　Ｚ、　Ｌｉ
ｖ、およびＺ、八ｈａｎｇ＋Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅ、　１６（１９８４）１０１２）。しか
し。

再生体の発根およびその土壌中での確立の問題に関する
報告（Ｂ、　Ｌｉｐｐｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８
４）、前出。

Ｕ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅ＋ｅｔ　ａｌ、　（１９８６Ｌ
前出Ｍ、Ｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、前出）は、小植物体の生長
状件は。

しばしば１次善なものであることを示唆している。

剣１健：ハ盲　の盲　全　への　生 発育した一成葉を持つ実施例１１の小植物体を。

０．００５　ｒｎｇ／１．　ＩＢＡを加えた１／２　Ｍ
Ｓ　２ｓ培地（ＸＩ／２ＭＳマクロ塩、×１ミクロ塩、
　Ｂ５ビタミン、２％シヨ糖、　０．６５％フィトアガ
ー）に移し、マジェンタ箱に分配した。

箱をプロルックスまたは、非発熱性の白螢光ランプから
の５０−１００マイクロＥｍ−２ｓ−’（５００〜１０
００ルクス）の光中に１６時間おいた。

よく発達した根糸を持った小植物体が観察されたとき、
滅菌された（オートクレーブにかけるがまたは、マイク
ロ波で処理される）鉢混合物（２：２：１土壌：プロミ
ックス：砂混合物）を含む鉢に移した。毎週、ペーター
ズ２０　：　２０　：　２０完全肥料を与えた。硬化期
の水分蒸発を減少させるため。

植物をおおった。ダニの侵入やコナジラミは、当該技術
分野で公知の方法で制御した。Ｐ、Ａルミ２Ｚｅｒ　１
　＋ｅｔ　ａｌ、（１９８５）前出を参照せよ。

種を持つ植物体全体を再生した。

実施仔１１１３：　　　包不多　に・する氏、・ノ　ヒ
勿　氏先の実施例では、２．．１１−Ｄの最適濃度は５
ｍｇ／！と１０ｍｇ／／２との間、　　ＮＡＡの最適濃
度は、少なくとも３０＋＋＋ｇ／ｆｆｉであると示した
。しかし、オーキシン濃度を減少させたときの効果を、
　ＩＩ！濃度を変化させて試験した。他は、実施例１の
方法に従った。

結果は１表１６に記した。

全ての体細胞胚形成の効率は、１％または２％ショ糖で
最適であると示される。正常な胚の頻度は、最も低いシ
ョ糖濃度（０，５％）が最適である。

正常な胚生産の効率（正常胚の頻度×平均の正常な胚の
数）は、１％ショ糖で最適である。このショ糖濃度は２
体細胞胚上に形成される子葉の数にも影響を与える。最
も正常な双子葉植物の胚は。

それぞれのオーキシン濃度で、０．５％ショ糖により作
られた。各オーキシン濃度において（６，２５゜１２．
５．２５または５０＋ｎｇ／　Ｉ！、　）　、正常な（
双子葉植物の）胚は、シラ１１！濃度が上昇すると減少
する。低ショ糖濃度の使用により、高いレベルの効率お
よび胚の正常さが、比較的低いオーキシン濃度（６，２
５■／ｆｉ　　ＮＡＡ）で得られる。

表１６に示すように、　６．２５　ＮＷＡ、　２．０％
ショ糖培地での第二のインキュベート期間中の培養の生
産性は、第−培養培地中に低濃度ショ糖（０，５％）を
加えることにより、増加する。

また９表１６に示すように１体細胞胚の発芽（カラムの
頭の「％Ｐ、　ＬＶＳ　Ｊ≧５ｍｍ」（パーセント第−
葉≦５ｍｍ））は、１％または２％ショ糖で生産される
胚の間で、最高である。

（以下余白） 社　：ｌ−！：ＩＱ１ 裸　：　　　　　′ １　　；　　　　。

＋ｙ　　：　　　　　　。

実施例１４ニゲリシン　クーンデスチナの多　云換ベク
ターｐＨ５７５を有するアグロバクテリウムツメファシ
ェンスを調製した。このベクターの構築は、米国特許出
願第７８８，９８４号（１９８５年１０月２１日出願）
により充分に記述されており、その内容は、ここに開示
されている。このベクターは、カナマイシン耐性および
オクトピンシンターゼ遺伝子を持つ。バクテリアは、カ
ナマイシンを含むＹＥＰ培地（ＬＯ，Ｏｇ／（２酵母抽
出物、　１０．０ｇ／　ｊ２ペプトン。

