CN103122318A - 一株海洋真菌桔青霉及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——桔青霉（Penicillium citrinum） MNP12010101及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M2012318，保藏日期2012年8月28日。本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明具有抗肿瘤活性的桔青霉MNP12010101营养要求简单、容易培养；（2）该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性；（3）该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对神经癌细胞（PC12），肝癌细胞（HepG2）和组织细胞淋巴瘤细胞（U937）均有一定的抗肿瘤活性。

Description

一株海洋真菌桔青霉及其在制备抗肿瘤药物中的应用
（一）技术领域
本发明涉及一株海洋真菌——半知菌纲壳霉目杯霉科桔青霉（Penicillium citrinum） MNP12010101，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 
（二）背景技术
癌症一直都是人类难以攻克的一个难题，寻找生理活性强的物质成为人类攻克疾病的主要工作之一。海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。 
海洋环境苛刻，具有低温、低照、高盐、高压和寡营养等特点，海洋微生物由于栖息于这样的极限环境下, 产生了与陆地生物完全不同的代谢系统和机体防御系统，所以能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物，研究发现它们许多成分也具有抗癌，抗菌等药用价值，并且许多特异的化学结构类型是在陆地微生物中难以发现的。 
细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种筛选方法，常用的有MTT法等。 
（三）发明内容
本发明目的是提供一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——桔青霉（Penicillium citrinum）MNP12010101，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 
本发明采用的技术方案是： 
一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——桔青霉（Penicillium citrinum） MNP12010101，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M 2012318，保藏日期 2012年8月28日。 
本发明菌株由浙江省东海海域采集的海水中分离和筛选得到。该菌株的菌落特征如下：涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，28℃培养36 h后长出圆形、外白内绿、直径约0.1~0.3cm的菌落；该菌株的菌体生长特征如下：在液体培养基中，28℃培养36 h后菌体呈颗粒状生长。 
菌株的筛选纯化方法为：将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28℃培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28℃培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株，并对该菌株进行菌种鉴定。 
所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，组成为：土豆150~350g/L，葡萄糖10~30g/L，琼脂15~35g/L，溶剂为人工海水，pH7.2~8.0。 
本发明经筛选获得的桔青霉（Penicillium citrinum ）MNP12010101，涂布或划线接种在平板培养基上生长迅速，28℃培养48 h后长出圆形、外白内绿、直径约0.1~0.3 cm的菌落。 
将所述的桔青霉（Penicillium citrinum ）MNP12010101的16sRNA部分核苷酸序列与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information USA，NCBI）的基因库中的微生物16sRNA序列比对，所述桔青霉MNP12010101的18s rRNA的部分核苷酸序列如下： 
GCCGTAGCTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACG GATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA。 
本发明还涉及所述的桔青霉MNP12010101在制备抗肿瘤药物中的应用。 
优选的，所述抗肿瘤药物为治疗神经癌、肝癌或淋巴瘤的药物。 
具体的，所述桔青霉MNP12010101的提取物用于制备抗肿瘤药物。 
优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法制得：将桔青霉MNP12010101接种至液体发酵培养基中，于25~35℃、150~250 r/min振荡条件下培养7d，再25~35℃下静置14d，得到发酵液，发酵液去除菌体细胞后用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干得浸膏，即为所述桔青霉MNP12010101的乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合物，pH 7.2~8.0。 
所述人工海水每100 ml组成为：NaCl 2.448 g，Na2SO4 0.3917 g，KCl 0.0664 g，KBr 0.0096 g，SrCl2 0.0024 g，MgCl·6H2O 0.4981 g， CaCl2·H2O 0.1102 g，NaHCO3 0.0192 g， H3BO3 0.0026 g， NaF 0.0004 g， 蒸馏水 100 ml。 
所述菌株在发酵培养前，通常需要先经斜面培养活化，然后经种子培养、获得种子菌株再接入液体发酵培养基进行产酶培养。 
所述的斜面培养基组成为：土豆150~350g/L，葡萄糖10~30g/L，琼脂15~35g/L，溶剂为人工海水，pH7.2~8.0。 
所述的平板培养基组成为：土豆150~350g/L，葡萄糖10~30g/L，琼脂15~35g/L，溶剂为人工海水，pH7.2~8.0。 
所述的种子培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合液，pH 7.2~8.0。 
所述的液体发酵培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合液，pH 7.2~8.0。 
具体的，所述提取物获得方法如下： 
（1）将海洋真菌桔青霉MNP12010101菌株接种于斜面培养基，于25~35℃培养24~48 h，得到活化后的菌种；所述的斜面培养基组成为：土豆150~350g/L，葡萄糖10~30g/L，琼脂15~35g/L，溶剂为人工海水，pH7.2~8.0；  
（2）将步骤（1）活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中，于25~35℃，150~250 r/min振荡条件下培养24~48h，得到种子液，所液体种子培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合物，pH 7.2~8.0。 
