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De
vorliegende Erfindung stellt elektrogesponnene Polymerfasern umfassend
Partikel aus Bakterien enthaltenden Hydrogelen bereit. Dabei werden
die Bakterien in vernetzte Hydrogele verpackt und anschließend
mit einem elektroverspinnbaren Polymer zu Fasern oder Faservliesen
versponnen. Die Bakterien sind in dieser erfindungsgemäßen
Vorrichtung ohne Zufuhr von Wasser bzw. Zellkulturmedien über
lange Zeit lebensfähig und vor dem Einfluss ansonsten für
sie tödlicher Lösungsmittel geschützt.
Durch Kontakt mit Wasser oder Zellkulturmedium lassen sich die Bakterien
wieder freisetzen.
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Beschreibung und Einleitung
des allgemeinen Gebietes der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete makromolekulare Chemie,
Polymerchemie, Mikrobiologie und Materialwissenschaften.
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Stand der Technik
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Nutzbakterien,
die erwünschte Stoffwechselprozesse durchführen
oder pathogene Keime abtöten, finden vielfältige
Verwendung beispielsweise in Abwasserreinigung, Gewässerschutz,
dem Bauwesen, im Agrar- und Lebensmittelbereich, der Pharmazie,
in Fermentationsprozessen und in Textil- und Kosmetikindustrie.
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Bisher
erfordert die Lagerung von Bakterien erheblich finanziellen und
technischen Aufwand, beispielsweise für die Anschaffung
und Unterhaltung von Zellkulturschränken und Kulturgefäßen,
das Gefriertrocknen, das Einfrieren und Lagern von Bakterien bei
sehr tiefen Temperaturen und das regelmäßige Versorgen
der Bakterien mit Nährmedien.
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Auch
gibt es Anwendungen, bei denen Bakterien unter Anderem vor dem Einfluss
einiger Lösungsmittel geschützt werden müssen,
die für sie tödlich sind.
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Daher
gibt es zahlreiche Bemühungen, Bakterien zu „verpacken”,
so dass sie vor dem Einfluss schädlicher Substanzen geschützt
sind und/oder sogar in Abwesenheit von Wasser oder Zellkulturmedium überlebensfähig
sind.
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In M
Okazaki, T Hamada, H Fujii, A Mizobe und S Matsuzawa beschreiben
in „Development of Poly(vinyl alcohol) Hydrogel for Waser
Water Cleaning. I. Study of Poly(vinyl alcohol) Gel as a Carrier
for Immobilizing Microorganisms.", J Appl
Polym Sci 1995, 58, 2235–2241 sowie in M
Okazaki, T Hamada, H Fujii, O Kusudo, A Mizobe und S Matsuzawa: "Development
of Poly(vinyl alcohol) Hydrogel for Waste Water Cleaning. II. Treatment
of N,N-Dimethylformamide in Waste Water with Poly(vinyl alcohol)
Gel with Immobilized Microorganisms." J Appl Polym Sci
1995, 58, 2243–2249 das Verpacken von Bakterien
in Hydrogelpartikel aus Polyvinylal kohol (PVA). Hierbei werden größere
Zellverbände verpackt, und die resultierenden Bakterien
enthaltenden Partikel sind durchlässig für Sauerstoff
und wässrige Medien.
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P
Wittlich, E Capan, M Schlieker, K-D Vorlog und U Jahnz beschreiben
in „Entrapment in LentiKats®" in „Fundamentals
of Cell Immobilisation Biotechnology. Series: Focus an Biotechnology,
Vo. 8A", V Nedovic, R Willaert (Eds.) Springer-Verlag,
Heidelberg 2004, S. 53–63 das Einkapseln von Biokatalysatoren
wie Bakterien, Pilzen, Hefen oder Enzymen in LentiKats®,
d. h. in vernetzte PVA-Partikel. Die Partikel enthalten einzelne Zellen
oder sehr kleine Zellverbände, messen jedoch in wässrigen
Lösungen bzw. Zellkulturmedien aufbewahrt werden, damit
die Biokatalysatoren nicht absterben.
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Die
DE 10 2005 053 011
A1 beschreibt Tetraorganosilicium-Partikel als Vesikel
zum Verpacken von Wirkstoffen. Erfindungsgemäße
Tetraorganosilicium-Verbindungen können Ausgangsstoffe
für die Herstellung von Hydrogelen sein, und bei den Wirkstoffen
kann es sich optional um Bakterien, Bakterienkonjugate oder Bakterienpräparate
handeln. Es findet sich jedoch kein Hinweis auf Bakterien enthaltende
Hydrogel-Vesikel, bei denen die Bakterien ohne Zufuhr von Luft und/oder
wässrigen Medien überlebenfähig wären.
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Die
Herstellung von Polymerfasern mit Durchmessern im Mikro- und Nanometerbereich
ist beispielsweise in der
DE
100 23 456 A1 beschrieben. In der
DE 100 53 263 A1 ist die
Herstellung von orientierten Meso- und Nanoröhrenvliesen
offenbart.
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Die
WO 2008/049250 A1 beschreibt
antibakterielle elektrogesponnene Polymerfasern mit Polyethylenimin-Nanopartikeln
für textile Anwendungen. Darin ist dargelegt, wie Mischungen
aus Partikeln (hier: aus Polyethylenimin) und elektrospinnbaren
Polymeren gemeinsam zu Fasern versponnen werden können.
