CN106282299B - 一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法，该方法包括如下步骤：a、制备载有待测药物的载体，所述载体可吸收水分；b、检测所筛选细菌的培养前最小抑菌浓度值；c、将所筛选细菌涂布在平板培养基上，并将载有待测药物的载体放置于培养基表面，培养细菌，载有待测药物的载体上形成抑菌圈；d、在c步骤获得的抑菌圈边缘0.5～4mm有菌区域内取菌，并重复c步骤；和e、检测每次培养细菌的最小抑菌浓度值，当检测培养细菌最小抑菌浓度值达到4倍诱导前的培养前最小抑菌浓度值时，得耐药细菌模型。

Description

一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法，属于生物领域。

背景技术

随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌不断出现，细菌的耐药性也不断增强。耐药菌的不断增加，给人和动物疾病的治疗带来了极大困难。细菌耐药性的产生和传播，引起了全世界的普遍关注，被世界卫生组织认为是21世纪最大的公共卫生安全问题之一。因此，对细菌耐药性的检测监测和评价就非常必要且十分迫切。

细菌耐药性的研究方法包括药物敏感性实验、质粒消除实验及质粒指纹图谱技术、基因探针技术、PCR技术、RT-PCR、基因芯片技术等。

以上技术所用研究对象除从临床分离的耐药菌株外，还通过体外人工诱导来获得耐药菌株，现较通用的是肉汤传代诱导方法。该法原理主要是让细菌在抗生素亚抑菌浓度的环境下持续传代培养，至细菌的最小抑菌浓度(MIC)变为原来4倍时，诱导结束。该法具有一定的局限性，主要表现在：①刺激细菌的亚抑菌浓度为人为设定，不同的浓度带来的实验结果不同，实验条件不易控制；②抗生素MIC含量极少，在配制过程中易出现误差，对实验结果影响较大；③每传代一次均要配制一定浓度的细菌液，一是繁琐，二是易出现误差；④在判断细菌诱导后的耐药程度时需要将细菌转种到固体平板上观测抑菌圈或测定MIC，实验环节多；⑤诱导周期较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法，该方法包括如下步骤：

a、制备载有待测药物的载体，所述载体可吸收水分；

b、检测所筛选细菌的培养前最小抑菌浓度值；

c、将所筛选细菌涂布在平板培养基上，并将载有待测药物的载体放置于培养基表面，培养细菌，载有待测药物的载体上形成抑菌圈；

d、在c步骤获得的抑菌圈边缘0.5～4mm有菌区域内取菌，并重复c步骤；

e、检测每次培养细菌的最小抑菌浓度值，当检测培养细菌最小抑菌浓度值达到4倍诱导前的培养前最小抑菌浓度值时，得耐药细菌模型。

进一步，步骤a所述载体为纸质的，所述药物均匀分布于载体；更进一步，所述载体为市售标准药敏纸片或按如下方法制备的含药纸片:

将定性滤纸制作成5-10mm的圆形滤纸片，装入青霉素小瓶内，瓶口封严，高压灭菌，烘干备用；将抗菌药物配制成药液，放入装有滤纸的小瓶内，使纸片充分浸透药液，烘干后密封备用。

进一步，步骤c培养温度为30～40℃，相对湿度为50～60％，培养时间为18～24小时；更进一步，培养温度为35℃，相对湿度为50％，培养时间为20小时。

进一步，步骤d取菌区域为抑菌圈边缘0.8～3mm；更进一步，为抑菌圈边缘1～2mm。

本发明所述待测药物为抗生素或具有抗菌作用的中药单方、复方水煎液、提取物或单体成分。

本发明方法适用于大部分需氧菌和厌氧菌及单细胞真菌，包括肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌和其他链球菌。

本发明的有益效果在于：

1、根据不同细菌对不同抗生素产生耐药变异的程度亦各有不同的特性，可以快速检验某一抗生素新药对哪种细菌存在产生耐药的可能性及耐药程度，进而预测该药在临床上的应用前景。

2、本发明方法在0代至N代做到全程监控，可以检测细菌在不同MIC时的生物学性状、生化代谢及结构上的的差异，为更深入探讨细菌耐药的形成过程提供了方法上的支持。

3、本发明利用纸片诱导法体外获得细菌耐药模型，一方面单纯验证了此方法；另一方面为建立细菌多重耐药模型打下实验基础，为涉及细菌耐药的相关研究提供一条新的途径。

4、与传统肉汤传代诱导法对比，本发明方法在实验环节、条件控制、结果判定及人力物力的投入上，均有较大的优势。另外，诱导浓度是细菌为生存而自我选择，且随传代这一浓度为逐渐变大的变量，有利于细菌耐药的快速形成，从而获得耐药菌株模型。

实施例1

1材料

菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希菌(ATCC25922)，铜绿假单胞菌(ATCC25922)，经复苏后传至第二代，4℃保藏备用。

