CN110251728A - 一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片 - Google Patents

一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片，属于生物材料技术领域。本发明所述制备方法的制备基材为经生物发酵制得的细菌纤维素膜；将经生物发酵制得的细菌纤维素膜经纯化处理、氧化处理、冻融处理、复合工艺处理、静电纺丝处理、冷冻干燥处理和压膜处理，得到生物外科补片。本发明所述制备方法得到的生物外科补片具有良好的生物相容性、力学性能、缝合性能及临床使用便利性，可以满足作为外科补片材料的基本要求。

Description

一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科 补片
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片。
背景技术
生物外科补片的现有制备方法为直接发酵，且为发酵过程中不添加其他成分的静态发酵方法，根据发酵时间的长短控制所得的细菌纤维素膜的厚度，从而间接调节膜材料的机械性能，固发酵时间长、膜材料的机械性能提升不明显，孔径密集，不利于细胞、组织的增殖，难以满足临床的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片。本发明所述制备方法得到的生物外科补片具有良好的生物相容性、力学性能、缝合性能及临床使用便利性，可以满足作为外科补片材料的基本要求。
本发明提供了一种生物外科补片的制备方法，包括以下步骤：
1)将菌种进行发酵培养，得到细菌纤维素膜；所述发酵培养过程中添加生物高分子材料；所述生物高分子材料包括聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯中的一种或多种；
2)将步骤1)得到的细菌纤维素膜依次在无机碱液和酸溶液中浸泡，得到纯化后的细菌纤维素膜；
3)将步骤2)得到的纯化后的细菌纤维素膜浸入氧化剂溶液中进行氧化，得到氧化后的细菌纤维素膜；
4)将步骤3)得到的氧化后的细菌纤维素膜进行冻融，得到冻融后的细菌纤维素膜；
5)将步骤4)得到的冻融后的细菌纤维素膜置于甘油水溶液中搅拌，干燥，得到复合处理后的细菌纤维素膜；
6)将步骤5)得到的复合处理后的细菌纤维素膜进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品；所述静电纺丝液包括聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液；所述溶液的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醚、正己烷、石油醚中的一种或多种；
7)将步骤6)得到的生物外科补片中间品进行冷冻干燥、压膜得到生物外科补片。
优选的是，步骤1)所述发酵培养用培养基每1000mL中包括：甘露醇20～25g，聚乙二醇10～15g，蔗糖25～30g，葡萄糖15～20g，烟酸0.5～0.8mg，酵母粉5～6g，玉米浆干粉10～15g，牛肉膏5～10g，蛋白胨5～10g，KH2PO41.5～2.5g，MgSO42.0～2.5g，无水乙醇8～10g，硫酸铵0.5～0.8g，柠檬酸0.5～0.6g，羧甲基纤维素钠0.5～0.6g和葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的混合物40～50g；所述葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的质量比为1:(1～5)。
优选的是，步骤1)所述菌种包括醋酸菌属、根瘤菌属、葡糖酸杆菌属、木醋杆菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属和土壤杆菌属中的一种或多种。
优选的是，步骤1)所述发酵培养的条件为在20～40℃、通氧量为0.01～10L/min、pH值为3～9的条件下发酵培养6～14d。
优选的是，当步骤1)中所述生物高分子材料包括两种及以上时，按照聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯的顺序逐一添加。
优选的是，步骤3)所述氧化剂为包括过氧化氢、次氯酸钠、过氧化钠、过氧化钾、过氧乙酸、过碳酸钠、过硼酸钠和过硼酸钾中的一种或几种的水溶液。
优选的是，所述过氧化氢、次氯酸钠、过氧化钠、过氧化钾、过氧乙酸、过碳酸钠、过硼酸钠和过硼酸钾在水中的质量分数分别为1～50％。
优选的是，步骤4)所述冻融为：置于-45～-1℃下冷冻0.2～10h，取出置于5～35℃环境下融冰0.2～10h，将融化后的水分倒掉；重复上述冷冻、融冰操作2～9次。
