CN107638588B - 包含细菌的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示内容提供了一种包含细菌的水凝胶，包含：水凝胶、细菌、和代谢物。水凝胶包含互相交联的多个高分子链，各高分子链包含至少一聚乙二醇链。细菌位于水凝胶内，且细菌以该高分子链为碳源发酵。代谢物为由细菌以该高分子链为碳源发酵时产生，并分布于该胶体中。本揭示内容亦提供一种包含细菌的水凝胶的制备方法。本揭示内容提供的水凝胶的功效在于能直接利用细菌在水凝胶内发酵并释出的代谢物。

Description

包含细菌的水凝胶及其制备方法
技术领域
本揭示内容是关于一种水凝胶，特别是一种内含细菌及其代谢物的水凝胶。
背景技术
利用细菌的发酵作用以获得细菌的代谢产物已有很久的历史，例如培养乳酸菌、醋酸菌、丝状菌、放线菌等，藉由菌体中的酶，能将培养基中的基质转化产出初级代谢物、次级代谢物、小分子活性物质，例如乙醇、乳酸、胺基酸、琥珀酸、丙酮酸、辅酶Q10等。
大多数发酵后的代谢混合物，后续须经分离、萃取、精制、或纯化等加工处理步骤，但这些处理过程可能造成其中一些代谢物的流失；或者，有些代谢物的物理化学性质较不稳定，较易挥发、降解、或失去活性。并且后续如需较完整地保留这些代谢物的组成或活性，也须较高的保存技术或成本。
发明内容
为了改善上述问题，本揭示内容提供一种水凝胶，其将细菌包封于水凝胶内部的三维网状结构中，并且细菌可利用水凝胶的胶体成分发酵，产生的代谢物，可直接从水凝胶向外释放。
本揭示内容的一实施方式为提供一种包含细菌的水凝胶，包含：一水凝胶，包含互相交联的多个高分子链，各该高分子链包含至少一聚乙二醇链；细菌，位于该水凝胶内，且该细菌以该高分子链为碳源发酵；以及代谢物，由该细菌以该高分子链为碳源发酵时产生，并分布于该胶体中。
本揭示内容的一实施方式为提供一种水凝胶的制备方法，包含：提供或接收一聚合物水溶液，该聚合物水溶液包含具有至少一聚乙二醇链的聚合物；将细菌与含有该聚乙二醇链的聚合物水溶液混合；使含有该细菌及该聚乙二醇链的聚合物水溶液发生交联反应，而形成含有该细菌的水凝胶；以及培养该水凝胶中的细菌，其中该细菌以该聚乙二醇链的聚合物为发酵的碳源而产生一代谢物。
根据本揭示内容的一实施方式，其中该聚乙二醇链的分子量为约250至约10000。
根据本揭示内容的一实施方式，其中各该高分子链为聚乙二醇、聚乙二醇二甲丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酰胺、或其组合。
根据本揭示内容的一实施方式，其中各该高分子链更包含一羧酸基团、一脂质基团、或一醣类基团，且该羧酸基团、该脂质基团及该醣类基团键结于该聚乙二醇链。
根据本揭示内容的一实施方式，其中该细菌为益生菌。
根据本揭示内容的一实施方式，其中该细菌为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)或痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。
根据本揭示内容的一实施方式，其中该代谢物包含具有2至6个碳原子的短链脂肪酸。
根据本揭示内容的一实施方式，其中各该高分子链包含聚乙二醇二甲丙烯酸酯，且该细菌为表皮葡萄球菌。
根据本揭示内容的一实施方式，其中各该高分子链更包含醣类基团，且该细菌为表皮葡萄球菌。
根据本揭示内容的一实施方式，其中各该高分子链更包含一羧酸基团，且该细菌为痤疮丙酸杆菌。
根据本揭示内容的一实施方式，其中使含有该细菌及该聚乙二醇链的聚合物水溶液发生交联反应包含：加入过氧二硫酸盐以及四甲基乙二胺(TEMED)于含有该细菌及该聚乙二醇链的聚合物水溶液中。
根据本揭示内容的一实施方式，其中使含有该细菌及该聚乙二醇链的聚合物水溶液发生交联反应包含：
根据本揭示内容的一实施方式，加入一光引发剂于含有该细菌及该聚乙二醇链的聚合物水溶液中，而形成一前驱物；以及以紫外光照射该前驱物，而形成该水凝胶。
根据本揭示内容的一实施方式，更包含将该水凝胶培养于一含养分的基质中。
附图说明
图1A绘示根据一些实施方式的水凝胶的示意图；
图1B绘示根据一些实施方式的水凝胶的示意图；
图2为根据一实验例，菌落数目的直方图；