５．０ｇ／ｆ　ＮａＣ１，１５ｇ／ｌ寒天、　ｐＨ７，
０）のプレート上、２８°Ｃで培養した。アグロバクテ
リウムのコロニーのいくつかをはぎとり、　　ＹＥＰブ
ロースまたは細胞最少培地に再懸濁した。約２５から５
０のコロニーを、　　１．５ｍｌの培地あたりに懸濁し
た。この懸濁コロニーを一晩増殖させた。

グリシン　クランデスチナ植物体を、温室で。

開花させるまで成長させた。植物体を、滅菌した土：プ
ロミックス：混合砂（２：２：１）中で直径２５ｃｍの
鉢あたり１から２植物体で成長させ、ピーターズ２０　
：　２０　：　２０完全植物肥料を毎週与えた。

短日間、自然光を、１３時間の人工（高圧ナトリウム）
光で補った。小節足動物の慢延を、ブリクトラン（ダウ
　ケミカル社の商品登録）或いはペンタツク（ゼオコン
社の商品登録）で制御した。コナジラミばオルテン（シ
ェブロン社の商品登録）で制御し、うどん粉病は、ベネ
レート（デュポンの商品登録）で制御した。

葉片を、植物体の未成熟な葉より取り、乾燥より組織を
保護するために冷水を入れた皿に移した。

外殖片を７０％イソプロパツールで１分間、−滴のリキ
ノックスを含むｌＯ％クロロックスで１０〜１５分間洗
浄および滅菌し、滅菌水で５分間２度洗浄した。

植物組織をサイトカイニンを含む再生培地に移植し、１
つのプレートあたり２０〜３０個の植物片を用いて、１
〜２日間ブレインキュベーションした。

ヱ久旦ム文元丈立ムの一晩懸濁培養物を、カナマイシン
を含むＹＥＰ培地に塗布し、単一コロニーを得た。単一
コロニーを選択し、カナマイシンを含むＹＩＥＰブロー
ス２５ｍ１に植菌するのに用いた。この培養物を、振盪
水浴中、２８°Ｃで、−晩生前させた。培養物を、遠心
分離し、　　ＹＥＰグロプロ或いは最少培地に再懸濁し
ている細胞を集めた。

ブレインキュベーション後１組織の各月に、約１０６の
生物体を含む再懸濁した一晩培養物を１　ｍｌあたり０
．５から１．０μρの割合で植菌した。予備実験では１
組織を培養溶液に浸漬すると、アグロバクテリウムが過
剰増殖し１組織を殺すことを。

示した。材料をアグロバクテリウムの存在下で２日間増
殖させ、それからメツオキシン（Ｍｅｆｏｘｉｎ）１成
あたり３００から４００μｇの濃度で含む再生培地に移
した。

２から７日後に、形質転換された組織を選抜するために
、１００〜３００μｇ／ｍｆｌのレベルのカナマイシン
とメツオキシンとを含む再生培地にこの材料を移した。

茎・葉が形成されるまで、隔週で、抗生物質を含む再生
培地上で継代培養した。茎・葉のある小植物体を２次に
発根培地に直接移した。発根した植物が再生した。

実施例１５ニゲリシン　マックスの多　云換ヘクターｐ
ｌ（４−１（ＮＲＲＬ寄託Ｎｏ、　Ｂ−１８００９で。

エシェリヒア　コリに８０２（ｐＨ４−１）として。

Ｕ、Ｓ、　　Ｄｅｐｔ、　　ｏｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅ、　　八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ＋　　ＭｉｄｌｌＩｅｓｔ　Ａｒ
ｅａ、　　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａ＋Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、１９８５年１０月１５日に
寄託されている）は、カナマイシン耐性マーカー遺伝子
とオクトピンシンターゼ遺伝子とを含む。このヘクター
を有するアグロバクテリウム　ツメファシェンスを、実
施例１４に述べたように培養した。

グリシン　マックス植物体を実施例１４で述べたように
成育させた。形質転換に用いた組織は、３〜５ｍｍの未
成熟の種子由来の未成熟の子葉であった。さやを植物体
より除去し、冷水中で貯蔵した。

次に、はこりや土を冷水下で洗い落としてその後におけ
るカビによる感染を避けるようにした。長さが約３〜５
ｍｍの種子を、さやを光に当てることにより前もって選
抜した。さやを、７０％イソプロパツールで１分間、２
５％クロックスおよび１滴のりキノックスで１０〜１５
分間滅菌し、それから５分間ずつ滅菌水で２度リンスし
た。未成熟の種子をさやから除き、胚軸を、茎頂領域よ
り離れた両方の子葉を切ることにより除去した。子葉が
現れるまで、圧力を胚の反対側にかけた。