Es handelt sich hierbei jedoch um antibakterielle Partikel, die
ihrerseits keine weiteren Substanzen oder Mikroorganismen verkapseln.
Zudem sind diese Partikel deutlich kleiner als die Bakterien enthaltenden
Partikel (nm vs. μm).
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Die
vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile des Standes
der Technik und stellt erstmals Bakterien enthaltende Hydrogelpartikel
bereit, die gemeinsam mit elektrospinnbaren Polymeren zu Fasern
und Faservliesen versponnen werden können. Die Bakterien
in den erfindungsgemäßen Polymerfasern umfassend Bakterien
enthaltende Hydrogelpartikel überleben für lange
Zeit ohne Zufuhr von Wasser bzw. Zellkulturmedien und sind in dieser
Vorrichtung vor dem Einfluss von ansonsten für sie tödlichen
Lösungsmitteln geschützt.
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Aufgabe
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Vorrichtung, in der Bakterien in wasserfreiem
Zustand überleben und vor dem Einfluss organischer Lösungsmittel
geschützt sind sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser
Vorrichtung bereitzustellen.
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Lösung der Aufgabe
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Diese
Aufgabe der Bereitstellung einer Vorrichtung, in der Bakterien in
wasserfreiem Zustand überleben und vor dem Einfluss organischer
Lösungsmittel geschützt sind, wird erfindungsgemäß gelöst
durch elektrogesponnene Polymerfasern umfassend Partikel aus Bakterien
enthaltenden Hydrogelen.
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Überraschend
wurde gefunden, dass Bakterien lange Zeit in wasserfreiem Zustand überleben
und auch vor dem Einfluss für sie an sich tödlicher
organischer Lösungsmittel geschützt sind, wenn
diese Bakterien zunächst in Hydrogelpartikel verpackt und
die Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikel anschließend
in elektrogesponnene Fasern eingebracht werden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung, in der Bakterien
in wasserfreiem Zustand überleben und vor dem Einfluss
organischer Lösungsmittel geschützt sind sowie
das Verfahren zur Herstellung dieser Vorrichtung sind nachfolgend
erläutert, wobei die Erfindung alle nachfolgend aufgeführten
Ausführungsformen einzeln und in Kombination miteinander
umfasst.
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Ein
Hydrogel ist ein wasserenthaltendes, jedoch wasserunlösliches
Polymer, dessen Moleküle chemisch oder physikalisch zu
einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind. Auf Grund
der Vernetzung ist zwar keine Wasserlöslichkeit gegeben,
aber Quellfähigkeit beim Kontakt mit Wasser. Beispielhaft,
aber nicht erschöpfend bestehen die Hydrogele aus den folgenden
Polymeren, jeweils in vernetzter Form: Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid,
Polyethylenimin, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylsäure, Methylzellulose,
Hydroxypropylzellulose, Polyacrylamid oder teilverseiftes Zelluloseacetat.
Alternativ kann es sich bei dem Hydrogel um Stärke handeln,
wobei Stärke verzweigt und nicht vernetzt ist.
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Dem
Fachmann ist bekannt, wie wasserlösliche Polymere chemisch
vernetzt werden können. Hierzu zählen beispielsweise
die Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen sowie
Vernetzungsmittel. Zu diesen Vernetzungsmitteln gehören
beispielsweise Monoaldehyde, Dialdehyde, Natriumhypochlorit, Diisocyanate,
Dicarbonsäurehalogenide und chlorierte Epoxide.
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Werden
im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrogele aus chemisch vernetzten
Polymeren eingesetzt, so werden die Vernetzungsmittel bevorzugt
aus Monoaldehyden wie Acetaldehyd, Formaldehyd und Dialdehyden wie
Glutaraldehyd ausgewählt.
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Handelt
es sich bei dem eingesetzten Hydrogel um chemisch vernetzten Polyvinylalkohol,
so wird als Vernetzungsmittel bevorzugt Glutaraldehyd eingesetzt.
Dem Fachmann ist bekannt, welche chemischen Vernetzungsmittel für
welche Polymere besonders gut geeignet sind. Er kann dieses Wissen
anwenden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu
verlassen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Hydrogele
aus vernetztem Polyvinylalkohol (PVA). Besonders bevorzugt bestehen
sie aus physikalisch vernetztem PVA.
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Die
physikalische Vernetzung von PVA zu Hydrogelen geschieht beispielsweise
durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen einer Lösung
dieses Polymeren. Dabei bilden sich in der Polymerlösung
Kristallite, die als Vernetzungspunkte wirken. Alternativ lässt
sich die physikalische Vernetzung auch durch Dehydratation und anschließendes
Annealing des Polymeren bewirken, da auch dabei Kristallite als
Vernetzungspunkte ausgebildet werden.