图3A为根据一实验例，气相色谱质谱分析的结果；
图3B为根据一实验例，各短链脂肪酸量的直方图；
图3C为根据一实验例，各短链脂肪酸分子的质谱；
图4A为根据一实验例，培养盘上细菌生长的影像；
图4B为根据一实验例，菌落数目的直方图；
图4C为根据一实验例，培养盘上细菌生长的影像；
图4D为根据一实验例，菌落数目的直方图；
图5A为根据一实验例，培养盘上细菌生长的影像；
图5B为根据一实验例，菌落数目的直方图；
图5C为根据一实验例，培养盘上细菌生长的影像；
图5D为根据一实验例，菌落数目的直方图；
图5E为根据一实验例，培养盘上细菌生长的影像；
图5F为根据一实验例，菌落数目的直方图；
其中，符号说明：
100：水凝胶 102：含PEG链的高分子链
104：水分 106：细菌
200：水凝胶 202：含PEG链的高分子链
204：水分 206：细菌
208：代谢物。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本揭示内容的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本揭示内容具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。
在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。为简化图式，熟知的结构或装置仅示意性地绘示于图中。须注意的是，为了清楚地表示图式的特征，图式中各元件的尺寸可能会任意地增加或减少。
请参看图1A，为根据一些实施方式的水凝胶示意图，绘示包封细菌的水凝胶刚形成的结构。水凝胶100由含有聚乙二醇(PEG)链的高分子链102经交联反应而形成，其中含有水分104。细菌106包封于水凝胶100的三维网状结构中。
请参看图1B，为根据一实施方式的水凝胶示意图，绘示包封细菌的水凝胶开始发酵后的结构。水凝胶200由含PEG链的高分子链202聚合形成，其中含有水分204。细菌206分解含PEG链的高分子链202，作为发酵作用的碳源，产生代谢产物208，部分的代谢物208可释出水凝胶200外。
本揭露内容的实施方式以含聚乙二醇链的聚合物(高分子，高分子链)形成水凝胶。聚乙二醇是一种水溶性聚醚型高分子，在生物医学上的应用受到了广泛的重视，并得到美国食品与药品管理局(FDA)的认可。聚乙二醇具有很多优点，如低毒性、不凝血性以及生物相容性。聚乙二醇和其他分子耦连或形成共聚物时，聚乙二醇的许多优良性质也会随之转移到结合物中。因此，含聚乙二醇基的聚合物是理想的制备水凝胶的基材。
高分子链可为聚乙二醇或聚乙二醇衍生物。聚乙二醇衍生物可由其聚乙二醇的部分或其末端修饰基团通过物理或化学交联的方式生成聚乙二醇基水凝胶，因此相较于聚乙二醇，具有较多的交联方式，因而可得到许多构造及功能不同的水凝胶。
根据一些实施方式，含聚乙二醇链的高分子链可为聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二甲丙烯酸酯(Polyethylene glycol dimethacrylate，简称PEG-DMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(Polyethylene glycol diacrylate，简称PEG-DA)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(Polyethyleneglycol methacrylate，简称PEG-MA)、聚乙二醇二丙烯酰胺(Polyethylene glycoldiacrylamide，简称PEG-DAA)、或其组合。
根据一些实施方式，含聚乙二醇链的高分子链中所包含的聚乙二醇链的分子量可为约250至约10000，例如：分子量约250，500，1000，2000，5000，8000，或10000。
根据一些实施方式，其中含有聚乙二醇链的高分子链可包含醣类基团，脂质基团，或羧酸基团。并且此羧酸基团、此脂质基团，及此醣类基团键结于此聚乙二醇链。