子葉の組を、　　１００ｍｍのディツシュ（ディツシュ
あたり３０ｍ１の培地）あたり１０の比率で再生培地に
載せ、そして２日間ブレインキュベーションした。

用いた再生培地は以下のような胚形成培地である：　（
１）ＭＳ塩、　Ｂ５ビタミン、３％スクロース、５００
■／！グルタミン、　　１００ｍｇ／４２メチオニン、
　１０ｎ＋ｇ／１２　ＮＡＡ、　　０．６％フィトアガ
ー、　ｐＨ５，９（オートクレーブ前）；そして（２）
　Ｍ　Ｓ塩、　Ｂ５ビタミン、３％スクロース、　　５
００ｍｇ／乏グルタミン、　　１００ｍｇ／ｆｆメチオ
ニン、　１０ｍｇ／ｊ２２．　４−Ｄ、０．６％フィト
アガー ブレインキュベーションした組織に、０．５μｌの再懸
濁したアグロバクテリウムを接種した。−アグロバクテ
リウムをあまりにも多（加えないことが重要である。と
いうのはそれが組織を速く増殖させ、それを殺してしま
うからである。接種に用いた１３（三！危乙テ巳しグＪ
１懸濁液は１雌あたのおよそ１０６個の菌体を含んでい
た。子葉を２日間バクテリアの存在下で成育させ、それ
から、アゲロバクチリアを殺除するための抗生物質（２
００ｍｇ／ｍｌメファキシン或いはタラフォラン）と形
質転換された体性胚を選抜するための１００μｇ　／　
ｍｌカナマイシンを含む新たな胚形成培地に移した。

子葉を１体性胚が形成されるまで、抗生物質とカナマイ
シンとを含む胚形成培地に２８日毎に戻して継代培養し
た。

茎・葉の繁殖と用いた発根培地は実施例１４に述べられ
た。実施例１４およびＰ、Ｌａｚｚｅｒｉ　　ら、　　
（１９８５）。

前出、の手順に従い、ｐＨ４−１を含むアグロバクテリ
ウムで形質転換された再生植物体を得た。

この植物体を、実施例１２の鉢に入れである混合土に移
し１葉組織が検査の目的で採取できるようになるまで、
生育させた。組織は、５０及び１００μｇ／　ｍｌカナ
マイシン存在下で再カルス化アッセイを行うことにより
カナマイシン耐性を、そしてペーパー電気泳動によりオ
クトビン合成を、検査した。

組織はカナマイシン存在下で成長し、オクトピンの存在
については陽性であるようだった。

植物は成長を続け、正常のようであり、そして多くの種
子のさやを生じた。

１１６　：　　−タ　　　　　　の゛　　云　　　　゛
遺伝子型選抜を、胚形成能力及び種々のダイズの遺伝子
型のアグロバクテリウム　ッメファシエｌスＡ２８１株
で（またＥｌｌＡＩＯＩ株としても知られている）に対
する感受性を決定するために１行った。

これはＥ、１ｌｏｏｄら、　　（１９８６）’Ｊ、　Ｂ
ａｃｔ、　１６８：１２９１−１３０１に述べられてい
る。この株は請求すれば著者より入手可能である。この
選抜に用いた培地は、　Ｂ５ビタミン、１．５％スクロ
ース、　１０＋＋＋ｇ／滅ＮＡＡおよび０．２％ゲルラ
イトを含む正塩である。子葉を、長さが３から５ｍｍの
間の未成熟の胚より得、胚軸を除去した。子葉を、前軸
側が上になるように培地上に置いた。結果を表１７に示
す。“応答パーセントは、プレートされた子葉のうち体
性胚を与えた子葉の数をいう。“′応答基準”という縦
欄の見出し下のパ平均パは１体性胚を形成させることに
より応答した子葉により産出された体性胚の数のことで
ある。見出し“全体基準下の“平均゛′は。

プレートした子葉のあたりに形成した体性胚の数をいう
。“Ｎ　Ｉ＋は再生について評価した子葉の数をいう。

アグロバクテリウムの感受性は、瘤形成により決定した
。

いくつかの優れた再生遺伝子型が見出された。

これは、標準であるＪ１０３よりも有意に優れて再生さ
せる２種を含んでいた。これらの遺伝子型は。

”Ｍａｎｃｈｕ”と”Ｗｉｌｌｉａｍｓ”である。アグ
ロバクテリウムと共存培養後、瘤を産生ずる未熟な子葉
を持ついくつかの遺伝子型も同定した。最もよい遺伝子
型は、　”ＭｃＣａｌｌ”＋　Ｊ１０３．　Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ及び’Ｐｅｋｉｎｇ”であり、この順に優れてい
た。