优选的是，步骤6)所述静电纺丝液中聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈或聚碳酸酯的质量浓度分别为0.01～5g/mL。
优选的是，步骤6)中复合处理后的细菌纤维素膜与聚乳酸、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、壳聚糖或聚己内酯的质量比分别为(0.1～3):10。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法制备得到的生物外科补片。
本发明提供了一种生物外科补片的制备方法。本发明所述制备方法的制备基材为经生物发酵制得的细菌纤维素膜；将生物发酵制得的细菌纤维素膜经纯化处理、氧化处理、冻融处理、复合工艺处理，静电纺丝处理、冷冻干燥处理和压膜处理制备得到生物外科补片。本发明采用微生物经静态/动态法发酵制得的细菌纤维素膜，通过在发酵过程中添加适量生物高分子材料，其拉伸强度、缝合强度等性能可以满足临床上对生物外科补片的要求；且所述细菌纤维素膜通过化学方法提高了材料的孔径，能够促进细胞组织的增殖；所述细菌纤维素膜经静电纺丝工艺在其表面覆盖一层具有抑菌和可降解功能的生物高分子涂层后，得到的生物外科补片能起到抑菌防感染，预防组织粘连的作用，对患者术后的快速恢复具有重大意义。本发明所述生物外科补片采用细菌纤维素膜为基材，相比其它动物源性基材，具有来源广泛、成本低廉且在临床上的应用更加安全的优点。本发明通过发酵条件的改进使所得细菌纤维素膜厚度和力学性能更好的满足临床使用需求，化学处理和冻溶干燥方法得到更适于人体组织细胞生长的支架材料，静电纺丝使生物补片获得抑菌、防黏连的功效，所以产生了缝合强度、生物相容性大大提高的效果。本发明所述制备方法得到的生物外科补片具有良好的生物相容性、力学性能、缝合性能及临床使用便利性，可以满足作为外科补片材料的基本要求。
附图说明
图1为本发明提供的生物外科补片实物图(经裁剪后)；
图2为本发明提供的生物外科补片SEM图(放大5000倍)。
具体实施方式
本发明提供了一种生物外科补片的制备方法，制备基材为经生物发酵制得的细菌纤维素膜；将经生物发酵制得的细菌纤维素膜经纯化处理、氧化处理、冻融处理、复合工艺处理，静电纺丝处理、冷冻干燥处理和压膜处理，得到生物外科补片；
所述生物外科补片的制备方法包括以下步骤：
1)将菌种进行发酵培养，得到细菌纤维素膜；所述发酵培养过程中添加生物高分子材料；所述生物高分子材料包括聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯中的一种或多种；
2)将步骤1)得到的细菌纤维素膜依次在无机碱液和酸溶液中浸泡，得到纯化后的细菌纤维素膜；
3)将步骤2)得到的纯化后的细菌纤维素膜浸入氧化剂溶液中进行氧化，得到氧化后的细菌纤维素膜；
4)将步骤3)得到的氧化后的细菌纤维素膜进行冻融，得到冻融后的细菌纤维素膜；
5)将步骤4)得到的冻融后的细菌纤维素膜置于甘油水溶液中搅拌，干燥，得到复合处理后的细菌纤维素膜；
6)将步骤5)得到的复合处理后的细菌纤维素膜进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品；所述静电纺丝液包括聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液；所述溶液的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醚、正己烷、石油醚中的一种或多种；
7)将步骤6)得到的生物外科补片中间品进行冷冻干燥、压膜得到生物外科补片。
本发明将菌种进行发酵培养，得到细菌纤维素膜；所述发酵培养过程中添加生物高分子材料；所述生物高分子材料包括聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯中的一种或多种。本发明优选先将菌种进行活化、扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到细菌纤维素膜；所述菌种优选包括醋酸菌属、根瘤菌属、葡糖酸杆菌属、木醋杆菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属和土壤杆菌属中的一种或多种；所述发酵培养优选为在20～40℃、通氧量为0.01～10L/min、pH值为3～9的条件下发酵培养6～14d，在发酵的第一天和第三天优选分别加入发酵液体积1～5％的甘露醇和1～10％的聚乙二醇；本发明所述发酵培养过程中添加生物高分子材料；所述生物高分子材料包括聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯中的一种或多种。在本发明中，当所述生物高分子材料包括多种时，优选按照聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯的顺序逐一添加，如当所述生物高分子材料包括聚酯和聚氯乙烯时，先添加聚酯，再添加聚氯乙烯；当所述生物高分子材料包括甘油、聚己内酯和聚乙烯时，本发明先添加甘油，然后是聚己内酯，最后是聚乙烯。