根据一实施方式，含有聚乙二醇链及醣类基团的高分子链可例如Propargyl-PEG5-beta-D-glucose，或PEG5-tetra-Ac-beta-D-glucose。
根据一实施方式，含有聚二醇链及羧酸基团的高分子链为F68-COOH。
根据一些实施方式，藉由不同的含PEG链的衍生物所交联聚合形成的水凝胶，可筛选特定的可发酵水凝胶的细菌种类，或是产生不同的代谢物。
根据一实施方式，可藉由调整含聚乙二醇链的高分子链在水溶液的浓度，或接枝其他含碳的分子，以调控水凝胶的硬度、膨润度、含水量。
在一些实施方式中，于含聚乙二醇链的高分子链聚合反应前，将混合液注入模具以形成特定形状或厚度的水凝胶。例如：由玻璃夹片、硅胶条、与固定夹阻成的U型模具；其中，硅胶条置于玻璃夹片之间，并由固定夹将玻璃夹片与硅胶条夹紧。
根据一些实施方式，交联反应可以藉由加入引发剂而发生，引发剂可为过氧二硫酸盐，例如过氧二硫酸钠，过氧二硫酸钾，或过氧二硫酸铵。
根据一些实施方式，可于制备水凝胶体时，可加入产生自由基的催化剂，例如：亚硫酸钠或四甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetramethyl-ethane-1,2-diamine，简称TEMED)。
根据一实施方式，水凝胶中包含一指示剂成分，例如酚红，可根据水凝胶内的酸碱值产生颜色的变化，当酚红的颜色变为黄色时，可藉此判断水凝胶内含有细菌发酵产生酸性物质。
根据一实施方式，可利用UV光照射，以引发含聚乙二醇链的高分子链发生交联反应而形成水凝胶。例如，将含PEG链的高分子链(例如PEG-DMA)溶解于水溶液中，之后在溶液中加入光引发剂和菌液，将PEG-DMA/光引发剂/菌液(前趋物)避光搅拌均匀后，注入模具。然后进行紫外光照交联时，紫外光的照射时间不超过明显地造成细菌死亡的时间，例如不超过8分钟。紫外光照射后，含PEG链的高分子链交联形成水凝胶并同时将细菌包封于水凝胶中。其中光引发剂为在光照下可产生自由基引发聚合反应的化合物。
根据一实施方式，水凝胶中的细菌种类为与宿主(例如：人类)共生的菌种，例如：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，或痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)。
根据一实施方式，水凝胶所包封的细菌为益生菌。益生菌是普遍存在于宿主的皮肤、消化肠胃道、上呼吸道，属于宿主的正常菌丛与宿主共生，没有致病性或致病性低，能与致病的病原菌竞争，改善宿主微生物相中菌丛的平衡，因此有益宿主的健康。
根据一实施方式，水凝胶中的细菌具有可分解聚乙二醇链的酶，例如：dioldehydratase，PEG acetaldehyde lyase，或其他可分解含PEG链的高分子链的酶。细菌可能将酶分泌出菌体外，于体外将含PEG链转变为代谢产物；或是细菌可摄入含PEG链的高分子链的一部分后，在菌体内转变为代谢产物。
根据一些实施方式，加入细菌可在水凝胶开始聚合前，或开始聚合但未完全凝固为胶体时。
根据一实施方式，将细菌包封于水凝胶后，细菌可开始发酵PEG基水凝胶。
根据一实施方式，可将含细菌的水凝胶储存于较低的温度，例如：2℃至10℃。较佳为1至14天，更佳为1至10天，又更佳为1至7天。
根据一实施方式，可将包封细菌的水凝胶置于液态培养基中，以更佳地维持细菌活性。培养细菌的温度为摄式20℃至摄式40℃，例如20℃至25℃、25℃至30℃、30℃至35℃、35℃至40℃。培养时间为12小时至96时，较佳为24至70小时，更佳为48至72小时。培养基成分中含有碳源、氮源、硫源、磷源、无机盐、微量元素，例如培养基为胰蛋白酶大豆培养基(TSB)，或LB培养基(LB broth)。
根据一实施方式，PEG基水凝胶于使用时(例如覆盖在皮肤表面)，其中包封的细菌仍具有活性，因此可持续地发酵，制造代谢物，因此可利用细菌发酵的新鲜产物的组成分，并且有些易降解的产物也可持续在胶体内制造及释出。
根据一实施方式，亦可选择性地在发酵产生代谢物后，将水凝胶作灭菌处理，例如可用辐射灭菌(例如UV、X射线、γ射线)，高温蒸气湿热、化学处理(例如酒精)，使水凝胶在使用于人体前，没有细菌活性，而发酵的代谢物仍保留于水凝胶中。