（以下余白） １１７：　　　のネタ　９ｂの巨Ｊと−組織学的評価を
体細胞胚発生および発達、続くＮＡＡまたは２．４−Ｄ
の誘導に採用した。

品種Ｊ１０３の接合体胚をＮ１０．ＯＯ又は０２５．０
０またはＤｏ、５０（ＮＡＡ又は２．４−Ｄでｍｇ／ｊ
２）を含む培地（正塩、　Ｂ５ビタミン、１．５％スク
ロースおよび０．６５％寒天）で、Ｎ１０培地で培養し
た品種ＭｃＣａ　Ｉ　Ｉの接合体胚から培養し、リン酸
緩衝液、　ｐｉ（６，８中で３％グルタルアルデヒド、
またはＦＡＡ　（ホルムアルデヒド：酢酸：アルコール
）で１又は２目間隔で固定した（Ｍ、Ｅ、ＭｃＣｕｌｌ
ｅｙら　（１９８１）　”　Ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ
Ｐｌａｎｔ　　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　　Ｐｒ１ｎｃｉ
ｐｌｅｓ　　ａｎｄ　　５ｅｌｅｃｔｅｄ１４ｅｔｈｏ
ｄｓ″、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ
、　６．５８−６．９２）。

固定した胚をＴＢＡシリーズからパラフィン油によって
脱水し、そしてＴｉ５ｓｕｅ　Ｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ　
Ｃｏ、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ）に包埋した。切片を回転ミクロトームで８
〜１０μｍの厚みに切断した。スライドをヘマトキシリ
ン（Ｊ、Ｅ、　５ａｓｓ（１９５８）　Ｂｏｔａｎｉｃ
ａｌ　　旧ｃｒｏ−７、サフラニン、トルイジンブルー
（Ｍ、Ｅ。

ＭｃＣｕｌｌｅｙら（１９８１）前出）、ナイルレッド
、アニリンブルー（Ｊ、Ｅ、　Ｓａｓｓ（１９５ｇ）前
出）、ヨード（Ｗ　、　Ａ　、　Ｊｅｎｓｅｎ（１９６
２）助違則籾復１（ｉｓｔｏ＋洟明卦↓■）、過ヨード
酸・シッフ試薬（Ｊ、Ｅ、　５ａｓｓ（１９５８）前出
）で適当に染色した。

ダイズ体細胞胚は単又は多細胞起源の両方を有し得る。

球状から魚雷型段階への胚形成経路は接合体胚形成のそ
れと似ている。体細胞胚はＮＡＡを含む培地で形成を続
けるので、胚軸、特に基部。

は体細胞胚のそれよりも長くなり、頂端は減少するか、
な（なる。子葉は常に正しく出るが、大きさがしばしば
減少する。オーキシンとして２，４−りを用いると、最
もよく起る異常は不正確な子葉の発生であり２体細胞胚
は角型になる。一般に５頂端領域は平たくなるか、なく
なる。

２つのオーキシン処理間での発生パターンの差が観察さ
れた。間接および直接体細胞胚形成が両オーキシンで観
察されたが、直接体細胞胚が生じる様式に違いがあった
。２．１−Ｄは表皮を生じ。

細胞の隣接する数亜層は分裂領域を生じる。この領域に
沿って生じる胚は多細胞発生を示す広域胚柄領域を有す
ると特徴づけられた（Ｅ、Ｇ、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１
９８６）Ａｎｎａｌ、　Ｂｏｔ、　５７：４４３−４６
２）。ＮＡＡ胚は最も頻繁に周囲の細胞、特に死滅した
周囲の細胞からの厚い細胞壁に囲まれた細胞から生じた
。単細胞発生の指標である狭い胚柄が観察された。

いずれのオーキシン処理についても、子葉段階の体細胞
胚は衰弱細胞の領域と関係があり、その細胞は発達して
いる胚に対して栄養源となるか。

又はそれらが胚形成経路に入れるようにする。ある細胞
の遊離を生じ得る。

胚形成組織の特徴、即ち小さな細胞、黒く染まる細胞質
、明確な仁を有する大きな黒く染まる核。

および多数のデンプン顆粒、を示す細胞の形成は両オー
キシン処理で観察された。胚形成細胞は隣接細胞間に明
確な細胞壁を示した。そのような組織から形成される胚
は狭い胚柄を有していた。これらの組織内のある細胞は
多核であり、メガメトゲネシス（ｍｅｇｅｍｅｔｏｇｅ
ｎｅｓｉｓ）の間の細胞とは異なり、３つの大きさの異
なる核と巨大なサイズの細胞を有する。