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Nachfolgend
sind Phyla (Stämme), Klassen und Ordnungen der Bakterien
genannt, die erfindungsgemäß in Hydrogelpartikel
eingebracht werden können:
- – Phylum:
Aquificae
- – Klasse: Aquificae
- – Odnung: Aquificales
- – Phylum: Thermotogae
- – Klasse: Thermotogae
- – Ordnung: Thermotogales
- – Phylum: Thermodesulfobacteria
- – Klasse: Thermodesulfobacteria
- – Ordnung: Thermodesulfobacteriales
- – Phylum: Deionococcus-Thermus
- – Klasse: Deinococci
- – Ordnungen: Deionococcales, Thermales
- – Phylum: Chloroflexi
- – Klasse: Chloroflexi
- – Ordnungen: Chloroflexales, Herpetosiphonales
- – Klasse: Anaerolineae
- – Ordnung: Anaerolineales
- – Phylum: Thermomicrobia
- – Klasse: Thermomicrobia
- – Ordnung: Thermomicrobiales
- – Phylum: Nitrospira
- – Klasse: Nitrospira
- – Ordnung: Nitrospirales
- – Phylum: Deferribacteres
- – Klasse: Deferribacteres
- – Ordnung: Deferribacterales
- – Phylum: Cyanobacteria
- – Klasse: Cyanobacteria
- – Ordnungen: Subsection I (früher Chroococcales),
Subsection II (Pleurocapsales), Subsection III (Oscillatoriales),
Subsection IV (Nostocales), Subsection V (Stigonematales)
- – Phylum: Chlorobi
- – Klasse: Chlorobia
- – Ordnung: Chlorobiales
- – Phylum: Proteobacteria
- – Klasse: Alphaproteobacteria
- – Ordnungen: Rhodospirillales, Rickettsiales, Rhodobacterales,
Sphingomonadales, Caulobacterales, Rhizobiales, Parvularculales
- – Klasse: Betaproteobacteria
- – Ordnungen: Burkholderiales, Hydrogenophilales, Methylophilales,
Neisseriales, Nitrosomonadales, Rhodocyclales, Procabacteriales
- – Klasse: Gammaproteobacteria
- – Ordnungen: Chromatiales, Acidithiobacillales, Xanthomonadales,
Cardiobacteriales, Thiotrichales, Legionellales, Methylococcales,
Oceanospirillales, Pseudomonadales, Alteromonadales, Vibrionales,
Aeromonadales, Enterobacteriales, Pasteurellales
- – Klasse: Deltaproteobacteria
- – Odnungen: Desulfurellales, Desulfovibrionales, Desulfobacterales,
Desulfarcales, Desulfuromonales, Synthrophobacterales, Bdellovibrionales,
Myxococcales (Unterordnungen: Cystobacterieae, Sorangineae, Nannocystineae)
- – Klasse: Epsilonproteobacteria
- – Ordnung: Campylobacterales
- – Phylum: Firmicutes
- – Klasse: Clostridia
- – Ordnungen: Clostridiales, Thermoanaerobacteriales,
Haolanaerobiales
- – Klasse: Mollicutes
- – Ordnungen: Mycoplasmatales, Entomoplasmatales, Acholeplasmatales,
Anaeroplasmatales, Incertae sedis
- – Klasse: Bacilli
- – Ordnungen: Bacillales, Lactobacillales
- – Phylum: Actinobacteria
- – Klasse: Actinobacteria
- – Ordnungen: Acidimicrobiales, Rubrobacterales, Coriobacteriales,
Sphaerobacterales, Actinomycetales (Unterordnungen: Micorcoccineae,
Corynebacterineae, Actinomycineae, Propionibacterineae, Pseudonocardineae,
Streptomycineae, Streptomycineae, Micromonosproineae, Frankineae,
Glycomycineae), Bifidobacteriales
- – Phylum: Planctomycetes
- – Klasse: Planctomycetacia
- – Ordnung: Planctomycetales
- – Phylum: Chlamidiae
- – Klasse: Chlamydiae
- – Ordnung: Chlamydiales
- – Phylum: Spirochaetes
- – Klasse: Spirochaetes
- – Ordnung: Spirochaetales
- – Phylum: Fibrobacteres
- – Klasse: Fibrobacteres
- – Ordnung: Fibrobacterales
- – Phylum: Acidobacteria
- – Klasse: Acidobacteria
- – Ordnung: Acidobacteriales
- – Phylum: Bacteroidetes
- – Klasse: Bacteroidetes
- – Ordnung: Bacteroidales
- – Klasse: Flavobacteria
- – Ordnung: Flavobacteriales
- – Klasse: Sphingobacteria
- – Ordnung: Sphingobacteriales
- – Phylum: Fusobacteria
- – Klasse: Fusobacteria
- – Ordnung: Fusobacteriales
- – Phylum: Verrucomicrobia
- – Klasse: Verrucomicrobiae
- – Ordnung: Verrucomicrobiales
- – Phylum: Dictyoglomi
- – Klasse: Dictyoglomi
- – Ordnung: Dictyoglomales
- – Phylum: Gemmatimonadetes
- – Klasse: Gemmatimonadetes
- – Ordnung: Gemmatimonadales
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Erfindungsgemäß besteht
die elektrogesponnene Polymerfaser aus mindestens einem elektrospinnbaren
Polymer ausgewählt aus der Gruppe Poly-(p-xylylen); Polyvinylidenhalogenide,
Polyester wie Polyethylenterephthalate, Polybutylenterephthalat;
Polyether; Polyolefine wie Polyethylen, Polypropylen, Poly(Ethylen/Propylen)
(EPDM); Polycarbonate; Polyurethane; natürliche Polymere,
z. B. Kautschuk; Polycarbonsäuren; Polysulfonsäuren;
sulfatierte Polysaccharide; Polylactide wie PLLA; Polyglycoside;
Polyamide; Homo- und Copolymerisate von aromtischen Vinylverbindungen
