CN109329066A - 一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法 - Google Patents

一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：步骤1)选取鸡血藤种子，消毒，放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出嫩叶；步骤2)选取嫩叶作为外植体，将其置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织；步骤3)将愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团；步骤4)将细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系；步骤5)将悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系。本发明每升鸡血藤悬浮细胞中可提取到1.5～2g多糖。

Description

一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及中药材栽培技术领域，尤其涉及一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法。
背景技术
鸡血藤，中药名。为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎。秋、冬二季采收，除去枝叶，切片，晒干。分布于广东、广西、云南等地。具有活血补血，调经止痛，舒筋活络之功效。用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。随着研究的深入，科学家发现，鸡血藤提取物富含多糖等多种物质，具有明显的抗肿瘤作用，在医学上的需求量越来越大。野生鸡血藤植株的产量已经不能满足市场需求。为满足对该中药材的需求，近年来，逐渐采用人工栽培及组织培养的方式对鸡血藤进行培养。组织培养由于具有培养时间短、不占用耕地等优点，逐渐快速发展起来。然而，在组织培养中，由于培养时间较短，因此鸡血藤悬浮细胞中多糖等物质的含量较野生型少。如何在较短的时间内使得培养的鸡血藤植株中含有较多量的多糖，是目前正在积极探究的技术问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度800～1500lux，光周期8～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为7～15天。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1500～3000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为20～40天。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2000～4000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为4～8天。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～120rpm转速震荡培养，培养时间为2～3天。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～200rpm转速震荡培养，培养时间为7～15天。
优选的是，所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法中，步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶；；步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；首先，本发明将萌发的嫩叶作为外植体，外植体的分化小，获得的悬浮细胞更加有活力，代谢更快，对养分的吸收更好。步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA0.2～0.6mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液。本发明的继代固体培养基、启动液体培养基和增殖液体培养基中均含有蜂胶、酵母提取物和银杏叶汁液，这样，细胞能够吸收和利用较多的黄酮类化合物、蛋白质类化合物和其他营养物质，激发其自身对黄酮类化合物的合成，从而促进其产生更多的黄酮类化合物。同时，本发明根据材料不同阶段的不同生长状况，合理配置不同浓度的培养基的各个组分的含量，从而促进更个阶段不同材料的快速生长和对营养成分的吸收。利用本发明的方法对培养获得的鸡血藤悬浮细胞周期短，且每升鸡血藤悬浮细胞中可提取到1.5～2g多糖，实现了在较短时间内获得大量的药效成分的目的。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；首先，本发明将萌发的嫩叶作为外植体，外植体的分化小，获得的悬浮细胞更加有活力，代谢更快，对养分的吸收更好。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液。本发明的继代固体培养基、启动液体培养基和增殖液体培养基中均含有蜂胶、酵母提取物和银杏叶汁液，这样，细胞能够吸收和利用较多的黄酮类化合物、蛋白质类化合物和其他营养物质，激发其自身对黄酮类化合物的合成，从而促进其产生更多的黄酮类化合物。同时，本发明根据材料不同阶段的不同生长状况，合理配置不同浓度的培养基的各个组分的含量，从而促进更个阶段不同材料的快速生长和对营养成分的吸收。利用本发明的方法对培养获得的鸡血藤悬浮细胞周期短，且每升鸡血藤悬浮细胞中可提取到1.5～2g多糖，实现了在较短时间内获得大量的药效成分的目的。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度800～1500lux，光周期8～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为7～15天。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1500～3000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为20～40天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2000～4000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为4～8天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～120rpm转速震荡培养，培养时间为2～3天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为3～5g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～200rpm转速震荡培养，培养时间为7～15天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基10％～20％的悬浮启动培养后的培养物。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
所述银杏叶汁液的获取方法为：取银杏叶片按照质量比10:1加入水，之后粉碎，并以200目过滤筛过滤，得到滤液即为银杏叶汁液。
实施例1
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/4MS、蔗糖7g/L和6-BA0.1mg/L，其初始pH值为5.8。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2mg/L，NAA0.02mg/L，蔗糖10g/L、蜂胶5g/L、酵母提取物2g/L、质量分数2％的银杏叶汁液和琼脂8g/L。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L，蔗糖5g/L、蜂胶15g/L、酵母提取物5g/L、质量分数5％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4MS、6-BA0.2mg/L，NAA0.02mg/L、蔗糖2g/L、蜂胶10g/L、酵母提取物2g/L和质量分数2％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L、蔗糖2g/L、蜂胶10g/L、酵母提取物2g/L和质量分数2％的银杏叶汁液。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度800lux，光周期8小时/日，培养温度为24℃，培养时间为7天。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1500lux，光周期10小时/日，培养温度为24℃，培养时间为20天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2000lux，光周期10小时/日，培养温度为24℃，培养时间为4天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24℃，100rpm转速震荡培养，培养时间为2天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为3g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24℃，100rpm转速震荡培养，培养时间为7天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基10％的悬浮启动培养后的培养物。
实施例2
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出10mm长度的嫩叶。。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.5mg/L，NAA0.1mg/L，蔗糖15g/L、蜂胶10g/L、酵母提取物5g/L、质量分数10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA 1mg/L，NAA0.1mg/L，蔗糖10g/L、蜂胶20g/L、酵母提取物10g/L、质量分数15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/2MS、6-BA2～0.6mg/L，NAA0.1mg/L、蔗糖5g/L、蜂胶15g/L、酵母提取物5g/L和质量分数10％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA 1mg/L，NAA 0.1mg/L、蔗糖5g/L、蜂胶5g/L、酵母提取物5g/L和质量分数10％的银杏叶汁液。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度1500lux，光周期12小时/日，培养温度为28℃，培养时间为15天。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度3000lux，光周期12小时/日，培养温度为28℃，培养时间为40天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度4000lux，光周期12小时/日，培养温度为28℃，培养时间为8天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为28℃，120rpm转速震荡培养，培养时间为3天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为5g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为28℃，200rpm转速震荡培养，培养时间为15天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基20％的悬浮启动培养后的培养物。