在本发明中，所述生物高分子材料的添加能够加速细菌纤维素膜的发酵，同时增强细菌纤维素膜的力学性能和微孔结构，使得细菌纤维素膜满足不同临床需求。在本发明中，所述发酵培养基每1000mL中包括：甘露醇20～25g，聚乙二醇10～15g，蔗糖25～30g，葡萄糖15～20g，烟酸0.5～0.8mg，酵母粉5～6g，玉米浆干粉10～15g，牛肉膏5～10g，蛋白胨5～10g，KH2PO41.5～2.5g，MgSO42.0～2.5g，无水乙醇8～10g，硫酸铵0.5～0.8g，柠檬酸0.5～0.6g，羧甲基纤维素钠0.5～0.6g和葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的混合物40～50g；所述葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的质量比为1:(1～5)，更优选为1：3.5。在本发明中，所述发酵培养的条件优选为在30℃、通氧量为1.0L/min、pH值为6.0的条件下发酵培养8d。在本发明中，所述细菌纤维素膜的厚度为0.05～2.0cm，更优选为0.5cm。
得到细菌纤维素膜后，本发明将细菌纤维素膜依次在无机碱液和酸溶液中浸泡，得到纯化后的细菌纤维素膜。本发明优选先将细菌纤维素膜进行第一清洗，将第一清洗后的细菌纤维素膜在无机碱液中浸泡0.5～5h，加热煮沸1～5h，进行第二清洗，在酸溶液中浸泡0.5～5h，进行第三清洗，得到纯化后的细菌纤维素膜；所述第一清洗、第二清洗和第三清洗独立的为在注射用水中浸泡搅拌3～60min，倒掉注射用水。在本发明中，所述第一清洗、所述第二清洗和所述第三清洗的次数优选为5次。在本发明中，所述第一清洗优选为将细菌纤维素膜的pH洗至4.0～8.0，更优选为6.0。在本发明中，所述无机碱液包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、碳酸钠、碳酸氢钠溶液中的一种或多种；所述无机碱液的质量浓度为0.1～5.0mol/L，温度为60～100℃。在本发明中，所述酸溶液包括醋酸、柠檬酸、乳酸、草酸、甲酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等有机酸中的一种或多种。
得到纯化后的细菌纤维素膜后，本发明将纯化后的细菌纤维素膜浸入氧化剂溶液中进行氧化，得到氧化后的细菌纤维素膜。本发明优选将纯化后的细菌纤维素膜浸入氧化剂溶液中，搅拌5～60min，真空抽滤，淋洗后，得到氧化后的细菌纤维素膜。在本发明中，所述氧化剂为质量分数分别为1～50％的过氧化氢、次氯酸钠、过氧化钠、过氧化钾、过氧乙酸、过碳酸钠、过硼酸钠和过硼酸钾水溶液中的一种或几种。在本发明中，所述氧化能够使所述细菌纤维素膜的孔径满足组织细胞生长繁殖要求，促进组织生长。在本发明中，所述真空抽滤优选为将细菌纤维素膜装在玻璃柱中，启动真空泵进行抽滤，抽滤后优选使用注射用水对细菌纤维素膜进行淋洗。在本发明中，所述淋洗至淋洗液中细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml时停止。在本发明中，所述淋洗优选为将细菌纤维素膜的pH洗至4.0～8.0，更优选为6.0。
得到氧化后的细菌纤维素膜后，本发明将氧化后的细菌纤维素膜进行冻融，得到冻融后的细菌纤维素膜。本发明优选将氧化后的细菌纤维素膜置于-45～-1℃下冷冻0.2～10h，取出置于5～35℃环境下融冰0.2～10h，将融化后的水分倒掉；重复上述冷冻、融冰操作2～9次，取最后一次融冰的细菌纤维素膜，将融化后的水分倒掉，得到冻融后的细菌纤维素膜。
得到冻融后的细菌纤维素膜后，本发明将冻融后的细菌纤维素膜置于甘油水溶液中搅拌，干燥，得到复合处理后的细菌纤维素膜。优选的，本发明将冻融后的细菌纤维素膜置于质量分数为0.5～3％的甘油水溶液中，20rpm～1000rpm下搅拌0.5～4h，本发明优选平铺于不锈钢网上进行干燥，干燥得到复合处理后的细菌纤维素膜。在本发明中，所述干燥的条件为：10～99℃干燥0.5～24h，更优选为65℃。在本发明中，所述甘油水溶液中甘油的质量分数优选为3.85％。在本发明中，所述搅拌的条件优选为20～1000rpm搅拌0.5～4h，最优选为500rpm搅拌4h。在本发明中，所述不锈钢网的面积优选为20～100cm*20～100cm，目数优选为100～50目，本发明所述平铺时优选要保证复合膜材料平整、和不锈钢网之间无气泡产生。本发明对所述干燥的方式没有特殊限定，优选在鼓风干燥箱中进行干燥。本发明复合处理后的细菌纤维素膜为生物外科补片基材，本发明所述生物补片基材的纤维直径优选为0.05～0.5μm；厚度优选为2～2000μm，尺寸为a cm*b cm(2≤a≤10，2≤b≤10)，形状优选为矩形、圆形、椭圆形或不规则形状。
