CN107502956A - 一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置及方法，所述装置包括箱体9，箱体设置有门11，箱体内设置有接收基底5，在接收基底的上方设置有连接有喷嘴3的喷丝管1，喷嘴3通过导线与高压发生器6的正极或负级连接，接收基底5通过导线与高压发生器6的负级或正极连接，移动装置12与喷丝管1连接，高压发生器的负极接地，喷丝管的上端通过导线与注射泵8连接，计算机分别与注射泵8、高压发生器6和移动装置12电连接，箱体内设置有紫外灭菌灯10。本发明的装置为可为电纺丝过程提供无菌化环境，规避外源微生物的污染，简单、便捷，成本较低。解决微生物存储过程中取用困难，运输繁琐的问题，菌种储存效果好。
Description
技术领域
本发明属于纳米纤维制备技术与微生物保存的交叉领域，具体涉及一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置及方法。
背景技术
微生物是十分重要的生物资源，也是极为重要的工程化生产资料。一种优良的微生物种类被选育出来，必须保持其优良性状不变或尽可能减少变异，才能保证其良好的生产性能，从而长期稳定使用，或在基础研究中保证研究结果获得良好重复性。因此，微生物保存在微生物性能保持和生物合成方面具有重要的意义。微生物保存主要是根据微生物的生理、生化特性，人工创造低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等环境，可以降低微生物代谢活动，减少变异，使微生物可以长期处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的(王奕峰,金子辰,吴立梦.上海预防医学,2007,19(2):87-88)。
当前常用的保存微生物的方法多数是通过创造低温或超低温、干燥、真空等单独或多重条件来达到所需保存目的，最早的保存方法是传代培养，随着制冷剂、干燥机的出现，逐渐出现了新的方法，主要是冷冻保存法、干燥法、冻干法等，这三种保存方法被认为是目前保存效果最好、使用最普遍的储存手段，不仅能实现长时间保存，而且微生物复活速率和复苏率较高。在保存过程中，传代培养存在诸多缺陷。比如，传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。而且传代次数不得超过5代(祝琳.山东化工,2014,43(1):105-106)。虽然现有的菌种保存方法已经实现良好的保存效果，但同时也对储藏设备和操作技术提出更高的要求，能源和资源负担加重，导致一些偏远地区不能有效保存菌种。同时，液体形式的微生物存储往往存在较大的运输及制备困难，大大限制了微生物的广泛应用，因此开发新的固体基质的微生物存储方法具有十分重大的意义。
从1934年Formhals申请第一个静电纺丝专利以来，静电纺丝技术日益得到人们的重视，所得到的纤维因其直径小、各向异性、比表面积大、孔隙率高、精细程度一致，均一性高与长径比大等优点，使其在过滤材料、生物医学工程、电学和光学、催化剂载体材料等领域都有研究和应用(XuejunXin,Mohammad Hussain,Jeremy J.Mao.Biomaterials,2007,28(26):316-325)。目前，用于静电纺丝的聚合物已有数十种，其中包括天然或合成聚合物。几乎所有的可溶性或可熔性聚合物制备的纤维都可加工成不同形状、不同尺寸，且通过对添加剂种类和含量的调整，可达到预期的结果，添加剂种类也从简单的炭黑颗粒到复杂的生物物质如酶、病毒和细菌等(Greiner A,Wendorff J.AngewandteChemie InternationalEdition,2007,46(30):5670-5703)。其中，微生物/聚合物复合纤维作为一种新型的生物学材料更是引起了研究者极大的兴趣。Salalha等人(Salalha W,Kuhn J,Dror Y,etal.Nanotechnology,2006,17(18):4675-4681)将细菌封装在聚乙烯醇(PVA)纳米纤维中，制备出具有生物活性的纳米纤维，结果表明，细菌和病毒可以在纺丝过程中存活，在制成干燥的膜后仍可维持数月的活性。此外，Gensheimer等(Gensheimer M,Becker M,Bris-HeepA,et al.Advanced Materials,2007,19(18):2480-2482)通过电纺聚乙烯醇(PVA)细菌悬液以及聚氧化乙烯(PEO)细菌悬液实现对大肠杆菌和白色葡萄球菌的封装，实验结果显示由聚合物和细菌组成的纤维织物并未完全丧失生物活性功能，细菌仍可以存活，但大肠杆菌室温存储时间仅为1h左右。
发明内容
本发明的目的在于克服传统纺丝装置易受外界条件干扰的弊端，提供一种能规避环境中外源微生物的污染的用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置。
本发明的第二个目的是提供一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，包括箱体9，箱体设置有门11，箱体内设置有接收基底5，在接收基底的上方设置有连接有喷嘴3的喷丝管1，喷嘴3通过导线与高压发生器6的正极或负级连接，接收基底5通过导线与高压发生器6的负级或正极连接，移动装置12与喷丝管1连接，高压发生器的负极接地，喷丝管的上端通过导线与注射泵8连接，计算机分别与注射泵8、高压发生器6和移动装置12电连接，箱体内设置有紫外灭菌灯10。基底为包裹铝箔的玻璃片、包裹铝箔的硅片、铁板、铜板、锡板、金板、银板、铬板或锰板。所述喷嘴为一根磨平的注射器针头或商用同轴或三轴的纺丝针头。
所述箱体的材料为透明或半透明的塑料、透明或半透明的玻璃。
所述箱体的形状为立方体、圆柱体或不规则体。
一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将微生物母液接种于培养液中，培养至对数中后期或稳定期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为5-100：1的比例，将水溶性高分子聚合物和添加剂溶解于所述培养液中，使水溶性高分子聚合物的浓度为3％-50％，搅拌1-24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为1-50：50-99的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，25-40℃恒温震荡培养1-24h，得到活性高分子混合液；