さらに、外植体の子葉の異なった領域が体細胞胚を生じ
た。ＮＡＡを含む培地では、胚は外植体子葉の切断しな
い部分の表面に沿って発生した。この“繁殖能力のある
三日月”領域は第１図に示される。ここに正常な形態を
有する多数の体細胞胚が培地に前軸表面でおいた子葉に
生じた。２，４−Ｄを調整した培地に置くと、培地に前
軸表面を置いた外植体子葉は、外植体子葉の中央自軸領
域から生じた。この方向はパ繁殖能力のある三日月パ領
域からの胚形成を阻害するようであった。この“繁殖能
力のある卵形゛領域を第１図に示す。２゜４−Ｄでは、
同軸側を培地に置いた子葉は多数の正常胚を生じ、そし
てその発生は中央自軸領域よりむしろ周辺の“繁殖能力
のある三日月゛がらであった。２．４−Ｄは多数の全杯
数を生じた。オーキシン処理により生じた正常な胚の数
は１本研究では差が見られなかった。しかし、オーキシ
ンと方向性の相互作用を調べると、培地に同軸側を置く
と２．４−Ｄは、培地に前軸側を置いたＮＡＡより。

多くの正常な胚を生じた。表１８は胚発生に於ける培地
と方向性の効果を示す。

表１８ 胚形成における培地と方向性の効果 平均値　　標準誤差 実力」ｌ影Ｌ１離 未熟な子葉を滅菌したＮｏ、３５メツシユ（５００μｍ
）上で押しつふず解離操作により、胚形成能を有する子
葉のそれらの領域に創傷を与えた。２０の子葉を各２ｃ
＋ｆｌのメツシュ片上でつぶし、　１／４　ｍｍ２片に
した。もし組織がメツシュ上に残っていれば、形質転換
／再生過程の間に、一つの培地から他へ多数の子葉を容
易に効率的に移すのに、このメツシュ自身簡便な方法と
なる。

ステンレス鋼製のメツシュはナイロンメツシュより胚形
成を有意に高頻度で生じた。鋼は殺菌が容易で再利用で
きるので有利である。青銅製のメツシュは結果が得られ
ず。全ての組織に毒性がある。中位から低い再生能を有
する遺伝子型（例えばＭｃＣａｌｌ、　Ｐｅｋｉｎｇ、
または”Ｍａｎｉｔｏｂａ　Ｂｒｏｉｙｎ”）はステン
レス鋼製のメツシュ上での解離が特に有効である。これ
らの遺伝子型の解離させた子葉は実際、解離させない子
葉より多くの体性胚を生ずる（表１９参照）。鋼製メツ
シュに弱い電流（２μＡ）を通すと胚形成の頻度がさら
に上昇した。

茜　　　　　へ Ｑ　　　　　　　ロ 口　　　　　　も マ １１９　：　　タ　　　云　　　と　タ　　　、云　　
１φ１彰チヂ］町≧クシペキン種植物を温室で育てた。

さやの表面を殺菌し、胚軸を除去後、３〜５ｍｍの未熟
子葉を切出した（Ｐ、Ａ、Ｌａｚｚｅｒｉ　ら（１９８
５）前出）。未熟子葉の必ずしも全ての細胞が体細胞胚
を形成し得るわけではない。実施例１７に示すように、
　　ＮＡＡ処理で胚形成能を有する細胞は未熟子葉の離
れた表面に近い、狭い三日月に限定される。この領域の
細胞は体細胞胚を直接の胚形成により生じ、即ち、介在
するカルス相がない。この領域を傷つげ、アグロバクテ
リウムと胚形成能を有する細胞を直接接触させるために
、未熟子葉を５００μｍメツシュに押しつケ、　ＭＳ３
３４．　Ｂ５ビタミン、１．５％スクロース。

１０■／ｌＮＡ＾および固化剤として０．２％ゲルライ
トを含む培地に置いた。解離させた子葉にＬＢＡ４４０
４（ｐＨ５ＰＺ３Ｄ）　０）−晩懸濁液を接種した。ｐ
Ｈ５ＰＺ３Ｄはβ−ファゼオリンプロモーターの後に１
５ｋｄゼインコード領域を含むミクロＴｉプラスミドで
ある。このプラスミドはまた選択マーカーとして用い得
るネオマ゛イシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子を
も含む。−晩２８°Ｃで培養後２組織を５００ｍｇ／／
２のメツオキシン（セフオキシチン）を含む上記培地に
移した。体細胞胚を３０日日目取り、成長調整物質をベ
ンジルアデニン、カイネチン、およびゼアチン各０．１
７ｍｇ／　１　、およびＮＡＡ　０．０５ｍｇ／　Ｅに
変えた以外は上と同じ培地に置いた。胚は発芽が起こる
まで、１ケ月間隔でこの培地に移した。発芽胚を０．１
５％ゲルライトで固化したＨＰＮ塩を含む培地に移した
。発根植物を土壌に移し、そして温室で正常に成育させ
た。成熟するまで成長した植物は形態的異常はなく、正
常な種子をつけた。

