CN1065918C - 用于细菌对药物敏感试验的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种用于细菌对药物敏感试验的方法。以pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中配制成的浓度为5毫克/毫升的噻唑蓝为检测试剂，将菌悬液与标准浓度的抗菌素在35℃-37℃常规恒温条件下保温作用2～5小时后，按菌悬液∶检测试剂体积比为20∶1的量与检测试剂混合，菌悬液的起始浓度≥1.5×106/毫升，以其显色反应进行细菌对药物敏感性的定性或定量的判定。
Description
本发明涉及的是一种医学上对细菌作药物敏感试验的方法。更具体的讲是对活体形态的致病细菌进行对药物敏感试验的显色／比色的方法。
各种致病细菌对抗菌药物的敏感性各异。测定细菌对不同药物的敏感程度，对于临床治疗中的用药选择，以便及时有效地控制感染，具有重要的意义。目前的细菌对药物敏感性试验方法可有扩散法和稀释法两类。扩散法中常用的有纸片法、快速纸片法(用氯化三苯四氮唑的TTC法)等，都是在对试液作18～24小时的培养后，通过测定抑菌圈的大小来判定细菌对药物是否敏感。这类方法通常只能作定性的测定，只有在与稀释法相配合，经统计学的回归分析得到其抑菌圈直径与MIC(最小抑菌浓度)间相关关系的回归方程后，才可用于定量检测。稀释法中有试管稀释法、微量液体稀释法等，虽可克服扩散法的缺点，能作定量或半定量的MIC测定，但其同样也都要有18～24小时的培养过程，并且是通过观察菌液是否浑浊来判定结果，敏感性差，难以发现有10％的改变。
本发明的目的是针对上述情况，提供一种能快速、准确、方便和直观地进行细菌对药物敏感试验的定性和定量的测定方法。
本发明的用于细菌对药物敏感试验的方法，是以pH7．2-7．4的磷酸盐缓冲液中配制成的浓度为5毫克／毫升的噻唑蓝为检测试剂。将菌悬液与标准浓度的抗菌素在35℃～37℃常规恒温条件下保温作用2～5小时后，按菌悬液∶检测试剂体积比为20∶1的量与检测试剂混合，菌悬液的起始浓度≥1．5×106／毫升，以其显色反应进行细菌对药物敏感性的定性或定量的判定。具体的判定方法可以采用肉眼直接观察法，或是用分光光度仪测定其光密度(OD)值的方法。
如果采用肉眼直接观察的方法，其所用试样的菌悬液最小浓度可为1．5×106／毫升，与标准浓度抗菌素混合后，于35～37℃常规恒温条件保温2～5小时，再如入检测试剂，于室温条件下放置～10分钟，直接观察该混合试样是否有蓝色的显色反应。如试样不显蓝色仍保持为无色状态，表明其中无活菌存在；若显蓝色，则判定为有活菌存在。由于测试孔板通常均为白色，在此背景颜色下，这种蓝色显色反应的细小变化都会极为明显和易于观察判别。因而其不仅可作为简单而直观的定性判定，还能很容易按常规方法，通过直接观察按常规抗菌素浓度梯度排列的各混合试样的蓝色显色反应，以与蓝色试样所邻接的该未显色试样作出药物最小抑菌浓度值的定量判定。
如果采用仪器作定量判定，所用试样菌悬液的起始浓度可为1×106／毫升。与标准浓度抗菌素混合后，于35～37℃常规恒温条件保温2～5小时，加入检测试剂，于35℃～37℃常规恒温条件下保温30～60分钟后，按菌液量∶二甲基亚砜体积比为1∶2加入二甲基亚砜并混匀，以分光光度仪测510～530纳米，最好是520纳米处的光密度值，与标准曲线对照，即可作出药物最小抑菌浓度值的定量判定。
噻唑蓝的化学名称为：3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑盐(简称MTT)，呈黄色粉末。现只在肿瘤的诊断治疗中被用于对细胞毒测定、动物细胞存活和增殖反应等方面的测定。目前认为其作用原理是基于黄色的MTT能被哺乳动物活细胞中的线粒体脱氢酶，如琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶等还原成蓝色的甲臜(Formazan)，并且其生成量与活细胞的数量及活力成正比，死细胞或红细胞没有这种能力，活化的细胞比静止的细胞能产生更多的甲瓒。从而通过比色分析方法可对细胞的数量及其代谢的强弱进行测定分析。由于细菌与哺乳动物的细胞是两类完全不同的细胞，细菌为低等的原核细胞，没有哺乳动物细胞等高等真核细胞所特有的线粒体。因而这一反映细胞生长增殖及存活状况的MTT染色法一直被认为只能用于对人类等哺乳动物的细胞检测上。