wie Poly(alkyl)styrole), z. B. Polystyrole, Polyalpha-methylstyrole;
Polyacrylnitrile, Polymethacrylnitrile; Polyacrylamide; Polyimide;
Polyphenylene; Polysilane; Polysiloxane; Polybenzimidazole; Polybenzothiazole;
Polyoxazole; Polysulfide; Polyesteramide; Polyarylenvinylene; Polyetherketone;
Polyurethane, Polysulfone, anorganisch-organische Hybridpolymere
wie ORMOCER® der Fraunhofer Gesellschaft
zur Förderung der angewandten Forschung e. V. München;
Silicone; vollaromatische Copolyester; Poly(alkyl)acrylate; Poly(alkyl)methacrylate;
Polyhydroxyethylmethacrylate; Polyvinylacetate, Polyvinylbutyrate
wie PVA; Polyisopren; synthetische Kautschuke wie Chlorbutadien-Kautschuke,
z. B. Neopren® von DuPont; Nitril-Butadien-Kautschuke,
z. B. Buna N®; Polybutadien; Polytetrafluorethylen;
modifizierte und nicht modifizierte Cellulosen, Homo- und Copolymerisate
von alpha-Olefinen und Copolymeren aufgebaut aus zwei oder mehr
die vorstehend genannten Polymere bildenden Monomereinheiten; Polyvinylalkohole, Polyalkylenoxide,
z. B. Polyethylenoxide; Poly-N-vinylpyrrolidon; Hydroxymethylcellulosen;
Maleinsäuren; Alginate; Collagene.
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Alle
vorgenannten Polymere können in den erfindungsgemäßen
elektrogesponnen Polymerfasern jeweils einzeln oder in beliebigen
Kombinationen miteinander eingesetzt werden, und zwar in jedem beliebigen Mischungsverhältnis.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform besteht die elektrogesponnene
Polymerfaser aus Poly-L-lactid (PLLA), Polystyrol (PS) oder Polyvinylbutyral
(PVB).
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Die
elektrogesponnenen Polymerfasern umfassend Partikel aus Bakterien
enthaltenden Hydrogelen werden hergestellt durch ein Verfahren umfassend
folgende Schritte:
- – Herstellen einer
Lösung aus Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikeln und
mindestens einem elektrospinnbaren Polymer in eine organischen Lösungsmittel
oder einem Gemisch organischer Lösungsmittel,
- – Elektrospinnen dieser Lösung,
wobei
die Hydrogelpartikel physikalisch oder chemisch vernetzt sind.
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Wie
eingangs beschrieben, handelt es sich bei einem Hydrogel um ein
wasserenthaltendes, jedoch wasserunlösliches Polymer, dessen
Moleküle chemisch oder physikalisch zu einem dreidimensionalen
Netzwerk verknüpft sind.
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Die
Hydrogelpartikel enthaltend Bakterien können physikalisch
oder chemisch vernetzt sein.
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Partikel
aus Bakterien enthaltenden, physikalisch vernetzten Hydrogelen werden
erfindungsgemäß hergestellt durch ein Verfahren
umfassend folgende Schritte:
- a) Herstellung
einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen
Polymers,
- b) Herstellung eines Sediments einer wässrigen Flüssigkultur
der Bakterien,
- c) Inkontaktbringen des Polymers mit dem Sediment der Flüssigkultur
der Bakterien,
- d) Rühren des Gemisches aus Schritt d) bei Hochgeschwindigkeit,
- e) physikalische Vernetzung des Polymers,
- f) Abfiltrieren der gebildeten Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikel.
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Die
physikalische Vernetzung gemäß Schritt e) erfolgt
dabei vorteilhaft durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren wie
oben beschrieben. Optional kann Schritt e) des obigen Verfahrens
vor Schritt c) durchgeführt werden, so dass die physikalische
Vernetzung vor Zugabe der Bakterien erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der wässrigen Lösung eines
wasserlöslichen Polymers um eine wässrige Lösung
von Polyvinylalkohol.
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Partikel
aus Bakterien enthaltenden, chemisch vernetzten Hydrogelen werden
erfindungsgemäß hergestellt durch ein Verfahren
umfassend folgende Schritte:
- a) Herstellung
einer Lösung eines wasserlöslichen Polymers,
- b) chemische Vernetzung des wasserlöslichen Polymers
zum Hydrogel und Quellung dieses Hydrogels,
- c) Herstellung eines Sediments einer wässrigen Flüssigkultur
der Bakterien,
- d) Inkontaktbringen des Polymers mit dem Sediment der Flüssigkultur
der Bakterien,
- e) Rühren des Gemisches aus Schritt d) bei Hochgeschwindigkeit,
- f) Abfiltrieren der gebildeten Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikel.