ＤＮＡを成熟植物の頂点付近から集めた葉組織から抽出
し、、ＥｃｏＲＩで分解した。ザザンハイプリダイゼー
ションをノアゼオリン／ゼイン構築物を含むｐＨ５ＰＺ
３Ｄの４．ＩＫｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１断片を用いて行った。

このＥｃｏ　Ｒ１断片は形質転換ダイスからの２．７Ｋ
ｂバンドとハイブリダイズした。対照に用いた非形質転
換体ダイズのＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。オ
クトピン生産試験は陰性であった。

Ｉ２０：３云 以下に今日までに回収された形質転換再生植物の得られ
る上記実施例に用いた形質転換手順を。

より完全に述べる。約５０００の３〜５ｍｍの長さの未
熟子葉の表面殺菌したさやから取り出し、ステンレス鋼
製またはナイロン製メツシュ上に前軸側を下にして置き
、そこで子葉をつぶした。メツシュを次いでＮＩＯ培地
（ＭＳ塩、　Ｂ５ビタミン、１０ｍｇ／ｆｆのα−ＮＡ
Ａ、　１．５％スクロース、およヒ０．２％ゲルライト
）上に置いた。２０の解離子葉をつげた各メツシュにｐ
Ｈ５ＰＺ３Ｄを保持するアグロバクテリウムＥＨＡＩＯ
Ｉ株（無力化したＡ２８１）の−晩培養懸濁液を５０μ
！接種した。解離組織のアグロバクテリウムとの共存培
養を一晩２８°Ｃで行った。

翌日、培養物を１０ｍｇ／／２の６４１８と５００ｍｇ
／ｆｆｉのセフオキシチンを含むＮＩＯ培地に移した。

１ケ月後、得られた体細胞胚をさらに成長させ２体細胞
胚を発達させるために５００ｍｇ／ｆｆｉのセフオキシ
チンを含むＢＫＺＮ培地（ＭＳ塩、　Ｂ５ビタミン、６
−Ｂ八。

カイネチン、およびゼアチンを各０．０１７　ｍｇ／　
ｌ　。

ｃｘ　−ＮＡＡ　０．０５＋ｎｇ／／！、　　２％スク
ロース、および０．２％ゲルライト）に移した。胚をＢ
ＫＺＮ培地で維持し。

１ケ月毎に発芽が起こるまで、植えついだ。このとき、
　ＨＰＮ−塩を含む培地に移した。

２１：冑　のＩ其 子葉を生じた後、アグロバクテリウムを加える最良の時
期を決定するため、子葉（処理当り１００）を１．５％
スクロースを含むＭＳ培地で出させ１表２０に示す時間
に、−晩培養したアグロバクテリウム懸濁液１μｇを上
に置き、そして２日間共存培養後、　　５００ｍｇ／ｌ
のメツオキシンを含む同じ培地に置いた。結果を表２０
に示す。カルスを５段階で表し、０はカルスなし、１は
カルスが認められる。

そして５は大きなカルス、である。

（以下余白） １２２　：　丑　　ｌ立　　ｌＩ　　日オーエンとクレ
ス（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ＋　　７７
　：８７−９４に用いられているアグロバクテリウムに
３日接触させる方が、もっと短時間接触させる場合に比
べ、より良い結果が得られるかどうかを決定するために
ＭｃＣａ　Ｉ　ＩとＪ１０３遺伝子型のそれぞれの１０
０個の胚を外植した後、直ちにアグロバクテリウムＡ２
８１を接種した。１日と３日間共存培養した後。

応答の頻度が比較され、以下のような結果となった。

１日日のＭｃＣａｌｌ：５２．７８の子葉が、平均カル
ス率１．０５±、０２３で応答した。３つはホルモンを
含まない培地上で生育し続けた。

３日間の共存培養でのＪ１０３　：　１３．８９の子葉
が応答し、平均カルス率は２．２８±０．２４であった
。

３日間の共存培養でのＭｃＣａｌｌ　：　４６個の“′
こぷ”が子葉上に現れた。これらは、ホルモンを含まな
い培地上では生育できなかったので、それらはそもそも
こぶではないであろう。この操作を行ってもこぶは得ら
れるものではなかった。