培养基：营养琼脂，用于培养保存细菌；MHA(Mueller-Hinton Agar)，用于检测细菌MIC；MHB(Mueller-Hinton Broth)，用于细菌的传代诱导。平板直径为9cm，培养基厚度约4至5mm。

抗生素标准品：检测细菌MIC。用无菌PBS稀释为1mg/ml，分装后-20℃保存备用。

含药纸片：市售亚胺培南含药纸片，头孢他啶含药纸片。与抗生素标准品同种类，-20℃保存备用。

2实验方法

含药纸片诱导某一细菌之前，用肉汤稀释法检测该菌的MIC，此为0代细菌的MIC；用接种环取一环细菌均匀涂布在MH平板上，放置含抗生素纸片于培养基表面，37℃、50～60％湿度的环境下培养18～24h(此为诱导第1代)；在距离抑菌圈边缘1～2mm有菌区域内取一环菌，重复1代的操作至N代；在诱导传代的同时，用肉汤稀释法检测每代细菌的MIC，当测试菌的MIC达到4倍诱导前的MIC时，判定诱导成功；也可参照CLSI标准中的耐药范围，测量抑菌圈直径。

3实验结果

3.1金黄色葡萄球菌(ATCC25923)耐药结果

结果见表1。当金黄色葡萄球菌在亚胺培南持续刺激下传代至29代时，MIC值由0.5μg/ml提高到8μg/ml，诱导后的MIC值是诱导前的16倍，但诱导过程中MIC值有3次反复；该菌在头孢他啶持续刺激下传代至21代时，MIC值由7.81μg/ml提高到15.62μg/ml，是诱导前MIC值的2倍，在诱导过程中有1次反复。诱导金黄色葡萄球菌耐药时，头孢他啶较亚胺培南MIC值反复次数少，在抗生素对倍稀释的浓度梯度下平台期相对较长；但达到4倍诱导前MIC值时所需要的传代次数，亚胺培南少于头孢他啶。

表1本发明方法体外诱导金黄色葡萄球菌耐药不同代数的MIC(μg/ml)

诱导代数	0代	1～2代	3～7代	8～10代	11～14代
						亚胺培南	0.5	1	0.5	1	2
诱导代数	0代	1～9代	10～11代	11～20代	21～22代
						头孢他啶	7.81	7.81	3.91	7.81	15.62
诱导代数	15代	16代	17代	18～28代	29～30代
						亚胺培南	4	2	4	2	8

3.2大肠埃希菌(ATCC25922)耐药结果

结果见表2。当大肠埃希菌在亚胺培南持续刺激下传代至29代时，MIC值由0.5μg/ml提高到8μg/ml，是诱导前MIC值的16倍，但诱导过程中MIC值有2次反复；该菌在头孢他啶持续刺激下传代至8代时，MIC值由0.031μg/ml提高到0.125μg/ml，是诱导前MIC值的4倍，在诱导过程中有1次反复。诱导大肠埃希菌耐药时，头孢他啶较亚胺培南MIC值反复次数少，8代后MIC值无变化；达到4倍诱导前MIC值时所需要的传代次数，头孢他啶少于亚胺培南。

表2本发明方法体外诱导大肠埃希菌耐药不同代数的MIC(μg/ml)

诱导代数	0代	1～7代	8～10代	11代	12～14代	15～28代	29～30代
								亚胺培南	0.5	0.5	1	2	1	2	8
诱导代数	0代	1～4代	5代	6～7代	8～22代
								头孢他啶	0.031	0.062	0.125	0.062	0.125

3.3铜绿假单胞菌(ATCC25922)耐药结果

结果见表3。铜绿假单胞菌在亚胺培南持续刺激下传代至3代时，MIC值由8μg/ml提高到32μg/ml，是诱导前MIC值的4倍，4代至8代MIC值为诱导前的8倍，且无反复；该菌在头孢他啶持续刺激下，4代之前MIC无变化，传至5代时MIC值由0.5μg/ml直接跃至7.81μg/ml，是诱导前MIC值的14倍，且继续诱导传代至10代时，MIC值仍在提高。两种抗生素诱导大肠埃希菌耐 药时，MIC值无反复现象；亚胺培南达到4倍诱导前MIC值时所需要的传代次数少于头孢他啶，但头孢他啶经过诱导传代后，MIC值提高幅度大于亚胺培南。

表3本发明方法体外诱导铜绿假单胞菌耐药不同代数的MIC(μg/ml)

诱导代数	0代	1代	2代	3代	4代	5代	6代	7代	8代	9代	10代
												亚胺培南	8	16	16	32	64	64	64	64
头孢他啶	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	7.81	7.81	15.62	15.62	15.62	31.25

3.4不同诱导代数细菌抑菌圈直径与MIC的关系(以铜绿假单胞菌为例)