根据一实施方式，本揭示内容的水凝胶所包含的含聚乙二醇链的高分子(高分子链，或聚合物)，为细菌选择性的发酵起始物，换言之，特定的细菌其具有分解及代谢此含聚乙二醇链的高分子链的酶，才能以此水凝胶发酵。
根据一实施方式，本揭示内容的水凝胶发酵释出的代谢物成分具有利于宿主的功效，例如可抑制宿主体表或粘膜的病原菌的生长。
根据一实施方式，水凝胶中的代谢物产物包含抗菌的物质，例如细菌素(Bacteriocin)或短链脂肪酸，例如：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸。
以下为通过实验例及实施例阐述本申请的揭示内容，但不构成对本申请的权利范围的限制。
细菌培养：
细菌以胰蛋白酶大豆培养基(tryptic soy broth,简称TSB)(Sigma,St.Louis,MO,USA)培养。隔夜培养后将菌液稀释100倍，再培养至OD600吸光值为1.0。离心5000xg10分钟以收集细菌。之后以磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline，简称PBS)清洗，并使细菌悬浮于PBS以做进一步的实验。
实验例1、含聚乙二醇链的高分子可做为特定细菌的选择性发酵的碳来源。
实验方法：
测试表皮葡萄球菌(ATCC编号12228)、痤疮丙酸杆菌(ATCC编号6919)，和USA300(一致病性的抗药性黄金葡萄球菌菌株)三种细菌，分别培养于不含PEG-DMA的固态培养基，和含PEG-DMA的固态培养基，之后检视不同实验条件下各菌种的发酵状况。
实验材料：
1.制备养分充足的藻胶培养基，培养基中含有2％重量/体积的藻胶，并添加养分充足培养基成分：10克/升的酵母菌抽出物(Biokar Diagnostics,Beauvais,France)，3克/升TSB，2.5克/升K2HPO4，和1.5克/升KH2PO4)。此外，培养基中添加0.002％重量/体积的酚红，酚红的颜色从红色或橘红转变为黄色表示培养基中产生酸性物质。
2.制备含PEG-DMA的培养基，如前述养分充足的藻胶培养基的配方，并添加2％重量/体积的PEG-DMA(平均分子量为550，型号25852-47-5，Sigma)。PEG-DMA的结构式为
Figure BDA0001356820190000081
其中n为对应分子量的整数。
将欲测试的细菌加入固态培养基的方式为在制备含培养基的藻胶加热后，冷却至约45℃，将细菌加入含培养基的藻胶并混合均匀，之后藻胶凝固后，细菌分布于固态培养基中。细菌数量为每200微升(μl)的固态培养基中有106的菌落形成单位(CFU)。
将细菌培养于V-底的96-孔聚丙烯(polypropylele,PP)微量盘(
Figure BDA0001356820190000082
Corning,NY)。每一孔的固态培养基体积为200微升。控制组包括培养基仅加PEG-DMA，或仅加细菌。将细菌于37℃培养2天。
实验结果如下表一，其中「-」表示培养基中无添加成分或细菌，「+」表示培养基中有添加此成分或细菌。表一显示，表皮葡萄球菌在含有PEG-DMA的培养中，含酚红的固态培养基在两天后转变为黄色。而在痤疮丙酸杆菌和USA300的培养中，添加PEG-DMA并不会发酵变为黄色。因此，PEG-DMA选择性地诱发表皮葡萄球菌的发酵，而不会引起痤疮丙酸杆菌和USA300的发酵。此外，不同的菌种能制造不同的酶以对特定的基质发酵，表一显示在这3种细菌中，表皮葡萄球菌具有发酵PEG-DMA的酶。
表一
组别1 组别2 组别3
细菌(-) 细菌(+) 细菌(+)
PEG-DMA(+) PEG-DMA(+) PEG-DMA(+)
表皮葡萄球菌 橘红 橘红 黄
痤疮丙酸杆菌 橘红 橘红 橘红
USA300 橘红 橘红 橘红
实验例2、含单醣基团的PEG链分子能做为细菌的选择性发酵的碳来源。
所测试的含单醣基团的PEG链分子为化合物A：propargyl-PEG5-beta-D-glucose(分子量394.4)，结构式如下：
Figure BDA0001356820190000091
以及化合物B：PEG5-tetra-Ac-beta-D-glucose(分子量562.6)，结构式如下：