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Dem
Fachmann ist bekannt, wie eine chemische Vernetzung gemäß Schritt
b) des obigen Verfahrens durchzuführen ist. Geeignete Vernetzer
wurden bereits genannt.
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In
einer weiteren Ausführungsform werden chemisch vernetzte,
Bakterien enthaltende Hydrogelpartikel hergestellt, indem Schritt
e) gemäß dem obigen Verfahren vor Schritt d) durchgeführt
wird. In dieser Ausführungsform werden also zunächst
Partikel des chemisch vernetzten Hydrogels hergestellt und anschließend die
Bakterien eingebracht.
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Dem
Fachmann ist des Weiteren bekannt, wie er Flüssigkulturen
von Bakterien sowie Sedimente dieser Flüssigkulturen herstellen
muss. Er kann dieses Wissen anwenden, ohne den Schutzbereich der
Patentansprüche zu verlassen.
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Sollen
Hydrogelpartikel aus physikalisch vernetztem Polyvinylalkohol hergestellt
werden, so weist die Lösung des Polyvinylalkohols gemäß Schritt
a) des oben genannten Verfahrens zur Herstellung physikalisch vernetzter
Hydrogelpartikel vorteilhaft eine Konzentration von 10 Gew.-% bis
20 Gew.-% auf.
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Vorteilhaft
wird die Lösung in eine die Partikelvorläufer
stabilisierende Phase eingebracht. Bei dieser Phase kann es sich
beispielsweise um ein Silikonöl handeln, z. B. um ein Phenylmethylsilicon
wie AP200®.
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Die
wässrige Lösung des Polyvinylalkohols und das
Sediment der Flüssigkultur der Bakterien werden vorteilhaft
im Verhältnis 6:1 (w/w) miteinander vermischt.
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Sowohl
physikalisch als auch chemisch vernetzte Hydrogelpartikel entstehen
durch Hochgeschwindigkeitsrühren, wobei darunter vorteilhaft
Rührgeschwindigkeiten von 5.000–bis 15.000 U/min
zu verstehen sind.
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Anschließend
werden die gebildeten Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikel abfiltriert.
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Das
Elektrospinnen an sich ist bekannt. Dabei wird eine Lösung
des verspinnenden Polymeren an einer als Elektrode dienenden Kante
einem hohen elektrischen Feld ausgesetzt. Beispielsweise kann dies
geschehen, indem die zu verspinnende Lösung in einem elektrischen
Feld unter geringem Druck durch eine mit einem Pol einer Spannungsquelle
verbundenen Kanüle extrudiert wird. Es entsteht ein auf
die Gegenelektrode gerichteter Materialstrom, der sich auf dem Weg
zur Gegenelektrode verfestigt.
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Optional
kann die Spinnlösung zusätzlich zu dem Polymer
oder Polymerengemisch weitere Komponenten enthalten. Im Falle der
vorliegenden Erfindung enthält die Spinnlösung
zusätzlich die Hydrogelpartikel enthaltend Bakterien.
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Optional
kann während des Spinnvorgangs zwischen Düse und
Gegenelektrode ein Rahmen aus einem leitfähigen Material
eingebracht werden, beispielsweise ein rechtwinkliger Rahmen. In
diesem Fall werden die Fasern in Form eines orientierten Vlieses
auf diesem Rahmen abgeschieden. Dieses Verfahren zur Herstellung
orientierter Meso- und Nanofaservliese ist dem Fachmann bekannt
und kann angewendet werden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche
zu verlassen.
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Gemäß Schritt
h) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine
Lösung aus mindestens einem elektrospinnbaren Polymer und
den Hydrogelpartikeln aus Schritt g) elektroversponnen.
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Vorteilhaft
wird die Spinnlösung hergestellt, indem die Hydrogelpartikel
aus Schritt g) zunächst in einem organischen Lösungsmittel
oder einem Gemisch organischer Lösungsmittel vordispergiert
und anschließend eine Lösung des elektrospinnbaren
Polymers zugegeben wird. Dabei ist es von Vorteil, das elektrospinnbare
Polymer in demselben Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch
zu lösen wie die Hydrogelpartikel.
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Dem
Fachmann ist bekannt, welche organischen Lösungsmittel
für das Elektrospinnverfahren geeignet sind. Beispielsweise
eignen sich Dichlormethan, Ethanol, Chloroform sowie Gemische dieser
Lösungsmittel.
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In
den erfindungsgemäßen elektrogesponnenen Polymerfasern
umfassend Partikel aus Bakterien enthaltenden Hydrogelen können
Bakterien über lange Zeit (mindestens für ein
Jahr) in trockenem Zustand lebend gelagert werden. „Trocken” bedeutet
hierbei, dass Wasser bzw. Zellkulturmedium weder in den elektrogesponnenen
Polymerfasern umfassend Partikel aus Bakterien enthaltenden Hydrogelen
vorliegen noch zugegeben werden müssen, um die Bakterien
am Leben zu erhalten. Bei Bedarf können die so gelagerten
Bakterien durch Benetzung mit Wasser oder einem Zellkulturmedium
reaktiviert werden, erkenntlich an der einsetzenden Vermehrung der
Bakterien.
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Auf
der anderen Seite sind Bakterien in den erfindungsgemäßen
elektrogesponnenen Polymerfasern umfassend Bakterien enthaltende
Hydrogele gegenüber Lösungsmitteln geschützt,
die andernfalls für sie tödlich wären.