得到复合处理后的细菌纤维素膜后，本发明将复合处理后的细菌纤维素膜进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品；所述静电纺丝液包括聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液；所述溶液的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醚、正己烷、石油醚中的一种或多种。本发明优选将复合处理后的细菌纤维素膜固定于静电纺丝设备接收装置上，将静电纺丝液装入注射器中，进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品；所述静电纺丝液包括含质量浓度为0.01～5g/mL聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液；所述溶液的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醚、正己烷、石油醚中的一种或多种；所述冻融干燥后的细菌纤维素膜与聚乳酸、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、壳聚糖或聚己内酯的质量比分别为(0.1～3):10；所述静电纺丝的条件为：正极电压10～30KV，负极电压-0.1～-10KV，接受距离5～30cm。在本发明中，所述静电纺丝液优选包括含质量浓度为0.2～5g/mL聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液。当所述静电纺丝液为聚乳酸-二氯甲烷溶液和聚己内酯-二氯甲烷溶液时，本发明优选将聚乳酸-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品A1，再将聚己内酯-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A2；本发明对不同静电纺丝液的使用顺序没有限定，比如聚乳酸-二氯甲烷溶液和聚己内酯-二氯甲烷溶液的静电纺丝顺序可以调换。在本发明中，所述冻融干燥后的细菌纤维素膜与聚乳酸、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、壳聚糖或聚己内酯的质量比分别优选为1:10、1:8、1:8、1:10、1:5、1:8。在本发明中，所述静电纺丝的条件优选为：正极电压20KV，负极电压2KV，接受距离15cm。本发明所述细菌纤维素膜经静电纺丝工艺在其表面覆盖一层具有抑菌和可降解功能的生物高分子涂层后，得到的生物外科补片能起到抑菌防感染，预防组织粘连的作用。
得到生物外科补片中间品后，本发明将生物外科补片中间品进行冷冻干燥、压膜得到生物外科补片。本发明优选将生物外科补片中间品浸泡于体积浓度为50～99％的乙醇水溶液中10～60min，取出后浸入注射用水中浸泡10～60min，冷冻干燥得到冷冻干燥的生物外科补片中间品。得到冷冻干燥的生物外科补片中间品后，本发明将冷冻干燥后的生物外科补片中间品进行压膜，得到生物外科补片。在本发明中，所述压膜的厚度为0.01mm～10mm。在本发明中，所述生物外科补片优选裁剪成5～100mm*5～100mm规格，经内包、外包、灭菌、包装后，得到生物外科补片产品。在本发明中，所述灭菌优选包括微波、紫外线、X射线、γ射线、电子束和Co60灭菌方式中的一种或多种，当所述灭菌方式为Co60时，剂量优选为5～50KGy，更优选为15KGy。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法制备得到的生物外科补片。本发明所述生物外科补片实物图如图1所示，SEM图如图2所示。本发明采用微生物经静态/动态法发酵制得的细菌纤维素膜，通过在发酵过程中添加适量生物高分子材料，其拉伸强度、缝合强度等性能可以满足临床上对生物外科补片的要求；且所述细菌纤维素膜通过化学方法提高了材料的孔径，能够促进细胞组织的增殖；所述细菌纤维素膜经静电纺丝工艺在其表面覆盖一层具有抑菌和可降解功能的生物高分子涂层后，得到的生物外科补片能起到抑菌防感染，预防组织粘连的作用，对患者术后的快速恢复具有重大意义。本发明所述生物外科补片采用细菌纤维素膜为基材，相比其它动物源性基材，具有来源广泛、成本低廉且在临床上的应用更加安全的优点。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
步骤1)培养基的配制：称取甘露醇20g，聚乙二醇15g，蔗糖25g，葡萄糖20g，烟酸0.5mg，酵母粉5g，玉米浆干粉10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，KH2PO42g，MgSO42g，无水乙醇8g，硫酸铵0.5g，柠檬酸0.5g，羧甲基纤维素钠0.5g，葡萄糖酸10g，葡萄糖酸钠40g，加入1000mL纯化水中。