本发明通过对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、绿脓假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌等ATCC标准菌株，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等临床分离菌株，细胞培养液的污染菌，肿瘤病人腹水中污染菌，双歧杆菌等厌氧菌，以及一些霉菌等多种常见细菌进行试验后发现，这些细菌的活细菌同样可被MTT染成蓝色，死细菌则不能被染色。活菌经染色后显微镜观察，菌体呈蓝色，菌液亦呈蓝色，其颜色深浅与菌液浓度成正相关；用分光光度仪比色分析的光密度(OD)值与菌液浓度成直线关系。
为进一步考察本发明上述方法测定的可靠性，对被测菌液试样进行了加热处理对存活率影响的试验。用肉汤将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC)均稀释成浓度为1×108／毫升后，分别在60℃温度时加热不同时间，以及在30分钟内以不同温度加热处理后，再按菌液量∶MTT检测试剂=20∶1的量加入上述检测试剂，室温下作用30分钟，再按试样体积的两倍量加入二甲基亚砜并混匀，于520纳米波长比色的OD值计算两种试验条件下各自的细菌存活率。试验结果分别如表1和表2所示。此结果显示出，其蓝色深浅及比色分析的OD值与加热的温度高低及作用时间长短均成正相关。
表1 60℃下不同加热时间的细菌存活率试验结果
| 加热时间(分钟) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 金黄色葡萄球菌(存活率％) | 100 | 25 | 21 | 13 | 13 | 11 | 9 |
| 大肠杆菌(存活率％) | 100 | 91 | 76 | 61 | 63 | 61 | 56 |
表2不同温度下加热30分钟的细菌存活率试验结果
| 加热湿度(℃) | 0 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
| 金黄色葡萄球菌(存活率％) | 100 | 51 | 11 | 8 | 2 | 0．1 | 0．005 |
| 大肠杆菌(存活率％) | 100 | 83 | 60 | 47 | 10 | 5 | 0．1 |
常用化学消毒剂，如甲醛、新洁尔灭、75％乙醇、诗乐氏、灭菌王等作用于菌液时，MTT加入其中后的颜色深浅及比色分析的OD值均与这些消毒剂的浓度及作用时间成正相关。以新洁尔灭为例，对上述同种菌液分别以不同浓度的新洁尔灭均处理60分钟，和均以1％新洁尔灭处理不同时间后，按上述相同方法作加入MTT检测试剂的处理后，于520纳米波长比色的OD值计算两种试验条件下各自的细菌存活率试验结果，分别如表3和表4所示。试验还表明用臭氧处理时的情况与上述试验类似。
表3不同浓度新洁尔灭处理60分钟后的细菌存活率试验结果
| 新洁尔灭浓度(％) | 0 | 0．1 | 1 | 10 |
| 金黄色葡萄球菌(存活率％) | 100 | 100 | 13 | 0．002 |
| 大肠杆菌(存活率％) | 100 | 100 | 20 | 0．002 |
表4 1％新洁尔灭不同处理时间的细菌存活率试验结果
| 处理时间(分钟) | 30 | 60 | 90 | 120 |
| 金黄色葡萄球菌(存活率％) | 43 | 17 | 6 | 1 |
上述的试验结果充分表明，以MTT作为检测试剂，通过对细菌进行蓝色染色时，只有活细菌才被染色，死细菌则不被染色。这一结果与目前常规稀释法的结果相同，因而本发明的这一MTT方法完全可以被应用于对细菌进行药物敏感性试验的测定。通过多次重复试验，本发明方法的检测结果相当稳定，重复试验的结果几乎完全一致，试验结果的重复率基本为100％。以本发明方法与常规稀释法作测定MIC的平行试验，其所测MIC的吻合度达可95％，所显示的细菌定性药物敏感试验结果(耐药、中度敏感、极敏感)则完全一致，只是其MIC较常规方法低1-2个稀释度。从而表明，本发明上述的MTT方法与目前的常规方法在对细菌进行药物敏感性试验时，可得到基本一致和吻合的检测判定结果。由于本发明方法是以显色方式进行，并且所显的蓝色明显和易于观察分辨，可使其比目前常规所用的扩散法和稀释法具有多方面的优越性。例如，目前上述常规方法测定的时间通常需18～24小时，本发明上述的MTT方法则不超过5小时；上述常规稀释法对结果的判定是通过对各测试孔中菌液是否浑浊来实现，不直观，本发明上述的MTT方法则是通过在各测试孔白色背景下的蓝色显色反应实现；本发明MTT方法的准确度和敏感性均非常高，对上述常规稀释法检测中不易判定的测试孔，通过加入MTT检测试剂，观察是否出现蓝色即可准确作出判定。因此本发明的上述MTT方法与目前的常规检测方法相比，明显具有更加快速、准确、方便和直观，特别是可以用方便的直接观察方式作出定量性的判定的优点，在医学检验方面具有极大的实用价值和意义。