Figure BDA0001356820190000092
实验方法为将化合物A及化合物B各自添加于固态藻胶培养基，并加入表皮葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌于培养基中培养，之后记录培养基中的酚红指示剂的颜色。
实验结果如下表二所示，其中「-」表示培养基中无添加此成分，「+」表示培养基中含有此成分。表二显示，表皮葡萄球菌可发酵化合物A及化合物B，但痤疮丙酸杆菌则无法发酵化合物A及化合物B。因此，这两个含单醣基团的PEG链分子能做为表皮葡萄球菌的选择性发酵起始物。
表二
化合物A(-) 化合物A(+) 化合物B(-) 化合物B(+)
表皮葡萄球菌 红 黄 红 黄
痤疮丙酸杆菌 红 红 红 红
实验例3、含羧酸基团的PEG链分子，能做为细菌的选择性发酵的碳来源。
泊洛沙姆(F68)，又称Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol)，为含有PEG链的高分子。F68(分子量约8400，型号：412325，SIGMA-ALDRICH)的结构如下：
Figure BDA0001356820190000093
将F68末端的羟基(-OH基团)修饰为羧酸(-COOH基团)，结构式如下：
Figure BDA0001356820190000101
将产生的具有羧酸基的F68(F68-COOH)添加至TSB培养液，与痤疮丙酸杆菌一起培养，以下表三为实验的条件及结果，其中「-」表示无添加此成分或细菌，「+」表示有添加此成分或细菌。
表三
F68-COOH - + - +
痤疮丙酸杆菌 - - + +
两天后的培养液颜色 红 橘红 橘 黄
以上结果显示，当培养液中存在F68-COOH时，痤疮丙酸杆菌可将F68-COOH代谢产生酸性的代谢产物。因此，对于痤疮丙酸杆菌，F68-COOH为一选择性的发酵起始物。
实验例4、双层胶体重叠试验，测试表皮葡萄球菌发酵PEG-DMA对USA300的生长的影响。
实验步骤：配制养分充足的藻胶培养基，其中含有2％重量/体积的藻胶。将培养基加热，冷却至45℃后，加入USA300细菌，添加的菌量为每200微升内含USA300的数目为105CFU。
实验组为固态培养基中添加2％PEG-DMA，对照组为未添加PEG-DMA的固态培养基。以V-底的96孔PP微量盘培养细胞，每一孔加200微升含USA300菌的培养基。表皮葡萄球菌涂布在含USA300的固态培养基的上表面，涂布量为20微升的PBS内含细菌数目105CFU。
于37℃培养两天后，拍摄每一个培养孔的藻胶影像，计算在固态培养基中USA300的菌落数(计算大于0.005mm2的菌落)，以ImageJ软体(NIH,Bethesda,MD,USA)计数。
请参看图2，为固态培养基中USA300的菌落数目的直方图，数字为3次独立实验的平均值加减标准差，图式中的「**」符号表示双尾t-检定的p值小于0.01。
图2显示，含有PEG-DMA的培养基中USA300的菌落数目，明显少于在不含PEG-DMA的培养基中USA300的菌落数目。因此，PEG-DMA的存在能促进表皮葡萄球菌抑制USA300的生长。并且生长在固态培养基上的表皮葡萄球菌，能将PEG-DMA发酵，产生抑制USA300生长的成分，其扩散进入固态培养基，所以降低固态培养基中USA300的菌落生长。
实验例5、将表皮葡萄球菌与PEG-DMA共培养于液态培养基后，将菌液进行气相色谱质谱分析。
所用的机器型号Agilent 5890Series II GC连接5971MS detector(AgilentTechnologies,Inc.,Palo Alto,CA)。
实验步骤：表皮葡萄球菌(ATCC编号12228)培养在添加入2％PEG-DMA的液态培养基。对照组为不含PEG-DMA的液态培养基，于37℃培养两天。之后以5000xg的离心力离心10分钟，收集上清液。以0.22微米(μm)孔径的滤膜过滤上清液以移除上清液中残留的细菌。之后以气相色谱质谱分析检验上清液中的短链脂肪酸成份，2H7-butyric acid为标准样品。