步骤2)发酵：取产纤维素膜的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种转移至不锈钢托盘扩大培养，得到种子液，放于37℃恒温培养箱中培养10天，在发酵的第一天和第三天分别加入2％的甘露醇和5％的聚乙二醇，且整个发酵过程维持体系pH为6.8，通氧量0.4L/min，发酵完成后，在发酵液上层得到一层细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜取出备用；
步骤3)清洗及前处理：使用注射用水清洗发酵所得的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH为6，然后将其放入灭菌注射用水配制的1L的0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，浸泡5h，再加热煮沸2h，取出，用灭菌注射用水浸泡并搅拌50min，直至拧出液pH为6.0，再转移至灭菌注射用水配制的1L的1mol/L的醋酸、柠檬酸混合溶液中，其中醋酸、柠檬酸的物质的量之比为4:1，浸泡5h后取出，再用注射用水浸泡并用玻璃棒进行搅拌3min，倒掉洗涤后的注射用水。
步骤4)氧化及纯化处理：将步骤3)中所得的细菌纤维素膜转移至15％的过氧化氢溶液中，浸泡及搅拌30min，取出装于玻璃柱中，启动真空泵进行抽滤，以注射用水作为淋洗液对细菌纤维素膜进行持续淋洗，并对淋洗液进行检测，所得细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml，即得到纯化的细菌纤维素膜；
步骤5)冻融干燥处理：置于-45℃环境下冷冻0.2h，取出置于5℃环境下融冰10h，将融化后的水分倒掉；重复以上操作2次。取最后一次融冰的细菌纤维素膜，将融化后的水分倒掉，留存备用；
步骤6)复合过程：将细菌纤维素膜放于0.5％的甘油溶液中进行搅拌，转速为1000rpm，时间为0.5h，完成后平铺于不锈钢网上，转移至鼓风干燥箱中进行干燥，此时温度为10℃，时间为24h，干燥完成后即得生物外科补片基材，留存备用；
步骤7)静电纺丝液的配制：配制聚乳酸-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为1.5g/mL；配制聚己内酯-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为1.5g/mL，备用；
步骤8)静电纺丝：将步骤5)所得的生物外科补片基材固定于静电纺丝设备接收装置上，先将步骤6)中的聚乳酸-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A1，其中静电纺丝参数为电压20KV，接收距离为20cm；再将聚己内酯-二氯甲烷溶液转移到注射器中，对A1进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A2，其中静电纺丝参数为电压20KV，接收距离为20cm，且细菌纤维素膜与聚乳酸或聚己内酯质量比为1.0:10；
步骤9)对中间品进行纯化处理：将步骤7)得到的生物外科补片中间品浸泡于浓度为85％的乙醇溶液中20min，取出再转移至注射用水中浸泡20min，然后利用冷冻干燥制备成型；
步骤10)包装：利用压膜机将干燥成型样品制备成厚度为0.025mm、裁剪成大小为5mm*5mm规格，经过内包、外包、产品灭菌(剂量为35KGy)、包装后，即得最终成品。
实施例2
步骤1)培养基的配制：称取甘露醇25g，聚乙二醇10g，蔗糖30g，葡萄糖15g，烟酸0.8mg，酵母粉6g，玉米浆干粉15g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，KH2PO41.5g，MgSO42.5g，无水乙醇10g，硫酸铵0.8g，柠檬酸0.6g，羧甲基纤维素钠0.6g，葡萄糖酸10g，葡萄糖酸钠50g，加入1000mL纯化水中。
步骤2)发酵：取产纤维素膜的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种转移至不锈钢托盘扩大培养，得到种子液，放于40℃恒温培养箱中培养6天，在发酵的第一天和第三天分别加入2％的甘露醇和5％的聚乙二醇，且整个发酵过程维持体系pH为3.8，通氧量3.5L/min，发酵完成后，在发酵液上层得到一层细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜取出备用；
步骤3)清洗及前处理：使用注射用水清洗发酵所得的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH为6，然后将其放入灭菌注射用水配制的1L的0.75mol/L的氢氧化钠溶液中，浸泡5h，再加热煮沸2h，取出，用灭菌注射用水浸泡并搅拌60min，直至拧出液pH为6.0，再转移至灭菌注射用水配制的1L的1mol/L的醋酸、柠檬酸混合溶液中，其中醋酸、柠檬酸的物质的量之比为4:1，浸泡5h后取出，再用注射用水浸泡并用玻璃棒进行搅拌60min，倒掉洗涤后的注射用水。