Zu diesen Lösungsmitteln zählen beispielsweise
Ethanol, Propanol, Aceton, Dichlormethan, Chloroform, Toluol und
Tetrahydrofuran (THF). Bakterien, die in der erfindungsgemäßen
Vorrichtung „verpackt” sind, können sogar
aus diesen Lösungsmitteln verarbeitet werden.
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Es
ist hervorzuheben, dass schon die „Verpackung” von
Bakterien in Hydrogelen, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beschrieben wird, dazu führt, dass derart verpackte Bakterien
trocken gelagert werden können, vor den genannten, aridernfalls
für die tödlichen Lösungsmitteln geschützt
sind und aus diesen verarbeitet werden können. Werden diese
Bakterien enthaltenden Hydrogelpartikel jedoch zusätzlich
in elektrogesponnene Polymerfasern eingebracht, sind sie in den
hier genannten Anwendungen besser handhabbar.
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In
einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden
die erfindungsgemäßen elektrogesponnenen Polymerfasern
umfassend Bakterien enthaltende Hydrogele daher zur Lagerung von
Bakterien im trockenen Zustand verwendet. Diese Lagerung ist vorteilhaft,
da damit erhebliche Kosten für die sonst üblichen Lagerungsverfahren
gespart werden, beispielsweise für die Anschaffung und
Unterhaltung von Zellkulturschränken und Kulturgefäßen,
von Gefriertrocknungsapparaturen, das Einfrieren und Lagern von
Bakterien bei sehr tiefen Temperaturen und das regelmäßige
Versorgen der Bakterien mit Zellkulturmedien.
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Erfindungsgemäße
elektrogesponnenen Polymerfasern umfassend Bakterien enthaltende
Hydrogele lassen sich in einer speziellen Ausführungsform
für Textilausrüstungen und für den Einbau
in Membranen verwenden. Bei den Bakterien, die auf diese Weise quasi
in den Textilien oder Membranen „gelagert” werden, handelt
es sich bevorzugt um Nutzbakterien, die erwünschte Stoffwechselprozesse
durchführen oder die pathogene Keime abtöten.
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In
den Membranen kann beispielsweise eine Schicht aus erfindungsgemäßen
elektrogesponnenen Polymerfasern umfassend Bakterien enthaltende
Hydrogele zwischen zwei elektrogesponnenen Vliesen ohne Hydrogelpartikel
gelagert werden. Optional können solche Membranen auf ein
Trägermaterial, beispielsweise ein Kunststoff- oder Papierfilter,
aufgebracht werden und dann zum Abfiltrieren pathogener Bakterien
aus wässrigen Medien genutzt werden: Beim Kontakt mit Wasser
werden die Nutzbakterien aus den Hydrogelen freigesetzt und töten
die pathogenen Bakterien, welche in der Filtermembran zurückgehalten
werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform können die die
erfindungsgemäßen elektrogesponnenen Polymerfasern
umfassend Bakterien enthaltende Hydrogele für die Ausrüstung
von Kosmetikprodukten verwendet werden. So lassen sich beispielsweise
Hygieneprodukte wie Windeln und Inkontinenzeinlagen auf diese Weise mit
Nutzbakterien ausrüsten, die pathogene Keime und/oder Geruchsbakterien
abtöten.
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In
einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen
elektrogesponnenen Polymerfasern umfassend Bakterien enthaltende
Hydrogele in bakteriellen Brennstoffzellen eingesetzt werden.
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Im
Allgemeinen gibt es vielfältige Verwendungsmöglichkeiten
für die erfindungsgemäßen elektrogesponnenen
Polymerfasern umfassend Bakterien enthaltende Hydrogele. Diese Anwendungsbereiche
können unterschieden werden nach Lebenlassen von Nutzbakterien
als Funktionseinheiten einerseits und Abtöten von schädlichen
Bakterien andererseits. Damit lässt sich diese erfindungsgemäße
Vorrichtung beispielsweise für die oben aufgeführten
Anwendungen in Textilien und Membranen nutzen, aber auch für
Anwendungen in der Abwasserreinigung, im Umweltschutz (Gewässererhalt),
im Agrar- und Lebensmittelsektor, in der Pharmazie, der Fermentation
und dem Bausektor.
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Abbildungslegenden
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1
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1 zeigt
eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des
Elektrospinnverfahrens geeigneten Vorrichtung.
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Die
Vorrichtung umfasst eine Spritze 3, an deren Spitze sich
eine Kapillardüse 2 befindet. Diese Kapillardüse 2 ist
mit einem Pol einer Spannungsquelle 1 verbunden. Die Spritze 3 nimmt
die zu verspinnende Lösung 4 auf. Gegenüber
dem Ausgang der Kapillardüse 2 ist in einem Abstand
von etwa 20 cm eine mit dem anderen Pol der Spannungsquelle 1 verbundene
Gegenelektrode 5 angeordnet, die als Kollektor für
die gebildeten Fasern fungiert.