１日間の共存培養が最もよいようである。組織の壊死は
、アゲロバクチ１ウムに対する接触時間の増加とともに
増えるが、　Ｊ１０３とＭｃＣａｌｌは、　Ｐｅｋｉｎ
ｇやＣｅｎ　ｔｕｒｙといった他の遺伝子型のものほど
感受性（すなわち２組織の損傷に対して敏感である）を
示さないようである。

尖巖尉刹工童訳剋 選択剤Ｇ４１８とカナマイシンの最適の割合を決定する
ための実験が、アガーとゼラチンを用いて行われた。前
の実験のデータから、　２５ｍｇ／　ｊ２の６４１８は
、おそらく多すぎるであろうということが示されていた
。胚形成応答が、ことなる培地上で、２つの異なる選択
剤を様々な濃度で用いて比較された。応答は、また根の
形成（通常ばみられない）をも含むものであった。結果
は以下の通り。

（以下余白） Ｋ５０＋アガー　　　−０／１０　　　胚芽応答。色は
緑がかった黄色。

Ｋ５０＋ゼラチン　　−５／１０　　胚芽応答。色は緑
がかった黄色。

Ｋ１００＋　アガー　　−１／１０　　　胚芽応答。色
は緑がかった黄色。

Ｋ１００＋　ゼラチン　−３／１０　　胚芽応答。色は
白ぽい黄色からうす緑。

Ｋ２Ｏ０＋　アガー　　−０／１０　　　胚芽応答。黄
緑色。

Ｋ２Ｏ０＋　ゼラチン　−０／１０　　胚芽応答。色は
白ぽい黄色から黄緑色。

Ｋ３００＋　アガー　　−０／１０　　　胚芽応答。黄
緑色。

Ｋ３００＋　ゼラチン　−０７１０　　胚芽応答。白ぽ
い黄色。

ＧＩＯ＋アガー　　　−０１５胚芽応答。４１５が通常
の緑色、１１５は白。

Ｇ４０＋ゼラチン　　−０１５　　胚芽応答。４１５が
通常の緑色、１１５は白。

Ｇ１５＋アガー　　　−０／１０　　　胚芽応答。すべ
て通常の緑色。

＊Ｇ１５＋ゼラチン　　１／１０　　胚芽応答。９／１
０は通常の緑色、　１／１０が白。

Ｇ２０＋アガー　　　−１／１０　　　胚芽応答。黄色
がかった緑色。

Ｇ２０＋ゼラチン　　−０／１０　　胚芽応答。９／１
０は黄色がかった緑色、　１／１０が白。

Ｇ２５＋アガー　　　−０／１０　　　胚芽応答。５／
１０が緑、　５／１０が黄緑。

Ｇ２５＋ゼラチン　　−０／１０　　胚芽応答。７／１
０が黄緑、　３／１０は白。

（以下余白） Ｇ４１８は、アガーとゼラチンで、カナマイシンよりも
安定な結果を示した。カナマイシンは、ゼラチン上より
もアガー上で、よりよい結果を示した。

アガー上のＧＩＯあるいはに５０の割合が形質転換した
組織の選抜として働くのに適切であった。

２４：打止　　と゛ ベクターｐＨ５ＰＺ３Ｄを保持しているヱ久Ｏｔ＜））
±リウム　テユメファシエンスのＥＨＡＩＯＩ　（Ａ２
８１）　とＬＢＡ４４０４種が準備された。このベクタ
ーは、カナマイシン抵抗性遺伝子とオクトピン合成遺伝
子を持っている。バクテリアはＬＢ培地（５，Ｏｇ／　
Ｉ！、　　イーストエクストラクト、　１０．０ｇ＃！
　　）リプトン、５．０ｇ／　ｉ！　ＮａＣｌ、　１５
ｇ／　ｌアガー、　ｐＨ７，５）、　２８°Ｃで培養し
た。アグロバクテリウムのコロニーのいくつかをかき取
り、　ＬＢ液体培地に懸濁した。懸濁コロニーは、−夜
、２８°Ｃで成育させた。ＬＢＡ４４０４　（ｐＨ５Ｐ
Ｚ３Ｄ）に対する培地中に用いられた抗生物質はストレ
プトマイシン２５０■／Ｉ２．、カナマイシン２５■／
ｌ。

そして、テトラサイクリン２．８＋ｎｇ／ｊ２で、　Ｅ
ＨＡＩＯＩ（ｐＨ５ＰＺ３Ｄ）に用いられた抗生物質は
、カナマイシン５０ｍｇ／Ｃナリジキシン酸２０ｍｇ／
Ｃそしてテトラサイクリン２ｍｇ／ｌであった。