步骤4)氧化及纯化处理：将步骤3)中所得的细菌纤维素膜转移至30％的过氧化氢溶液中，浸泡及搅拌30min，取出装于玻璃柱中，启动真空泵进行抽滤，以注射用水作为淋洗液对细菌纤维素膜进行持续淋洗，并对淋洗液进行检测，所得细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml，即得到纯化的细菌纤维素膜；
步骤5)冻融干燥处理：置于-1℃环境下冷冻10h，取出置于35℃环境下融冰0.2h，将融化后的水分倒掉；重复以上操作9次。取最后一次融冰的细菌纤维素膜，将融化后的水分倒掉，留存备用；
步骤6)复合过程：将细菌纤维素膜放于3％的甘油溶液中进行搅拌，转速为20rpm，时间为2h，完成后平铺于不锈钢网上，转移至鼓风干燥箱中进行干燥，此时温度为50℃，时间为12h，干燥完成后即得生物外科补片基材，留存备用；
步骤7)静电纺丝液的配制：配制聚乳酸-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为4.5％；配制聚己内酯-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为4.5％，备用；
步骤8)静电纺丝：将步骤5)所得的生物外科补片基材固定于静电纺丝设备接收装置上，先将步骤6)中的聚乳酸-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A1，其中静电纺丝参数为电压10KV，接收距离为5cm；再将聚己内酯-二氯甲烷溶液转移到注射器中，对A1进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A2，其中静电纺丝参数为电压30KV，接收距离为30cm，且细菌纤维素膜与聚乳酸或聚己内酯质量比为0.1:10；
步骤9)对中间品进行纯化处理：将步骤7)得到的生物外科补片中间品浸泡于浓度为50％的乙醇溶液中60min，取出再转移至注射用水中浸泡10min，然后利用冷冻干燥制备成型；
步骤10)包装：利用压膜机将干燥成型样品制备成厚度为0.025mm、裁剪成大小为50mm*50mm规格，经过内包、外包、产品灭菌(剂量为25KGy)、包装后，即得最终成品。
实施例3
步骤1)培养基的配制：称取甘露醇22g，聚乙二醇13g，蔗糖28g，葡萄糖18g，烟酸0.65mg，酵母粉6g，玉米浆干粉12g，牛肉膏8g，蛋白胨8g，KH2PO42.0g，MgSO42.2g，无水乙醇9g，硫酸铵0.7g，柠檬酸0.6g，羧甲基纤维素钠0.6g，葡萄糖酸15g，葡萄糖酸钠30g，加入1000mL纯化水中。
步骤2)发酵：取产纤维素膜的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种转移至不锈钢托盘扩大培养，得到种子液，放于25℃恒温培养箱中培养11天，在发酵的第一天和第三天分别加入1％的甘露醇和3％的聚乙二醇，且整个发酵过程维持体系pH为7，通氧量8L/min，发酵完成后，在发酵液上层得到一层细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜取出备用；
步骤3)清洗及前处理：使用注射用水清洗发酵所得的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH为6，然后将其放入灭菌注射用水配制的1L的1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，浸泡5h，再加热煮沸2h，取出，用灭菌注射用水浸泡并搅拌60min，直至拧出液pH为6.0，再转移至灭菌注射用水配制的1L的1mol/L的醋酸、柠檬酸混合溶液中，其中醋酸、柠檬酸的物质的量之比为4:1，浸泡5h后取出，再用注射用水浸泡并用玻璃棒进行搅拌60min，倒掉洗涤后的注射用水。
步骤4)氧化及纯化处理：将步骤3)中所得的细菌纤维素膜转移至30％的过氧化氢溶液中，浸泡及搅拌30min，取出装于玻璃柱中，启动真空泵进行抽滤，以注射用水作为淋洗液对细菌纤维素膜进行持续淋洗，并对淋洗液进行检测，所得细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml，即得到纯化的细菌纤维素膜；
步骤5)冻融干燥处理：置于-1℃环境下冷冻10h，取出置于5℃环境下融冰10h，将融化后的水分倒掉；重复以上操作2次。取最后一次融冰的细菌纤维素膜，将融化后的水分倒掉，留存备用；
步骤6)复合过程：将细菌纤维素膜放于1.5％的甘油溶液中进行搅拌，转速为500rpm，时间为1h，完成后平铺于不锈钢网上，转移至鼓风干燥箱中进行干燥，此时温度为99℃，时间为2h，干燥完成后即得生物外科补片基材，留存备用；