结果见表4。铜绿假单胞菌经亚胺培南和头孢他啶连续诱导传代后，抑菌圈直径随传代次数增加逐渐变小，而MIC为增高趋势。亚胺培南抑菌圈变小明显，诱导至7代时抑菌圈直径为0；而相对应的MIC值在4代以后呈较稳定的态势。头孢他啶抑菌圈减小的程度较亚胺培南弱，且所需要的传代次数多。2种抗生素在抑菌圈和MIC两者数据变化上均表现为负相关关系。见表4。

表4铜绿假单胞菌不同代数抑菌圈直径

mm与MICμg/ml的关系

实施例2本发明方法与肉汤传代诱导法的比较

肉汤传代诱导法：

实验方法：接种10μl 0.5麦氏浓度实验菌株菌液于1/4MIC抗生素浓度营养肉汤内，于35℃温箱内培养24小时为一代，后由该培养基中取第一代菌液稀释为上述浓度后继续传至下一相同的培养肉汤中……如此重复传代，传代同时用纸片法测量并记录每代转种菌株的抑菌环直径，根据临床实验室标准化研究院(CLSI)的标准判断是否出现耐药。出现耐药时，再精确测量该代菌的MIC值，若诱导后MIC值>4倍诱导前MIC，则判定诱导成功。

亚胺培南对大肠埃希菌的诱导结果

结果见表5。大肠埃希菌在1/4MIC抗生素浓度环境下进行连续传代，传至29代后，该菌对亚胺培南的MIC达到诱导前的4倍。而根据实施例1表2的结果，采用本发明方法传代至11代时大肠埃希菌对亚胺培南的MIC就达到诱导前的4倍。

表5亚胺培南体外诱导大肠埃希菌耐药不同代数的MIC(μg/ml)

诱导代数	0代	1～5代	6～15代	15～28代	29～35代
						MIC	0.5	0.5	1	1	2

亚胺培南对铜绿假单胞菌的诱导结果

结果见表6。铜绿假单胞菌在1/4MIC抗生素浓度环境下进行连续传代，传至11代后，该菌对亚胺培南的MIC达到诱导前的4倍。而根据实施例1表3的结果，采用本发明方法传代至3代时铜绿假单胞菌对亚胺培南的MIC就达到诱导前的4倍。

表6亚胺培南体外诱导铜绿假单胞菌耐药不同代数的MIC(μg/ml)

诱导代数	0代	1～3代	4～10代	11～15代
					MIC	8	8	16	32

通过上述实验可以看出本发明相对于肉汤传代诱导法存在明显优势，详见表7。

表7本发明方法相对于肉汤法的优势

因此，本发明方法较肉汤传代诱导法，在实验环节、条件控制、结果判定及人力物力的投入上，均有较大的优势。另外，诱导浓度是细菌为生存而自我 选择，且随传代这一浓度为逐渐变大的变量，有利于细菌耐药的快速形成，从而获得耐药菌株模型。

实施例3中药类含药纸片制备方法

本发明方法选用市售标准药敏纸片进行诱导，也可以采用自制药敏纸片进行诱导，自制药敏纸片方法如下：

用打孔器将新华1号定性滤纸制作成6mm的圆形滤纸片，50片一包装，装入青霉素小瓶内，用单层牛皮纸封口高压灭菌(121℃，15～20min)，烘干备用。

将中药(水煎剂、提取物或单体)配制成一定浓度的药液，将一定量药液放入装有50片滤纸的小瓶内，使纸片充分浸透药液，37℃，24～36h，烘干后密封备用。保持干燥或冷冻保藏。

根据50片滤纸吸收药液总量，计算出每个滤纸片药物含量。

Claims (8)

1.一种体外人工获得细菌耐药菌株的方法，该方法包括如下步骤：

a、制备载有待测药物的载体，所述载体可吸收水分；

b、检测所筛选细菌的培养前最小抑菌浓度值；

c、将所筛选细菌涂布在平板培养基上，并将载有待测药物的载体放置于培养基表面，培养细菌，载有待测药物的载体上形成抑菌圈；

d、在c步骤获得的抑菌圈边缘0.5～4mm有菌区域内取菌，并重复c步骤；

e、检测每次培养细菌的最小抑菌浓度值，当检测培养细菌最小抑菌浓度值达到4倍诱导前的培养前最小抑菌浓度值时，得耐药菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a所述载体为纸质的，所述药物均匀分布于载体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a所述载体为市售标准药敏纸片或按如下方法制备的含药纸片:

将定性滤纸制作成5-10mm的圆形滤纸片，装入青霉素小瓶内，瓶口封严，高压灭菌，烘干备用；将抗菌药物配制成药液，放入装有滤纸的小瓶内，使纸片充分浸透药液，烘干后密封备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c的培养温度为30～40℃，相对湿度为50～60％，培养时间为18～24小时。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养温度为35℃，相对湿度为50％，培养时间为20小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d取菌区域为抑菌圈边缘0.8～3mm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a所述待测药物为抗生素或具有抗菌作用的中药单方、复方水煎液、提取物或单体成分中的任意一种。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b所述细菌包括肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌中的任意一种。