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Während
der Betriebs der Vorrichtung wird an den Elektroden 2 und 5 eine
Spannung zwischen 18 kV und 35 kV eingestellt und die Spinnlösung 4 unter
einem geringen Druck durch die Kapillardüse 2 der
Spritze 3 ausgetragen. Auf Grund der durch das starke elektrische
Feld von 0,9 bis 2 kV/cm erfolgenden elektrostatischen Aufladung
der Polymermoleküle in der Lösung entsteht ein
auf die Gegenelektrode 5 gerichteter Materialstrom, der
sich auf dem Wege zur Ge genelektrode 5 unter Faserbildung 6 verfestigt,
infolge dessen sich auf der Gegenelektrode 5 Fasern 7 mit
Durchmessern im Mikro- und Nanometerbereich abscheiden.
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2
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Die
Abbildung zeigt M. luteus enthaltende Partikel aus physikalisch
vernetztem Polyvinylalkohol eingebettet in PVB-Fasern. Der weiße
Balken am unteren Bildrand entspricht einer Länge von 3,00 μm.
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3
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Die
Abbildung zeigt den Bakterienrasen nach Inkubation einer Fasermatte
(wie in 3 beschrieben) auf einer Agarplatte.
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Ausführungsbeispiele
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Ausführungsbeispiel 1:
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Herstellung von Hydrogelpartikeln
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Zur
Herstellung der Hydrogelpartikel wurde eine Mischung aus einem Milliliter
einer Lösung von zehn Gewichtsprozent Polyvinylalkohol
56–98 (KSE) in Wasser in 80 g Silikonöl (AP200,
Wacker) dispergiert. Hierzu wurde ein Hochgeschwindigkeitsrührer
IKA® T18 basic Ultra-Turrax® mit einem Dispergierwerkzeug S 18N-19G
bei 10 000 U/min verwendet. Die Behandlungszeit betrug zehn Minuten.
Die entstandene Dispersion wurde anschließend bei –20°C
eingefroren. Nach 20 Stunden bei –20°C wurde die
Dispersion für vier Stunden bei Raumtemperatur gelagert.
Dieser Zyklus wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten auftauen
wurde die Dispersion unter schnellem Rühren mit der dreifachen
Menge an Aceton versetzt. Anschließend konnten die nun
kollabierten Hydrogelpartikel abfiltriert werden.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Herstellung von in Hydrogelpartikeln immobilisierten
Bakterien
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Bei
den in den Hydrogelpartikeln immobilisierten Bakterien handelte
es sich um Escherichia (E.) coli sowie um Micrococcus (M.) luteus.
E. coli wurde in einer Nährlösung aus 30 g Trypton-Soja-Bouillon
auf 1000 ml Wasser kultiviert und M. luteus in einem Gemisch von
5,0 g Fleischextrakt und 3,0 g Pepton auf 1000 ml Wasser bei pH
= 7. Die Bakterien wurden sedimentiert und mit 50 mmol/L Phosphat-Puffer
pH = 7 gewaschen.
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Zur
Herstellung Bakterien enthaltender Hydrogelpartikel wurden der verwendeten
Polyvinylalkohol-Lösung unmittelbar vor der Verarbeitung
die Bakterien in Form des Sedimentes einer Flüssigkultur
zugesetzt. Hierbei wurden 0,5 g Sediment auf 3 g PVA-Lösung
verwendet.
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Ausführungsbeispiel 3:
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Nachweis lebender Bakterien in den Hydrogelpartikeln
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Der
Nachweis lebender Bakterien in den Hydrogelpartikeln erfolgte durch
Aufbringen solcher Partikel auf Agarplatten. Die Agarplatten bestanden
jeweils aus den zuvor beschriebenen Nährmedien, denen zur
Verfestigung Agar-Agar zugesetzt worden war. Anschließend
wurden die Agarplatten bei 37°C für längstens
72 h inkubiert, wobei sich im Bereich der aufgebrachten Partikel
bakterielles Wachstum zeigte. Proben des Bewuchses wurden den Platten
entnommen, auf frischen Agarplatten erneut kultiviert und mikroskopisch
untersucht. Hierbei konnte bestätigt werden, dass es sich
um die zuvor immobilisierten E. coli und M. luteus handelte. Die Partikel
wurden in verschlossenen Gefäßen unter Ausschluss
von Licht bei 4°C aufbewahrt. Zu verschiedenen Zeitpunkten
wurden erneut Partikel auf Agarplatten aufgebracht, um die Überlebensfähigkeit
der Bakterien in den Partikeln über einen längeren
Zeitraum qualitativ zu verfolgen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tab. 1 gezeigt. Tabelle 1: Überlebensfähigkeit
bei Lagerung bei 4°C
| Lagerung/Monate | M.
luteus | E.
coli |
| 0 | lebend | lebend |
| 1 | lebend | lebend |
| 2 | lebend | lebend |
| 3 | lebend | lebend |
| 4 | lebend | lebend |
| 5 | lebend | lebend |
| 6 | lebend | lebend |
| 7 | lebend | lebend |
| 8 | lebend | lebend |
| 9 | lebend | lebend |
| 10 | lebend | lebend |
-
Ausführungsbeispiel 4:
-
Schutz der Bakterien in Hydrogelpartikeln
gegen organische Lösungsmittel
-
Die
erhaltenen Partikel wurden auf ihre Eigenschaft, die enthaltenen
Bakterien gegen organische Lösungsmittel zu schützen
hin überprüft. Hierzu wurden Proben der Partikel
in kleinen Volumina dieser Lösungsmittel gelagert. Zum
Nachweis lebender Bakterien in diesen Partikeln wurden Proben mit
einer Pipette entnommen. Diese ließ man anschließend
auf einem sterilen Objektträger zur Entfernung des Lösungsmittels
eintrocknen. Der Objektträger wurde hiernach auf eine Agarplatte
gelegt und nach dem Quellen der Partikel wieder entfernt, wobei
die Partikel auf der Agaroberfläche zurückblieben.