以下介绍的是作为对本发明上述内容进一步详细说明的实例。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例。各例中所用的MTT检测试剂的配制方法为：将市售的MTT溶解于pH7．2-7．4的磷酸盐缓中液中，配制成浓度为5毫克／毫升的溶液，微孔滤膜(0．22微米)过滤后，于-20℃保存备用。
例1
以本发明方法与常规微量稀释法对金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 25932)的药物敏感状况作对照试验。
常规微量稀释法，采用由华神药业股份有限公司研制的“华神药敏检测试剂盒”，按其说明书规定的方法操作。培养22小时后观察孔中试样是否浑浊。
本发明方法在该药敏板上已有标准浓度抗菌素的各孔中均加入浓度为1．5×106／毫升的菌液，于35～37℃常规孵育5小时后，测试板的各孔中分别均加入上述备用的MTT检测试剂5微升混合，于室温条件下放置10～30分钟，用眼直接观察孔中试样是否显蓝色。
两种方法的试验结果及判定结论如表5所示。该实验结果显示，两种方法虽在某些药物的具体MIC值上略有小的差异，但对细菌的药物敏感性判定结论则是完全一致的。
例2
以本发明方法与常规微量稀释法对阴沟肠杆菌标准菌株(ATCC 23355)的药物敏感状况作对照试验。
常规微量稀释法的操作同上例，培养24小时后观察孔中试样是否浑浊。
本发明方法的操作也同上例，培养5小时并加入检测试剂后，观察孔中试样是否显蓝色。
两种方法的试验结果及判定结论如表6所示。该实验结果显示，两种方法虽在某些药物的具体MIC值上略有小的差异，但对细菌的药物敏感性判定结论同样也是完全一致的。
表5 两种方法对金黄色葡萄球菌的药物敏感试验结果
| 试验药物 | 常规方法 | 本发明方法 | ||
| MIC(毫克／升) | 判定结论 | MIC(毫克／升) | 判定结论 | |
| 磺胺甲 恶唑 | 512 | 耐药 | 512 | 耐药 |
| 复达欣 | 16 | 中度敏感 | 16 | 中度敏感 |
| 头孢拉定 | 2 | 极敏感 | 8 | 极敏感 |
| 去甲万古霉素 | 1 | 极敏感 | ＜0．5 | 极敏感 |
| 洁霉素 | 0．5 | 极敏感 | ＜0．25 | 极敏感 |
表6 两种方法对阴沟肠杆菌的药物敏感试验结果
| 试验药物 | 常规方法 | 本发明方法 | ||
| MIC(毫克／升) | 判定结论 | MIC(毫克／升) | 判定结论 | |
| 对氨卞青霉素 | 8 | 极敏感 | 4 | 极敏感 |
| 对氧哌嗪青霉素 | 16 | 极敏感 | 8 | 极敏感 |
Claims (5)
1．一种用于细菌对药物敏感试验的方法，其特征在于在pH7．2-7．4的磷酸盐缓冲液中配制成含5毫克／毫升噻唑蓝的溶液作为检测试剂，将菌悬液与标准浓度的抗菌素在35℃～37℃常规恒温条件下保温作用2～5小时后，按菌悬液∶检测试剂体积比为20∶1的量与检测试剂混合，菌悬液的起始浓度≥1．5×106／毫升，以其显色反应进行细菌对药物敏感性的判定。
2．如权利要求1所述的细菌对药物敏感试验的方法，其特征在于所说的菌悬液起始浓度为1．5×106／毫升，与标准浓度抗菌素混合于35～37℃常规恒温条件保温2～5小时，再加入检测试剂于室温条件下放置～10分钟后，直接观察各混合试样，以有蓝色显色反应作为有活菌存在的定性判定。
3．如权利要求2所述的细菌对药物敏感试验的方法，其特征在于所说的菌悬液浓度为1．5×106／毫升，与标准浓度抗菌素混合于35～37℃常规恒温条件保温2～5小时，再加入检测试剂于室温条件下放置～10分钟后，直接观察按常规标准抗菌素浓度梯度排列的各混合试样的蓝色显色反应，以与蓝色显色试样所邻接的该未显色试样作药物最小抑菌浓度值的定量判定。
4．如权利要求1所述的细菌对药物敏感试验的方法，其特征在于所说的菌悬液浓度为1×106／毫升，与标准浓度抗菌素混合于35～37℃常规恒温条件保温2～5小时，再加入检测试剂继续保温30～60分钟后，按菌液量∶二甲基亚砜体积比为1∶2加入二甲基亚砜并混匀，以分光光度仪510～530纳米处的光密度值作药物最小抑菌浓度值的定量判定。
5．如权利要求4所述的细菌对药物敏感试验的方法，其特征在于以所说的分光光度仪的520纳米处的光密度值作药物最小抑菌浓度值的定量判定。
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