由于许多细菌的抑菌发酵成份为短链脂肪酸，因此本实验分析表皮葡萄球菌的代谢PEG-DMA的产物中的短链脂肪酸成分。实验结果显示，在不含PEG-DMA的培养液的上清液中，仅侦测到极端低的(小于0.1微克/毫升)的短链脂肪酸量。请参看图3A，气相色谱质谱分析的结果，显示表皮葡萄球菌发酵PEG-DMA产生的5个主要的短链脂肪酸，分别为醋酸(Ac)，丙酸(PA)，异丁酸(Iso-BA)，丁酸(BA)，和异戊酸(Iso-VA)，其中「*」符号表示为标准样品(2H7-butyric acid)的峰(peak)。图3B为各个短链脂肪酸量(单位：微克/毫升)的直方图，显示样品中含有醋酸(592.1微克/毫升)，丙酸(7.8微克/毫升)，异丁酸(8.3微克/毫升)，丁酸(3.8微克/毫升)，异戊酸(11.9微克/毫升)。图3C为所辨识的5个短链脂肪酸(醋酸、丙酸、异丁酸、丁酸、和异戊酸)的质谱，例如位在31，43，45，和60m/z值的分子离子符和乙酸的HCO+，CH3CHO+，CH3CO+，CH3COOH质谱。
这些结果显示表皮葡萄球菌将PEG-DMA发酵代谢成特定的短链脂肪酸成分。
实验例6、以最低杀菌浓度测试(minimum bactericidal concentration，简称MBC)短链脂肪酸抗USA300的活性。
实验方法：USA300细菌(106CFU/mL)分别与不同浓度的丁酸或醋酸，在96孔微量盘过夜培养，醋酸和丁酸的测试浓度为0.02mM至100mM，于每一小孔中各加100微升不同浓度的醋酸或丁酸。控制组为仅加PBS。培养后，将USA300与PBS做1:100至1:105的序列稀释，取5微升的稀释液涂布在藻胶盘上，隔夜培养后计算藻胶盘上的菌落数(CFU)。MBC定义为达到99.9％(大于1log10菌落数/毫升)的杀菌程度。
实验结果请参看图4A至图4D。图4A及图4C为细菌生长的影像图。图4B及图4D为量化的直方图，根据三次独立的结果，显示平均值加减标准差。符号「***」表示双尾t-检定的p值小于0.001。UD为检测不到(undetectable)。
实验结果显示丁酸的MBC值和醋酸的MBC值为10mM，且两种酸完全抑制USA300的浓度为50mM。
先前已知丙酸可在试管中及活体中抑制USA300的生长。丙酸抗USA300的活性源自于它降低USA300细胞内pH值的能力。本实验分析乙酸和丁酸，其为表皮葡萄球菌发酵PEG-DMA所产生的含量较高的短链脂肪酸，因此于体外(in vitro)检验乙酸和丁酸这两种成分的抑制USA-300的活性。实验的结果显示这2种短链脂肪酸，具有良好的抑制USA300生长的功效。
实验例7、包封于PEG-DMA水凝胶的表皮葡萄球菌可发酵PEG-DMA。
水凝胶制作方法：将10％重量/体积的PEG-DMA(平均分子量为550，型号25852-47-5，Sigma)溶解于水中，的后加入0.002％重量/体积的酚红以作为指示剂，0.001％的过氧二硫酸铵(APS)作为提供自由基的引发剂，以及表皮葡萄球菌(2x108CFU/毫升)，将这些成分混合均匀。的后加入TEMED作为自由基反应的催化剂，使PEG-DMA交联形成水凝胶，且表皮葡萄球菌也包封于水凝胶中。此外，制备控制组水凝胶，例如：没有添加表皮葡萄球菌的水凝胶，不含表皮葡萄球菌的丙烯酰胺水凝胶(acrylamide hydrogel)，以及包封表皮葡萄球菌的丙烯酰胺水凝胶。
之后将水凝胶置入含TBS的液态培养基中，于37℃培养3天。
以下表四显示，培养两天后水凝胶的呈色，酚红的颜色与水凝胶内的发酵作用有关。其中，符号「-」表示水凝胶中没有表皮葡萄球菌，符号「+」表示水凝胶中包封表皮葡萄球菌。表四显示包封表皮葡萄球菌PEG-DMA水凝胶，水凝胶中酚红的颜色从橘红变为黄色，而丙烯酰胺水凝胶及不含细菌的水凝胶则无此现象。因此，表皮葡萄球菌能代谢水凝胶中的PEG-DMA。
表四
表皮葡萄球菌(-) 表皮葡萄球菌(+)
PEG-DMA水凝胶 橘红 黄
丙烯酰胺水凝胶 橘红 橘红
实验例8、含表皮葡萄球菌的PEG-DMA水凝胶抑制小鼠皮肤伤口中的USA300细菌。
小鼠实验执行于加州大学圣地牙哥分校(UCSD)。UCSC伦理委员会按照动物照顾和使用委员会(IACUC)的协议(编号：S10058)核准这项研究。