いくつかの遺伝子型の組織から得られた３選抜を行った
。あるいは行っていない胚が、　ｐＨ５ＰＺ３Ｄを保持
するアグロバクテリウムと共存培養した後。

評価された。１００個の子葉対が、それぞれの処理に用
いられた。子葉対はナイロン網目ごとに単離された。用
いたすべてのバクテリアはｐＨ５Ｚ３Ｄを保持していた
。共存培養の期間は、１日間だけであった。結果は表２
１に示す。

それぞれの処理で得られた体性胚の数は、上記の表の最
後の行に示す。ＬＢＡ４４０４はＰｅｋｉｎｇに対し。

より効果的であるように思われ、一方ＥＨＡＩＯＩはＪ
１０３にもっとも適するようである。

この実験の目的の１つは、共存培養期に続く選抜を行う
ことが、必要であるか、あるいは得策であるかを決定す
ることであった。初めの結果は。

胚（部分的に形質転換された）はＪ１０３中で１選抜下
でまだ発育するであろうが、　Ｐｅｋｉｎｇ中ではそう
ではないであろうということを示唆している。いずれの
場合でも、得られた胚の数は非常に少なく。

胚に途方にくれるという心配をする必要はない。

形質転換された胚は１選抜なしでも得られうる。

（以下余白） （発明の要約） 大豆（グリシン　マックス）、グリシン　ソーヤおよび
他のグリシン種の体性胚形成方法が未熟子葉組織を用い
て、好ましくは除去された胚軸を用いて提供される。こ
の方法は該組織をオーキシン、好ましくは少なくとも約
１５ｍｇ／ｌの濃度でＮＡＡを含有する培地上で培養す
ることを包含する。そのような体性胚形成の別の方法が
提供され、そこではその培養培地は相乗的に作用する炭
水化物およびオーキシンを低濃度で含有する。特に、そ
のような組織の胚形成細胞が同定されそのような細胞を
再生および形質転換培地と接触させる改良されたマセレ
ーション方法が開示されている。

大豆および他のグリシン種から体性組織を形質転換する
方法も提供される。

全植物体で繁殖能力のある形質転換植物が得られる。

４、　゛の　　　なう゛ロー 第１図は、未成熟の胚に由来の大豆子葉の図である。こ
の図は、かなり頻繁に体性の胚を生じる細胞における。

“繁殖力のある三日月”領域および“′繁殖力のある卵
形゛″領域示す。

■・・・繁殖力のある三日月領域、２・・・繁殖力のあ
る卵形領域。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリシン種植物の体性胚形成方法であって、（ａ）
   該植物の未熟胚から子葉組織を切り取ること、 （ｂ）該子葉組織を少なくとも約１５ｍｇ／ｌの濃度で
   ＮＡＡ類のオーキシンを含有する誘導培地上で培養する
   こと、 を包含する方法。 ２、前記オーキシンがＮＡＡを包含する特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、前記工程（ｂ）の胚がさらに培養されて植物体全体
   を再生する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記子葉組織が体性胚の生成の前に外来ＤＮＡをゲ
   ノムへ組み込むことにより形質転換される特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ５、グリシン種植物の体性細胞から植物体全体を再生す
   る方法であって、 約２％（Ｗ／Ｖ）より少ない炭水化物および約５．０ｍ
   ｇ／ｌと約５０ｍｇ／ｌとの間の濃度でオーキシンを含
   有する培地上に該細胞を培養して胚を生成させること、
   および該胚を適当な培地上に配置して植物体全体を生成
   させることを包含する方法。 ６、前記体性細胞が、未熟胚から採取された子葉組織の
   繁殖力のある三日月領域から採取される特許請求の範囲
   第５項に記載の方法。 ７、前記子葉組織をメッシュに押圧することにより該組
   織を解離し可視的な細胞群に分割する特許請求の範囲第
   ６項に記載の方法。 ８、前記体性細胞が、外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込
   むことにより形質転換された特許請求の範囲第６項また
   は第７項に記載の方法。 ９、外来ＤＮＡを含有するグリシン種植物を生産する方
   法であって、 （ａ）繁殖能力のある三日月領域を有する該種の未熟胚
   から採取された子葉組織を解離すること、（ｂ）該外来
   ＤＮＡが該解離された組織の細胞へ組み込まれるように
   該組織を該ＤＮＡと接触させること、 （ｃ）該解離された組織を該組織用胚形成培地と接触さ
   せて体性胚を生成すること、 （ｄ）該体性胚を外来ＤＮＡを含有する全植物体の適当
   な再生用培地に移すこと、 を包含する方法。 １０、前記工程（ｂ）の後に、非形質転換組織の生育を
   阻止または阻害する非選択培地が用いられ、そして形質
   転換体が該外来ＤＮＡにより授けられる表現型の同定に
   より同定されかつ選択される特許請求の範囲第９項に記
   載の方法。