Wachstum im Bereich des Objektträgers zeigte das Vorhandensein
lebender Bakterien aus den Partikeln an. Bei den getesteten Lösungsmitteln
handelte es sich um Aceton, Ethanol, Chloroform, Dichlormethan,
Tetrahydrofuran und Toluol. Ebenfalls getestet wurde eine Mischung
von Aceton mit 15% Wasser.
-
Die
Ergebnisse sind in Tab. 2 gezeigt. Tabelle 2: Überlebensfähigkeit
in verschiedenen Lösungsmitteln
| Lösungsmittel | Verweildauer/h | E.
coli | M.
luteus |
| Dichlormethan | 0,5 | lebend | lebend |
| 24 | lebend | lebend |
| 144 | lebend | lebend |
| 264 | lebend | lebend |
| Ethanol | 0,5 | lebend | lebend |
| 24 | lebend | lebend |
| 144 | lebend | lebend |
| 264 | lebend | lebend |
| Tetrahydrofuran | 0,5 | lebend | lebend |
| 24 | lebend | lebend |
| 144 | lebend | lebend |
| Chloroform | 0,5 | lebend | lebend |
| 24 | lebend | lebend |
| 144 | lebend | lebend |
| 264 | lebend | lebend |
| Toluol | 0,5 | lebend | lebend |
| 24 | lebend | lebend |
| 144 | lebend | lebend |
| 264 | lebend | lebend |
| 15%
Wasser in Aceton | 1 | tot | tot |
-
Ausführungsbeispiel 5:
-
Einbringen der Bakterien enthaltenden
Hydrogelpartikel in Polymerfasern
-
Das
Einbringen der Partikel in Polymerfasern erfolgte durch die Technik
des Elektrospinnens. Hierbei wurde die gesamte Apparatur zur Verminderung
der Wahrscheinlichkeit der Kontamination der Proben durch Auswischen
mit 70 vol.% Ethanol weitestgehend keimfrei gemacht. Bisher wurden
Bakterien enthaltende Partikel in Poly-(L-lactid) (PLLA) und Polyvinylbutyral
(PVB) und Polystyrol (PS) versponnen.
-
Im
Falle von PLLA wurde als Lösungsmittel Dichlormethan verwendet.
Die Partikel wurden hierbei zuerst in einer kleinen Menge Lösungsmittel
mit Hilfe von Ultraschall vordispergiert. Anschließend
wurde eine höher konzentrierte Lösung von PLLA
in Dichlormethan zugegeben, so dass die Gesamtkonzentration 4 Gew.-% PLLA
betrug. Die Konzentration der Partikel in der Lösung lag
bei ca. 10 mg pro Gramm Lösung. Die Lösung wurde
bei einem Elektrodenabstand von 20 cm und einer Spannung von 25
kV versponnen. Die Flussrate betrug 0,9 mL/h. Im Fall von Polyvinylbutyral
und Polystyrol war die Vorgehensweise analog. Als Lösungsmittel wurden
Ethanol und Chloroform verwendet.
-
Die
Spinnbedingungen sind in Tab. 3 gezeigt. Tabelle 3: Bedingungen des Verspinnens
der Partikel mit verschiedenen Polymeren.
| Polymer | [c]/gew.-% | Spannung/kV | Distanz/cm | Fluss/mLh–1 |
| PLLA | 4 | 25 | 20 | 0,9 |
| PVB | 11 | 25 | 20 | 0,9 |
| PS | 13 | 25 | 20 | 0,5 |
-
- 1
- Spannungsquelle
- 2
- Kapillardüse
- 3
- Spritze
- 4
- Spinnlösung
- 5
- Gegenelektrode
- 6
- Faserbildung
- 7
- Fasermatte
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102005053011
A1 [0009]
- - DE 10023456 A1 [0010]
- - DE 10053263 A1 [0010]
- - WO 2008/049250 A1 [0011]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - M Okazaki,
T Hamada, H Fujii, A Mizobe und S Matsuzawa beschreiben in „Development
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- - J Appl Polym Sci 1995, 58, 2235–2241 [0007]
- - M Okazaki, T Hamada, H Fujii, O Kusudo, A Mizobe und S Matsuzawa: ”Development
of Poly(vinyl alcohol) Hydrogel for Waste Water Cleaning. II. Treatment
of N,N-Dimethylformamide in Waste Water with Poly(vinyl alcohol)
Gel with Immobilized Microorganisms.” J Appl Polym Sci
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- - P Wittlich, E Capan, M Schlieker, K-D Vorlog und U Jahnz beschreiben
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Vo. 8A”, V Nedovic, R Willaert (Eds.) Springer-Verlag,
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