5)向上述用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体9内喷入医用酒精，关闭门11，开启紫外灭菌灯10灭菌10-30min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵8通入灭菌后喷丝管1中，喷嘴与接收基底5的距离调控为5-30cm，施加电压5-50kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
所述微生物为细菌、真菌或病毒。
所述水溶性高分子聚合物数均分子量为25000-300000的聚乙烯醇、数均分子量为200-20000的聚乙二醇、数均分子量为4*104-107的聚氧化乙烯、数均分子量为10000-300000的海藻酸钠、数均分子量为8000-100000的聚乙烯吡咯烷酮、数均分子量为1000-10000的羧甲基淀粉、数均分子量为1000-10000的羧甲基纤维素、数均分子量为500-1800万的聚丙烯酰胺、数均分子量为500-200万的聚丙烯酸、数均分子量为10000-200000的壳聚糖和明胶中至少一种。所述添加剂为20种人体蛋白质氨基酸、粘土、水滑石、埃洛石、葡聚糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖、乳糖酸、苹果酸、山梨醇、藻酸、脱脂乳、血清、抗坏血酸、半胱氨酸、羧氨、氨基脲、海藻糖和甘油中至少一种。
本发明的优点：本发明的装置为可为电纺丝过程提供无菌化环境，规避外源微生物的污染，为实现微生物的保存提供了适宜的无菌环境，本发明的装置简单、便捷，成本较低，且可有效规避外界微生物的污染。
本发明的方法制备的用于微生物保存的高分子纳米纤维可实现对纳米纤维直径的调控，通过调控纤维直径实现对微生物的有效负载。利用电纺丝过程水分瞬间挥发为体系提供干燥环境的原理，可实现对多种微生物的保存。以固体基质保存微生物可解决微生物存储过程中取用困难，运输繁琐的问题，本发明的方法在室温条件下微生物转接方面具有极为巨大的应用潜力，菌种储存效果远好于文献所报道的菌种储存效果。
附图说明
图1为本发明的用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置结构示意图。
图2A为聚乙烯吡咯烷酮纳米纤维的明场图像；
图2B为含绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(EGFP)在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)纳米纤维体系中分布的荧光图像；
图2C为聚乙烯吡咯烷酮纳米纤维的明场图像与含绿色荧光蛋白大肠杆菌荧光图像融合后的荧光显微镜图像；从图2C中可以看出大肠杆菌是附着在高分子纳米纤维表面。
图3为实施例2获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维扫描电镜图。
图4为实施例3获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维扫描电镜图。
图5为实施例4获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维成膜的数码照片，说明PVP高分子活性纳米纤维可快速大量制备成肉眼可见的白色纤维膜，且该膜可溶于水，以实现后续菌种的复苏。
图6为本发明制备的高分子-微生物活性纳米纤维在室温储存条件下的活性对比图。其中，
图6A为对照例获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维溶于水后涂在固体琼脂板在常温下放置1h的菌落生长情况数码照片。
图6B为实施例5获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维溶于水后涂在固体琼脂板在常温下放置1h的菌落生长情况数码照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，见图1，包括箱体9，箱体设置有门11，箱体内设置有接收基底5，在接收基底的上方设置有连接有喷嘴3的喷丝管1，喷嘴3通过导线与高压发生器6的正极(或负级)连接，接收基底5通过导线与高压发生器6的负级(或正极)连接，移动装置12与喷丝管1连接，高压发生器的负极接地，喷丝管的上端通过导线与注射泵8连接，计算机分别与注射泵8、高压发生器6和移动装置12电连接，箱体内设置有紫外灭菌灯10。
基底为包裹铝箔的玻璃片，还可以是包裹铝箔的硅片、铁板、铜板、锡板、金板、银板、铬板或锰板。
所述喷嘴为一根磨平的注射器针头或商用同轴或三轴的纺丝针头。
箱体的材料为透明的塑料，还可以是半透明的塑料、透明的玻璃或半透明的玻璃。
箱体的形状为立方体，还可以是圆柱体或不规则体。
实施例1
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将含绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(EGFP)母液接种于液体LB培养液中，在37℃、250rpm下培养至对数中后期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为5：1的比例，将数均分子量为100000的聚乙烯吡咯烷酮和甘油溶解于LB培养液中，使所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10％，室温下搅拌24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为30：70的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，37℃恒温震荡培养12h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌20min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为15cm，施加电压17kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