水凝胶制作方法：将10％重量/体积的PEG-DMA(平均分子量为550，型号25852-47-5，Sigma)溶解于水中，之后加入0.001％重量/体积的过氧二硫酸铵(APS)作为提供自由基的引发剂，表皮葡萄球菌(每毫升的混合液中含2x108CFU)，混合均匀。之后加入TEMED作为自由基反应的催化剂，使PEG-DMA交联形成水凝胶，且表皮葡萄球菌也包封于水凝胶中。之后将水凝胶静置于含TBS的液态培养基中。此外制备不含表皮葡萄球菌的PEG-DMA水凝胶，不含细菌的丙烯酰胺水凝胶，以及包封表皮葡萄球菌的丙烯酰胺水凝胶。
实验所用的动物为2至3个月大的ICR(Institute of Cancer Research)母小鼠(Harlan Labs,Placentia,CA,USA)。以异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠后，以电动剪刀在小鼠的背部皮肤左右两侧制造2道各1mm长的伤口，分别为第一道伤口，和第二道伤口。之后为了模拟抗耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染，以含USA300的缓冲溶液(108CFU溶于10微升PBS)加在伤口上。
实验组为小鼠感染USA300菌10分钟后，覆盖PEG-DMA水凝胶(不含表皮葡萄球菌)于第一道伤口上，以及覆盖包封表皮葡萄球菌的PEG-DMA的水凝胶在同一只小鼠的第二道伤口上。
对照组1为小鼠感染USA300菌10分钟后，第一道伤口上没有覆盖水凝胶，以及覆盖PEG-DMA水凝胶(不含表皮葡萄球菌)在同一只小鼠的第二道伤口上。
对照组2为小鼠感染USA300菌10分钟后，覆盖丙烯酰胺水凝胶(不含表皮葡萄球菌)于第一道伤口上，以及覆盖包封表皮葡萄球菌的丙烯酰胺水凝胶在同一只小鼠的第二道伤口上。
一共执行3次独立实验，其中每次每组小鼠数目为3只。所有使用小鼠的实验皆操作于生物安全性等级2(BSL-2)的设施中。
为了计算USA300的数目，于感染后24小时后，切下小鼠伤口处的皮肤。切下的皮肤以组织研磨器在500微升PBS缓冲液中均质化。将均质化的组织液作序列稀释，涂布在含酚红的甘露醇盐藻胶(mannitol salt agar，简称MSA)培养盘(BD,Sparks,MD,USA)。将培养盘于37℃培养24小时，的后计算培养盘上的菌落数目，其中黄色菌落视为USA300菌落。
请参看图5A至图5F，其中图5A、图5C、图5E为各序列稀释浓度的细菌生长的影像。图5B、图5D、图5F为为3次独立实验，每组各3只小鼠的量化结果，显示USA300的菌落数目(黄色菌落数目)的平均值加减标准差。符号「***」表示双尾t-检定的p值小于0.001。
图5A及图5B显示以包封表皮葡萄球菌的PEG-DMA水凝胶覆盖伤口，USA300的菌落数目(7.5±1.2x105CFU)，明显少于以PEG-DMA水凝胶覆盖伤口处的USA300的菌落数目(5.0±1.5x105CFU)。这证明包封表皮葡萄球菌的PEG-DMA水凝胶具有在伤口处抑制抗药性病原菌USA300生长的益生菌的活性。
图5C及图5D显示对照组1的实验结果，未包封细菌的PEG-DMA水凝胶(PEGHydrogel)并不会降低伤口中的USA300生长，这显示PEG-DMA水凝胶本身并未影响伤口中USA300的定殖。图5D中「ns」代表统计结果的差异为不显著(not significant)。
图5E及图5F显示对照组2的实验结果，丙烯酰胺水凝胶(Acrylamide Gel)有无包封表皮葡萄球菌，对于伤口中的USA300的生长，没有显著差异。图5F中「ns」代表统计结果的差异为不显著(not significant)。
以上这些结果显示，水凝胶中的PEG-DMA发酵后，具有能抑制伤口中的病原菌USA300的生长的功效。
本揭示内容的有益效果：
本揭示内容的水凝胶，可以保持大量的水分在胶体的三维结构中，并维持一定的形状，因此，将水凝胶作为载体，于使用时可提供或维持所覆盖之处的湿度，并将水凝胶中含有的功效分子成分缓释出来。