步骤7)静电纺丝液的配制：配制聚乳酸-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为5％；配制聚己内酯-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为5％，备用；
步骤8)静电纺丝：将步骤5)所得的生物外科补片基材固定于静电纺丝设备接收装置上，先将步骤6)中的聚乳酸-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A1，其中静电纺丝参数为电压30KV，接收距离为30cm；再将聚己内酯-二氯甲烷溶液转移到注射器中，对A1进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A2，其中静电纺丝参数为电压10KV，接收距离为5cm，且细菌纤维素膜与聚乳酸或聚己内酯质量比为3.0:10；
步骤9)对中间品进行纯化处理：将步骤7)得到的生物外科补片中间品浸泡于浓度为99％的乙醇溶液中10min，取出再转移至注射用水中浸泡60min，然后利用冷冻干燥制备成型；
步骤10)包装：利用压膜机将干燥成型样品制备成厚度为0.010mm、裁剪成大小为5mm*50mm规格，经过内包、外包、产品灭菌(剂量为5KGy)、包装后，即得最终成品。
实施例4
步骤1)培养基的配制：称取甘露醇25g，聚乙二醇10g，蔗糖30g，葡萄糖19g，烟酸0.8mg，酵母粉6g，玉米浆干粉13g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，KH2PO42.5g，MgSO42.0g，无水乙醇8g，硫酸铵0.5g，柠檬酸0.6g，羧甲基纤维素钠0.6g，葡萄糖酸10g，葡萄糖酸钠35g，加入1000mL纯化水中。
步骤2)发酵：取产纤维素膜的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种转移至不锈钢托盘扩大培养，得到种子液，放于32℃恒温培养箱中培养10天，在发酵的第一天和第三天分别加入1.5％的甘露醇和5％的聚乙二醇，且整个发酵过程维持体系pH为5.2，通氧量0.3L/min，发酵完成后，在发酵液上层得到一层细菌纤维素膜，将细菌纤维素膜取出备用；
步骤3)清洗及前处理：使用注射用水清洗发酵所得的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH为6，然后将其放入灭菌注射用水配制的1L的1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，浸泡3h，再加热煮沸2h，取出，用灭菌注射用水浸泡并搅拌60min，直至拧出液pH为6.0，再转移至灭菌注射用水配制的1L的1mol/L的醋酸、柠檬酸混合溶液中，其中醋酸、柠檬酸的物质的量之比为4:1，浸泡5h后取出，再用注射用水浸泡并用玻璃棒进行搅拌30min，倒掉洗涤后的注射用水。
步骤4)氧化及纯化处理：将步骤3)中所得的细菌纤维素膜转移至50％的过氧化氢溶液中，浸泡及搅拌30min，取出装于玻璃柱中，启动真空泵进行抽滤，以注射用水作为淋洗液对细菌纤维素膜进行持续淋洗，并对淋洗液进行检测，所得细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml，即得到纯化的细菌纤维素膜；
步骤5)冻融干燥处理：置于-25℃环境下冷冻6h，取出置于15℃环境下融冰5h，将融化后的水分倒掉；重复以上操作2次。取最后一次融冰的细菌纤维素膜，将融化后的水分倒掉，留存备用；
步骤6)复合过程：将细菌纤维素膜放于2.5％的甘油溶液中进行搅拌，转速为800rpm，时间为0.75h，完成后平铺于不锈钢网上，转移至鼓风干燥箱中进行干燥，此时温度为65℃，时间为5h，干燥完成后即得生物外科补片基材，留存备用；
步骤7)静电纺丝液的配制：配制聚乳酸-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为0.5％；配制聚己内酯-二氯甲烷溶液10mL，其浓度为0.5％，备用；
步骤8)静电纺丝：将步骤5)所得的生物外科补片基材固定于静电纺丝设备接收装置上，先将步骤6)中的聚乳酸-二氯甲烷溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A1，其中静电纺丝参数为电压20KV，接收距离为20cm；再将聚己内酯-二氯甲烷溶液转移到注射器中，对A1进行静电纺丝得到生物外科补片中间品A2，其中静电纺丝参数为电压15KV，接收距离为15cm，且细菌纤维素膜与聚乳酸或聚己内酯质量比为1.0:10；
步骤9)对中间品进行纯化处理：将步骤7)得到的生物外科补片中间品浸泡于浓度为75％的乙醇溶液中40min，取出再转移至注射用水中浸泡40min，然后利用冷冻干燥制备成型；