实施例3
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出5mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/3MS、蔗糖11g/L和6-BA0.2mg/L，其初始pH值为5.8。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA 0.35mg/L，NAA0.06mg/L，蔗糖12.5g/L、蜂胶7.5g/L、酵母提取物3.5g/L、质量分数6％的银杏叶汁液和琼脂8g/L。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.75mg/L，NAA0.06mg/L，蔗糖7.5g/L、蜂胶17.5g/L、酵母提取物7.5g/L、质量分数10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/3MS、6-BA0.4mg/L，NAA0.06mg/L、蔗糖3.5g/L、蜂胶12.5g/L、酵母提取物3.5g/L和质量分数6％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.75mg/L，NAA0.06mg/L、蔗糖3.5g/L、蜂胶12.5g/L、酵母提取物3.5g/L和质量分数6％的银杏叶汁液。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度1150lux，光周期10小时/日，培养温度为16℃，培养时间为11天。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度2250lux，光周期11小时/日，培养温度为26℃，培养时间为30天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度3000lux，光周期11小时/日，培养温度为26℃，培养时间为6天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为26℃，110rpm转速震荡培养，培养时间为60天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为4g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为26℃，150rpm转速震荡培养，培养时间为11天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基15％的悬浮启动培养后的培养物。
实施例4
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出2mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/4MS、蔗糖10g/L和6-BA0.2mg/L，其初始pH值为5.8。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.3mg/L，NAA0.024mg/L，蔗糖12g/L、蜂胶7g/L、酵母提取物3g/L、质量分数5％的银杏叶汁液和琼脂8g/L。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.6mg/L，NAA0.08mg/L，蔗糖7g/L、蜂胶17g/L、酵母提取物8g/L、质量分数12％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4MS、6-BA0.3mg/L，NAA0.03mg/L、蔗糖3g/L、蜂胶11g/L、酵母提取物3g/L和质量分数4％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.7mg/L，NAA0.04mg/L、蔗糖3g/L、蜂胶12g/L、酵母提取物3g/L和质量分数4％的银杏叶汁液。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度1000lux，光周期9小时/日，培养温度为25℃，培养时间为8天。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1800lux，光周期10小时/日，培养温度为25℃，培养时间为28天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2500lux，光周期10小时/日，培养温度为25℃，培养时间为5天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为25℃，100～120rpm转速震荡培养，培养时间为2天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为3g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为25℃，120rpm转速震荡培养，培养时间为9天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基12％的悬浮启动培养后的培养物。
实施例5
一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出9mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/2MS、蔗糖12g/L和6-BA0.2mg/L，其初始pH值为5.8。
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.4mg/L，NAA0.08mg/L，蔗糖12g/L、蜂胶9g/L、酵母提取物4g/L、质量分数9％的银杏叶汁液和琼脂8g/L。
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.9mg/L，NAA0.09mg/L，蔗糖9g/L、蜂胶19g/L、酵母提取物9g/L、质量分数14％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4MS、6-BA0.5mg/L，NAA0.09mg/L、蔗糖4g/L、蜂胶14g/L、酵母提取物4g/L和质量分数9％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.9mg/L，NAA0.09mg/L、蔗糖4g/L、蜂胶14g/L、酵母提取物4g/L和质量分数9％的银杏叶汁液。
步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度1400lux，光周期10小时/日，培养温度为27℃，培养时间为13天。
步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度2800lux，光周期10小时/日，培养温度为27℃，培养时间为35天。
步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度3500lux，光周期10小时/日，培养温度为27℃，培养时间为7天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为27℃，110rpm转速震荡培养，培养时间为2天。
步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为4g/L继代培养产物。
步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为27℃，180rpm转速震荡培养，培养时间为14天。
步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基18％的悬浮启动培养后的培养物。
效果验证：
采用实施例1至实施例5的方法对培养得到鸡血藤悬浮细胞，之后每个实施例中取1L鸡血藤悬浮细胞，提取多糖后，利用硫酸-蔥酮法测定多糖含量，结果如表一所示。
表一
从表一可以看出，本发明的方法对鸡血藤悬浮细胞的培养非常成功，多糖含量大大提高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括：
步骤1)首先选取鸡血藤种子，然后对所述种子进行消毒，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA 0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；
步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA 0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；
步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；
步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液。
2.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度800～1500lux，光周期8～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为7～15天。
3.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1500～3000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为20～40天。
4.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2000～4000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为4～8天。
5.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～120rpm转速震荡培养，培养时间为2～3天。
6.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～200rpm转速震荡培养，培养时间为7～15天。
7.根据权利要求1所述的鸡血藤悬浮细胞的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。
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