（3）将步骤（2）种子菌株以10%~15%的体积比的接种量，移种到液体培养基中，于25~35℃、150~250 r/min振荡条件下培养7天后，在25~35℃下静置14天，得到发酵液；所述液体培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合物，pH 7.2~8.0； 
（4）将步骤（3）的发酵液于4℃条件下细胞破碎、离心或者过滤，分离除去菌体，所得发酵液用乙酸乙酯萃取后收集上层萃取液，浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏，即桔青霉MNP12010101的乙酸乙酯提取物。 
本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明具有抗肿瘤活性的桔青霉MNP12010101营养要求简单、容易培养；（2）该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性；（3）该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对神经癌细胞（PC12），肝癌细胞（HepG2）和组织细胞淋巴瘤细胞（U937）均有一定的抗肿瘤活性。 
（四）附图说明
图1为平板培养基上桔青霉MNP12010101的菌落形态； 
图2 为光学显微镜下桔青霉MNP12010101的菌体形态。 
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 
实施例1：菌株的筛选、纯化及鉴定  
（1）将自东海海域采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28℃培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28℃培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株。所述土豆平板培养基按如下组成配制：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。 
（2）对筛选获得的菌株MNP12010101的PCR产物核苷酸序列比对，将其命名为桔青霉MNP12010101（Penicillium citrinum  MNP12010101），提交中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M 2012318，保藏日期2012年8月28日。 
实施例2：菌株的活化及大规模培养 
(1)将实施例1中筛选获得的菌株接种于斜面培养基，于28℃培养24~48h，得到活化后的菌株，所述斜面培养基按如下组成配制：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，人工海水1000ml。 
(2)将步骤（1）活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中，于26~28℃、150~250 r/min振荡条件下培养24~48h，得到种子液，所液体种子培养基组成为：麦芽浸粉5.0g/L，麦芽糖1.8g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，溶剂为水：人工海水体积比2 : 8的混合液，pH 7.8。 
(3)将步骤（2）种子菌株以10%~15%的体积比的接种量，移种到液体培养基中，于25~35℃、150~250 r/min振荡条件下培养7天后，在25~~35℃下静置14天，得到发酵液；所述液体培养基组成为：麦芽浸粉5.0g/L，麦芽糖2.0g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L， 溶剂为水：人工海水体积比2 : 8的混合液，pH7.5； 
实施例3：海洋真菌桔青霉MNP12010101抗肿瘤活性研究 
(1)将实施例2中培养所得的发酵液先于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎20min，然后于4℃条件下离心（9000r/min，15min）或者过滤，除去菌体，用乙酸乙酯进行萃取，对萃取相进行旋蒸，所得浸膏即为该菌株的次级代谢产物总浸膏。 
(2)将步骤（1）所得的发酵液总浸膏进行抗肿瘤活性测定。具体步骤如下：选取两株肿瘤细胞，分别为肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12细胞），癌细胞（HepG2细胞）和组织细胞淋巴瘤细胞（U937）取对数期的细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板中，培养48h，待测样品（总浸膏）加入0.1% DMSO10μL溶解后，用无血清的1640细胞培养基稀释，加100μL至试验组中，使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml，阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基，空白对照组则为无细胞和样品的无血清培养基，依托泊苷（VP-16）作为阳性对照品，每个浓度设5个复孔，肿瘤细胞在CO2培养箱（37℃）培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT20μL，继续培养4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150μL，振荡10min，用酶标仪充分振荡使得MTT紫色产物完全溶解，测490nm的A值，根据公式：抑制率=（A阴性对照组-A空白对照组）-（A样品组-A空白对照组）/(A阴性对照组-A空白对照组)即可求得抑制率，结果见表1。  
表1：发酵液总浸膏对3种肿瘤细胞的抑制作用 
Figure BDA0000264723671
用SPSS软件测得海洋真菌桔青霉MNP12010101的提取物对PC12肿瘤细胞半抑制率浓度IC50值为19.39ug/ml，对HepG-2肿瘤细胞的半抑制率浓度IC50值为123.14 ug/ml，对U937的半抑制率浓度IC50值为13.48ug/ml。  
Figure IDA00002647237700011

Claims (6)

1.一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——桔青霉（Penicillium citrinum） MNP12010101，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M 2012318，保藏日期2012年8月28日。
2.如权利要求1所述的桔青霉MNP12010101，其特征在于的18s rRNA的部分核苷酸序列如下：
GCCGTAGCTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA。
3.如权利要求1所述的桔青霉MNP12010101在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗神经癌、肝癌或淋巴瘤的药物。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述桔青霉MNP12010101的提取物用于制备抗肿瘤药物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法制得：将桔青霉MNP12010101接种至液体发酵培养基中，于25~35℃、150~250 r/min振荡条件下培养7d，再25~35℃下静置14d，得到发酵液，发酵液去除菌体细胞后用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干得浸膏，即为所述桔青霉MNP12010101的乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水：人工海水体积比1：1~4的混合物，pH 7.2~8.0。
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