本实施例制备的PVP高分子活性纳米纤维可实现对大肠杆菌的有效负载，绿色荧光点均位于纤维表面，表明大肠杆菌是附着在纳米纤维表面(见图2A、图2B和图2C)。
实施例2
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将含绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(EGFP)母液接种于液体LB培养液中，在37℃、250rpm下培养至稳定期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为100：1的比例，将数均分子量为25000的聚乙烯醇和葡聚糖溶解于LB培养液中，使所述聚乙烯醇的浓度为50％，室温下搅拌1h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为1：50的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，37℃恒温震荡培养24h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌20min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为30cm，施加电压30kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
本实例制备的聚乙烯醇(PVA)高分子活性纳米纤维尺寸较均匀(图3)。
实施例3
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将含绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(EGFP)母液接种于液体LB培养液中，在37℃、250rpm下培养至稳定期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为100：1的比例，将数均分子量为300000的聚乙烯醇和苹果酸溶解于LB培养液中，使所述聚乙烯醇的浓度为3％，室温下搅拌24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为1：99的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，37℃恒温震荡培养1h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌20min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为25cm，施加电压30kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
本实例制备的聚乙烯醇(PVA)高分子活性纳米纤维中的大肠杆菌是附着在纤维表面(图4)。
实施例4
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将酵母菌母液接种于液体培养液中，在30℃、225rpm下培养至稳定期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为50：1的比例，将数均分子量为8000的聚乙烯吡咯烷酮和粘土溶解于液体培养液中，使所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为40％，室温下搅拌24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为50：99的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，30℃恒温震荡培养20h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌30min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为5cm，施加电压22kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。(图5)。
实施例5
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将含绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(EGFP)母液接种于液体LB培养液中，在37℃、250rpm下培养至对数中后期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为70：1比例，将数均分子量为100000的聚乙烯吡咯烷酮和甘油溶解于LB培养液中，使所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10％，室温下搅拌24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为1：50的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，37℃恒温震荡培养18h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌20min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为12cm，施加电压50kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。见图6B。
对照例：
将实施例5的的步骤(2)不加甘油，其它同实施例5为对照。见图6A。
图6A为对照例获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维溶于水后涂在固体琼脂板在常温下放置1h的菌落生长情况数码照片。
图6B为实施例5获得的用于微生物保存的高分子纳米纤维溶于水后涂在固体琼脂板在常温下放置1h的菌落生长情况数码照片。
从图6A和图6B可以看出，在室温下用于微生物保存的高分子纳米纤维可维持一定时长的细菌活性，加入甘油后细菌活性明显增强。
实施例6