本揭示内容的以PEG为基底的水凝胶，可作为碳源丰富的微环境，不但可让细菌存活在其中，更诱导细菌利用含PEG链的高分子链(聚合物)当作碳的来源进行发酵，释放出发酵的功能性产物。例如本揭示内容的实验例显示包封表皮葡萄球菌的PEG-DMA水凝胶，特异性发酵PEG-DMA代谢成特定的短链脂肪酸并具有良好的抗菌效果。短链脂肪酸一般是具2至6个碳原子的脂肪酸，也称为挥发性脂肪酸，为具有短的半衰期为能被快速代谢的挥发性化合物。短链脂肪酸除了可抑制病原菌的生长，对于宿主细胞，短链脂肪酸为class I和classII的组蛋白去乙酰酶(HDAC)的抑制剂，并且可抑制发炎反应。
因此本揭示内容的水凝胶的一用途为可作为一种新型的抗菌水凝胶，应用于生物医学领域，例如皮肤保养品(例如：面膜，凝胶)，或是医疗材料(例如敷料、贴片)。
宿主身上的不同的细菌种类会制造不同的特定的酶以代谢特定的碳源。大部分皮肤共生的细菌包括表皮葡萄球菌，痤疮丙酸杆菌，和致病的黄金葡萄球菌会代谢同样的碳源，例如葡萄糖为短链脂肪酸。为了得到最大的存活率，共生的细菌和致病的葡萄球菌可能经由发酵葡萄糖产生短链脂肪酸，互相排挤。一但致病黄金葡萄球菌克服这些干扰存活，感染会加速，对宿主造成危害。而本揭示内容的实施例显示藉由选择性的发酵起始物(SFI)以特异性地驱动表皮葡萄球菌的发酵，因此可放大表皮葡萄球菌对抗致病的黄金葡萄球菌的益生菌效应。
抗耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus，简称MRSA)或称多重抗药金黄色葡萄球菌(Multiple-resistant Staphylococcusaureus)，是金黄色葡萄球菌的一独特菌株，对几乎所有青霉素类抗生素具有抗药性，包括甲氧苯青霉素(Methicillin)及其他抗β内酰胺酶的青霉素。MRSA首次发现于1961年的英国，目前已广泛散播，在医院中此细菌更被称为「超级细菌」。
切开伤口引流是抗耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌感染病人的治疗措施，这些病人通常也被施加抗生素作为辅助治疗。然而，对于多重抗药性细菌使用抗生素治疗，细菌可能演化出中和这些抗生素的能力。换言之，使用抗生素，提高了产生抗药性细菌的风险，并且非专一性地也杀死其他与宿主共生的细菌菌种。
本揭示内容的水凝胶，可应用于作为抗生素治疗时的佐剂，以减少抗生素的使用量，因此减少产生抗药性细菌的机会，以及减少对非病原性共生菌的杀菌效果。
本揭示内容的水凝胶，亦可应用于经皮给药的贴片剂型。经皮给药的投药系统可长效缓慢的释放功效分子于皮肤。但是一些具功效的细菌二次代谢物半衰期短，因此藉由活性细菌在胶体中的发酵作用，可以持续性地产生及释放具功效分子。
虽然本揭示内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

Claims (7)

1.一种包含细菌的水凝胶，其特征在于，包含：
水凝胶，包含互相交联的多个高分子链，所述高分子链为聚乙二醇二甲丙烯酸酯或包含醣类基团的PEG链分子；
细菌，位于所述水凝胶内，且所述细菌以所述高分子链为碳源发酵，所述细菌为表皮葡萄球菌；以及
代谢物，由所述细菌以所述高分子链为碳源发酵时产生，并分布于所述水凝胶的胶体中。
2.如权利要求1所述的包含细菌的水凝胶，其中所述高分子链的分子量为250至10000。
3.如权利要求1所述的包含细菌的水凝胶，其中所述包含醣类基团的PEG链分子为Propargyl-PEG5-beta-D-glucose或PEG5-tetra-Ac-beta-D-glucose。
4.如权利要求1所述的包含细菌的水凝胶，其中所述代谢物包含具有2至6个碳原子的短链脂肪酸。
5.一种包含细菌的水凝胶，其特征在于，包含：
水凝胶，包含互相交联的多个高分子链，所述高分子链为包含羧酸基团的PEG链分子；
细菌，位于所述水凝胶内，且所述细菌以所述高分子链为碳源发酵，所述细菌为痤疮丙酸杆菌；以及
代谢物，由所述细菌以所述高分子链为碳源发酵时产生，并分布于所述水凝胶的胶体中。
6.如权利要求5所述的包含细菌的水凝胶，其中所述高分子链的分子量为250至10000。
7.如权利要求5所述的包含细菌的水凝胶，其中所述高分子链为F68-COOH。
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