步骤10)包装：利用压膜机将干燥成型样品制备成厚度为0.04mm、裁剪成大小为50mm*100mm规格，经过内包、外包、产品灭菌(剂量为50KGy)、包装后，即得最终成品。
有益效果如表1所示。
表1生物外科补片各项参数
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种生物外科补片的制备方法，包括以下步骤：
1)将菌种进行发酵培养，得到细菌纤维素膜；所述发酵培养过程中添加生物高分子材料；所述生物高分子材料包括聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯中的一种或多种；
2)将步骤1)得到的细菌纤维素膜依次在无机碱液和酸溶液中浸泡，得到纯化后的细菌纤维素膜；
3)将步骤2)得到的纯化后的细菌纤维素膜浸入氧化剂溶液中进行氧化，得到氧化后的细菌纤维素膜；
4)将步骤3)得到的氧化后的细菌纤维素膜进行冻融，得到冻融后的细菌纤维素膜；
5)将步骤4)得到的冻融后的细菌纤维素膜置于甘油水溶液中搅拌，干燥，得到复合处理后的细菌纤维素膜；
6)将步骤5)得到的复合处理后的细菌纤维素膜进行静电纺丝，得到生物外科补片中间品；所述静电纺丝液包括聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈、聚碳酸酯中的一种或多种的溶液；所述溶液的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醚、正己烷、石油醚中的一种或多种；
7)将步骤6)得到的生物外科补片中间品进行冷冻干燥、压膜得到生物外科补片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述发酵培养用培养基每1000mL中包括：甘露醇20～25g，聚乙二醇10～15g，蔗糖25～30g，葡萄糖15～20g，烟酸0.5～0.8mg，酵母粉5～6g，玉米浆干粉10～15g，牛肉膏5～10g，蛋白胨5～10g，KH2PO41.5～2.5g，MgSO42.0～2.5g，无水乙醇8～10g，硫酸铵0.5～0.8g，柠檬酸0.5～0.6g，羧甲基纤维素钠0.5～0.6g和葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的混合物40～50g；所述葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的质量比为1:(1～5)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述菌种包括醋酸菌属、根瘤菌属、葡糖酸杆菌属、木醋杆菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属和土壤杆菌属中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述发酵培养的条件为在20～40℃、通氧量为0.01～10L/min、pH值为3～9的条件下发酵培养6～14d。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当步骤1)中所述生物高分子材料包括多种时，按照聚乳酸、聚酰胺、聚酯、甘油、聚丙交酯、聚己内酯、聚氯乙烯、聚乙烯的顺序逐一添加。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述氧化剂为包括过氧化氢、次氯酸钠、过氧化钠、过氧化钾、过氧乙酸、过碳酸钠、过硼酸钠和过硼酸钾中的一种或几种的水溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述过氧化氢、次氯酸钠、过氧化钠、过氧化钾、过氧乙酸、过碳酸钠、过硼酸钠和过硼酸钾在水中的质量分数分别为1～50％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述冻融为：置于-45～-1℃下冷冻0.2～10h，取出置于5～35℃环境下融冰0.2～10h，将融化后的水分倒掉；重复上述冷冻、融冰操作2～9次。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述静电纺丝液中聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、聚丙烯腈或聚碳酸酯的质量浓度分别为0.01～5g/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中复合处理后的细菌纤维素膜与聚乳酸、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、壳聚糖或聚己内酯的质量比分别为(0.1～3):10。
11.基于权利要求1～10任一项所述制备方法制备得到的生物外科补片。
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