用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将噬菌体病毒母液接种于液体培养液中，在40℃、200rpm下培养至生长后期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为40：1的比例，将数均分子量为10000的羧甲基纤维素和海藻糖溶解于液体培养液中，使所述羧甲基纤维素的浓度为20％，室温下搅拌24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为20：90的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，37℃恒温震荡培养24h，得到活性高分子混合液；
5)向用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体内喷入医用酒精，关闭门，开启紫外灭菌灯灭菌10min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵通入灭菌后喷丝管中，喷嘴与接收基底的距离调控为20cm，施加电压5kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
本实例制备的用于微生物保存的高分子纳米纤维成膜在室温下可维持24小时时长的噬菌体病毒活性。
实验证明，用数均分子量为200聚乙二醇、用数均分子量为20000的聚乙二醇、数均分子量为4*104聚氧化乙烯、数均分子量为4*107的聚氧化乙烯、数均分子量为10000海藻酸钠、数均分子量为300000的海藻酸钠、数均分子量为1000的羧甲基淀粉、数均分子量为10000的羧甲基淀粉、数均分子量为1000的羧甲基纤维素、数均分子量为500万的聚丙烯酰胺、数均分子量为1800万的聚丙烯酰胺、数均分子量为500万的聚丙烯酸、数均分子量为200万的聚丙烯酸、数均分子量为10000的壳聚糖、数均分子量为200000的壳聚糖、由质量比为1：1的数均分子量为200000的壳聚糖和明胶组成的组合物替代本实施例的数均分子量为10000的羧甲基纤维素，其它同本实施例，制备出相应的用于微生物保存的高分子纳米纤维，有较好的微生物存储效果。
用20种人体蛋白质氨基酸、水滑石、埃洛石、蔗糖、淀粉、葡萄糖、乳糖酸、山梨醇、藻酸、脱脂乳、血清、抗坏血酸、半胱氨酸、羧氨、氨基脲和由质量比为1：1的蔗糖和淀粉组成的组合物替代本实施例的海藻糖，其它同本实施例，制备出相应的用于微生物保存的高分子纳米纤维，有较好的微生物存储效果。
Claims (9)
1.一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，包括箱体(9)，所述箱体设置有门(11)，其特征是，箱体内设置有接收基底(5)，在接收基底的上方设置有连接有喷嘴(3)的喷丝管(1)，喷嘴(3)通过导线与高压发生器(6)的正极或负级连接，接收基底(5)通过导线与高压发生器(6)的负级或正极连接，移动装置(12)与喷丝管(1)连接，高压发生器的负极接地，喷丝管的上端通过导线与注射泵(8)连接，计算机分别与注射泵(8)、高压发生器(6)和移动装置(12)电连接，箱体内设置有紫外灭菌灯(10)。
2.根据权利要求1所述的一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，其特征是所述基底为包裹铝箔的玻璃片、包裹铝箔的硅片、铁板、铜板、锡板、金板、银板、铬板或锰板。
3.根据权利要求1所述的一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，其特征是所述喷嘴为一根磨平的注射器针头或商用同轴或三轴的纺丝针头。
4.根据权利要求1所述的一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置，其特征是所述箱体的材料为透明或半透明的塑料、透明或半透明的玻璃。
5.根据权利要求1或4所述的装置，其特征是所述箱体的形状为立方体、圆柱体或不规则体。
6.一种用于微生物保存的高分子纳米纤维制备方法，包括以下步骤：
1)将微生物母液接种于培养液中，培养至对数中后期或稳定期，得到微生物原液，置于4℃保存；
2)按质量比为5-100：1的比例，将水溶性高分子聚合物和添加剂溶解于所述培养液中，使水溶性高分子聚合物的浓度为3％-50％，搅拌1-24h，配制成分散均匀的高分子溶液；
3)将所述高分子溶液、喷嘴、高纯水、喷丝管和枪头置于灭菌锅中进行灭菌处理；
4)按质量比为1-50：50-99的比例，将步骤2)获得的微生物原液与灭菌后的高分子溶液混合，25-40℃恒温震荡培养1-24h，得到活性高分子混合液；
5)向权利要求1-5之一所述的用于微生物保存的高分子纳米纤维制备装置的箱体(9)内喷入医用酒精，关闭门(11)，开启紫外灭菌灯(10)灭菌10-30min；
6)将所述活性高分子混合液通过注射泵(8)通入灭菌后喷丝管(1)中，喷嘴与接收基底(5)的距离调控为5-30cm，施加电压5-50kV，进行电纺，得到用于微生物保存的高分子纳米纤维。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是所述微生物为细菌、真菌或病毒。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征是所述水溶性高分子聚合物数均分子量为25000-300000的聚乙烯醇、数均分子量为200-20000的聚乙二醇、数均分子量为4*104-107的聚氧化乙烯、数均分子量为10000-300000的海藻酸钠、数均分子量为8000-100000的聚乙烯吡咯烷酮、数均分子量为1000-10000的羧甲基淀粉、数均分子量为1000-10000的羧甲基纤维素、数均分子量为500-1800万的聚丙烯酰胺、数均分子量为500-200万的聚丙烯酸、数均分子量为10000-200000的壳聚糖和明胶中至少一种。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征是所述添加剂为20种人体蛋白质氨基酸、粘土、水滑石、埃洛石、葡聚糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖、乳糖酸、苹果酸、山梨醇、藻酸、脱脂乳、血清、抗坏血酸、半胱氨酸、羧氨、氨基脲、海藻糖和甘油中至少一种。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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